CN102879370A - 一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法 - Google Patents
一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种应用荧光光谱快速同时检测牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星残留的方法。首先对脱蛋白衍生化后的牛奶进行三维荧光光谱扫描,然后用化学计量学手段解析荧光光谱,构建快速同时检测牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星含量的多元校正模型。在用已构建的校正模型对未知牛奶样品中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的残留进行预测时发现本发明能够快速地区分阴性和阳性样品,并进一步测定两种药物残留的含量。本发明具有简单快速、灵敏度高的特点,大大提高了检测效率,简化抗生素残留检测的操作步骤,可处理大批量样品,可在实际检测应用中推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时测定牛奶中两种抗生素的检测方法,特别的,涉及一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法。
背景技术
近年来,随着我国居民收入的提高和对乳制品消费观念的转变,我国的乳制品工业得到了迅猛地发展。然而从目前国内奶业的生产与加工状况来看,我国乳制品的质量与安全现状不容乐观。我国乳牛的农场化养殖水平较低,大部分原料乳来自乳牛散养户,因此原料乳的品质波动性很大。乳制品掺假,滥用抗生素等诸多问题使得乳制品安全性存在重大隐患。
磺胺甲基异恶唑和达氟沙星分别属于磺胺类药物和喹诺酮类药物,这两类抗生素都具有广谱抗菌性,被广泛地用于治疗动物疾病(乳牛的乳房炎)和动物饲料添加剂中。如果对奶牛用药不当,滥用抗生素并不遵循休药期,牛乳中就会有抗生素残留。食用有抗生素残留的食品会给人体的健康带来严重的危害,如一些过敏反应和细菌耐药性,长期食用有致癌的可能性。许多国家都规定了牛奶中磺胺类药物和达氟沙星抗生素的允许的最大残留量分别为100μg/L和30μg/L。
中华人名共和国国家标准(GB/T 22966-2008和GB/T 21312-2007)分别规定了牛奶中磺胺类抗生素和喹诺酮类抗生素的液相色谱串联质谱测定方法。这种检测方法灵敏度高,但通常需要复杂的前处理,耗时较长,费用昂贵。因此,迫切需要建立一种快捷简便的检测方法,以满足日常生产检验中对原料乳进行快速监测的需求,从而保证最终产品的质量。
荧光光谱法始于十九世纪六十年代,近年来,随着荧光分析法的发展,其应用范围日益广泛,具有灵敏度高、线性范围宽、不需复杂预处理等特点。随着技术的进步,荧光分析仪器的灵敏度,准确度和选择性不断提高,遍及工业,农业,食品,医药,环境科学的各个领域,成为一种重要且有效的痕量组分分析的方法。三维荧光光谱的三个维度是指激发波长、发射波长和荧光强度。三维荧光技术可为二阶校正法提供矩阵响应数据阵,能使我们在未知干扰物存在下,依然能对多个感兴趣的组分进行定量分析。选择覆盖感兴趣组分的最大荧光激发和发射波谱区间,对其进行三维荧光扫描,就可以为后期的数据分析提供完整的数据矩阵,对多种物质进行同时检测。已有研究表明结合三维荧光技术和化学计量学而建立的荧光检测方法具有直接检测复杂食品体系中痕量物质如抗生素残留的能力,但是目前还未有应用此种技术对食品中不同种类的抗生素残留同时检测的报道。
发明内容
针对上述情况,本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种快速同时测定牛奶中多类抗生素(磺胺类抗生素和喹诺酮类抗生素)残留的方法,可快速地筛分出阴性和阳性样品,并进一步确认其准确浓度,为实际应用提供了一种快捷简便的监控方法。
本发明通过以下方案实现:
一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法,通过以下步骤实现:
(1)校正集样品制备:向阴性牛奶中添加一系列随机组合浓度梯度的磺胺甲基异恶唑和达氟沙星溶液。
(2)校正集样品的荧光测定:经过除蛋白质,加入荧光胺试剂衍生化后,采集三维荧光光谱。
(3)校正集模型的建立:对光谱数据预处理后,采用化学计量学方法的多元校正模型构建磺胺甲基异恶唑和达氟沙星两种物质的浓度和三维荧光光谱数据间的回归模型。
(4)模型的验证:采用交叉验证的方法建立校正模型;
(5)模型的预测能力:对未知样品采用与步骤(2)相同的预处理方法,采集其三维荧光光谱,收集到的光谱信息用步骤(4)获得的校正模型对其进行预测。
本发明牛奶样品的预处理为除脱蛋白质与荧光胺试剂衍生化,不包含其他化学分离。
本发明所述的除蛋白质采用加入30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白质的方法。
所述的荧光胺试剂衍生化采用1mg/mL荧光胺丙酮溶液的方法进行。
本发明三维荧光光谱的采集方式和采集条件为:采用三维荧光光谱扫描,激发发射狭缝均为5nm,光电倍增管电压为600V,扫描速度为12000nm/min,每隔5nm取数据点,每个样品做3次平行扫描,取平均值。
所述的步骤(3)中光谱数据预处理包括平滑与中心化。
所述采用的化学计量学方法为三线性偏最小二乘法-判别式(PLSDA)和三线性偏最小二乘法(PLS);PLSDA算法用于定性地筛分出阴性和阳性样品,PLS算法用于确定样品中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的浓度。
所述的模型的验证采用交叉验证的方法建立校正模型,根据Hotelling T2和样品的剩余偏差去除异常点,再依据模型的预测误差最小化原则选择主成分数对未知样品进行预测。
本发明的有益效果:
(1)磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的同时测定,快速的筛分阴性样品和阳性样品,并确定其浓度。
(2)牛奶样品的预处理无需包含复杂的化学分离,仅需脱蛋白质与衍生化,就可利用化学计量学的方法将磺胺甲基异恶唑和达氟沙星信息从复杂的牛奶荧光背景中提取出来。
(3)利用三维荧光光谱的高阶优势,对荧光性质与荧光条件各异,并相互干扰的两种抗生素,利用三维荧光光谱确定两个抗生素的特征峰,在牛奶体系中实现其同时检测。
(4)采用加标实验先建立校正模型,进而应用建立的校正模型预测未知样品。
(5)采用的化学计量学方法为三线性偏最小二乘法-判别式(PLSDA)和三线性偏最小二乘法(PLS)。PLSDA算法可用于定性地筛分出阴性和阳性样品,PLS算法可用于确定样品中两种抗生素的浓度。
附图说明
图1三维荧光光谱图(A)空白牛奶;
图2三维荧光光谱图(B)空白牛奶添加达氟沙星和磺胺甲基异恶唑;
图3化学计量算法解析后的荧光光谱图(A)激发光谱:(1)磺胺甲基异恶唑;(2)达氟沙星;(3)牛奶背景;
图4化学计量算法解析后的荧光光谱图(B)发射光谱:(1)磺胺甲基异恶唑;(2)达氟沙星;(3)牛奶背景;
图5PLSDA模型对预测集样品的分析结果(A)磺胺甲基异恶唑;
图6PLSDA模型对预测集样品的分析结果(B)达氟沙星。
具体实施方式
一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法,通过以下步骤实现:
(1)校正集样品制备:向阴性牛奶中添加一系列随机组合浓度梯度的磺胺甲基异恶唑和达氟沙星溶液。
(2)校正集样品的荧光测定:经过除蛋白质,加入荧光胺试剂衍生化后,采集三维荧光光谱。
(3)校正集模型的建立:对光谱数据预处理后,采用化学计量学方法的多元校正模型构建磺胺甲基异恶唑和达氟沙星两种物质的浓度和三维荧光光谱数据间的回归模型。
(4)模型的验证:采用交叉验证的方法建立校正模型;
(5)模型的预测能力:对未知样品采用与步骤(2)相同的预处理方法,采集其三维荧光光谱,收集到的光谱信息用步骤(4)获得的校正模型对其进行预测。
本发明牛奶样品的预处理为除脱蛋白质与荧光胺试剂衍生化,不包含其他化学分离。
本发明所述的除蛋白质采用加入30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白质的方法。
所述的荧光胺试剂衍生化采用1mg/mL荧光胺丙酮溶液的方法进行。
本发明三维荧光光谱的采集方式和采集条件为:采用三维荧光光谱扫描,激发发射狭缝均为5nm,光电倍增管电压为600V,扫描速度为12000nm/min,每隔5nm取数据点,每个样品做3次平行扫描,取平均值。
所述的步骤(3)中光谱数据预处理包括平滑与中心化。
所述采用的化学计量学方法为三线性偏最小二乘法-判别式(PLSDA)和三线性偏最小二乘法(PLS);PLSDA算法用于定性地筛分出阴性和阳性样品,PLS算法用于确定样品中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的浓度。
所述的模型的验证采用交叉验证的方法建立校正模型,根据Hotelling T2和样品的剩余偏差去除异常点,再依据模型的预测误差最小化原则选择主成分数对未知样品进行预测。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
1.校正集样本:采用GB/T 22966-2008和GB/T 21312-2007的方法确定阴性牛奶样品作为校正集牛奶基质。加入7个浓度水平的达氟沙星和8个浓度水平的磺胺甲基异恶唑标准工作液溶液,两种抗生素浓度随机混合,共15个样品作为校正集。
2.校正集样品的测定:移取5mL牛奶于50mL容量瓶中,加入随机组合的0,10,20,30,40,50,60μg/L达氟沙星和0,30,50,100,120,150,200μg/L磺胺甲基异恶唑标准溶液,加超纯水定容到刻度,混合均匀,取8mL样液置于10mL离心管中,加入0.5mL 30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液,涡旋振荡,静置10min后4000r/min下离心10min,过滤。取5mL滤液于试管,加入400μL荧光胺丙酮溶液(1mg/mL),涡旋振荡混匀,室温下反应30min后扫描其三维荧光光谱。
3.校正集样品的三维荧光光谱采集:用荧光光谱仪(日立F-7000荧光光谱仪)对校正集样品进行三维荧光光谱扫描,激发波长范围为280~420nm,发射波长范围为420~550nm。光电倍增管电压(PMT)为600V,响应速度为0.1,扫描速度为12000nm/min,激发、发射的狭缝宽度均为5nm。间隔5nm采集荧光强度数据。
4.快速筛选方法的建立:将收集到的荧光光谱数据导入Unscrambler 9.7软件,用三线性偏最小二乘判别式法(PLSDA)提取分析物的光谱信息,对数据进行回归计算。
(1)首先,对光谱数据进行平滑,中心化处理。
(2)对校正集样品赋值:那些小于最大残留量浓度的样品被赋值为-1(阴性样品)而大于最大残留量浓度的则被赋值为1(阳性样品),用赋值变量和三维荧光光谱数据用三线性偏最小二乘判别法进行回归计算,得到校正模型。牛奶中磺胺类药物和达氟沙星抗生素的允许的最大残留量分别为100μg/l和30μg/l。
(3)根据Hotelling T2(p-value<5%)和样品的剩余偏差去除异常点,采用交叉验证,对磺胺甲基异恶唑和达氟沙星分别选择使模型的预测均方根误差最小时的主成分数。所建立模型的参数见表1。
(4)为了检验所建立模型的预测能力,按照方法,用所建立的校正模型对样品进行分析得到测定值。最后,那些预测值小于零的样品被归类为阴性样品,大于零的则归类为阳性样品。
将本发明方法应用到商业牛乳的检测中,结果如图5,图6和表2显示,对于磺胺甲基异恶唑,阴性和阳性样品的判别正确率为100%。而就达氟沙星而言,56个阳性样品中,被误判为阴性的样品数为1,这样假阴性的概率计算为1.78%,这远小于欧盟所规定的5%。
5.定量检测模型的建立:与4不同的是用三线性偏最小二乘法(PLS)对收集到光谱数据和两种抗生素的浓度据同时进行回归计算。
(1)首先,同样地对光谱数据进行平滑,中心化处理。
(2)将磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的添加浓度和三维荧光光谱数据进行回归计算,得到校正模型。
(3)根据Hotelling T2(p-value<5%)和样品的剩余偏差去除异常点,采用交叉验证,对磺胺甲基异恶唑和达氟沙星分别选择使模型的预测均方根误差最小时的主成分数。所建立模型的参数见表1。
(4)为了检验所建立模型的预测能力,按照方法,用所建立的校正模型对样品进行分析得到未知样品中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的浓度。
将本发明方法应用到商业牛乳的检测中,结果显示,对于磺胺甲基异恶唑,样品回收率在84.5~108.5%,方法的重复性(RDSr)和重现性(RSDR)分别为0.6%和1.7%;而对于达氟沙星而言,样品回收率在66.8~153.0%,方法的重复性(RDSr)和重现性(RSDR)分别为1.3%和11.4%。可见,荧光法结合偏最小二乘算法(PLS)能够进一步确定样品中这两种抗生素的浓度。
表1两种化学计量校正模型的相关指标
表2PLSDA定性模型的预测结果
Claims (8)
1.一种同时测定牛奶中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的荧光方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)校正集样品制备:向阴性牛奶中添加一系列随机组合浓度梯度的磺胺甲基异恶唑和达氟沙星溶液。
(2)校正集样品的荧光测定:经过除蛋白质,加入荧光胺试剂衍生化后,采集三维荧光光谱。
(3)校正集模型的建立:对光谱数据预处理后,采用化学计量学方法的多元校正模型构建磺胺甲基异恶唑和达氟沙星两种物质的浓度和三维荧光光谱数据间的回归模型。
(4)模型的验证:采用交叉验证的方法建立校正模型;
(5)模型的预测能力:对未知样品采用与步骤(2)相同的预处理方法,采集其三维荧光光谱,收集到的光谱信息用步骤(4)获得的校正模型对其进行预测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,牛奶样品的预处理为除蛋白质与荧光胺试剂衍生化,不包含其他化学分离。
3.根据权利要求1所述的方法,所述的除蛋白质采用加入30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白质的方法。
4.根据权利要求1所述的方法,所述的荧光胺试剂衍生化采用1mg/mL荧光胺丙酮溶液的方法进行。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,三维荧光光谱的采集方式和采集条件为:采用三维荧光光谱扫描,激发发射狭缝均为5nm,光电倍增管电压为600V,扫描速度为12000nm/min,每隔5nm取数据点,每个样品做3次平行扫描,取平均值。
6.根据权利要求1所述的方法,所述的步骤(3)中光谱数据预处理包括平滑与中心化。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述采用的化学计量学方法为三线性偏最小二乘法-判别式(PLSDA)和三线性偏最小二乘法(PLS);PLSDA算法用于定性地筛分出阴性和阳性样品,PLS算法用于确定样品中磺胺甲基异恶唑和达氟沙星的浓度。
8.根据权利要求1所述的方法,所述的模型的验证采用交叉验证的方法建立校正模型,根据Hotelling T2和样品的剩余偏差去除异常点,再依据模型的预测误差最小化原则选择主成分数对未知样品进行预测。
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