CN108614069A - 一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵液中植酸酶活性的测定方法，本发明提供的方法可以准确测定发酵液中植酸酶的活性，且避免了传统方法中植酸酶发酵液中磷对检测过程的干扰，避免了长时间的样品透析预处理，且本发明提供的方法操作简单。此外，本发明提供了一种发酵液中植酸酶活性的测定装置，采用本发明提供的测定装置可以准确测定发酵液中植酸酶的活性，且本发明提供的装置结构简单、无需使用昂贵的部件，便可实现植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶活性测定技术领域，尤其涉及一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法和装置。
背景技术
植酸酶是催化植酸及植酸盐水解为肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类水解酶的统称，在饲料、食品、环境和医药等领域有着广泛应用。植酸酶活力测定对发酵生产植酸酶过程的优化控制具有重要的意义，也是产品质量控制和保证使用效果的关键环节。
植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定主要采用比色法。目前应用较广的有钼酸铵-FeSO4法、钼酸铵-VC法、钼酸铵-氨基奈酚磺酸法以及钒钼法。其中钒钼法于1994年被美国分析化学专家列入AOAC(Associ-ation of Analytical Communities)标准方法，我国也于2002年将钒钼法作为测定饲用植酸酶活性的国家标准。这些方法的基本原理是：植酸酶作用于植酸及植酸盐会释放出无机磷，无机磷在酸性条件下与钼酸盐发生反应，产生磷钼蓝，其最大吸收波长为720nm。当无机磷含量在一定范围内时，与磷钼蓝颜色的深浅成正比。通过测定显色后溶液的吸光度，定量的测定发酵液中植酸酶作用底物植酸或植酸盐释放的无机磷的量，进而计算出植酸酶的活力。该方法测定过程中，不仅样品的颜色、浊度等都有干扰，最大的问题是发酵液中无机磷含量往往较高，在短时间内植酸酶分解植酸钠释放出的无机磷，要比发酵液中原先含有的无机磷低得多，为此，需要对样品进行长时间的透析除磷预处理和酶反应过程，不能满足发酵生产中大批量、多批次快速、准确检测的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法和装置，所述方法避免了发酵液中磷的干扰，省略了长时间的样品透析预处理；减少了发酵液样品颜色及浑浊造成的终点判断误差，提高了植酸酶活性测定的准确性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：
将植酸酶发酵液进行稀释，得到植酸酶发酵液稀释液；
将所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液混合，将所得体系进行酶解反应，当所述酶解反应的时间为T时，向所得体系中加入三氯乙酸-乙酸缓冲液终止所述酶解反应，得到待测样品液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，根据预定的植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，得到植酸钠消耗的物质的量为Sx；
利用E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；
其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。
优选的，所述酶解反应的时间为28～32min，酶解反应的温度为35～39℃。
优选的，所述植酸钠溶液与植酸酶发酵液稀释液的体积比为(1.8～2.2)：1。
优选的，所述三氯化铁溶液的浓度为0.018～0.022mol/L。
优选的，所述线性标准曲线的获得方法，包括以下步骤：
将植酸钠与水混合，得到系列浓度植酸钠标准溶液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液分别对所述植酸钠标准溶液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，得到以植酸钠消耗的物质的量为纵坐标，以滴定时间为横坐标的线性标准曲线。
优选的，所述植酸钠标准溶液的浓度为0～5.0mmol/L。
本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定装置，包括计算机控制系统、滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶，其中，所述计算机控制系统分别与所述滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶通信连接，所述计算机控制系统对所述滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶的工作状态进行控制和调节；所述计算机控制系统对测定结果进行自动输出；所述光电检测装置包括光源和光电接收转换器；所述滴定池分别与滴定液瓶和工作液瓶连通；所述滴定池设置在所述光源和光电接收转换器之间，所述光电检测装置用于检测滴定池中颜色的变化。
优选的，所述滴定池与所述滴定液瓶、滴定池与工作液瓶之间分别设置有液体泵，所述计算机控制系统与所述液体泵通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定液瓶和工作液瓶工作状态的控制和调节。
优选的，还包括废液瓶和清洗液瓶，所述清洗液瓶和废液瓶分别与滴定池连通，所述滴定池与所述废液瓶和清洗液瓶之间分别设置有液体泵，所述计算机控制系统与所述液体泵通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定液瓶和工作液瓶工作状态的控制和调节。
本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：将植酸酶发酵液进行稀释，得到植酸酶发酵液稀释液；将所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液混合，将所得体系进行酶解反应，当所述酶解反应的时间为T时，向所得体系中加入三氯乙酸-乙酸缓冲液终止所述酶解反应，得到待测样品液；以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，根据预定的植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，得到植酸钠消耗的物质的量为Sx；利用E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。本发明提供的方法可以准确测定发酵液中植酸酶的活性，且避免了传统方法中植酸酶发酵液中磷对检测过程的干扰，避免了长时间的样品透析预处理，且本发明提供的方法操作简单。
此外，本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定装置，采用本发明提供的测定装置可以准确测定发酵液中植酸酶的活性，且本发明提供的装置结构简单、无需使用昂贵的部件，便可实现植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定。
附图说明
图1为本发明提供的植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定装置，1-进样口；2-滴定池；3-光电通路；4-液体泵；5-清洗液瓶；6-滴定泵；7-滴定液瓶；8-液体泵；9-工作液瓶；10-搅拌子；11-液体泵；12-废液瓶；
图2为实施例1～3和对比文件1～3的植酸酶酶活性值的相关性分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：
将植酸酶发酵液进行稀释，得到植酸酶发酵液稀释液；
将所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液混合，将所得体系进行酶解反应，当所述酶解反应的时间为T时，向所得体系中加入三氯乙酸-乙酸缓冲液终止所述酶解反应，得到待测样品液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，根据预定的植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，得到植酸钠消耗的物质的量为Sx；
利用E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；
其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。
本发明将植酸酶发酵液进行稀释，得到植酸酶发酵液稀释液。本发明对所述稀释的倍数没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的稀释倍数且能够保证在酶解反应后剩余的植酸钠的物质的量与滴定时间均在线性范围内即可。在本发明中，所述植酸酶发酵液来源于毕赤酵母工程菌高密度发酵。
得到植酸酶发酵液稀释液后，本发明将所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液混合，将所得体系进行酶解反应，当所述酶解反应的时间为T时，向所得体系中加入三氯乙酸-乙酸缓冲液终止所述酶解反应，得到待测样品液。在本发明中，所述乙酸缓冲液的浓度优选为0.18～0.22mmol/L，更优选为0.19～0.21mmol/L；所述乙酸缓冲液的pH值优选为5.3～5.7，更优选为5.4～5.6。在本发明中，所述植酸钠溶液的浓度优选为4.8～5.2mmol/L，更优选为4.9～5.1mmol/L；在本发明中，所述三氯乙酸-乙酸缓冲液优选为三氯乙酸和上述乙酸缓冲液的混合物；所述三氯乙酸-乙酸缓冲液中三氯乙酸的浓度优选为0.08～0.12g/mL，更优选为0.09～0.11g/mL。
在本发明中，所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液的混合优选为先将植酸酶发酵液稀释液和乙酸缓冲液混合，再向得到的混合物中加入植酸钠溶液。在加入植酸钠溶液前，本发明优选先对植酸酶发酵液稀释液和乙酸缓冲液的混合液加热、保温，以使植酸酶在与植酸钠底物反应前处于最适pH；所述加热的温度优选为35～39℃，更优选为36～38℃；所述保温的时间优选为4～6min，更优选为4.5～5.5min。
在本发明中，所述乙酸缓冲液与植酸酶发酵液稀释液的体积比优选为(6500～7500)：1，更优选为(6800～7200)：1。在本发明中，所述植酸钠溶液与植酸酶发酵液稀释液的体积比优选为(1.8～2.2)：1，更优选为(1.9～2.1)：1。
在本发明中，所述酶解反应的时间优选为28～32min，更优选为29～31min；所述酶解反应的温度优选为35～39℃，更优选为36～38℃。
在本发明中，所述酶解反应优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌即可。
在本发明中，终止所述酶解反应的时间优选为8～12min，更优选为9～11min。
在本发明中，所述终止酶解反应优选采用将三氯乙酸-乙酸缓冲液加入酶解体系中，使植酸酶完全失去活性，进而达到终止酶解反应的目的。
得到待测样品液后，本发明以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，根据预定的植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，得到植酸钠消耗的物质的量为Sx；利用E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。
在本发明中，所述磺基水杨酸溶液的溶质优选为磺基水杨酸结晶固体，所述磺基水杨酸的质量浓度优选为8～12％，更优选为9～11％；所述工作液优选为体积比为1:50的磺基水杨酸溶液和乙酸缓冲液的混合液；所述三氯化铁溶液的浓度优选为0.018～0.022mol/L，更优选为0.019～0.021mol/L；本发明以磺基水杨酸溶液为指示剂，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，在滴定过程中，随着三氯化铁溶液加入量的增加，Fe3+先与植酸钠发生络合反应生成白色络合物，待植酸钠消耗完后，稍过量的Fe3+与磺基水杨酸生成紫红色络合物，此时即为反应终点。
在本发明中，所述滴定时间tx为滴定完成后的所需的滴定时间；所述Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量。
在本发明中，所述线性标准曲线的获得方法，包括以下步骤：
将植酸钠与水混合，得到系列浓度植酸钠标准溶液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液分别对所述植酸钠标准溶液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，得到以植酸钠消耗的物质的量为纵坐标，以滴定时间为横坐标的线性标准曲线。
本发明优选将植酸钠与水混合，得到系列浓度植酸钠标准溶液。在本发明中，所述植酸钠标准溶液的浓度优选为0～5.0mmol/L。
得到植酸钠标准溶液后，本发明以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述植酸钠标准溶液进行滴定，至工作液指示反应终点，记录滴定时间并判断滴定终点。在本发明中，对所述植酸钠标准溶液进行滴定的操作优选与对所述待测样品液进行滴定的操作一致。在本发明中，所述植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线的回归方程为S＝vt×t+b；其中，S为植酸钠消耗的物质的量，vt为反应速度，t为反应时间。
在本发明中，所述Sx的取值优选经过下述计算过程得到：
反应速度vt＝ΔS/Δt
S＝f×M×V
S：植酸钠消耗物质的量
t：滴定时间
f:络合滴定当量系数
M:滴定液浓度
V：滴定液消耗体积
t1为植酸钠标准溶液加入0.5mL时滴定所需要的时间，Vx1三氯化铁溶液消耗体积；t2为植酸钠标准溶液加入0.1mL时滴定所需要的时间，Vx2三氯化铁溶液消耗体积，则反应速度vt：
vt＝f×M(Vx1-Vx2)/(t1-t2)
其中络合滴定当量系数f可以通过植酸标准液(5.0mmol/L)加入0.5mL时，三氯化铁溶液消耗体积Vx1计算得出：
f＝5.0×0.5/(0.02×Vx1)
则线性标准曲线中截距b：
f×M×Vx1＝f×M(Vx1-Vx2)/(t1-t2)×t1+b；
b＝f×M×t2(Vx2-Vx1)
则滴定时间tx在t2-t1范围内的植酸量为：
Sx＝f×M×tx(Vx1-Vx2)/(t1-t2)+f×M×t2(Vx2-Vx1)
最后通过E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。
本发明提供了一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定装置，如图1所示，包括计算机控制系统、滴定池2、光电检测装置3、滴定液瓶7和工作液瓶9，其中所述计算机控制系统分别与所述滴定池2、光电检测装置3、滴定液瓶7和工作液瓶9通信连接，所述计算机控制系统对所述滴定池2、光电检测装置3、滴定液瓶7和工作液瓶9的工作状态进行控制和调节；所述计算机控制系统对测定结果进行自动输出；所述光电检测装置3包括光源和光电接收转换器；所述滴定池分别与滴定液瓶、工作液瓶和废液瓶连通；所述滴定池设置在所述光源和光电接收转换器之间，所述光电检测装置3用于检测滴定池中颜色的变化。
在本发明的实施例中，所述滴定池2与所述滴定液瓶7、滴定池2与所述工作液瓶9之间分别设置有液体泵；具体的，所述滴定池2与所述滴定液瓶7之间设置有液体泵6，所述滴定池2与所述工作液瓶9之间设置有液体泵8。在本发明的实施例中，所述计算机控制系统与所述液体泵6和液体泵8通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵6和液体泵8的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定池2与所述滴定液瓶7和工作液瓶9工作状态的控制和调节。
在本发明的实施例中，所述测定装置还包括废液瓶12和清洗液瓶5，所述废液瓶12和清洗液瓶5分别与滴定池2连通，所述滴定池2与所述废液瓶12和清洗液瓶5之间分别设置有液体泵；具体的，所述滴定池2与所述废液瓶12之间设置有液体泵11，所述滴定池2与所述清洗液瓶5之间设置有液体泵4。在本发明的实施例中，所述计算机控制系统与所述液体泵11和液体泵4通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵11和液体泵4的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定液瓶7和工作液瓶9工作状态的控制和调节。
在本发明的实施例中，所述滴定池2为圆柱形空心反应器；滴定池2顶部设置有进样口1；滴定池2底部设置有搅拌子10，与清洗液瓶5、滴定液瓶7和工作液瓶9连接的进口，与所述废液瓶12连接的出口。
在本发明中，采用上述技术方案所述测定装置对植酸酶发酵液中植酸酶活性进行测定的方法，优选包括以下步骤：
1)标定：计算机控制系统控制液体泵8将工作液瓶9中的5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为8％～12％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池2，用定量注射器吸取0.1mL的5.0mmol/L植酸钠标准溶液通过进样口1注入滴定池2，计算机控制系统控制滴定泵6将滴定液瓶7中的三氯化铁溶液泵入(转速60转/分钟)滴定池2，同时控制搅拌子10运转，并控制转速为600r/min，时间为90s，以混匀反应体系，滴定池上的光电检测装置3自动记录滴定时间和光电流变化，根据颜色变化引起的光电流变化率自动判断滴定终点，到达滴定终点，计算机控制系统控制液体泵11将滴定池中的反应液排至废液瓶12，并通过计算机控制系统控制液体泵4将清洗液5泵入滴定池进行清洗，按此步骤依次加入0.5mL的5.0mmol/L植酸钠标准溶液，通过设置的程序自动计算得到植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，完成标定过程。
2)样品测定：按照步骤1)中的方法进行样品测定，不同之处在于，用定量注射器吸取0.5mL的待测样品液通过进样口1注入滴定池2；滴定完成后，根据植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，通过计算机控制系统自动计算植酸酶的活性。
下面将结合本发明的实施例对本发明中的技术方案进行清除、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)酶水解：
取3.5L乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入具塞试管中，加0.5mL稀释2倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液1.0mL，振荡均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入5.0mL10％TCA终止反应，振荡后静止10min，使植酸酶完全失去活性，得到待测样品液。
2)标定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内，用定量注射器吸取0.1mL、0.5mL的5.0mmol/L植酸钠标准溶液注入滴定池，由滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液，三氯化铁可以与反应池中的植酸钠反应生成白色络合物，当植酸钠消耗完，稍过量的Fe3+与磺基水杨酸生成紫红色络合物显示终点。通过设置的程序自动计算得到植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线S＝34.38×t+7.06(R2＝0.9992)。
3)样品滴定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内(图1)，用定量注射器吸取0.5mL待测样品液注入反应池，由计量滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液。反应池上的光电检测装置自动记录滴定时间和光电流变化。根据光电流变化率自动判断滴定终点。通过计算机控制系统自动计算植酸酶的活性值为1092.4U/mL。
对比例1
基于钼钒酸铵国标法测定稀释倍数为2倍的植酸酶发酵液的酶活性：
将90μL乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入1.5mL EP管中，加10μL通过透析去除磷酸根的稀释2倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液200μL，混合均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入200μL钼钒酸铵终止显色液，于415nm处测定吸光度值，计算得到酶活性值为1208.2U/mL。
实施例2
1)酶水解：
取3.5L乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入具塞试管中，加0.5mL稀释3倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液1.0mL，振荡均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入5.0mL10％TCA终止反应，振荡后静止10min，使植酸酶完全失去活性，得到待测样品液。
2)标定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内，用定量注射器吸取0.1mL、0.5mL的5.0mmol/L植酸钠标准溶液注入滴定池，由滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液，三氯化铁可以与反应池中的植酸钠反应生成白色络合物，当植酸钠消耗完，稍过量的Fe3+与磺基水杨酸生成紫红色络合物显示终点。通过设置的程序自动计算得到植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线S＝34.38×t+7.06(R2＝0.9992)。
3)样品滴定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内(图1)，用定量注射器吸取0.5mL待测样品液注入反应池，由计量滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液。反应池上的光电检测装置自动记录滴定时间和光电流变化。根据光电流变化率自动判断滴定终点。通过计算机控制系统自动计算植酸酶的活性值为736.9U/mL。
对比例2
基于钼钒酸铵国标法测定稀释倍数为3倍的植酸酶发酵液的酶活性：
将90μL乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入1.5mL EP管中，加10μL通过透析去除磷酸根的稀释3倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液200μL，混合均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入200μL钼钒酸铵终止显色液，于415nm处测定吸光度值，计算得到酶活性值为740.3U/mL。
实施例3
1)酶水解：
取3.5L乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入具塞试管中，加0.5mL稀释4倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液1.0mL，振荡均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入5.0mL10％TCA终止反应，振荡后静止10min，使植酸酶完全失去活性，得到待测样品液。
2)标定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内，用定量注射器吸取0.1mL、0.5mL的5.0mmol/L植酸钠标准溶液注入滴定池，由滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液，三氯化铁可以与反应池中的植酸钠反应生成白色络合物，当植酸钠消耗完，稍过量的Fe3+与磺基水杨酸生成紫红色络合物显示终点。通过设置的程序自动计算得到植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线S＝34.38×t+7.06(R2＝0.9992)。
3)样品滴定：
由试剂泵抽取5mL磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液(由2mL质量浓度为10％的磺基水杨酸钠与100mL乙酸缓冲液配制)泵入滴定池内(图1)，用定量注射器吸取0.5mL待测样品液注入反应池，由计量滴定泵以60转/分钟匀速加入0.02mol/L三氯化铁溶液。反应池上的光电检测装置自动记录滴定时间和光电流变化。根据光电流变化率自动判断滴定终点。通过计算机控制系统自动计算植酸酶的活性值为539.6U/mL。
对比例3
基于钼钒酸铵国标法测定稀释倍数为4倍的植酸酶发酵液的酶活性：
将90μL乙酸缓冲液(0.2mmol/L，pH 5.5)加入1.5mL EP管中，加10μL通过透析去除磷酸根的稀释4倍的植酸酶发酵液，37℃保温5.0min后加入5.0mmol/L植酸钠反应底物溶液200μL，混合均匀，于37℃条件下反应，精确计时30min后取出具塞试管，并向其中加入200μL钼钒酸铵终止显色液，于415nm处测定吸光度值，计算得到酶活性值为582.7U/mL。
实施例4
利用GraphPadPrism软件对实施例1～3和对比例1～3的植酸酶酶活性值做相关性分析。
图2为实施例1～3和对比文件1～3的植酸酶酶活性值的相关性分析图，由图可知，两者的相关性系数R2为0.98，反应该实验方法具有较好的稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：
将植酸酶发酵液进行稀释，得到植酸酶发酵液稀释液；
将所述植酸酶发酵液稀释液、乙酸缓冲液和植酸钠溶液混合，将所得体系进行酶解反应，当所述酶解反应的时间为T时，向所得体系中加入三氯乙酸-乙酸缓冲液终止所述酶解反应，得到待测样品液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液对所述待测样品液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，根据预定的植酸钠消耗的物质的量与滴定时间的线性标准曲线，得到植酸钠消耗的物质的量为Sx；
利用E＝(S0-Sx)×d/T，计算得到植酸酶发酵液中植酸酶活性；
其中，E为植酸酶发酵液中植酸酶活性，S0为酶解反应前体系中植酸钠的物质的量，Sx为滴定完成后的植酸钠消耗的物质的量，T为酶解反应的时间，d为植酸酶发酵液的稀释倍数。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述酶解反应的时间为28～32min，酶解反应的温度为35～39℃。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述植酸钠溶液与植酸酶发酵液稀释液的体积比为(1.8～2.2)：1。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述三氯化铁溶液的浓度为0.018～0.022mol/L。
5.根据权利要求1～4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述线性标准曲线的获得方法，包括以下步骤：
将植酸钠与水混合，得到系列浓度植酸钠标准溶液；
以磺基水杨酸溶液-乙酸缓冲液为工作液，采用三氯化铁溶液分别对所述植酸钠标准溶液进行滴定，至工作液指示反应终点时结束滴定，得到以植酸钠消耗的物质的量为纵坐标，以滴定时间为横坐标的线性标准曲线。
6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述植酸钠标准溶液的浓度为0～5.0mmol/L。
7.一种植酸酶发酵液中植酸酶活性的测定装置，包括计算机控制系统、滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶，其中，所述计算机控制系统分别与所述滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶通信连接，所述计算机控制系统对所述滴定池、光电检测装置、滴定液瓶和工作液瓶的工作状态进行控制和调节；所述计算机控制系统对测定结果进行自动输出；所述光电检测装置包括光源和光电接收转换器；所述滴定池分别与滴定液瓶和工作液瓶连通；所述滴定池设置在所述光源和光电接收转换器之间，所述光电检测装置用于检测滴定池中颜色的变化。
8.如权利要求7所述的测定装置，其特征在于，所述滴定池与所述滴定液瓶、滴定池与工作液瓶之间分别设置有液体泵，所述计算机控制系统与所述液体泵通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定液瓶和工作液瓶工作状态的控制和调节。
9.如权利要求7所述的测定装置，其特征在于，还包括废液瓶和清洗液瓶，所述清洗液瓶和废液瓶分别与滴定池连通，所述滴定池与所述废液瓶和清洗液瓶之间分别设置有液体泵，所述计算机控制系统与所述液体泵通信连接，所述计算机控制系统通过对所述液体泵的工作状态进行控制和调节实现对所述滴定液瓶和工作液瓶工作状态的控制和调节。
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| CN (1) | CN108614069A (zh) |
Citations (6)
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2018
- 2018-07-26 CN CN201810834317.3A patent/CN108614069A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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