CN107760782A - 一种exosome来源的与肝癌相关的miRNA‑33b及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肿瘤源性的exosome来源的与人类肝癌相关的miRNA标志物及其在诊断人类肝癌中的用途，所述miRNA该标志物为exosome来源的miRNA‑33b。本发明还提供了检测exosome来源的miRNA‑33b的试剂、含有该检测试剂的试剂盒及其在诊断人类肝癌中的用途。本发明还提供了用于检测exosome来源的miRNA‑33b的方法及其在诊断人类肝癌中的用途。本发明还提供了从少量血清中快速提取exosome的试剂、含有该exosome提取试剂的试剂盒以及使用该试剂盒从血液中提取exosome的方法。本发明的miRNA标志物及其检测试剂可用于肝癌的早期诊断，其灵敏性和特异性均优于现有技术。

Description

一种exosome来源的与肝癌相关的miRNA-33b及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种exosome来源的与人类肝癌相关的miRNA标志物及其用途，更具体的涉及人类血液中肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b及其在诊断肝癌中的应用。

背景技术

微小RNA(microRNA，miRNA)来源于长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA在细胞核中经酶切作用，形成具有茎环结构的miRNA前体，miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA；成熟的miRNA在特定的宿主细胞内与脂质或脂蛋白结合形成微囊泡，以外切酶体形式分泌至胞外，经体液微循环，被内吞入特定的受体细胞内发挥特定调节功能。肿瘤相关miRNA可能来源于肿瘤细胞死亡、溶化或肿瘤细胞向周围环境所释放的miRNA。miRNA可在转录后水平通过与靶基因特异性的碱基互补配对，引起靶基因的降解或者抑制其翻译，调控癌基因和/或抑癌基因的表达，广泛参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化侵袭、迁移血管生成等，与多种肿瘤的发生发展及预后关系密切。因此，有学者提出了“癌microRNA”(OncomiRs)的观点，即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中充当了类似癌基因的角色。

Exosomes是一种纳米级的小囊泡状结构，存在于血液或其他生物体液中。它形成于众多细胞(包括树突状细胞和肿瘤细胞)的胞吐作用。Exosomes的外膜是由脂质双分子层组成，其成分包含有选择性蛋白、mRNA和miRNA。在Exosomes中包含有大于120种的miRNA，exosome中的miRNA可以影响干细胞变异(let-7)、器官形成(miR-1)、造血作用(miR-181)、肿瘤发生(miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-93-1)以及新陈代谢。

肝癌是严重威胁我国人民生活健康的疾病之一，其致死率位居第三位。全世界每年因肝癌死亡的患者中，约有40％来自中国。80％的肝癌常与慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有关。如此高的致死率是因为缺乏敏感而特异的无创性指标来进行早期诊断。由于早期肝癌症状不明显，通常在晚期才得以确诊，那时，由于大多存在癌细胞肝内或/及肝外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会。

随着治疗方法和影像检测技术水平的提高，早期肝癌根治切除术后的五年生存率已大大提高。然而，由于大部分的肝癌患者在确诊的时候已经处于晚期，肝癌患者的整体治疗效果及病人预后都比较差。目前临床应用多种治疗手段(手术切除、放疗，化疗及联合治疗方法)，仍无法彻底解决肿瘤治疗中存在的复发和转移的问题。秉承早发现早治疗的原则，及早发现肝癌的发生和转移，对于改善患者预后，提高临床治疗效果至关重要。

目前对于肝癌的诊断主要依靠影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振(MRI)等，同时结合血清中的肿瘤标志物如甲胎蛋白(AFP)等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。因此，开发一种高敏感性和特异性的肝癌诊断方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种血液中肿瘤源性的exosome来源的与肝癌相关的miRNA标志物，所述标志物是exsome来源的miRNA-33b，其序列为：5’-5’-UUCAUUCAUUACUUUUGUACGC-3’。

本发明还提供了exsome来源的miRNA-33b在诊断人类肝癌中的用途。

本发明还提供了一种检测肿瘤源性的exosome来源的与肝癌相关的miRNA-33b标志物的试剂，所述试剂是用于扩增所述miRNA-33b的引物对，或者是用于检测所述miRNA-33b的探针；优选地，用于扩增所述miRNA-33b的正向引物为：5’-actcactagttggcccaattacttatggta-3’，反向引物为：5’-cgccggagtgcctgtcgtggagt-3’。

本发明还提供了一种诊断人类肝癌的试剂盒，其包含检测肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b标志物的试剂，所述试剂是用于扩增所述miRNA-33b的引物对，或者是用于检测所述miRNA-33b的探针。进一步地，所述试剂盒还包含PCR反应常用的试剂和酶，所述常用试剂包含PCR反应缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、dNTP等；所述酶包含M-MLV逆转录酶、polyA多聚酶；所述试剂盒还可以包括标准品和/或对照品。

本发明还提供了检测血液中肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b标志物的试剂在制备用于诊断人类肝癌的试剂盒中的用途，所述试剂是用于扩增所述miRNA-33b的引物对，或者是用于检测所述miRNA-33b的探针。进一步地，所述试剂盒还包含PCR反应常用的试剂和酶，所述常用试剂包含PCR反应缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、dNTP等；所述酶包含M-MLV逆转录酶、polyA多聚酶；所述试剂盒还可以包括标准品和/或对照品。

本发明还提供了检测肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b标志物的试剂在诊断人类肝癌中的用途，所述试剂是用于扩增所述miRNA-33b的引物对，或者是用于检测所述miRNA-33b的探针。

本发明还提供了一种检测肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b标志物的方法，所述方法包括：(1)分离纯化血液中肿瘤源性的exosome；(2)提取样本总RNA；(3)将步骤(2)获得的RNA逆转录成cDNA；(4)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(3)获得的cDNA和参照基因进行扩增检测；(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。优选地，所述步骤(4)中对cDNA进行扩增检测时所用的正向引物为：5’-actcactagttggcccaattacttatggta-3’，反向引物为：5’-cgccggagtgcctgtcgtggagt-3’。

本发明还提供了检测肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b标志物的方法在诊断人类肝癌中的用途。

本发明还提供了一种从少量血清中快速提取exosome的试剂，所述试剂是用于沉淀exosome的聚合物，优选地，所述试剂是北京捷腾生物科技公司的GenExo试剂。

本发明还提供了一种从少量血清中快速提取exosome的试剂盒，其含有上述提取exosome的试剂，优选地，所述试剂盒还包含用于进一步纯化分离exosome的层析柱，更优选地，所述试剂盒还包括健康人血清exosome标准品或/对照品。

本发明还提供了一种利用exosome试剂盒从血液中提取exosome的方法，包括：1)取1ml样本血浆，3000×g离心15分钟，吸取上清；2)根据北京捷腾生物科技公司提供的GenExo exosome提取试剂盒的使用说明，将上清移入离心管中，按照1∶1的比例在上清中加入GenExo试剂，室温下静置反应5分钟；3)收集沉淀物(含exosome)；4)加入100μl样本缓冲液充分混合震荡，然后加入层析管中，1500×g离心5分钟，收集流出液；-80℃保存。

具体来说，本发明解决技术问题的技术方案包括：

(1)建立统一标准的标本库和数据库，以标准操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；

(2)血液中肿瘤源性exosome来源的miRNA差异表达谱分析：选择肝癌病例和肝脏良性疾病患者的血液样本，收集肿瘤源性exosome来源的miRNA，进行芯片分析，筛选差异表达的miRNA；

(3)对已筛选的差异表达miRNA在大样本人群中进行定量分析。

上述步骤(3)中的大样本定量分析可以采用RT-PCR、QPCR、Solexa测序技术、Tapman low densityarray(TLDA)芯片检测等来完成。在本发明的具体的实施方案中，采用QPCR进行验证。

采用QPCR进行差异表达miRNA的验证，具体的操作步骤为：

(1)分离纯化血液中肿瘤源性的exosome；

(2)提取样本总RNA；

(3)将步骤(2)获得的RNA逆转录成cDNA；

(4)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和参照基因进行扩增检测；

(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

其中，在步骤(3)中，可以采用加尾法或茎环法将总RNA中的miRNA反转录成cDNA。

加尾法的实验原理是：在小RNA的3’末端由polyA聚合酶加上一段polyA尾巴，然后用一个3’末端含有一段polyT的长引物将miRNA逆转录成cDNA，所得到的cDNA的长度比较适合进行荧光定量PCR。

茎环法的实验原理是：该方法应用了一个单一的茎环状的引物，避免对目的miRNA进行加尾。反应过程分两步：首先，茎环状引物与目的miRNA分子的3’端结合，引物3’端与miRNA的3’端有6个互补配对的核苷酸，然后用逆转录酶将之逆转录成cDNA第一链。其次是PCR反应。cDNA第一链的茎环状结构打开后，链的长度增加了，以其为模板即可进行传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结构，防止引物与pre-miRNA或其他长链RNA的杂交；茎部的碱基堆积增强了miRNA和DNA异质双链的亲合力，提高了逆转录的效率；且茎环状结构展开后增加了miRNA的长度，为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。

本发明的优点和有益效果如下：

(1)血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于肝癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)通过检测血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs的表达来诊断人类肝癌是否发生的试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于肝癌患者的辅助诊断，有助于反映肝癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用miRNA芯片对miRNAs进行分析，且应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中RNA提取及QRT-PCR检测过程中所用到的试剂，如TRIZOL、氯仿、异丙醇和75％乙醇等，均为市售产品。PCR扩增试剂盒(10Xbuffer、dNTPs mixture、Taq)及反转录反应试剂(RNase抑制剂、M-MuLV反转录酶、5×M-MuLV缓冲液以及反转录用dNTP混合物)均购买于TaKaRa公司；基于DNA染料法的荧光定量PCR检测试剂SYBR Green PCR Master Mix为AB公司产品；GenExo exosome提取试剂盒来自北京捷腾生物科技公司。

实施例1：与人类肝癌相关的miRNA的筛选

1.1样本的收集和样本资料的整理

发明人于2012年5月在北京医院收集了大量的肝癌患者和肝脏良性疾病患者的外周血样本(用于研究的样本为同期收集、采样、分装、保存条件均一)，通过对样本资料的整理，发明人从中选择了22例符合同医院、尽量同科室随机收集的肝癌病人血浆和22例同医院与实验组同一时期随机收集的肝脏良性疾病患者的血浆，尽量避免采取有肝癌家族史人的血浆的样本进行miRNA芯片的检测。

1.2miRNA芯片检测

1.2.1exosome的分离与纯化：

1)取1ml样本血浆，3000×g离心15分钟，吸取上清；

2)根据北京捷腾生物科技公司提供的GenExo exosome提取试剂盒的使用说明，将上清移入离心管中，按照1∶1的比例在上清中加入GenExo试剂，室温下静置反应5分钟；

3)收集沉淀物(含exosome)；

4)加入100μl样本缓冲液充分混合震荡，然后加入层析管中，1500×g离心5分钟，收集流出液；-80℃保存。

1.2.2总RNA的提取：

1)加入Trizol，室温保存5分钟；

2)加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10分钟；

3)12000rpm高速离心15分钟，吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

4)12000rpm高速离15分钟，小心弃掉上清液，按Trizol∶75％DEPC乙醇＝1∶1的体积比，向沉淀中加入75％DEPC乙醇(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。

1.2.3miRNA芯片操作

miRNA芯片购自ABI公司，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

1.2.4结果

根据miRNA芯片的检测结果，发现肝癌患者肿瘤源性的exosome来源的miRNA-26a和miRNA-33b的表达低于肝脏良性疾病患者，其中以miRNA-33b差异最为明显，所述miRNA-33b的序列为：5’-UUCAUUCAUUACUUUUGUACGC-3’。

实施例2：QPCR验证差异表达的miRNA-46a

根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-33b进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集和样本资料的整理的方式选择肝癌组和肝脏良性疾病组各150例样本。

2.1RNA提取过程同实施例1。

2.2反转录：

将10pg-1μg的总RNA模板与2μl的10×缓冲液、2μl的dATP(10mM)、0.5μl的polyA多聚酶、0.5μl的RNase抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1小时。然后，反应管中加入0.5μg/μl的Oligo(dT)特异性RT引物1μl，70℃孵育5分钟后立刻冰上孵育至少2分钟，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl的5×缓冲液、1μl的dNTP(10mM)、0.5μl的M-MLV反转录酶、0.5μl的RNase抑制剂、10μl的polyA反应混合液和4μl的无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1小时。

2.3QPCR反应：

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：

SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl∶1μl正向引物(5μM/μl)，1μl反向引物(5μM/μl)，2.0μl模板cDNA，8.5μl的无酶水。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃，10分钟；95℃，25秒，62℃，50秒，45个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。其中，扩增miRNA-33b的正向引物的序列为：5’-actcactagttggcccaattacttatggta-3’，反向引物为：5’-cgccggagtgcctgtcgtggagt-3’。以snRNA U6作为参照基因，扩增snRNA U6的上游引物的序列为：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；下游引物的序列为：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。

通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

结果：肝癌患者中，miRNA-33b的表达水平约为23％；而肝脏良性疾病患者中，miRNA-33b的表达水平约为95％。由此可知，与肝脏良性疾病患者相比，miRNA-33b在肝癌患者血液中的含量低，同RNA-sep结果一致。

实施例3：分析miRNA-33b对肝癌发病的诊断

以exosome来源的miRNA-33b为研究对象，并与血浆游离的miRNA在对照组和肝癌组敏感性和特异性上作比较。以肝癌病人为实验组、肝硬化病人和正常人作为对照组，首先利用exoquick试剂来提取血浆中的exosome(步骤同实施例1)。选用45例肝癌血清样本、36例肝硬化病人和36例正常人血清样本进行miRNA-33b的QPCR实验，求得各标本CT值，利用样本miRNA-33b CT值比U6CT值做散点图。

实验证明：exosome组聚集性比血浆组好。exosome组实验结果和之前肝癌组织与癌旁组织miRNA-33ba的表达趋势相同，而血浆组不明显，exosome组肝癌病人血浆与正常人血浆中的miRNA-33b有统计学意义。

利用ROC曲线分析显示，miRNA-33b在区分肝癌组和正常组时，其AUC值为0.7563，最佳临界点时的敏感性为75％、特异性为69％，而血浆组肝癌病人血浆和肝硬化病人血浆组无统计学差异。实验结果显示exosome中miRNA作为潜在的诊断标志物的灵敏性和特异性都好于血浆组。

显然，上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明做出种种的等同变型或替换，而这些等同的变型或替换也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种与肝癌相关的miRNA标志物及其在诊断人类肝癌中的用途，其特征在于，所述miRNA标志物为肿瘤源性的exosome来源的miRNA-33b，其序列为：5’-UUCAUUCAUUACUUUUGUACGC-3’。

2.一种检测权利要求1所述miRNA标志物的试剂，其特征在于，所述试剂是用于扩增所述miRNA-33b的引物对，或者是用于检测所述miRNA-33b的探针；优选地，用于扩增所述miRNA-33b的正向引物为：5’-actcactagttggcccaattacttatggta-3’，反向引物为：5’-cgccggagtgcctgtcgtggagt-3’。

3.一种诊断人类肝癌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的试剂，优选地，还包含PCR反应常用的试剂和酶。

4.权利要求2所述的试剂在制备用于诊断人类肝癌的试剂盒中的用途。

5.权利要求2所述的试剂在诊断人类肝癌中的用途。

6.一种检测权利要求1所述的miRNA标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)分离纯化血液中肿瘤源性的exosome；

(2)提取样本总RNA；

(3)将步骤(2)获得的RNA逆转录成cDNA；

(4)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(3)获得的cDNA和参照基因进行扩增检测；

(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；

优选地，所述步骤(4)中对cDNA进行扩增检测时所用的正向引物为：5’-actcactagttggcccaattacttatggta-3’，反向引物为：5’-cgccggagtgcctgtcgtggagt-3’。

7.权利要求6所述的方法在诊断人类肝癌中的用途。

8.一种从少量血清中快速提取exosome的试剂，所述试剂是用于沉淀exosome的聚合物，优选地，所述试剂是北京捷腾生物科技公司的GenExo试剂。

9.一种从少量血清中快速提取exosome的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求8所述的试剂；优选地，所述试剂盒还包含用于进一步纯化分离exosome的层析柱；更优选地，所述试剂盒还包括健康人血清exosome标准品或/对照品。

10.一种利用权利要求9所述的试剂盒从血液中提取exosome的方法，包括：

1)取1ml样本血浆，3000×g离心15分钟，吸取上清；

2)根据北京捷腾生物科技公司提供的GenExo exosome提取试剂盒的使用说明，将上清移入离心管中，按照1∶1的比例在上清中加入GenExo试剂，室温下静置反应5分钟；

3)收集沉淀物(含exosome)；

4)加入100μl样本缓冲液充分混合震荡，然后加入层析管中，1500×g离心5分钟，收集流出液；-80℃保存。