CN104059983A - 一种标志基因fdcsp及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种标志基因FDCSP及其应用。本发明对胆囊息肉和胆囊结石组织进行高通量转录组深度测序及生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中上调、胆囊结石中下调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的FDCSP基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。

Description

一种标志基因FDCSP及其应用
技术领域
本发明涉及一种标志基因及其应用。具体地，本发明涉及一种标志基因FDCSP(follicular dendritic cell secreted protein)及其在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。
背景技术
胆囊结石(cholelithiasis)是我国的常见疾病之一，自然人群的患病率约10％以上，可导致严重的后果，如重症胆道感染、梗阻性黄疽、胆源性胰腺炎，与胆道肿瘤亦密切相关，威胁着人们的身体健康。胆囊结石的形成原因复杂，按成分主要可分为3种胆石：胆固醇类结石、胆色素结石、混合性结石。长期以来，许多学者致力于胆固醇性结石发病机理的研究。致石基因，遗传流行病学和动物模型的分子生物学研究显示，基因因素对胆囊结石的形成有重大影响；胆石病的遗传模式可能是多基因参与。
胆囊息肉样病变(polypoid lesions of the gallbladder，PLG)，并非是指某一单一的疾病，而是指向胆囊壁上向胆囊腔内突出或隆起的病变的统称，又称为胆囊隆起性病变(apophysis lesions of the gallbladder，ALG)。包括肿瘤性和非肿瘤性病变，肿瘤性息肉包括腺瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、血管瘤、神经纤维瘤等，而非肿瘤性病变包括胆固醇息肉、炎性息肉、胆囊腺肌增生症等。胆囊息肉样病变在临床表现上无特异性，往往无症状或症状轻微，只有少数人可能有右上腹或上腹部不适、隐痛，或伴有消化道症状，因此目前对PLG的诊断主要依靠影像学，包括B超、CT和胆囊造影术等。以B超为首选，但尚不能在术前明确病变的性质。由于本组疾病包含良、恶性病变20余种，术前明确病变的性质困难，如何对待和处理胆囊息肉样病变，对手术治疗的时机选择，都是十分重要的问题。
胆囊结石是胆囊癌重要的危险因素之一，但是结石是否胆囊腺瘤恶变的危险因素则存在争议。通过病理分析，发现胆囊息肉合并结石组比单纯息肉组的胆囊粘膜肠化生和不典型增生的发生率要高，前者为44％，后者为10.3％，胆囊结石是胆囊息肉恶变的高危险因素之一。此外，胆囊存在结石可能对术前息肉的超声检测产生影响。术前超声检测胆囊息肉的一般敏感度为36％-90％，如果不合并胆囊结石，敏感性可达99％。综上所述，胆囊结石可能是胆囊息肉恶变的危险因素之一，结石对术前超声检测也存在一定影响，造成恶变息肉的漏诊。在胆囊结石误诊为胆囊息肉12例病理分析(现代中西医结合杂志，2003年8月，1645-1646页)中也对误诊原因进行了分析，认为目前胆囊良性肿瘤术前鉴别诊断尚不完善，多靠影像学检查。B超检查时，其表现为在胆囊黏膜上出现强回声隆起性病变，不随患者体位变化而移位。病例由于结石较小，尚在早期形成阶段，无钙盐沉积，在声像学上不易和胆囊息肉鉴别。胆囊黏膜由于慢性炎症，黏液腺化生，分泌的黏液将小的结石牢固地黏附在黏膜上，不随体位变化而移动，是造成误诊的原因。由于结石多发造成临床上多发性息肉的错误诊断，因惧怕息肉恶变而行胆囊切除术，造成误治。
因此寻找可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性分子标记，弥补影像学的不足，提高临床诊断水平，已成为目前临床急需解决的难题。
以高通量测序为核心的基因组学技术迅速发展，已广泛应用到生物医学的各个领域并取得突出进展，使我们对于疾病的分子与遗传学基础的认识达到了一个新的水平。这些研究成果对于阐明疾病的病因、解析疾病发生的分子机制、寻找疾病特异的生物标志物和药物靶点，进而提升疾病的预防、诊断和治疗水平具有重要意义。
故而，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，随后进行了生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中上调、胆囊结石中下调的基因，进一步采用荧光定量PCR进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的FDCSP基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。本发明提供的标志基因可用于制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明目的是提供了一个可以区别胆囊息肉和胆囊结石的标记基因FDCSP。
本发明目的是提供了一种检测FDCSP基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒。
进一步，本发明还提供了一对检测FDCSP基因表达水平的荧光定量PCR引物。
进一步，本发明还提供了一种检测FDCSP基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒使用方法。
本发明目的是提供FDCSP基因在制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂中的应用。
本发明目的是提供了一种用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，所述试剂盒包括：a.提供FDCSP蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定FDCSP蛋白的试剂。
进一步，所述试剂是能特异性结合FDCSP蛋白的抗体。
为实现上述目的，本发明对7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本进行了高通量转录组深度测序，高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，发现在胆囊结石与胆囊息肉组之间共有150个差异表达基因，其中143个差异表达基因在胆囊结石中上调，7个差异表达基因在胆囊息肉中上调。我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中上调、在胆囊结石中下调的差异表达基因FDCSP。
本发明运用荧光定量PCR方法对筛选到的差异表达基因FDCSP进行功能分析。
为了实现上述目的，本发明分别提取了45例胆囊息肉组织和38例胆囊结石组织的总RNA的进行提取，设计了用于扩增FDCSP基因的2条引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，用于扩增内参基因GAPDHP65的2条引物SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。制备了含有FDCSP基因序列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较FDCSP基因在胆囊息肉组织和胆囊结石组织中的表达水平。结果表明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FDCSP在胆囊结石组织的表达水平明显低于胆囊息肉组织和对照质粒100copies，而在胆囊息肉组织中的FDCSP高表达，即生物信息学筛选得到的FDCSP基因能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。
本发明目的是提供了一种检测FDCSP表达水平的荧光定量PCR试剂盒及其使用方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
本发明制备的一种检测FDCSP表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为GAPDHP65内参引物，上游引物序列为SEQID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。所述荧光定量PCR反应液包括50×ROXReference Dye、2×SYBR Premex Ex TaqII(TIi RNaseH Plus)，去离子水。
本发明还公开了一种检测FDCSP表达水平的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：上游引物(10μmol/L)2μL；下游引物(10μmol/L)2μL；样品cDNA4μL；50×ROX Reference Dye1μL；2×SYBR Premex ExTaqII(TIi RNaseH Plus)25μL，加离子水至50μL。荧光定量PCR程序：95℃30-60s预变性，接30-40个循环：95℃5-10s，60℃30-60s。
所述的试剂盒还包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液；
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂，包括TRIzol等；
所述的试剂盒还包括DEPC处理水、无菌水。
所述的试剂盒应用于FDCSP基因的定量检测，制备区别胆囊息肉和胆囊结石辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。。
本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107-102copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。
本发明优点：
(a)本发明提供的FDCSP能很好的区别胆囊息肉组织和胆囊结石组织，可作为检测胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。
(b)本发明提供的检测FDCSP表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，有保证了结果的一致性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1研究样本的收集及RNA提取
收集7例胆囊结石样本和2例胆囊息肉样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
实施例2数据分析
测序平台：Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台
高通量转录组深度测序后，为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和KEGG通路的富集，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了1个在胆囊息肉中上调、在胆囊结石中下调的差异表达基因FDCSP。
实施例3胆囊息肉及胆囊结石组织FDCSP基因表达情况
一材料和方法
1、材料
胆囊息肉及胆囊结石组织取自于2005年-2010年住院病例，分别取了45例和38例。
2、方法
2.1胆囊息肉及胆囊结石组织总RNA的提取
按Trizol试剂盒说明书提取组织的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。采用总RNA抽提试剂盒子提取。主要操作步骤如下：
(1)用胞裂解液BL裂解组织细胞，离心取上层细胞，在上层细胞中加入1ml的Trizol，用带针头的一次性注射器抽打裂解物10次；
(2)静置5分钟后，加入200μl的氯仿，用力颠倒离心管混匀后，室温静置使之分层，12 000g离心5分钟，小心移取水相至1.5ml的离心管中；
(3)加入等体积的异丙醇，彻底混匀后，取出750μl移入吸附柱，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，将剩余的全部将入吸附柱中，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中；
(4)加入500μL RP液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中；
(5)将500μl的W3液，静置1分钟，离心15秒；
(6)将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500μl W3液，离心15秒；
(7)倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一收集管中，离心1分钟；
(8)将吸附柱放入另一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50μl纯水，室温静置1分钟后，离心1分钟，将RNA贮存于-70℃；
(9)总RNA完整性鉴定：取2μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带；
(10)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
2.2FDCSP基因检测引物设计与合成
根据PCR引物设计原则，应用Premier5.0和增强版的OligoArchitectTM软件进行引物设计。
FDCSP的上、下游引物序列分别为：
上游引物：5’-AAGAAGTATCAGTGACAG-3’；SEQ ID NO.1
下游引物：5’-TTCAGGTATTGGAATAGG-3’；SEQ ID NO.2
产物长度为138bp。
内参基因GAPDHP65的上、下游引物序列分别为
上游引物：5’-GAGATTAGTTAAGTGGACATT-3’；SEQ ID NO.3
下游引物：5’-AAGAGAAGATGTGGTTGT-3’；SEQ ID NO.4
产物长度为103bp。
2.3定量标准曲线的建立
标准DNA模板的制备
按照说明书，从胆囊息肉或胆囊结石组织中，利用Invitrogen RTIZOL试剂盒提取总RNA，并进一步采用RNA clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)对总RNA进行过柱纯化，接着进行逆转录反应：
第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下：
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O 加水至10μl
将上述组份混合后42℃反应2min；
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 使用量
步骤1的反应液 5.0μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl
RT Primer Mix 0.5μl
5×PrimeScript Buffer2 2μl
RNase Free dH2O 2.0μl
总体积 10μl
将上述组份混合均匀后37℃孵育15min，然后85℃灭活5sec，即得到cDNA。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR，反应体系和条件如下：10×Ex Taqbuffer5μL，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)2μL，上游引物(10pmol)2μL，下游引物(10pmol)2μL，cDNA(0.1-2μg)2.5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，双蒸水补齐至50uL。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，30cycles；最后72℃延伸10min。
取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化(回收使用试剂盒：EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit)，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在108-102copies/μl)。
2.4敏感性实验
取重组质粒按比例稀释为108、107、106、105、104、103、102个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为108-102copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。
2.5qRT-PCR检测FDCSP基因表达量
取上述45例胆囊息肉组织和38例胆囊结石组织提取其总RNA，进行逆转录反应：
第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下：
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O 加水至10μl
将上述组份混合后42℃反应2min；
第二步反转录反应，反应体系及条件如下：
试剂 使用量
步骤1的反应液 5.0μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl
RT Primer Mix 0.5μl
5×PrimeScript Buffer2 2μl
RNase Free dH2O 2.0μl
总体积 10μl
将上述组份混合均匀后37℃孵育15min，然后85℃灭活5sec，即得到cDNA。采用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTMII(TIi RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(货号RR820A)。50μL qRT-PCR反应体系包括：上游引物(10μmol/L)2μL；下游引物(10μmol/L)2μL；样品cDNA4μL；50×ROX Reference Dye1μL；2×SYBR Premex Ex TaqII(TIi RNaseH Plus)25μL，加离子水至50μL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃30s。
对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。
根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较FDCSP基因在胆囊息肉组织及胆囊结石组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FDCSP在胆囊息肉组织的表达量在0.002-0.150之间，而胆囊结石组织中的表达水平明显低于胆囊息肉组织和对照质粒100copies，以上结果说明FDCSP在胆囊息肉组织中高表达，在胆囊结石组织中的低表达。
实施例4一种检测FDCSP基因的试剂盒及使用方法
RNA提取试剂：Invitrogen RTIZOL试剂
反转录试剂：TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)
荧光定量试剂：
荧光定量PCR反应体系及方法：
50μL荧光定量PCR反应体系包括：上游引物(10μmol/L)2μL；下游引物(10μmol/L)2μL；样品cDNA4μL；50×ROX Reference Dye1μL；2×SYBR Premex Ex TaqII(TIi RNaseH Plus)25μL，加离子水至50μL。
荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接35个循环：95℃5s，60℃30s。
实施例5一种检测FDCSP蛋白的试剂盒及使用方法
该试剂盒含有a.提供FDCSP蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定FDCSP蛋白的试剂。所述试剂包括针对人FDCSP蛋白的特异性抗体(如博士德生物的FDCSP(FDC-SP)Antibody，货号BA2313-1；或者用标准的杂交瘤技术产生的抗FDCSP蛋白的单克隆抗体)。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在FDCSP蛋白及蛋白的含量。此外，试剂盒还可以进一步包括组织蛋白抽提试剂，蛋白定量试剂以及蛋白marker等。
本发明通过高通量转录组深度测序及生物信息学分析，筛选到1个在胆囊息肉中上调、胆囊结石中下调的基因FDCSP，进一步采用荧光定量PCR对其进行经典的分子生物学实验验证，结果显示筛选得到的FDCSP基因可作为区别胆囊息肉和胆囊结石的特异性标记分子。同时本发明还提供了检测FDCSP表达水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，又保证了结果的一致性，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.FDCSP基因作为特异性标记分子在制备区别胆囊息肉和胆囊结石的诊断剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FDCSP基因在胆囊息肉组织中高表达，在胆囊结石组织中低表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断剂为能特异且定量鉴定FDCSP基因mRNA和/或FDCSP蛋白的试剂。
4.用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a.提供FDCSP蛋白的平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定FDCSP蛋白的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能特异性结合FDCSP蛋白的抗体。
6.用于检测个体胆囊息肉和/或胆囊结石的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：a.提供FDCSP基因mRNA平均量的标准对照；b.能特异且定量鉴定FDCSP基因mRNA的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂是能与所述的FDCSPmRNA杂交的多核苷酸探针和/或能在扩增反应中特异性扩增部分或全长FDCSP基因片段的两条寡核苷酸引物。
8.根据权利要求6或7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性寡核苷酸引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。
9.根据权利要求7-8任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的寡核苷酸引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
10.根据权利要求4-9任意一项所述的试剂盒，其特征在于，PCR体系包括：上游引物、下游引物、样品cDNA、2×UltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer，SuperEnzyme Mix，RNase-Free Water；荧光定量PCR程序：95℃30-60s预变性，接30-40个循环：95℃5-10s，60℃30-60s。
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