CN109557036A - 一种内肽酶活力测定的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种内肽酶活力测定的新方法；是以牛血清白蛋白为底物，根据内肽酶特征产物肽的显色反应，测定反应前后反应体系吸光度值，同时用能反应体系中肽含量多少的标准物绘制标准曲线，通过查标准曲线确定反应前后产物肽含量的变化，从而对内肽酶准确定量。本发明克服了常规内肽酶活力测定过程中蛋白质以及氨基酸的干扰，能快速准确测定内肽酶活力,操作简单，快速。

Description

一种内肽酶活力测定的新方法

技术领域

本发明涉及一种内肽酶活力测定的新方法，目的在于准确测定内肽酶活性大小，以提高相关食品加工原料及加工过程、食品用酶等的内肽酶监控准确度，属于食品加工技术领域。

背景技术

内肽酶是蛋白酶的一种，主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键使蛋白质长链分解成短肽片段。在许多食品加工原料及食品加工过程中，内肽酶活力的大小直接影响到底物蛋白、产物蛋白的含量及组成比例。比如啤酒酿造原料—麦芽，内肽酶活力的大小关系到成品麦芽库尔巴哈值的大小以及高中低分子的蛋白质含量，进而影响到啤酒泡沫性质以及啤酒的稳定性。内肽酶是很多发酵食品的重要监测指标，但是目前所采用的内肽酶活性测定的方法都不够精确。目前常用的内切酶活力测定方法从原理上分为两种：一种是以牛血红蛋白为底物，适当条件下酶和底物反应，三氯乙酸沉淀蛋白终止反应，在280nm下测定吸光度值，空白管为酶反应前加三氯乙酸终止反应，用反应组和对照组的吸光度值差表示酶活力。在280nm下部分氨基酸以及核酸等生物大分子也存在吸收峰，这种方法测得的是内肽酶和外肽酶的综合酶活力；另一种是内肽酶与蛋白底物反应，沉淀蛋白后，让体系中产物氨基酸与茚三酮反应，测定吸光度值的变化，来表示内肽酶活力，这种方法实际上主要测定的是外肽酶的活力。目前以上两种内肽酶活力测定方法都不能准确反映内肽酶的活力。

发明内容

为了克服现有内肽酶活力测定方法的不足，本发明提供了一种内肽酶活力测定的新方法；本发明通过测定反应体系中内肽酶产物肽含量的增加量来测定内肽酶活力，能准确反映内肽酶活力，而且本发明操作简单，快速。

本发明的原理是：

双缩脲和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，该紫色络合物在540nm下有最大吸收，这种反应叫双缩脲反应。内肽酶反应产物中的寡肽和多肽分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与肽含量成正比，可用分光光度计(540nm)来测其吸光度。以双缩脲为标准品，建立双缩脲浓度与540nm下吸光度之间的关系方程，用三氯乙酸沉淀反应体系中的蛋白质，剩余内肽酶反应产物肽，按照标准曲线的方法测定反应体系的吸光度值，将反应体系吸光度值代入标准方程，获得反应体系吸光度值对应的双缩脲的浓度。酶活力单位定义为，固体样品：每克绝干原料每min产生1微克双缩脲为一个酶活力单位；液体样品：每毫升样品溶液每min产生1微克双缩脲为一个酶活力单位。

一种内肽酶活力测定的新方法，步骤如下：

1、标准曲线的绘制

以缩二脲浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝ax+b(r²≥0.99)，变形得方程-1：x＝(y-b)/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点。

2、粗酶液提取

对于固体样品，先粉碎过80目筛；参照食品安全国家标准GB5009.3-2016食品中水分的测定，计算固体样品粉末的水分含量，记为w(单位％)；取粉碎后的待测固体样品适量，记为m(单位g)，加入样品质量4倍的pH5.2、浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，用pH5.2，浓度为0.1mol/L柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液定容至V(单位mL，根据原料酶活力大小来调整定容体积，酶活力大可以适当增大定容体积，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1)4℃条件下过滤收集上清液作为待测粗酶液。

对于液体样品可直接取样V₀mL置于冰浴中，缓慢加入95％乙醇溶液，使体系中乙醇的终浓度为60％(v/v)，静置沉淀后，抽滤，得湿酶粉。于4℃冰箱保存。测定酶活时，用柠檬酸―磷酸氢二钠缓冲液(0.05mol/L、pH6.0)复溶并定容至V，即得到待测粗酶液(单位：mL；根据原料酶活力大小来调整定容体积，酶活力大可以适当增大定容体积，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1)。

3、实验组的测定

实验组至少做3个平行处理。每个平行处理分别取待测粗酶液适量(≤2mL)记为v(单位mL)，用浓度为0.2mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液至2mL。50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL进行反应，加入牛血清白蛋白溶液后在50℃水浴中的反应时间记为h(单位：min(反应时间h可根据原料酶活力大小来调整，酶活力大可以适当缩短反应时间，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1)；加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液终止反应；4℃静置30min，5000r/min离心10min收集全部上清液；向上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值；三个平行吸光度值分别记为y1，y2，y3。y1，y2，y3分别代入方程-1计算实验组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x1，x2，x3。计算平均值

4、对照组的测定

对照组至少做3个平行处理。对照组3个平行处理分别取待测粗酶液v(与实验组中待测粗酶液体积相等)，用浓度为0.2mol/L，pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液体积至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL后立即加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，在50℃水浴中的反应时间记为h(单位：min，与实验组反应时间一致)。5000r/min离心10min收集全部上清液，上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值，三个平行吸光度值分别记为y₀₁，y₀₂，y₀₃。将对照组的三个吸光度值分别代入方程-1计算对照组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x₀₁，x₀₂，x₀₃，计算平均值

5、酶活力计算

固体样品内肽酶活力按照如下公式3计算。

液体样品内肽酶活力按照如下公式4计算。

公式(3)、(4)中：

U：内肽酶活力单位，单位：u

实验组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

对照组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

7：单位：mL；是指试验组和对照组反应体系的体积7mL(即2mL待测粗酶液+1mL牛血清白蛋白+4mL碱性硫酸铜溶液)；

h：酶与底物反应时间，单位：min

m：固体待测样品的取样量，单位：g

V：粗酶液提取中定容的体积，单位：mL

v：反应组和对照组试管中加入粗酶液体积，单位：mL

w：样品水分含量，单位：％

V₀：液体样品取样的毫升数，单位：mL

本发明的有益效果是：

由于蛋白酶的底物、产物包括蛋白酶本身都属于蛋白质，在蛋白酶活力测定尤其是内肽酶活力的测定过程中，往往不能很好的排除蛋白质以及氨基酸的干扰。本发明利用内肽酶的产物是二肽以上的寡肽以及多肽这一性质，利用内肽酶产物肽含有与双缩脲相同的肽键结构的特性，采用双缩脲法准确测定内切酶反应体系中肽的含量，并用双缩脲的浓度来间接表示产物肽的浓度，准确地检测内肽酶活力的大小，成功排除了氨基酸的干扰，利用三氯乙酸可以沉淀蛋白的性质通过对照实验排除了底物蛋白等的干扰，从而更加准确的测定出内肽酶的活性。另外本发明操作简单快速。本发明对食品加工业及蛋白酶制剂业等提供了重要参考。

具体实施方式

本发明中：

4g/L缩二脲溶液的配制方法：称取0.8163g缩二脲(源叶生物公司，纯度为98％)溶于去离子水中，搅拌至溶解并定容至200mL。

所述浓度为0.1mol/L、pH5.2柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液组分：称取4.2028g柠檬酸溶解并定容至200mL配制柠檬酸溶液；另称取7.1612g磷酸氢二钠溶解并定容至200mL配制磷酸氢二钠溶液；将磷酸氢二钠溶液缓慢加入107.2mL柠檬酸溶液中，直至pH为5.2停止，磷酸氢二钠所用体积约为92.8mL。

所述浓度为0.2mol/L、pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液组分：GB/T603-2002(参考化学试剂试验方法中所用制剂及制品)进行配制。

所述浓度为10g/L牛血清白蛋白溶液组分：称取1g牛血清白蛋白溶于浓度为0.2mol/L、pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液中，并定容至100mL。

所述浓度为15％三氯乙酸组分：精确称取15g三氯乙酸固体，溶于去离子水中，并定容至100mL。

所述碱性硫酸铜溶液组分：参照GB/T2441.2-2010(尿素测定方法)进行配制。

本发明中所用缓冲液均可根据现有技术或相关标准得到或配制。

实施例1

测定小麦芽中内肽酶活力。具体步骤如下：

1、标准曲线的绘制

取6只试管，分别编号(1-6号)，其中1号管不加缩二脲试剂，为调零管；另5只试管中分别加入不同毫升数的浓度为4g/L双缩脲试剂，使1-6号管中双缩脲的浓度成梯度增加，直至6号管中双缩脲浓度≤4mg/mL；用蒸馏水补至相同的体积；每只试管中加入碱性硫酸铜试剂5mL，用漩涡混合器充分混匀，室温下放置30min；将1-6号试管于540nm波长下比色，分别记录试管2，3，…6的吸光度(OD)值。以每只试管的缩二脲浓度mg/mL为横坐标x，每只试管吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝ax+b(r²≥0.99)，变形得方程-1：x＝(y-b)/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点(a值和b值在用软件生成标准曲线时会自动生成)。

如：按照表1中的添加量，依次将4g/L的缩二脲溶液、水、碱性硫酸铜溶液加入带编号的6只试管中，用漩涡混合器充分混匀，室温下放置30min，试管1作为调零管，于540nm波长下比色，记录试管2，3，…6的吸光度(OD)值，并填入表1。以表1中缩二脲浓度mg/mL为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝0.0642x+0.0046(R²＝0.9924)，变形得方程-1：x＝(y-0.0046)/0.0642。

表1标准曲线各试剂添加量以及数据记录表

2、粗酶液提取

取市售小麦芽100g，粉碎过80目筛。精确称取10g小麦芽粉，置于烧杯中，缓慢加入40mL pH5.2柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，将烧杯中的溶液转移到体积为50mL的容量瓶中，用pH5.2柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液多次冲洗烧杯杯壁并将冲洗液倒入容量瓶中，定容至50mL。4℃条件下用普通滤纸过滤收集上清液作为粗酶提取液。

3、实验组的测定

取三支试管，每只试管分别加入1mL粗酶液和1mL pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在50℃水浴下保温10min后，分别加入1mL牛血清白蛋白溶液并计时，在50℃水浴条件下反应4h，立即加入0.8mL 15％三氯乙酸溶液终止反应。取出试管，在4℃下静置30min，5000r/min离心10min取上清液，添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值。三个平行吸光度值分别记为y1，y2，y3。y1，y2，y3分别代入方程-1中计算实验组反应体系中与每个吸光度值对应的缩二脲的浓度x1，x2，x3。计算平均值结果见表2。

表2实验组数据

4、对照组的测定

取三只试管，每只试管分别加入1mL粗酶液和pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液1mL。50℃水浴预热10min，分别加入1mL牛血清白蛋白溶液后立即加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，50℃水浴准确反应时间4h。取出试管，5000r/min离心10min收集全部上清液，添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值。三个平行吸光度值分别记为y₀₁，y₀₂，y₀₃。三次平行值分别代入方程-1计算对照组反应体系中与每个吸光度值对应的缩二脲的浓度x₀₁，x₀₂，x₀₃，计算平均值结果见表3。

表3对照组数据

5、水分含量的测定

参照GB5009.3-2016食品中水分的测定方法，测定步骤2中小麦芽粉的水分含量，做三个平行，测定结果如表4所示，计算样品的水分含量。

表4样品水分含量

6、酶活力计算

整理实验数据，根据样品内肽酶活力计算公式3，计算小麦芽中内肽酶酶活力大小，数据及结果如表5所示，经计算小麦芽中内肽酶活力为387.32u。

表5小麦芽内肽酶活力大小计算数据

实施例2

测定小麦叶片中内肽酶活力。具体步骤如下：

1、标准曲线的绘制

标准曲线的绘制方法及标准曲线参考实施例1。

2、粗酶液提取

精确称取20g小麦叶片，置于烧杯中，缓慢加入60mL pH5.2柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，在4℃条件下磁力搅拌30min，将烧杯中的溶液转移到100mL容量瓶中，用pH5.2柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液多次冲洗杯壁，并定容至100mL。4℃条件下用普通滤纸过滤收集上清液作为粗酶提取液。

3、实验组的测定

取三支试管，每支试管中分别加入1mL粗酶液和1mL pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在50℃水浴下保温10min后，分别加入1mL牛血清白蛋白溶液，50℃水浴精确反应2h，立即加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，50℃水浴准确反应5h。取出试管5000r/min离心10min取上清液，添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值。三个平行吸光度值分别记为y₁，y₂，y₃。y₁，y₂，y₃分别代入方程-1计算实验组反应体系中与每个吸光度值对应的缩二脲的浓度x₁，x₂，x₃。计算平均值结果见表6。

表6实验组数据

4、对照组的测定

取三只试管，分别加入1mL粗酶液和1mL pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。50℃水浴预热10min，加入牛血清白蛋白溶液1mL后立即加入0.8mL 15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，50℃水浴准确反应时间2h。取出试管，在4℃条件下静置30min，5000r/min离心10min收集全部上清液，添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值。三个平行吸光度值分别记为y₀₁，y₀₂，y₀₃。三次平行值分别代入方程-1计算对照组反应体系中吸光度值相当于的缩二脲的浓度x₀₁，x₀₂，x₀₃，计算平均值结果见表7。

表7对照组数据

5、水分含量的测定

参照GB5009.3-2016食品中水分的测定，测定步骤2中小麦叶片的水分含量，做三个平行，测定结果如表8所示。测得小麦叶片水分含量为24.97％。

表8样品水分含量

6、酶活力计算

整理实验数据，根据样品内肽酶活力计算公式3，计算小麦叶片中内肽酶酶活力大小，数据及结果如表9所示，经计算小麦芽中内肽酶活力为353.75u。

表9小麦叶片内肽酶活力大小计算数据

Claims (4)

1.一种内肽酶活力测定的新方法，其特征在于，步骤如下：

1)标准曲线的绘制

以缩二脲浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝ax+b(r²≥0.99)，变形得方程-1：x＝(y-b)/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点；

2)粗酶液提取

对于固体样品，先粉碎过80目筛；测定固体样品粉末的水分含量，记为w；取粉碎后的待测固体样品适量，记为m，加入样品质量4倍的pH5.2、浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，用pH5.2，浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液定容至V；4℃条件下过滤收集上清液作为待测粗酶液；

对于液体样品直接取样，记为V₀，置于冰浴中，缓慢加入95％乙醇溶液，使体系中乙醇的终浓度为60％v/v，静置沉淀后，抽滤，得湿酶粉；于4℃冰箱保存；测定酶活时，用浓度为0.05mol/L、pH6.0的柠檬酸―磷酸氢二钠缓冲液复溶并定容至V，即得到待测粗酶液；

3)实验组的测定

实验组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液，记为v，用浓度为0.2mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL进行反应，加入牛血清白蛋白溶液后在50℃水浴中的反应时间记为h；加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液终止反应；4℃静置30min，5000r/min离心10min收集全部上清液；向上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值；三个平行吸光度值分别记为y1，y2，y3；y1，y2，y3分别代入方程-1计算实验组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x1，x2，x3；计算平均值

4)对照组的测定

对照组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液v，用浓度为0.2mol/L，pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液体积至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL后立即加入0.8mL浓度为15％三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，在50℃水浴中的反应时间记为h；5000r/min离心10min收集全部上清液，上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值，三个平行吸光度值分别记为y₀₁，y₀₂，y₀₃；将对照组的三个吸光度值分别代入方程-1计算对照组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x₀₁，x₀₂，x₀₃，计算平均值

5)酶活力计算

固体样品内肽酶活力按照如下公式3计算；

液体样品内肽酶活力按照如下公式4计算；

公式3)、4)中：

U：内肽酶活力单位，单位：u

实验组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

对照组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

7：单位：mL

h：酶与底物反应时间，单位：min

m：固体待测样品的取样量，单位：g

V：粗酶液提取中定容的体积，单位：mL

v：反应组和对照组试管中加入粗酶液体积，单位：mL

w：样品水分含量，单位：％

V₀：液体样品取样的毫升数，单位：mL。

2.如权利要求1所述一种内肽酶活力测定的新方法，其特征在于，所述步骤2)中，根据原料酶活力大小调整定容体积V，酶活力大适当增大定容体积，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1。

3.如权利要求1所述一种内肽酶活力测定的新方法，其特征在于，所述步骤3)中，根据原料酶活力大小调整反应时间h，酶活力大适当缩短反应时间，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1。

4.如权利要求1所述一种内肽酶活力测定的新方法，其特征在于，所述步骤3)中待测粗酶液体积v≤2mL。