CN1948462A - 一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用 Download PDF

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CN1948462A CN 200610113740 CN200610113740A CN1948462A CN 1948462 A CN1948462 A CN 1948462A CN 200610113740 CN200610113740 CN 200610113740 CN 200610113740 A CN200610113740 A CN 200610113740A CN 1948462 A CN1948462 A CN 1948462A
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Abstract

本发明公开了一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用。该啤酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的PEP4基因破坏，并导入酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶基因，得到的不产生蛋白酶A且谷胱甘肽产量比所述酿酒酵母高的菌株。所述啤酒酵母工程菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT－5 CGMCC №.1787。本发明的啤酒酵母工程菌与普通的啤酒酵母菌(受体菌)相比，泡沫稳定性升高，谷胱甘肽含量增加，而其生理、生化特性无明显差异。

Description

一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种啤酒酵母工程菌及其制备方法与应用。
背景技术
纯生啤酒在贮存过程中，其泡沫稳定性逐渐下降，主要是由于纯生啤酒中残留的酵母蛋白酶A对啤酒泡沫蛋白的降解作用所致；另外，同普通啤酒一样，啤酒包装后在运输和储存过程中由于氧化作用产生的一些反式二烯醛类等化合物，使得啤酒中产生一些令人不愉快的不新鲜味，即老化味。啤酒泡沫稳定性及风味稳定性均为衡量啤酒质量的重要指标，近年来虽然通过改善工艺条件及选用先进设备等可以在一定程度上提高啤酒的泡沫稳定性和减少啤酒氧化的可能性，但是要从根本上解决纯生啤酒泡沫及氧化问题还是需要利用分子生物学育种技术构建蛋白酶A缺失，高谷胱甘肽含量的啤酒酵母工业菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种啤酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
本发明所提供的啤酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的PEP4基因破坏，并导入酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶基因，得到的不产生蛋白酶A且谷胱甘肽产量比所述酿酒酵母高的菌株。
所述酿酒酵母可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597(购自中国微生物菌种保藏管理委员会)；所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列至少含有自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
所述啤酒酵母工程菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5CGMCC №.1787。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5，已于2006年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.1787。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃。生长最适pH为5.5。
本发明第二个目的是提供一种构建上述啤酒酵母工程菌的方法。
本发明所提供的构建上述啤酒酵母工程菌的方法，是将下述重组片段导入酿酒酵母，得到的不产生蛋白酶A且谷胱甘肽产量比所述酿酒酵母高的菌株即为啤酒酵母工程菌：所述重组片段包括谷胱甘肽合成酶基因(GSH1)、选自PEP4基因的5′端序列的长度至少为45bp的核苷酸片段1、选自PEP4基因的3′端序列的长度至少为45bp的核苷酸片段2；
所述谷胱甘肽合成酶基因(GSH1)位于所述核苷酸片段1和核苷酸片段2之间；
所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列至少含有自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
所述PEP4基因的5′端序列是自GenBank Accession Number为M13358 M13632的5′端第1-300位脱氧核苷酸，所述PEP4基因的3′端序列是自GenBank AccessionNumber为M13358M13632的5′端第1987-2146位脱氧核苷酸。
所述方法中，所述核苷酸片段1位于所述谷胱甘肽合成酶基因的3′端，所述核苷酸片段2位于所述谷胱甘肽合成酶基因的5′端；
所述谷胱甘肽合成酶基因的编码序列是自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
所述方法中，所述核苷酸片段1优选为GenBank Accession Number为M13358M13632的5′端第46-247bp位脱氧核苷酸序列；所述核苷酸片段2优选为GenBankAccession Number为M13358M13632的5′端第1987-2105bp位脱氧核苷酸序列。
所述方法中，所述重组片段还包括铜抗性基因CUP1；所述铜抗性基因CUP1位于所述谷胱甘肽合成酶基因与所述核苷酸片段1之间；
所述铜抗性基因CUP1的编码序列为自GenBank Accession Number为K02204M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸。
所述重组片段中，所述铜抗性基因CUP1的5′端位于所述核苷酸片段1的3′端，所述铜抗性基因CUP1的3′端位于所述谷胱甘肽合成酶基因的3′端，谷胱甘肽合成酶基因的5′端位于所述核苷酸片段2的5′端。
所述重组片段是用AatII和PstI酶切如图6所示的pPCG1获得的7.0kb的片段。
本发明的啤酒酵母工程菌，是将普通的啤酒酵母菌中的PEP4基因破坏，而同时将铜抗性基因和谷胱甘肽合成酶基因都增加了一个拷贝得到的。通过遗传稳定性实验、模拟啤酒发酵实验及小试实验发酵实验证明，本发明的啤酒酵母工程菌与普通的啤酒酵母菌(受体菌)相比，泡沫稳定性升高，谷胱甘肽含量增加，而其生理、生化特性无明显差异；工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般纯生啤酒厂的设备和条件均可使用。
附图说明
图1为PEP4的PCR产物电泳图
图2为重组质粒pYPEP的物理图谱
图3为重组质粒pYPEP的酶切验证电泳图
图4为重组质粒pPEP-1的构建流程示意图
图5为重组质粒pPEP-1的酶切验证电泳图
图6为重组质粒pPCG1的构建流程示意图
图7为重组质粒pPCG1的酶切验证电泳图
图8为酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787的构建示意图
图9为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的铜抗性检测结果
图10为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的PCR分子鉴定结果
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、蛋白酶A缺失高谷胱甘肽含量的工业啤酒酵母工程菌的获得及其应用实验
由于使用来源于非工业微生物的基因构建的工程菌是否适于饮用，能否被消费者接受还需要很长时间的实践证明，而啤酒酵母本身就含有谷胱甘肽合成酶基因，所以采用基因自克隆的方式将谷胱甘肽合成酶基因(自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸)插入到酵母蛋白酶A基因PEP4(自GenBank Accession Number为M13358 M13632的5′端第247-1987位脱氧核苷酸)中，这样就构建了PEP4基因被破坏而谷胱甘肽合成酶基因增加了一个拷贝的工程菌。该工程菌因蛋白酶A缺失使得纯生啤酒泡沫稳定性提高，谷胱甘肽含量的增加会使得啤酒保鲜时间延长。
一、蛋白酶A缺失高谷胱甘肽含量的工业啤酒酵母工程菌的获得
1、铜抗性低的工业用啤酒酵母菌的筛选
工业用啤酒酵母菌对铜的抗性普遍偏低，因此，可以依据铜抗性的提高有效筛选酵母转化子，铜抗性被普遍用作工业用啤酒酵母的选择标记。通过铜抗性测定，筛选到三株酵母在含有3.0mmol/L CuSO4的YEPD平板上几乎不能生长，确定用其中的一株AS2.597(购自中国微生物菌种保藏管理委员会)作为下一步转化实验的受体菌。
2、重组表达质粒载体pPCG1的构建及酶切验证
1)含有PEP4基因的重组质粒pYPEP的构建及酶切验证
A、编码酵母蛋白酶A的PEP4基因的获得
根据已报道的啤酒酵母的PEP4基因序列，设计相应引物，分别引入BamHI和SalI酶切位点(下划线所示)，进行PEP4基因的PCR扩增。引物序列为：
上游引物F1：5′GCA GGATCCCGTTTTGATACGATTTAC 3′( BanH I)
下游引物R1：5′CAG GTCGACTGGGCAGCAGCATAGAAC 3′( Sal I)
用工业啤酒酵母菌株AS2.597的总DNA作为模板，进行PCR扩增，在50μl PCR反应体系中含25μl Taq酶Mix，10μmol/L引物F1和R1各2μL，模板10μl，加无菌水11μl调整至50μl。反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃变性40s，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸15min使产物延伸完全。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约2.0kb的特异性条带，其大小与预期相当(图1)，经测序表明该片段具有PEP4基因的编码序列(GenBankAccession Number为M13358 M13632自5′端第46-2105位脱氧核苷酸序列)，其中图1中泳道1为Marker，泳道2为PEP4的PCR产物。
B、重组载体pYPEP的构建及酶切验证
回收步骤1)获得的PCR产物，经BamHI和SalI双酶切后，插入载体YIp5(GenBank号：L09157)的BamHI和SalI酶切位点之间，并对其分别用BamHI酶切，BamHI和SalI双酶切，EcoRI酶切，EcoRV酶切，HindIII酶切，SacI和XbaI双酶切，PstI酶切进行验证，结果表明BamHI酶切得到7331bp的条带(图3中泳道2)，BamHI和SalI双酶切得到2066和5265bp的条带(图3中泳道3)，EcoRI酶切得到982和6349bp的条带(图3中泳道4)，EcoRV酶切得到1649、1800和3882bp的条带(图3中泳道5)，HindIII酶切得到1440和5891bp的条带(图3中泳道6)，SacI和XbaI双酶切得到1455和5591bp的条带(图3中泳道7)，PstI酶切得到3151和4180bp的条带(图3中泳道8)，将酶切鉴定表明正确的含有PEP4基因的编码序列(GenBank Accession Number为M13358M13632自5′端第46-2105位脱氧核苷酸序列)的重组载体命名为pYPEP(图2)，其中图3中泳道1为分子量标准。
2)重组克隆质粒载体pPEP-1的构建及酶切验证
重组克隆质粒载体pPEP-1的构建如图4所示，其中，pICG是将YEP352质粒(GenBank号：L14758)中BamHI与SalI位点之间的12bp的片段替换为依次串连的下述片段所得：乙酰乳酸合成酶基因ILV2的5′端序列(自GenBank AccessionNumber为X02549的5′端第442-707位脱氧核苷酸)、CUP1基因(自GenBankAccession Number为K02204 M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸)、GSH1基因(自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸)、ILV2的3′端序列(自GenBank Accession Number为X02549的5′端2876-3371位脱氧核苷酸)；其中，YEP352质粒BamHI位点端与乙酰乳酸合成酶基因ILV2的5′端序列的5′端连接，乙酰乳酸合成酶基因ILV2的5′端序列的3′端与CUP1基因的5′端连接，CUP1基因的3′端与GSH1基因的3′端连接，GSH1基因的5′端与ILV2的3′端序列的5′端连接，ILV2的3′端序列的3′端与YEP352质粒SalI位点端连接。
用SacI和XbaI酶切质粒pICG，得到含部分ILV2序列(5′端长度为265bp的序列，即自GenBank Accession Number为X02549的5′端第442-707位脱氧核苷酸)及部分铜抗性基因CUP1(5′端长度为208bp的序列，即自GenBank Accession Number为K02204M64045的5′端第1098-1305位脱氧核苷酸)的DNA片段，将其命名为ILV+CUP，其长度为473bp，将该片段插入到pYPEP的PEP4基因的SacI和XbaI酶切位点之间，使ILV+CUP片段的两端分别与PEP4的5′端序列(自GENBANK AccessionNumber为M13358 M13632的5′端第46-247位脱氧核苷酸序列)和3′端序列(自GENBANK Accession Number为M13358 M13632的5′端第1987-2105位脱氧核苷酸序列)连接，得到重组载体，对其用EcoRV酶切，BglII酶切，BamHI+SalI双酶切，PstI酶切鉴定重组质粒，结果如图5所示，结果表明，EcoRV酶切得到797、1393和3882bp的产物(泳道1)，BglII酶切得到6072bp的产物(泳道2)，BamHI+SalI双酶切得到807和5265bp的产物(泳道3)，PstI酶切得到2921bp和3151bp的产物(泳道4)，图5中泳道5为分子量标准，将鉴定表明正确的重组载体命名为pPEP--1(构建流程示意图如图4所示)。
3)重组表达质粒载体pPCG1的构建及酶切验证(构建过程示意图如图6所示)
重组表达质粒载体pPCG1的构建所用质粒pYCUP的构建过程为：将5′端添加BglII及3′端添加SalI识别位点的铜抗性基因CUP1片段(自GenBank AccessionNumber为K02204 M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸序列)与经HincII酶切的pBluescript II SK(-)质粒(购自Stratagene公司)相连得到pMCUP质粒，其中CUP1中BglII位点在pBluescript M13上的KpnI一端，CUP1中SalI位点在pBluescript II SK(-)的HincII一端；然后用KpnI和SalI酶切pMCUP质粒得到的CUP1片段与KpnI和SalI双酶切的YEP352质粒连接构建成pYCUP质粒。
重组表达质粒载体pPCG1的构建所用质粒pGF-2的构建过程为：将5′端添加SacI及3′端添加SalI位点的谷胱甘肽合成酶基因GSH1片段(白GenBank AccessionNumber为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸序列)与经SmaI酶切的YEP352质粒连接，其中GSH1中SacI位点在YEP352质粒的SmaI一端，SalI位点在YEP352质粒的KpnI一端，构建成pGF-2质粒。
用BglII和SalI酶切质粒pYCUP，得到CUP1片段(自GenBank Accession Number为K02204 M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸序列)；
用SalI和XbaI酶切质粒pGF-2，得到4189bp的谷胱甘肽合成酶基因(GSH1)片段(自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸序列)；
用BglII和XbaI酶切质粒pPEP-1，得到5858pb的片段，将该片段与上述得到的铜抗性基因(CUP1)片段和谷胱甘肽合成酶基因(GSH1)片段连接，得到重组质粒pPCG1(图6)，将该重组质粒pPCG1用AatII，PstI，EcoRI，BglII，SalI分别酶切鉴定，结果如图7所示，AatII酶切重组质粒得到10991bp的片段(泳道1)，PstI酶切重组质粒得到3151和7840bp的片段(泳道2)，EcoRI酶切重组质粒得到2477、3310和5204bp的片段(泳道3)，BglII酶切重组质粒得到507、930和9554bp的片段(泳道4)，SalI酶切重组质粒得到4333和6658bp的片段(泳道5)，图7中泳道6为分子量标准。酶切鉴定表明该重组质粒pPCG1结构正确。
3、工业啤酒酵母菌工程菌-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC№.1787的获得(构建过程示意图如图8所示)
用AatII和PstI酶切重组质粒pPCG1得到一个7.0kb大小的DNA片段。此片段含有铜抗性基因(CUP1)和谷胱甘肽合成酶基因(GSH1)，两端为PEP4基因的5′端和3′端序列。将该DNA片段用醋酸锂完整细胞转化方法转化工业啤酒酵母菌AS2.597，使该片段和AS2.597基因组上的PEP4发生同源重组，结果，铜抗性基因和谷胱甘肽基因被整合到染色体上。这样，在重组酵母菌株中，PEP4基因被破坏，而同时铜抗性基因和谷胱甘肽合成酶基因都增加了一个拷贝。将得到的重组酵母菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5，该菌株已于2006年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.1787。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的细胞为椭圆形，在YEPD培养基上培养2天后，其菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃。生长最适pH为5.5。
二、工业啤酒酵母菌工程菌-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5CGMCC №.1787的验证
1、工程菌的分子验证
1)工程菌的稳定性检测
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787分别在有选择压力(YEPD+5mmol/L CuSO4)及无选择压力(YEPD)的液体培养基中连续传代培养5天，每天取样检测插入的DNA片段的丢失情况，具体方法为：
提取酵母染色体DNA，以其为模板，用PCR方法进行验证(同以下“3)PCR扩增验证”)。
结果表明，无论在有选择压力条件下，还是在无选择压力条件下，连续培养120h后，100％的工程菌细胞带有插入DNA片段，未发生丢失现象。
2)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的铜抗性检测
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787和受体菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597(购自中国微生物菌种保藏管理委员会)分别接种在含有3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L CuSO4的YEPD平板上，在30℃条件下培养3天后，观察结果，结果如图9所示，表明受体菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AS2.597在含有3mmol/L以上CuSO4的YEPD平板上不能生长，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787在3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L CuSO4的YEPD平板上均能生长；图9中，各培养皿左边数第一列五个菌落为受体菌AS2.597，其余7列为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC№.1787。
3)PCR扩增验证
分别以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787的基因组DNA和受体菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597的基因组DNA为模板，用表1中所述的引物的不同组合(PEP4-A和CUP1-B，GSH1-B和PEP4-D，PEP4-A和PEP4-D)进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图10所示，结果表明，受体菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597的基因组DNA用PEP4-A和CUP1-B引物组合扩增(图10中泳道5)及GSH1-B和PEP4-D引物组合扩增(图10中泳道6)均未扩增到片段，而用PEP4-A和PEP4-D引物组合(图10中泳道4)扩增到的PCR产物为2.0kb(PEP4基因(自GENBANK Accession Number为M13358M13632的5′端第46-2105位脱氧核苷酸)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5CGMCC№.1787的基因组DNA用PEP4-A和CUP1-B引物组合扩增(图10中泳道1)得到1.5kb的扩增产物(PEP4的5′端序列(自GENBANK Accession Number为M13358 M13632的5′端第46-247位脱氧核苷酸序列)，ILV2基因的5′端序列(自GenBank Accession Number为X02549的5′端第442-707位脱氧核苷酸)和CUP1基因(自GenBank Accession Number为K02204M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸))，用GSH1-B和PEP4-D引物组合扩增(图10中泳道2)得到4.3kb的扩增产物(GSH1基因(自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸)，PEP4基因3′端序列(自GENBANK Accession Number为M13358M13632的5′端第1987-2105位脱氧核苷酸序列))，用PEP4-A和PEP4-D引物组合(图10中泳道3)扩增到的PCR产物大小为5.7kb(PEP4的5′端序列(自GENBANKAccession Number为M13358M13632的5′端第46-247位脱氧核苷酸序列)，ILV2基因的5′端序列(自GenBank Accession Number为X02549的5′端第442-707位脱氧核苷酸)、CUP1基因(自GenBank Accession Number为K02204 M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸)，GSH1基因(自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸)，PEP4基因3′端序列(自GENBANK AccessionNumber为M13358 M13632的5′端第1987-2105位脱氧核苷酸序列))，该结果与预期大小一致，说明酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787为将受体菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597中的PEP4基因破坏，并且将CUP1及GSH1基因整合至PEP4基因所在位置得到的，可表达CUP1及GSH1基因而不表达PEP4基因。图10中泳道7为分子量标准。
       表1.PCR扩增验证引物
  引物   序列5’→3’
  CUP1-BGSH1-BPEP4-APEP4-D   ATCTGTTGTACTATCCGCTTTACA AGATCTAACAGGAGCACGTTTTGATACGATTTACTGGGCAGCAGCATAGAAC
2、酵母蛋白酶A活性及谷胱甘肽含量测定
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597和酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC№.1787分别经斜面活化后，首先分别接入10mlYEPD液体中，30℃摇床(200rpm)培养18小时后，按5％的接种量接至100mlYEPD液体中，在同样条件下培养72小时后，进行菌体和发酵液中酵母蛋白酶A活性测定及谷胱甘肽含量测定。
菌体中酵母蛋白酶A活性测定方法：
(1)酵母在YEPD培养基中培养后，离心收集菌体；
(2)用0.1M pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗一次，然后重新悬浮于十分之一体积(原培养基体积)的0.2M磷酸钾缓冲液，最终pH7.0；
(3)测定酶活时，用超声波细胞粉碎机将细胞破碎(5秒中一次，间隔一分钟，共20次)，5000rpm离心5分钟，上清液(酶液)备用。
(4)1％酪蛋白溶液(pH2.2)与步骤(3)获得的酶液于37℃保温20min，加10％三氯醋酸2ml终止反应10min后，15000g离心15min，上清液用Bradford法(0.1ml上清液与3ml蛋白试剂反应)(595nm)测定光密度值。空白对照为：反应液中的酶先用10％三氯醋酸灭活15min。
一个酵母蛋白酶A活性单位：在上述Bradford法中将0.1ml牛血清白蛋白(0.1mg/ml)与3ml蛋白试剂反应产生的光密度值(OD595)定义为一个酶活力单位。
发酵液中酵母蛋白酶A活性测定方法：
(1)发酵液100ml于4℃下50％硫酸铵饱和度盐析2h，20000g离心20min，沉淀用水溶解并定容到1ml即为蛋白酶A粗提液。
(2)测定方法同上述“(4)”
菌体中谷胱甘肽测定方法：
(1)取发酵液5ml，4000rpm离心5分钟，加5ml蒸馏水洗涤沉淀2次，加1ml蒸馏水，-20℃冰冻过夜；
(2)沸水浴中煮沸5分钟，加4ml蒸馏水，离心取上清液测定；菌体80℃干燥至恒重并称重。
(3)在比色管中依次加入下列溶液：1.5ml 0.15N NaOH；0.5ml待测液(0.5ml蒸馏水为空白对照)；0.5ml 3％甲醛；2.5ml DTNB显色剂，混匀，25℃水浴下反应5分钟，412nm比色；
(4)GSH(mg/g干细胞)＝OD412÷3.7236÷干细胞克数
发酵液中谷胱甘肽测定方法：
(1)在比色管中依次加入下列溶液：1.5ml 0.15N NaOH；1ml发酵液(1ml蒸馏水为空白对照)；0.5ml 3％甲醛；2.5ml DTNB显色剂，混匀，25℃水浴下反应5分钟，412nm比色；
(2)GSH(mg/100ml)＝OD412×100÷3.7236
蛋白酶A活性测定结果表明，在酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787中检测不到蛋白酶A活性(表2)，这就证明在酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787中PEP4基因已经被破坏。
谷胱甘肽含量测定结果表明(表2)，无论是菌体细胞中，还是发酵液中，酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787的谷胱甘肽含量都得到了提高。
表2.受体菌和酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787的蛋白酶A活性及谷胱甘肽含量比
                                 较
  菌株     酵母蛋白酶A活性(U/ml)                  GSH含量
  菌体   发酵液   菌体(mg/g干细胞)   发酵液(mg/100ml)
  受体菌AS2.597   29   18   7.74   1.91
  ZWYT-5   0   0   11.27   3.21
3、实验室发酵实验结果
将酿酒酵母AS2.597和酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787分别接入5ml麦芽汁培养基(糖度为10°P的麦芽汁)，25℃培养12小时，以10％(v/v)的接种量接种于10ml麦芽汁培养基，25℃培养36小时，全部接于含有200ml麦芽汁的三角瓶中，10℃静置培养15天，每隔三天取样(发酵液)按照步骤2的方法检测谷胱甘肽含量和蛋白酶A活性。
结果表明酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787中发酵液中没有蛋白酶A活性，而谷胱甘肽的含量比受体菌发酵液中的高(表3)，这说明在工程菌中GSH1基因得到了高表达而PEP4基因已成功敲除。
表3.受体菌和酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787的谷胱甘肽含量比较
  菌株                        发酵液中GSH含量(mg/100ml)
  第三天   第六天   第九天   第十二天   第十五天
  受体菌AS2.597   0.81   1.50   2.11   2.02   2.11
  ZWYT-5   1.10   1.81   2.61   2.82   2.91
4、小试(百升)发酵实验
1)啤酒发酵按下述方法进行：
将斜面和液体活化后的受体菌AS2.597或酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787分别按10％接种至70L麦芽汁(糖度为10°P)中，10℃发酵12天，封罐，16天时0℃冷贮，第20天时进行过滤和罐装。
2)谷胱甘肽含量和酵母蛋白酶A活性检测
啤酒发酵结束后，按照步骤2的方法检测发酵液中酵母蛋白酶A活性和发酵液中的谷胱甘肽含量，结果表明酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787发酵液中未检测到酵母蛋白酶A活性；酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787发酵的啤酒中谷胱甘肽含量是3.1mg/100ml，受体菌发酵的啤酒中谷胱甘肽含量是2.2mg/100ml，酿酒酵母ZWYT-5CGMCC №.1787发酵的啤酒中谷胱甘肽含量是受体菌发酵啤酒的1.4倍，说明在酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787细胞中蛋白酶A基因已被删除，并且GSH1基因得到了高表达。
3)发酵结束后其他指标的检测
百升实验在后贮期取样检测双乙酰含量及发酵度。
双乙酰含量测定方法如下所述：
(1)将双乙酰蒸馏器装好，加热蒸汽发生瓶，使水至沸，通汽预热后，置25ml容量瓶于冷凝器下口，外加冰浴冷却。
(2)加2～4滴消泡剂(有机硅消泡剂)于100ml量筒中，再注入未经除气的预先冷至5℃左右的酒液100ml，迅速加入步骤(1)中预热过的蒸馏器内，盖塞。
(3)然后用水封口，进行蒸馏，直至蒸馏液接近25ml时，取下容量瓶，用水定容至25ml刻度，摇匀。
(4)分别吸取蒸馏液10ml于两支比色管中，并于第一支管中加入0.5ml邻苯二胺溶液，第二支管中不加(作空白)充分摇匀后，同时置于暗处放置20～30min。
(5)然后于第一支比色管中加2ml盐酸溶液(4mol/L)，于第二支管中加入2.5ml盐酸溶液，混匀后，20min内于335nm测其吸光度。
(6)X＝A335×2.4，式中：X-双乙酰的含量(mg/L)；A335为在335nm波长下的吸光度；2.4为吸光度与双乙酰含量的换算系数。
发酵度测定方法：
取发酵液，滤去酵母，微火加热蒸发至原体积的1/3以除去乙醇。添加水恢复原体积后用比重瓶测定20℃时的比重，按下式计算真正发酵度。
w r ( % ) = w - w 1 w × 100
式中：w-发酵前麦汁浓度(°P)
w1-发酵后排除酒精后的发酵液浓度(°P)
wr-真正发酵度(％)
结果表明受体菌和工程菌的主要发酵指标基本相同(双乙酰含量均约0.03mg/L；发酵度均约65％)，说明染色体上的整合没有改变酵母的其他特性。
4)啤酒泡沫性能检测
将罐装后的啤酒置于20℃水浴恒温30min后，用Huffman泡沫测定仪(NIBEM法)测泡持时间。工程菌酿酒酵母ZWYT-5 CGMCC №.1787酿制啤酒的泡持时间为230s，比受体菌AS2.597酿制啤酒的泡持时间长20s，说明工程菌酿制啤酒的泡沫性能优于受体菌。

Claims (10)

1、一种啤酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的PEP4基因破坏，并导入酿酒酵母的谷胱甘肽合成酶基因，得到的不产生蛋白酶A且谷胱甘肽产量比所述酿酒酵母高的菌株。
2、根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.597；所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列至少含有自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
3、根据权利要求2所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述啤酒酵母工程菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZWYT-5 CGMCC №.1787。
4、一种构建权利要求1所述的啤酒酵母工程菌的方法，是将下述重组片段导入酿酒酵母，得到的不产生蛋白酶A且谷胱甘肽产量比所述酿酒酵母高的菌株即为啤酒酵母工程菌：所述重组片段包括谷胱甘肽合成酶基因、选自PEP4基因的5′端序列的长度至少为45bp的核苷酸片段1、选自PEP4基因的3′端序列的长度至少为45bp的核苷酸片段2；
所述谷胱甘肽合成酶基因位于所述核苷酸片段1和核苷酸片段2之间；
所述谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列至少含有自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
所述PEP4基因的5′端序列是自GenBank Accession Number为M13358 M13632的5′端第1-300位脱氧核苷酸，所述PEP4基因的3′端序列是自GenBank AccessionNumber为M13358 M13632的5′端第1987-2146位脱氧核苷酸。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述核苷酸片段1位于所述谷胱甘肽合成酶基因的3′端，所述核苷酸片段2位于所述谷胱甘肽合成酶基因的5′端；
所述谷胱甘肽合成酶基因的编码序列是自GenBank Accession Number为D90220的5′端第31-4220位脱氧核苷酸。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核苷酸片段1是GenBankAccession Number为M13358 M13632的5′端第46-247bp位脱氧核苷酸序列；所述核苷酸片段2是GenBank Accession Number为M13358 M13632的5′端第1987-2105bp位脱氧核苷酸序列。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组片段还包括铜抗性基因CUP1；所述铜抗性基因CUP1位于所述谷胱甘肽合成酶基因与所述核苷酸片段1之间；
所述铜抗性基因CUP1的编码序列为自GenBank Accession Number为K02204M64045的5′端第1098-2010位脱氧核苷酸。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组片段中，所述铜抗性基因CUP1的5′端位于所述核苷酸片段1的3′端，所述铜抗性基因CUP1的3′端位于所述谷胱甘肽合成酶基因的3′端，谷胱甘肽合成酶基因的5′端位于所述核苷酸片段2的5′端。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述重组片段是用AatII和PstI酶切如图6所示的pPCG1获得的7.0kb的片段。
10、权利要求1-3任一所述的啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。
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