CN108169217A - 一种简易高效蛋白酶活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简易高效蛋白酶活性测方法，吸取适量稀释的酶溶液1.00‑3.00mL、缓冲溶液2.00‑6.00 ml于试管中，并将2.00‑4.00mL酪素溶液放入37℃‑45℃恒温水浴中，将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，向反应溶液加入4.00ml‑8.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min‑10min，离心过滤，提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定。本发明利用紫外分光光度计测量酶溶液与酪素溶液反应后溶液的吸光值，从而得出蛋白酶的活性，不仅操作简单，而且测定反应单一，不会引起某些意外的生成物并产生回馈反应，测量精确度高，检测效果优异。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性检测技术领域，具体是一种简易高效蛋白酶活性检测方法。
背景技术
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗，还可用于将组织处理成为单个细胞，进行细胞组织培养。
酶活性又指酶活力，是指酶催化指定化学反应的能力，现有技术中通常通过测定反应中单位体积中底物的减少量或产物的增加量来测定酶促反应的速度，这种测量方式不仅复杂麻烦，成本较高，而且对底物的减少量或产物的增加量测量精确度不高，从而使结果产生较大的误差，与此同时，现有的测定反应较为复杂，反应过程中可能引起某些意外的生成物并产生回馈反应，从而对反应结构产生干扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简易高效蛋白酶活性检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种简易高效蛋白酶活性检测方法，其步骤如下：
1)吸取适量稀释的酶溶液1.00-3.00mL、缓冲溶液2.00-6.00ml于试管中，静置，并将2.00-4.00mL酪素溶液放入37℃-45℃恒温水浴中，预热5min-15min；
2)将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，摇匀后避光放置；
3)将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，升温至35℃-42℃，水浴加热10min-20min，并以秒表精确计时；
4)向反应溶液加入4.00ml-8.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min-10min，离心过滤5min-10min后去除未溶解的沉淀物；
5)提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定；
6)计算酶溶液中的酶活性，结果用整数表示。
作为本发明进一步的方案：步骤1)中，所述待测酶溶液的制备方法为：称取酶粉1～ 2g，精确至0.0001g，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，再用四层纱布过滤后备用。
作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述缓冲溶液的制备方法为：
a、中性缓冲溶液(适用于中性蛋白酶)pH＝7.5，
称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水溶解并定容至1000mL后利用PH计测定并校正；
b、酸性缓溶液(适用于酸性蛋白酶)pH＝2.0，
甲液：称取乳酸(60％-85％)12.0g，加水溶解并定容至1000ml，
乙液：称取乳酸钠(50％-70％)18.0g，加水溶解并定容至1000ml，
配制：取甲液10ml，加乙液2ml，混匀，稀释一倍后形成成0.05mol/L酸性冲溶液，再利用PH计测定并校正；
c、碱性缓冲溶液(适用于碱性蛋白酶)pH＝10.0，
甲液：称取硼酸钠(硼砂)10.0g，加水溶解并定容至500ml，
乙液：称取氢氧化钠2.0g，加水溶解并定容至500ml，
制备：取甲液500ml、乙液400ml混匀，用水稀释至1000ml后利用PH计测定并校正。
作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述酪素溶液的制备方法为：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.2-0.8mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸 2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约100ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度后放入冰箱中冷藏备用。
作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述三氯乙酸的制备方法为：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml，配制成0.4mol/L三氯乙酸溶液。
作为本发明再进一步的方案：步骤6)中，酶活性的计算公式为
X＝A×K×α/β×1/τ×N，
式中：X—样品的酶活性，u/g(u/ml)；
A—试样溶液的平均吸光度；
K—吸光常数；
α—反应试剂的总体积αml；
β—吸取酶溶液βml，以1ml计；
1/τ—反应时间τmin，以1min计；
N—稀释倍数。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用紫外分光光度计测量酶溶液与酪素溶液反应后溶液的吸光值，从而得出蛋白酶的活性，不仅操作简单，而且测定反应单一，不会引起某些意外的生成物并产生回馈反应，测量精确度高，检测效果优异。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种简易高效蛋白酶活性检测方法，其步骤如下：
1)吸取适量稀释的酶溶液1.00mL、缓冲溶液2.00ml于试管中，静置，并将2.00mL酪素溶液放入37℃恒温水浴中，预热5min；
其中，待测酶溶液的制备方法为：称取酶粉1g，精确至0.0001g，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，再用四层纱布过滤后备用；
缓冲溶液的制备方法为：
a、中性缓冲溶液(适用于中性蛋白酶)pH＝7.5，
称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水溶解并定容至1000mL后利用PH计测定并校正；
b、酸性缓溶液(适用于酸性蛋白酶)pH＝2.0，
甲液：称取乳酸(60％-85％)12.0g，加水溶解并定容至1000ml，
乙液：称取乳酸钠(50％-70％)18.0g，加水溶解并定容至1000ml，
配制：取甲液10ml，加乙液2ml，混匀，稀释一倍后形成成0.05mol/L酸性冲溶液，再利用PH计测定并校正；
c、碱性缓冲溶液(适用于碱性蛋白酶)pH＝10.0，
甲液：称取硼酸钠(硼砂)10.0g，加水溶解并定容至500ml，
乙液：称取氢氧化钠2.0g，加水溶解并定容至500ml，
制备：取甲液500ml、乙液400ml混匀，用水稀释至1000ml后利用PH计测定并校正；
酪素溶液的制备方法为：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.2-0.8mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约100ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度后放入冰箱中冷藏备用；
三氯乙酸的制备方法为：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml，配制成0.4mol/L三氯乙酸溶液；
2)再将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，摇匀后避光放置；
3)接着将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，升温至35℃，水浴加热10min，并以秒表精确计时；
4)然后将反应溶液加入4.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min，离心过滤 5min后去除未溶解的沉淀物；
5)随后提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定；
6)最后利用X＝A×K×α/β×1/τ×N计算酶溶液中的酶活性，结果用整数表示，
式中：X—样品的酶活性，u/g(u/ml)；
A—试样溶液的平均吸光度；
K—吸光常数；
α—反应试剂的总体积αml；
β—吸取酶溶液βml，以1ml计；
1/τ—反应时间τmin，以1min计；
N—稀释倍数。
实施例2：
一种简易高效蛋白酶活性检测方法，其步骤如下：
1)吸取适量稀释的酶溶液2.00mL、缓冲溶液4.00ml于试管中，静置，并将3.00mL酪素溶液放入40℃恒温水浴中，预热10min；
其中，待测酶溶液的制备方法为：称取酶粉1.5g，精确至0.0001g，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，再用四层纱布过滤后备用；
缓冲溶液的制备方法为：
a、中性缓冲溶液(适用于中性蛋白酶)pH＝7.5，
称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水溶解并定容至1000mL后利用PH计测定并校正；
b、酸性缓溶液(适用于酸性蛋白酶)pH＝2.0，
甲液：称取乳酸(60％-85％)12.0g，加水溶解并定容至1000ml，
乙液：称取乳酸钠(50％-70％)18.0g，加水溶解并定容至1000ml，
配制：取甲液10ml，加乙液2ml，混匀，稀释一倍后形成成0.05mol/L酸性冲溶液，再利用PH计测定并校正；
c、碱性缓冲溶液(适用于碱性蛋白酶)pH＝10.0，
甲液：称取硼酸钠(硼砂)10.0g，加水溶解并定容至500ml，
乙液：称取氢氧化钠2.0g，加水溶解并定容至500ml，
制备：取甲液500ml、乙液400ml混匀，用水稀释至1000ml后利用PH计测定并校正；
酪素溶液的制备方法为：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.2-0.8mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约100ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度后放入冰箱中冷藏备用；
三氯乙酸的制备方法为：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml，配制成0.4mol/L三氯乙酸溶液；
2)再将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，摇匀后避光放置；
3)接着将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，升温至35℃-42℃，水浴加热10min-20min，并以秒表精确计时；
4)然后将反应溶液加入6.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min-10min，离心过滤5min-10min后去除未溶解的沉淀物；
5)随后提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定；
6)最后利用X＝A×K×α/β×1/τ×N计算酶溶液中的酶活性，结果用整数表示，
式中：X—样品的酶活性，u/g(u/ml)；
A—试样溶液的平均吸光度；
K—吸光常数；
α—反应试剂的总体积αml；
β—吸取酶溶液βml，以1ml计；
1/τ—反应时间τmin，以1min计；
N—稀释倍数。
实施例3
一种简易高效蛋白酶活性检测方法，其步骤如下：
1)吸取适量稀释的酶溶液3.00mL、缓冲溶液6.00ml于试管中，静置，并将4.00mL酪素溶液放入45℃恒温水浴中，预热15min；
其中，待测酶溶液的制备方法为：称取酶粉2g，精确至0.0001g，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，再用四层纱布过滤后备用；
缓冲溶液的制备方法为：
a、中性缓冲溶液(适用于中性蛋白酶)pH＝7.5，
称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水溶解并定容至1000mL后利用PH计测定并校正；
b、酸性缓溶液(适用于酸性蛋白酶)pH＝2.0，
甲液：称取乳酸(60％-85％)12.0g，加水溶解并定容至1000ml，
乙液：称取乳酸钠(50％-70％)18.0g，加水溶解并定容至1000ml，
配制：取甲液10ml，加乙液2ml，混匀，稀释一倍后形成成0.05mol/L酸性冲溶液，再利用PH计测定并校正；
c、碱性缓冲溶液(适用于碱性蛋白酶)pH＝10.0，
甲液：称取硼酸钠(硼砂)10.0g，加水溶解并定容至500ml，
乙液：称取氢氧化钠2.0g，加水溶解并定容至500ml，
制备：取甲液500ml、乙液400ml混匀，用水稀释至1000ml后利用PH计测定并校正；
酪素溶液的制备方法为：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.2-0.8mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约100ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度后放入冰箱中冷藏备用；
三氯乙酸的制备方法为：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml，配制成0.4mol/L三氯乙酸溶液；
2)再将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，摇匀后避光放置；
3)接着将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，升温至35℃-42℃，水浴加热10min-20min，并以秒表精确计时；
4)然后将反应溶液加入8.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min-10min，离心过滤5min-10min后去除未溶解的沉淀物；
5)随后提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定；
6)最后利用X＝A×K×α/β×1/τ×N计算酶溶液中的酶活性，结果用整数表示，
式中：X—样品的酶活性，u/g(u/ml)；
A—试样溶液的平均吸光度；
K—吸光常数；
α—反应试剂的总体积αml；
β—吸取酶溶液βml，以1ml计；
1/τ—反应时间τmin，以1min计；
N—稀释倍数。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤如下：
1)吸取适量稀释的酶溶液1.00-3.00mL、缓冲溶液2.00-6.00ml于试管中，静置，并将2.00-4.00mL酪素溶液放入37℃-45℃恒温水浴中，预热5min-15min；
2)将预热后的酪素溶液加入存有缓冲溶液的试管中，摇匀后避光放置；
3)将稀释后的酶溶液加入含有酪素溶液的缓冲溶液试管中，升温至35℃-42℃，水浴加热10min-20min，并以秒表精确计时；
4)向反应溶液加入4.00ml-8.00ml的三氯乙酸溶液中，摇匀后继续加热5min-10min，离心过滤5min-10min后去除未溶解的沉淀物；
5)提取反应后溶液的上清液至10mm比色皿中，用紫外分光光度计，在275nm波长下，对比色皿中溶液进行吸光度测定；
6)计算酶溶液中的酶活性，结果用整数表示。
2.根据权利要求1所述的简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述待测酶溶液的制备方法为：称取酶粉1～2g，精确至0.0001g，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，再用四层纱布过滤后备用。
3.根据权利要求1所述的简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤1)，所述缓冲溶液的制备方法为：
a、中性缓冲溶液(适用于中性蛋白酶)pH＝7.5，
称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水溶解并定容至1000mL后利用PH计测定并校正；
b、酸性缓溶液(适用于酸性蛋白酶)pH＝2.0，
甲液：称取乳酸(60％～85％)12.0g，加水溶解并定容至1000ml，
乙液：称取乳酸钠(50％～70％)18.0g，加水溶解并定容至1000ml，
配制：取甲液10ml，加乙液2ml，混匀，稀释一倍后形成成0.05mol/L酸性冲溶液，再利用PH计测定并校正；
c、碱性缓冲溶液(适用于碱性蛋白酶)pH＝10.0，
甲液：称取硼酸钠(硼砂)10.0g，加水溶解并定容至500ml，
乙液：称取氢氧化钠2.0g，加水溶解并定容至500ml，
制备：取甲液500ml、乙液400ml混匀，用水稀释至1000ml后利用PH计测定并校正。
4.根据权利要求1所述的简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤1)中所述酪素溶液的制备方法为：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.2～0.8mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约100ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度后放入冰箱中冷藏备用。
5.根据权利要求1所述的简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述三氯乙酸的制备方法为：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml，配制成0.4mol/L三氯乙酸溶液。
6.根据权利要求1所述的简易高效蛋白酶活性检测方法，其特征在于，步骤6)中，酶活性的计算公式为X＝A×K×α/β×1/τ×N，
式中：X—样品的酶活性，u/g(u/ml)；
A—试样溶液的平均吸光度；
K—吸光常数；
α—反应试剂的总体积ml；
β—吸取酶溶液ml，以1ml计；
1/τ—反应时间min，以1min计；
N—稀释倍数。
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| CN201711456738.9A CN108169217A (zh) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | 一种简易高效蛋白酶活性检测方法 |
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| CN201711456738.9A CN108169217A (zh) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | 一种简易高效蛋白酶活性检测方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109557036A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-02 | 山东农业大学 | 一种内肽酶活力测定的新方法 |
| CN110305934A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-10-08 | 天津科技大学 | 一种简单便捷测定蛋白酶活力的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590167A (zh) * | 2012-02-15 | 2012-07-18 | 江南大学 | 一种测定酵母蛋白酶a活性的方法 |
| CN102809541A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-12-05 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种胶原蛋白酶酶活的测定方法 |
| CN104988210A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 绍兴文理学院 | 一种黄酒米曲的蛋白酶活力测定方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN102809541A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-12-05 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种胶原蛋白酶酶活的测定方法 |
| CN104988210A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 绍兴文理学院 | 一种黄酒米曲的蛋白酶活力测定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIANG ZHI-LIANG ET AL.: "Catalytic Resonance Scattering Spectral Assay of Papain Activity", 《JOURNAL OF GUANGXI NORMAL UNIVERSITY: NATURAL SCIENCE EDITION》 * |
| 冯健雯: "紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力", 《理化检验-化学分册》 * |
| 欧英杰 等: "紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究", 《中国食品添加剂》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109557036A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-02 | 山东农业大学 | 一种内肽酶活力测定的新方法 |
| CN110305934A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-10-08 | 天津科技大学 | 一种简单便捷测定蛋白酶活力的方法 |
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