CN113092426A - 一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法 - Google Patents

一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法 Download PDF

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张晓霞
刘瑞芳
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Abstract

本发明提供了一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，通过将待测样品中的蛋白酶通过激发酪蛋白间接的产生荧光的方式，进行蛋白酶指标的检测和结果的分析，既解决了常规检测反应现象不直观的问题，又提高了传统检测方法分析结果滞后的问题。与传统方法相比，本发明开发出了更便捷快速的检测方法，为多样性蛋白酶检测方法的开发提供途径，按照方法中能够激发酪蛋白的不同的蛋白酶标准品，可以根据产品中特异性蛋白酶的特性进行深入的分析，让分析方向更有针对性。

Description

一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法。
背景技术
UHT(超高温杀菌技术)产品是一款长货架期产品，其持续的稳定性是直接影响产品货架期的因素之一。为了保证产品的长保质期，传统方法采用对不同货架期产品进行定期开包形式的稳定性指标监控，以关注产品的稳定性，这种监控方式检验持续周期长，不利于问题的分析处理。
已引入的福林酚蛋白酶检测方法，则是通过间接的方式进行产品稳定性的监控，这种方法较传统监控有了较大的改进。但由于关键性试剂的纯度不能满足实验要求，导致要求的吸光常数K值不能满足规定(95％-105％)的范围，结果的准确性受到不可规避的影响。
即目前用于间接监控货架期产品的监测方法，由于以上原因，不能很好的辅助于常规货架期的监测。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，该方法能够提高检测的便捷性和精准度。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，包括以下步骤：
(1)将孵育缓冲液、FITC酪蛋白基质和待测样品混合后，得到第一混合液；
(2)对所述第一混合液进行离心处理，得到上清液和沉淀物；
(3)向所述上清液中加入TCA溶液后，得到第二混合液；
(4)将所述第二混合液与分析缓冲液混合后，得到第三混合液；
(5)将所述第三混合液置于荧光分光光度计中，记录在波长为485nm的激发光下的荧光强度，并监测波长为535nm的发射波强度；
(6)将所述发射波强度与标准曲线进行对照，得到待测样品中酪蛋白的浓度。
进一步地，步骤(1)中，选用20μl孵育缓冲液、20μl FITC酪蛋白基质和10μl待测样品。
进一步地，步骤(1)中，所述待测样品中含有浓度为0-2.5μg/ml的酪蛋白。
进一步地，步骤(1)中，所述孵育缓冲液中，含有浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠和浓度为150mmol/L的氯化钠；所述FITC酪蛋白基质为FITC-荧光素标记酪蛋白，是市售产品；
进一步地，步骤(2)中，所述离心处理的转速为10000r/min，时间为10min。
进一步地，步骤(3)中，所述TCA(三氯乙酸)溶液的加入量为150μl，TCA浓度为6.1N(N为当量浓度，含义为1升溶液中所含溶质的克当量数)。
进一步地，步骤(4)中，所述分析缓冲液中，含有浓度为500mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，用盐酸将pH值调至8.5。
进一步地，步骤(4)中，将2μl第二混合液与200μl分析缓冲液混合后移入黑色96孔板的孔中，得到第三混合液；或
将30μl第二混合液与3μl分析缓冲液混合后移入试管中，得到第三混合液；
进一步地，步骤(5)中，荧光分光光度计中装有485nm的滤光片，能够提供波长为485nm的激发光；并设定发射波波长为535nm，记录发射波强度。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，通过将待测样品中的蛋白酶通过激发酪蛋白间接的产生荧光的方式，进行蛋白酶指标的检测和结果的分析，既解决了常规检测反应现象不直观的问题，又提高了传统检测方法分析结果滞后的问题。
与传统方法相比，本发明开发出了更便捷快速的检测方法，为多样性蛋白酶检测方法的开发提供途径，按照方法中能够激发酪蛋白的不同的蛋白酶标准品，可以根据产品中特异性蛋白酶的特性进行深入的分析，让分析方向更有针对性。
附图说明
图1为酪蛋白的浓度对应检测荧光值的8档曲线图。
图2为酪蛋白的浓度对应检测荧光值的9档曲线图。
图3为酪蛋白的浓度对应检测荧光值的10档曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
传统蛋白酶检测方法具有以下问题：1、检测周期长：需要将产品放置不同的货架，定期进行开包检测产品的稳定性。必须进行不同时间段的放置后方可进行检测，检测过程繁琐，结果滞后。2、检验精度差：引入的福林酚蛋白酶检测方法，试剂的稳定性差，导致结果偏差大。检测的酶的针对性不清晰，检测过程用试剂纯度不可控。
因此，可采用以下思路对检测方法进行改善：1、提高检测的便捷性：使用快速试剂盒法进行检测，使检测的时效性提高。2、提升检测的精准度：一方面增加酶的可选择性，另一方面试剂的稳定性得到保障。
本发明提供了一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，该方法是基于福林酚检测方法的基础上，受现有试剂盒快速方法的启发下进行的新的探索和改进。改进的特点是：一方面利用荧光检测方法提高了检测的直观性，另一方面蛋白酶标准品的多样化选择，为方法的分析和使用提供了更广的途径，同时采用试剂盒的方法不仅提高了检测的精度，也提升了方法的检测效率，为产品稳定性分析提供了更可靠的检测依据和数据分析。
其中，配备的配套试剂盒将所有反应试剂均囊括进去，避免了在实验过程中因个别试剂来源不同产生的不稳定因素，影响最终结果的准确性问题。
该方法通过间接产生荧光的方式，判断能与酪蛋白发生反应的酶的活性，即利用特定的荧光素标记的酪蛋白为底物，通过特定蛋白酶的激活形成的具有荧光的碎片，用于检测蛋白酶活性的存在，直观的检测出蛋白酶的活性。该方法可以根据检测需要，配备不同的能与酪蛋白发生反应的蛋白酶，检测范围广，便于进行横向分析，使检测结果更有针对性。
对照例1
一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，包括以下步骤：
(1)将20μl孵育缓冲液、20μl FITC酪蛋白基质和10μl对照样品混合后，得到第一混合液；
所述孵育缓冲液从Sigema购买，为磷酸二氢钠孵育缓冲液，其中含有浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠和浓度为150mmol/L的氯化钠；所述FITC酪蛋白基质从Sigema购买，为FITC-荧光素标记酪蛋白；所述对照样品中含有浓度为0-2.5μg/ml的酪蛋白；
(2)对所述第一混合液以10000r/min的转速进行离心处理10min，得到上清液和沉淀物；
(3)向所述上清液中加入150μl，浓度为6.1N的TCA溶液后，得到第二混合液；
(4)将2μl第二混合液与200μl分析缓冲液混合后移入黑色96孔板的孔中，得到第三混合液，所述分析缓冲液中含有浓度为500mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，用盐酸将pH值调至8.5；
(5)将所述第三混合液置于荧光分光光度计中，记录在波长为485nm的激发光下的荧光强度，并监测波长为535nm的发射波强度；
(6)根据《F96PRO荧光分光光度计》中9.2.2增益设置：增益共1～17八档，打开软件后的初始值是1，一般用浓度最高的溶液来调节增益。通过调节使得荧光值在300～400范围内的稳定值。
记录当对照样品中酪蛋白的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2和2.5μg/ml时检测到的荧光值，减去空白荧光值后，将该数值作为纵坐标。上述参数值见表1。将对照样品中酪蛋白的浓度作为横坐标，绘制得到增益为8档曲线，其曲线图如图1所示。
表1
Figure BDA0003003110530000051
对照例2
步骤(1)～(5)同对照例1。
选择荧光分光光度计的增益为9档，记录当对照样品中酪蛋白的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2和2.5μg/ml时检测到的荧光值，减去空白荧光值后，将该数值作为纵坐标。上述参数值见表2。将对照样品中酪蛋白的浓度作为横坐标，绘制得到增益为9档曲线，其曲线图如图2所示。
表2
Figure BDA0003003110530000052
Figure BDA0003003110530000061
对照例3
步骤(1)～(5)同对照例1。
选择荧光分光光度计的增益为10档，记录当对照样品中酪蛋白的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2和2.5μg/ml时检测到的荧光值，减去空白荧光值后，将该数值作为纵坐标。上述参数值见表3。将对照样品中酪蛋白的浓度作为横坐标，绘制得到增益为10档曲线，其曲线图如图3所示。
表3
Figure BDA0003003110530000062
实施例
对11个品种的牛奶进行酪氨酸含量检测。检测步骤(1)～(5)同对照例1，区别仅在于将步骤(1)中的10μl对照样品替换为10μl待测样品。
步骤(6)：将波长为535nm的发射波强度与8档、9档和10档曲线分别进行对照，得到待测样品中酪蛋白的浓度，结果见表4。
表4
Figure BDA0003003110530000063
Figure BDA0003003110530000071
根据以上信息和实际曲线的线性和样品检测的荧光值范围，在后续检测中，可直接选择10档曲线进行检测分析。选择10档曲线的原因如下：1)使样品的吸光值尽可能接近设备规定的300-400之间，试验说明当两组数据都不能完全在300-400之间时，选择检测值比较大的值更灵敏一些；2)从控制的角度尽可能选择检测结果偏高的，加严监控。
申请人共对33批样品进行5次试验，曲线的相关性可达到0.99以上，说明与样品中的酪蛋白酶有一定的对应性。另外，本发明将以活力值为单位的蛋白酶，转化为常规的浓度单位，更直观和方便日常结果的换算。也可以此为基础开发类似蛋白酶的检测方法。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种蛋白酶荧光分光光度快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将孵育缓冲液、FITC酪蛋白基质和待测样品混合后，得到第一混合液；
(2)对所述第一混合液进行离心处理，得到上清液和沉淀物；
(3)向所述上清液中加入TCA溶液后，得到第二混合液；
(4)将所述第二混合液与分析缓冲液混合后，得到第三混合液；
(5)将所述第三混合液置于荧光分光光度计中，记录在波长为485nm的激发光下的荧光强度，并监测波长为535nm的发射波强度；
(6)将所述发射波强度与标准曲线进行对照，得到待测样品中酪蛋白的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，选用20μl孵育缓冲液、20μlFITC酪蛋白基质和10μl待测样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样品中含有浓度为0-2.5μg/ml的酪蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述孵育缓冲液中，含有浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠和浓度为150mmol/L的氯化钠；所述FITC酪蛋白基质为FITC-荧光素标记酪蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心处理的转速为10000r/min，时间为10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述TCA溶液的加入量为150μl，TCA浓度为6.1N。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述分析缓冲液中，含有浓度为500mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，用盐酸将pH值调至8.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，将2μl第二混合液与200μl分析缓冲液混合后移入黑色96孔板的孔中，得到第三混合液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，将30μl第二混合液与3μl分析缓冲液混合后移入试管中，得到第三混合液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，荧光分光光度计中装有485nm的滤光片，能够提供波长为485nm的激发光；并设定发射波波长为535nm，记录发射波强度。
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