CN109929884A - 一种酮戊二酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种酮戊二酸的制备方法。所提供的方法可以分为三步骤来看，第一步骤为菌种的发酵制备，第二步骤为转化，第三步骤为提取，与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于，本发明提供一种酮戊二酸的制备方法，利用酶催化法，有效的解决了现有化学法和发酵法所存在的技术问题，同时，本发明选择性高、能耗低、副产物少、环境友好且转化率高，适合大规模推广使用。

Description

一种酮戊二酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种酮戊二酸的制备方法。

背景技术

酮戊二酸外观为白色或类白色结晶粉末。是有机药物的中间体，特别是合成氨基酸及肽类的重要原料，酮戊二酸及其系列产品主要是用在食品、医药、保健品等行业。在食品行业，酮戊二酸及其系列产品主要作为运动营养饮料的主要成分；在保健品行业，作为膳食补充品出售；在医药行业，酮戊二酸及其系列产品可以降低术后患者和长期病人的机体损耗、减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症、促进患者手术后快速恢复、在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体，同时与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用；在化妆品行业，酮戊二酸及其系列产品因为具有能有治疗黄褐斑、清除自由基和延缓衰老等作用，因此，酮戊二酸的研究开发及推广应用是促进此类新型氨基酸药物发展的关键因素之一，具有重大意义，促进我国新型氨基酸药物的发展正是本项目的目的之所在。

目前国内酮戊二酸主流工业化生产技术依旧是化学合成，该种方法由于环境污染严重、杂质较多，因而制约了酮戊二酸和瓜氨酸在食品、医药、保健品、化妆品等领域的应用；同时，尽管发酵法生产酮戊二酸和瓜氨酸的相关研究较多，但由于其发酵周期长，且产生丙酮酸、乳酸等难分离产物，难以投入大规模工业化生产；酶催化法因其选择性高、能耗低、副产物少、环境友好成为酮戊二酸和瓜氨酸的主要生产工艺。

发明内容

本发明针对上述的酮戊二酸的工业化方法所存在的技术问题，提出一种方法简单、效果显著且环境友好、无污染的酮戊二酸的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明提供一种酮戊二酸的制备方法，包括以下有效步骤：

a、对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶，离心分离得到酮戊二酸菌体酶；

b、将分离得到的酮戊二酸菌体酶加入到转化罐中，同时，加入过氧化氢酶，35℃保温，400rpm，0.5vvm，罐压0.05Mpa；

c、将一水谷氨酸钠用自来水溶解后用蠕动泵流加入转化罐，流加速度为1.5升/小时，期间用1％盐酸控pH在6.5左右；

d、待转化结束后，将得到的转化液经过陶滤膜，超滤1000，超滤2500三套膜过滤，将其中的菌体及其他不溶性杂质去除；

e、将转化液过滤完成后，将得到的料液放入到钙化釜中，调节搅拌转速至200-250r/min，缓慢加入氢氧化钙固体，调节pH至3.4-3.6，当看到大量晶体析出时开始计时析晶1.5h，之后继续调节pH，用氢氧化钙调节pH至3.9-4.1，pH稳定后继续析晶2h，继续加入氢氧化钙，调节pH为5.4-5.6，当pH稳定后继续搅拌析晶1.5h，钙化后过滤，收集滤饼；

f、将得到的滤饼称重后，加入两倍湿滤饼量的水，开启搅拌，转速200-250r/min，将其分散开，分散均匀后，快速倒入配制好的15％硫酸，搅拌使其充分反应，调节pH至1.3-1.4，待PH稳定后保持此PH搅拌反应1h，将酸化液过滤，收集滤液，一倍滤饼量的去离子水分两次洗涤滤饼，第一次的合并至滤液，第二次的用作下一次酸化过滤的一次洗涤水，滤渣收集集中处理；

g、酸化后滤液加入0.3％液体量的活性炭，室温下持续搅拌2-3h进行脱色；

h、测量脱色后滤液pH、浓度、质量，过阳离子树脂柱，检测浓液出柱pH、浓度、质量，进阴柱；

i、测量过阳柱后滤液pH、浓度、质量，过阴离子树脂柱，检测滤液出柱pH、浓度、质量，进浓缩；

j、过柱后的料液进浓缩系统，加热50℃，极限真空，浓缩至波美度为20-21时停止，后梯度式降温进行结晶操作，温度降至20以下时进行离心操作；

k、将离心所得湿品装托盘进烘箱50度烘干，即可得到酮戊二酸。

作为优选，所述a步骤中，对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶，包括以下步骤：

a1、菌种活化:LB琼脂培养基在40℃左右加入25ug/ml卡那霉素，倒平板，冷却后平板划线，37℃培养过夜；

a2、一级种瓶:挑取活化好的单菌落至50mL/250mL的TB培养基中，加入25ug/ml卡那霉素，37℃，220rpm培养过夜；

a3、二级种瓶:在600ml/3000ml的TB培养基中加入25ug/ml卡那霉素，将长好的一级种瓶一对一接入，37℃，20rpm培养3.5-4h，OD大约3-4；

a4、发酵:培养基为高密度培养基，消前pH自然，121℃保温30min，冷却后37℃保温，接种前用氨水调pH至7.0，发酵过程用氨水调pH在7.0左右，接种量为5％，通气量为0.5vvm，整个发酵过程通过转速调节控制溶氧在20％以上；

a5、补料:当溶氧回升时开始补料，补料速率大约为15-20mL/h/升发酵液；

a6、诱导:当0D600达到15-20左右时加入IPTG诱导剂，浓度为0.2mM/L.诱导后降温至25℃培养；

a7、放罐:0D600达到60以上可以放罐。放罐料液放4℃冰柜保存；

a8、离心:带冷冻离心机400rpm离心30分钟，收集菌体，得到酮戊二酸菌体酶。

作为优选，所述b步骤中，酮戊二酸菌体酶的添加量为整个步骤中总质量的2％。

作为优选，所述c步骤中，一水谷氨酸钠的添加量为整个步骤中总质量的10％。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于，

1、本发明提供一种酮戊二酸的制备方法，利用酶催化法，有效的解决了现有化学法和发酵法所存在的技术问题，同时，本发明选择性高、能耗低、副产物少、环境友好且转化率高，适合大规模推广使用。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1，本实施例提供一种酮戊二酸的制备方法

本实施例所提供的方法可以分为三步骤来看，第一步骤为菌种的发酵制备，第二步骤为转化，第三步骤为提取。

第一步发酵：

菌种活化，菌种为采购浙江绿创生物科技有限公司所提供的酮戊二酸基因工程菌，LB琼脂培养基在40℃左右加入25ug/ml.卡那霉素，倒平板。冷却后平板划线(用单菌落或20％甘油管)，37℃培养过夜。

一级种瓶:挑取活化好的单菌落至50mL/250mL.的TB培养基中，加入25ug/ml卡那霉素，37℃，220rpm培养过夜。

二级种瓶:在600ml/3000ml的TB培养基中加入25ug/ml卡那霉素，将长好的一级种瓶一对一接入，37℃，20rpm培养3.5-4h，OD大约3-4。

发酵:培养基为高密度培养基，消前pH自然，121℃保温30min，冷却后37℃保温。接种前用氨水调pH至7.0，发酵过程用氨水调pH在7.0左右。接种量为5％，通气量为0.5vvm，整个发酵过程通过转速调节控制溶氧在20％以上。

补料:当溶氧回升时开始补料(时间大约在4-5小时)，补料速率大约为15-20mL/h/升发酵液。

诱导:当0D600达到15-20左右时加入IPTG诱导剂(时间大约在5-6小时)，浓度为0.2mM/L.诱导后降温至25℃培养。

放罐:0D600达到60以上可以放罐(大约18-20小时)。放罐料液放4℃冰柜保存。

离心:带冷冻离心机400rpm离心30分钟，收集菌体。

第二步转化(转化体系为8升为例)：

称取150克固定化菌体或冰冻的未固定化的菌体(大约为转化体系2％)，40mL40万单位的过氧化氢酶，自来水定容至5升(pH大约为6.4左右)，35℃保温，400rpm，0.5vvm，罐压0.05Mpa。

称取800克一水谷氨酸钠(大约为转化体系10％)，用3升自来水溶解，用蠕动泵流加入转化体系，流加速度为1.5升/小时。期间用1％盐酸控pH在6.5左右。每小时取样检测酮戊二酸，大约3小时左右结束转化，上述的目的主要是为了提高转化率，经过检测，转化率达到98％以上。

第三步提取：

陶滤超滤：转化液经过陶滤膜，超滤1000，超滤2500三套膜，将其中的菌体及其他不溶性杂质去除，提高产品的纯度。

钙化：料液进行钙化，调节搅拌转速至200-250r/min，缓慢加入氢氧化钙固体，调节pH至3.4-3.6，当看到大量晶体析出时开始计时析晶1.5h，之后继续调节pH，用氢氧化钙调节pH至3.9-4.1，pH稳定后继续析晶2h，继续加入氢氧化钙，调节pH为5.4-5.6(不可超过5.8)，当pH稳定后继续搅拌析晶1.5h，钙化后过滤，收集滤饼。

酸化：将钙盐称重后，加入两倍湿钙盐量的水，开启搅拌，转速200-250r/min，将其分散开，分散均匀后，快速倒入配制好的15％硫酸(一倍湿钙盐量的80％)，搅拌使其充分反应，调节pH至1.3-1.4，待PH稳定后保持此PH搅拌反应1h，将酸化液过滤，收集滤液，一倍滤饼量的去离子水(或上次顶洗水)分两次洗涤滤饼，第一次的合并至滤液，第二次的用作下一次酸化过滤的一次洗涤水，滤渣收集集中处理；

脱色：酸化后滤液加入0.3％液体量的活性炭，室温下持续搅拌2-3h(视脱色效果定量、定时)；

过柱：1)测量脱色后滤液pH、浓度、质量，过阳(XRD008)离子树脂柱，检测浓液出柱pH、浓度、质量，进阴柱；2)测量过阳柱后溶液pH、浓度、质量，过阴(XR651)离子树脂柱，检测浓液出柱pH、浓度、质量，进浓缩；

浓缩结晶：过柱后的料液进浓缩系统，加热50℃，极限真空，浓缩至波美度为20-21(50℃下)时停止，后梯度式降温进行结晶操作，温度降至20以下时进行离心操作。

烘干：所得湿品装托盘进烘箱50度烘干，检测，封存。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1.一种酮戊二酸的制备方法，其特征在于，包括以下有效步骤：

a、对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶，离心分离得到酮戊二酸菌体酶；

b、将分离得到的酮戊二酸菌体酶加入到转化罐中，同时，加入过氧化氢酶，35℃保温，400rpm，0.5vvm，罐压0.05Mpa；

c、将一水谷氨酸钠用自来水溶解后用蠕动泵流加入转化罐，流加速度为1.5升/小时，期间用1％盐酸控pH在6.5左右；

d、待转化结束后，将得到的转化液经过陶滤膜，超滤1000，超滤2500三套膜过滤，将其中的菌体及其他不溶性杂质去除；

e、将转化液过滤完成后，将得到的料液放入到钙化釜中，调节搅拌转速至200-250r/min，缓慢加入氢氧化钙固体，调节pH至3.4-3.6，当看到大量晶体析出时开始计时析晶1.5h，之后继续调节pH，用氢氧化钙调节pH至3.9-4.1，pH稳定后继续析晶2h，继续加入氢氧化钙，调节pH为5.4-5.6，当pH稳定后继续搅拌析晶1.5h，钙化后过滤，收集滤饼；

f、将得到的滤饼称重后，加入两倍湿滤饼量的水，开启搅拌，转速200-250r/min，将其分散开，分散均匀后，快速倒入配制好的15％硫酸，搅拌使其充分反应，调节pH至1.3-1.4，待PH稳定后保持此PH搅拌反应1h，将酸化液过滤，收集滤液，一倍滤饼量的去离子水分两次洗涤滤饼，第一次的合并至滤液，第二次的用作下一次酸化过滤的一次洗涤水，滤渣收集集中处理；

g、酸化后滤液加入0.3％液体量的活性炭，室温下持续搅拌2-3h进行脱色；

h、测量脱色后滤液pH、浓度、质量，过阳离子树脂柱，检测浓液出柱pH、浓度、质量，进阴柱；

i、测量过阳柱后滤液pH、浓度、质量，过阴离子树脂柱，检测滤液出柱pH、浓度、质量，进浓缩；

j、过柱后的料液进浓缩系统，加热50℃，极限真空，浓缩至波美度为20-21时停止，后梯度式降温进行结晶操作，温度降至20以下时进行离心操作；

k、将离心所得湿品装托盘进烘箱50度烘干，即可得到酮戊二酸。

2.根据权利要求1所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述a步骤中，对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶包括以下步骤：

a1、菌种活化:LB琼脂培养基在40℃左右加入25ug/ml卡那霉素，倒平板，冷却后平板划线，37℃培养过夜；

a2、一级种瓶:挑取活化好的单菌落至50mL/250mL的TB培养基中，加入25ug/ml卡那霉素，37℃，220rpm培养过夜；

a3、二级种瓶:在600ml/3000ml的TB培养基中加入25ug/ml卡那霉素，将长好的一级种瓶一对一接入，37℃，20rpm培养3.5-4h，OD大约3-4；

a4、发酵:培养基为高密度培养基，消前pH自然，121℃保温30min，冷却后37℃保温，接种前用氨水调pH至7.0，发酵过程用氨水调pH在7.0左右，接种量为5％，通气量为0.5vvm，整个发酵过程通过转速调节控制溶氧在20％以上；

a5、补料:当溶氧回升时开始补料，补料速率大约为15-20mL/h/升发酵液；

a6、诱导:当0D600达到15-20左右时加入IPTG诱导剂，浓度为0.2mM/L.诱导后降温至25℃培养；

a7、放罐:0D600达到60以上可以放罐。放罐料液放4℃冰柜保存；

a8、离心:带冷冻离心机400rpm离心30分钟，收集菌体，得到酮戊二酸菌体酶。

3.根据权利要求2所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述b步骤中，酮戊二酸菌体酶的添加量为整个步骤中总质量的2％。

4.根据权利要求3所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述c步骤中，一水谷氨酸钠的添加量为整个步骤中总质量的10％。