CN101392280A

CN101392280A - 一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法

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Publication number: CN101392280A
Application number: CNA2007101521504A
Authority: CN
Inventors: 庄汉忠
Original assignee: Individual
Current assignee: Weihai Hanbang Biological Environmental Protection Polytron Technologies Inc
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2007-09-18
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2027-09-18
Also published as: CN101392280B

Abstract

本发明属于环保类水处理技术领域，具体涉及一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法。该方法根据产品不同分子量的要求，制备不同的底物浓度的蔗糖溶液，然后加入1％的氯化钙溶液，并用30％醋酸缓冲溶液调节pH在5.2～5.4；调节加入的酶量并调节pH至上述范围；同时，对温度、搅拌速度和反应时间等反应条件进行控制；通过测定动力粘度，决定终点以停止反应，然后采用乙醇或甲醇或异丙醇沉淀，或用超滤膜系统进行分离纯化，使不同分子量产品的各项技术指标完全达到国际市场关于新型多糖生物絮凝剂的质量标准。本发明可以合成可控分子量，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝剂产品，可用于大规模工业化生产。

Description

一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法

技术领域

本发明属于环保类水处理技术领域，具体涉及一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法。

背景技术

水处理是一个关系到人们生产和生活的重要环保问题。絮凝剂是水处理中最为常用和有效的制剂。遗憾的是，目前国内外所使用的絮凝剂绝大多数都是无机或有机合成的化合物，其中不少都具有一定的毒副作用。因此，研发无毒无害，没有二次污染的生物絮凝剂是当今水处理领域中最受重视的课题之一。

有关生物絮凝剂，包括多糖生物絮凝剂的研究相当活跃，并取得某些进展。但总体看来还处在初级阶段。许多生物合成过程中，仍沿袭传统细菌发酵方法。这种方法无法合成可控制分子量的产品，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝剂，而这种产品恰恰是某些重要水处理领域，包括贵重金属选矿回收处理中所需要的。

发明内容

本发明的目的在于针对目前水处理中所使用絮凝剂的缺陷，提供一种先进的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，以便在控制条件下，工业上大规模合成各种不同分子量，尤其是超高分子量的多糖生物絮凝剂，满足目前市场对这类产品的迫切需求。

本发明的技术方案如下：一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，包括如下步骤：

(1)根据水处理中对多糖生物絮凝剂动力粘度的要求，配制具体浓度的蔗糖溶液；

(2)在蔗糖溶液中加入氯化钙溶液，氯化钙溶液作为酶的激活剂；

(3)用30％醋酸缓冲溶液调节上述溶液的pH值在5.2～5.4范围；

(4)向上述溶液中加入适量的葡聚糖蔗糖酶溶液，混匀后，用10％醋酸调节pH值在5.2～5.4范围；

(5)将上述溶液置于恒温水浴中，调节搅拌，充分反应直至溶液达到所要求的动力粘度；

(6)对反应产物进行加热灭菌，过滤除杂，纯化浓缩后即得最终产品。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(1)中共配制四种不同浓度的蔗糖溶液，分别为第一种0.80mol/L、第二种0.73mol/L、第三种0.58mol/L、第四种0.44mol/L。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(2)中每100ml蔗糖溶液加入1毫升0.5％的氯化钙溶液。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，步骤(3)调节完pH值后，将溶液高压消毒或煮沸15分钟后，冷却备用。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(4)中，根据四种不同浓度的蔗糖溶液，加入的葡聚糖蔗糖酶溶液依次分别为每100ml蔗糖溶液加入800、1000、1200和1400国际单位(IU)的酶液。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，步骤(5)中四种不同浓度的溶液分别置于的水浴温度依次为20～22℃、22～24℃、24～26℃、24～26℃。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，步骤(5)中四种不同浓度的溶液的动力粘度依次为第一种3000～5000CPS，第二种5000～15000CPS，第三种30000～45000CPS，第四种60000～80000CPS。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(6)中加热灭菌时，温度控制在80～90℃并持续搅拌1小时，然后降温至40℃以下。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(6)中纯化浓缩的方法为沉淀法，将过滤后的滤液用1倍体积95％以上浓度的甲醇或乙醇或异丙醇进行沉淀，沉淀后静置1小时以上，然后吸去上清液；再将沉淀溶解于蒸馏水中，使产物浓度不低于10％，再用等体积甲醇或乙醇或异丙醇进行第二次沉淀；如此重复，直至样品的还原糖含量低于1％，则将沉淀用蒸馏水或纯水溶解，加热除去有机溶剂，并真空浓缩至15％浓度。

如上所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其中，在步骤(6)中纯化浓缩的方法为超滤膜循环过滤法，物料的浓度为1％～2％，循环过滤直至样品的还原糖含量低于1％，然后将沉淀用蒸馏水或纯水溶解，加热除去有机溶剂，并真空浓缩至15％浓度。

本发明的有益效果如下：(1)本发明采用酶学合成方法制备多糖生物絮凝剂，可以合成可控分子量，尤其是超高分子量的产品；(2)该方法可用于大规模工业化生产，可实现高产、稳产和优质的目标；(3)通过本发明所制备的产品无毒、无害，而且具有极其良好的絮凝效果，质量优异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

葡聚糖蔗糖酶的制备，包括产酶菌的选育、培养、酶的生产、分离与纯化，过程比较复杂和专业化。详细过程可参考中国专利“一种含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆及其制备方法”(ZL 03100280.3)。

不同分子量的多糖生物絮凝剂可通过改变底物浓度、酶浓度和反应条件予以制备。现根据国际几个最大水处理公司提出的特殊要求，25℃时的动力粘度依次为：

A、高分子量：3000～5000CPS (15％浓度)

B、较高分子量：5000～15000CPS (15％浓度)

C、超高分子量：30000～45000CPS (15％浓度)

D、极高分子量：60000～80000CPS (10％浓度)

其制备方法如下：

(1)基质液的配制

①分别配制四种不同浓度的蔗糖溶液

A.0.80mol/L蔗糖溶液：称取蔗糖274克，用500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升。

B.0.73mol/L蔗糖溶液：称取蔗糖250克，用500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升。

C.0.58mol/L蔗糖溶液：称取蔗糖198.5克，用500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升。

D.0.44mol/L蔗糖溶液：称取蔗糖150.6克，用500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升。

②于上述四种蔗糖浓度溶液中，按每100ml容积加入1毫升0.5％氯化钙溶液，氯化钙溶液作为酶的激活剂。

③用新鲜配制的30％醋酸缓冲溶液调节pH在5.2～5.4范围。

④有条件时，将上述溶液高压消毒或煮沸15分钟后，冷却备用。

(2)反应液的制备

于上述四种基质液中，按每100ml容积依次加入800、1000、1200和1400国际单位(IU)酶液，仔细混匀后，再用10％醋酸调节pH在5.2～5.4范围。

1个国际单位(IU)葡聚糖蔗糖酶活性被定义为：在一定条件下(例如：30℃底物蔗糖浓度15％)，在1小时内能将1毫克蔗糖转化为葡萄糖的量。

(3)合成过程和反应条件的控制

①将上述四种反应液置不同温度的恒温水浴中：

A.20～22℃；B.22～24℃；C.24～26℃；D.24～26℃；

②适当调节搅拌速度和时间

A.搅拌速度30～40转/分，每搅拌1小时，停2小时；

B.搅拌速度40～50转/分，每搅拌1小时，停半小时；

C.搅拌速度50～80转/分，每搅拌2小时，停半小时；

D.搅拌速度80～100转/分，连续搅拌，可适当短暂停止，必要时可适当通入过滤空气。

③反应时间与终点判断

在上述控制条件下，一般反应所需时间依次为：

A.约20～24小时；B.约25～28小时；C.约28～30小时；D.约32～35小时。

具体终止反应时间应根据粘度高低来加以判断，其标准如下：

A：3000～5000CPS (25℃15％)

B：5000～15000CPS (25℃15％)

C：30,000～45,000CPS (25℃15％)

D：60,000～80,000CPS (25℃10％)

(4)反应产物的处理

①加热灭菌，以终止反应。方法是将反应物加热至80～90℃并持续搅拌1小时，然后降温至40℃以下。

②过滤除杂，工业上可用板框压滤机，实验室可用小型加压过滤器。以除去酶蛋白及其他杂质。必要时可加活性炭以除去色素及其他低分子物质。

(5)反应物的纯化与浓缩

有两种方法：其一是沉淀法，将过滤后的滤液用1倍体积95％以上浓度的甲醇、乙醇或异丙醇进行沉淀，沉淀后应静置1小时以上，然后吸去上清液，进行回收再生。再将沉淀溶解于蒸馏水中，使产物浓度不低于10％，再用等体积甲醇、乙醇或异丙醇进行第二次沉淀。然后取少量样品进行化学分析，若还原糖含量低于1％，则可将沉淀用蒸馏水或纯水溶解，加热除去有机溶剂，并真空浓缩至15％浓度。如测定还原糖过高则须进行第三次沉淀洗涤，以确保产品的纯度。

第二种纯化方法是采用超滤膜循环过滤，应选择适当的膜孔，一般以10万分子量为宜，物料浓度不宜过高，一般采用1％～2％。循环过滤的周期取决于物料中还原糖含量。只有当还原糖达标(低于1％)时方可停止。然后再进行浓缩(方法同上)。

(6)产品的技术指标

本发明产品的技术指标如表1所示

表1 多糖生物絮凝剂的技术指标

实施例1

取洁净的2000毫升烧杯或三口烧瓶1只，加入优质蔗糖274克，然后加入适量蒸馏水，搅拌使溶，并将体积调至1000毫升，进一步加入10毫升0.5％氯化钙溶液，搅拌混匀；再用30％醋酸缓冲液调节pH至5.2～5.4。将上述溶液煮沸15分钟后，冷却至25℃。

加入新鲜制备的酶液(本批酶活性为456IU/ml)800IU(即17.5毫升)搅拌混匀，再用10％醋酸调pH至5.2～5.4范围。

将上述反应物置20～22℃恒温水浴中，开启搅拌器，调节搅拌速度至30～40转/分，并开始记时，以后按每搅拌1小时，停止2小时的方式进行操作，期间温度应维持恒定，并保持操作环境洁净，避免杂菌污染。

当反应进行到18小时后，应每隔1小时，抽样测定反应物的粘度，当粘度达到3000～5000CPS即可终止反应。

将反应物加热升温至80～90℃ 1小时，然后将温度降至40℃左右，用小型纸板加压滤器过滤。滤液用95％酒精沉淀三次，每次酒精用量1100毫升。将第三次沉淀溶于蒸馏水，使体积约800毫升，测定其中还原糖含量(低于1％)，然后加热除去残留酒精并浓缩至15％浓度。

本例终点产品，体积为770毫升，实际浓度为15.2％，得率为85.4％。质量分析表明：产品外观为无色透明液体，灰分0.58％，固含物15.2％，pH5.8，动力粘度4500CPS。

实施例2

取洁净10升玻璃或不锈钢容器，加入优质蔗糖1.25公斤，加入蒸馏水3升，搅拌溶解后，再加入蒸馏水使溶液体积为5升，搅拌混匀，再加入0.5％氯化钙溶液50毫升，搅拌混匀，然后用30％醋酸缓冲液调pH至5.2～5.4，加热煮沸15分钟后，冷却至室温。

将上述溶液置22～24℃恒温水浴中，搅拌约半小时，待溶液内温恒定在上述范围时，加入酶液(活性同实施例1)50,000IU(即109.6毫升)，搅拌混匀，并用10％醋酸调pH至5.2～5.4范围，继续搅拌，并将转速调至40～60转/分，每搅拌1小时后，可停半小时，直至粘度达到5,000～15,000时即可加热终止反应。反应物的分离、纯化和浓缩过程与实施例1相同。

本例终点产物体积为3400毫升，浓度为14.8％，得率为80.5％，质量分析表明：产品外观为无色透明液体，固含物14.8％，灰分0.77％，pH6.0，动力粘度11250CPS。

实施例3

将250升带夹层的不锈钢反应罐清洗干净，并用高压蒸气消毒15分钟后。加二级反渗透纯水50升，在搅拌条件下，加入20公斤优质蔗糖，待完全溶解后，再加纯水至体积达100升。再加入5％氯化钙溶液100毫升，搅拌混匀后，再用30％醋酸缓冲液调pH至5.2～5.4。然后开启温控系统，使夹层温度在24～26℃范围，继续搅拌半小时，待溶液温度达到平衡状态时，加入酶液(本批酶活性480IU/ml)12×10⁵IU(即2500毫升)，搅拌混匀，并调节转速在50～80转/分范围。每搅拌2小时，停半小时，维持温度在24～26℃，持续反应至25小时后，开始测定产物的粘度，以后每隔1小时测定一次至粘度达到30,000～45,000时，即可加热至80～90℃1小时，以终止反应，然后通过框压滤机或袋式滤机过滤，除去杂质。再用100升95％乙醇或甲醇沉淀，静置1小时后，吸去上层酒精至回收塔，下层沉淀加适量纯水使溶并将体积调至100升左右，再加100升95％乙醇或甲醇进行第二次沉淀。必要时可进行第三次沉淀(方法同上)。当还原糖测定合格时，即可将沉淀溶解后，转入真空浓缩罐浓缩至14％～16％范围。本例所得产品容积为54升，浓度为15.3％，得率为82.6％，质量分析表明：产品外观为无色透明粘胶液，固含物15.3％，灰分0.93％，pH5.7，动力粘度40100CPS。

实施例4

3000升闭式搪玻璃双层反应罐，清洗干净，并用高压蒸气消毒15分钟，再用纯水漂洗一次，然后关闭出口阀门，加入纯水500升，在搅拌条件下加入优质蔗糖150公斤，搅拌使溶，再加纯水至总体积1000升。混匀后再加入5％氯化钙溶液1000毫升，搅拌混匀，再用30％醋酸缓冲液调pH至5.2～5.4，并持续低速搅拌。然后开启蒸气，升温至溶液沸腾15分钟后降温至25℃。

待反应罐内溶液温度稳定后，按14IU/ml加入酶液。本例反应液应加酶14×10⁶IU(相当于29.2升活性为480IU/ml酶液)。

加完酶液后加盖，并维持操作环境洁净，调节并维持温度在24～26℃范围，持续搅拌，开始时转速不必太快，随着反应物粘度增加，转速应适当加快(60～80转/分)，至粘度太高，转动困难时可通入过滤空气，以加快反应速度。一般在反应28小时后，应每隔1小时测定反应物粘度一次，直至粘度达到60,000以上时，即可加热终止反应。

然后用板框压滤机或袋式过滤机过滤除杂，再用有机溶剂沉淀或超滤方法进行纯化，方法已如前述。

本例终点产物：容积600升，浓度10.5％，得率84％，质量分析：产品外观为无色粘胶状液体，固含物10.5％，灰分0.88％，pH6.2，动力粘度65,000CPS(25℃ 10％)。

Claims

1.一种制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，包括如下步骤：

(2)在蔗糖溶液中加入氯化钙溶液；

(3)用30％醋酸缓冲溶液调节上述溶液的pH值在5.2～5.4范围；

2.如权利要求1所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(1)中共配制四种不同浓度的蔗糖溶液，分别为第一种0.80mol/L、第二种0.73mol/L、第三种0.58mol/L、第四种0.44mol/L。

3.如权利要求1所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(2)中每100ml蔗糖溶液加入1毫升0.5％的氯化钙溶液。

4.如权利要求1所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：步骤(3)调节完pH值后，将溶液高压消毒或煮沸15分钟后，冷却备用。

5.如权利要求2所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(4)中，根据四种不同浓度的蔗糖溶液，加入的葡聚糖蔗糖酶溶液依次分别为每100ml蔗糖溶液加入800、1000、1200和1400国际单位的酶液。

6.如权利要求2或5所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：步骤(5)中四种不同浓度的溶液分别置于的水浴温度依次为20～22℃、22～24℃、24～26℃、24～26℃。

7.如权利要求6所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：步骤(5)中四种不同浓度的溶液的动力粘度依次为第一种3000～5000 CPS，第二种5000～15000 CPS，第三种30000～45000CPS，第四种60000～80000 CPS。

8.如权利要求1所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(6)中加热灭菌时，温度控制在80～90℃并持续搅拌1小时，然后降温至40℃以下。

9.如权利要求1或8所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(6)中纯化浓缩的方法为沉淀法，将过滤后的滤液用1倍体积95％以上浓度的甲醇或乙醇或异丙醇进行沉淀，沉淀后静置1小时以上，然后吸去上清液；再将沉淀溶解于蒸馏水中，使产物浓度不低于10％，再用等体积甲醇或乙醇或异丙醇进行第二次沉淀；如此重复，直至样品的还原糖含量低于1％，则将沉淀用蒸馏水或纯水溶解，加热除去有机溶剂，并真空浓缩至15％浓度。

10.如权利要求1或8所述的制备多糖生物絮凝剂的酶学方法，其特征在于：在步骤(6)中纯化浓缩的方法为超滤膜循环过滤法，物料的浓度为1％～2％，循环过滤直至样品的还原糖含量低于1％，然后将沉淀用蒸馏水或纯水溶解，加热除去有机溶剂，并真空浓缩至15％浓度。