CN108034724A - 用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状rna分子标记物及其应用 - Google Patents

用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状rna分子标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于预测中期结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物及其应用。所述环状RNA分子标记物包括circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391；其cDNA序列如依次如SEQ ID NO：1～4所示。通过检测上述四个环状RNA分子在中期结直肠癌患者组织中的表达水平，并通过相应的预测模型，达到预测患者预后及死亡风险的目的，提高了通过结直肠癌患者组织标本预测预后及死亡风险的准确性，对患者的进一步诊治方案和延长患者生存期具有重大意义。

Description

用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物及 其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，更具体地，公开了一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal carcinoma，CRC)是世界十大恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率都位居恶性肿瘤的前列。根据全国范围的死亡原因调查发现，结直肠癌在因恶性肿瘤死亡中位居男性和女性死亡原因的第五位和第四位。由于结直肠癌早期症状不明显，且多数患者缺乏普查意识，往往出现症状才到医院就诊，而此时多已是中晚期结直肠癌，即使对其进行了以手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗，仍会有50％的患者出现复发转移，严重影响了结直肠癌患者的预后。因此，针对结结直肠癌患者新的预后标志物的发现，能够较准确的预测患者的预后风险和死亡风险，为患者的进一步诊治提供依据，对结直肠癌的诊断和治疗的有重大意义。
近年来，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的研究越来越引起人们的关注。基因组中编码蛋白质的区域不超过整个基因组的3％，其余部分都不参与编码蛋白质或者多肽，但大量转录组测序的研究表明，基因组的非编码序列是可以表达的，其表达产物就是非编码RNA，并且具有生物学功能。目前，已经有越来越多的研究来探究非编码RNA的生物学功能。其中，环状RNA(circular RNA，circRNA)作为一类特殊的非编码RNA分子，正成为非编码RNA研究领域的热点。
与线性RNA不同的是，环状RNA是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，通过针对环形结构等的实验设计，结合新一代高通量测序技术，已经有越来越多的环状RNA分子被鉴定出来，并且有许多环状RNA分子研究已经证明了环状RNA具有包括竞争性内源RNA，编码多肽等多种生物学功能，影响各种疾病包括肿瘤的发生发展。
环状RNA由可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，且具有高度保守型，同时具有一定的组织、时空和疾病特异性。由于其封闭环形结构，使其具有不易被核酸外切酶RNase R降解，比线性RNA更加稳定。以上特点使得环状RNA分子具有成为疾病诊断分子标志物的潜能。
专利CN201510160436.1、CN201510160437.6、CN201510160145.2、CN201610518307.X和CN201610533247.9均公开了与结直肠癌相关的环状RNA分子，但都是通过单个环状RNA分子进行检测，且针对的都是有无罹患结直肠癌的预测或诊断；目前，还未见有利用环状RNA分子对已患病的中期结直肠癌患者进行预后及死亡风险预测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服环状RNA分子在中期结直肠癌预后及死亡风险预测方面存在的缺陷和不足，提供一组用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物circRNA13452、hsa_circ_0008039、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391，通过综合分析上述四个环状RNA分子在中期结直肠癌患者组织中的表达水平，通过建立预后模型，达到预测患者预后及死亡风险的目的。
本发明的目的是提供一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物。
本发明的另一个目的是提供所述环状RNA分子标记物的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一组用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物，包括circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391，其cDNA序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。
本发明还请求保护上述环状RNA分子标记物在制备预测结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒或构建预测结直肠癌预后及死亡风险的模型中的应用。
一种用于检测权利要求1所述环状RNA分子标记物的荧光定量PCR引物组，包括分别检测circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391的上下游引物，其序列依次如SEQ ID NO：5～12所示。
本发明还提供一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的模型，所述模型为通过检测circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391的表达量来计算中期结直肠癌组织样本的预后评分指数，预后评分指数＝(0.4461×circRNA13452)+(-0.3879×hsa_circ_0008039)+(0.2159×hsa_circ_0079480)+(0.4461×hsa_circ_0087391)。
本发明还提供一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒，包含检测上述环状RNA分子标记物的荧光定量PCR引物组。
优选地，所述试剂盒检测待测样本的10μL体系为：2×GoTaq qPCR MasterMix 5μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，无酶水3.6μL，cDNA 1μL，共10μL。
优选地，所述试剂盒检测待测样本的PCR反应程序为：95℃2min；95℃15sec，60℃，1min，重复循环40次；4℃保存。
优选地，所述试剂盒还包含荧光定量PCR所需试剂。
本发明还提供利用上述试剂盒进行中期结直肠癌预后及死亡风险的方法为：
S1.提取中期结直肠癌组织样品RNA，逆转录成cDNA；
S2.利用上述引物组对S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，计算环状RNA分子的表达量。
S3.根据预后风险模型-预后评分指数＝(0.4461×circRNA13452)+(-0.3879×hsa_circ_0008039)+(0.2159×hsa_circ_0079480)+(0.4461×hsa_circ_0087391)计算出中期结直肠癌组织样本的预后评分指数，以预测中期结直肠癌的预后情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种用于预测中期结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子，所述环状RNA分子包括circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391；其cDNA序列如依次如SEQ ID NO：1～4所示。通过检测上述四个环状RNA分子在中期结直肠癌患者组织中的表达水平，并通过相应的预测模型，达到预测患者预后及死亡风险的目的，提高了通过结直肠癌患者组织标本预测预后及死亡风险的准确性，对患者的进一步诊治方案和延长患者生存期具有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用所述4个环状RNA分子对内部验证集样本判别的总生存及无进展生存的生存曲线图。图A为对内部训练集样本判别的总生存曲线图，图B为对内部训练集样本判别的无进展生存曲线图，图C为对内部验证集样本判别的总生存曲线图，图D为对内部验证集样本判别的无进展生存曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子及预后风险模型建立
1、环状RNA分子的筛选及预后风险模型的建立
(1)选取20例中期结直肠癌肿瘤组织和20例正常组织，其中20例中期结直肠癌患者组织又分为10例复发患者组织和10例未复发患者组织，使用TRIZOL的方法提取组织中的RNA；
(2)采用RNA-seq的高深度测序方法检测步骤(1)组织中的全部RNA表达，鉴定已有以及新发现的环状RNA，筛选在中期结直肠癌患者肿瘤组织相比正常组织高表达的环状RNA，以及中期结直肠癌复发患者组织相比未复发患者组织高表达的环状RNA，取两者环状RNA分子的并集，进一步筛选出能在中期结直肠癌患者肿瘤组织和复发患者中检测出来并且高表达一致的环状RNA分子。
(3)设计步骤(2)所得环状RNA分子的特异性荧光定量PCR引物。
(4)选取步骤(1)中部分样本，使用随机引物对组织RNA进行逆转录，得到组织cDNA，采用步骤(3)的特异性引物，通过荧光定量PCR的方法，对步骤(2)中筛选出的环状RNA进行验证，进一步筛选出荧光定量PCR结果和步骤(2)结果相一致的环状RNA分子。
(5)基于步骤(4)筛选到的环状RNA，对训练样本、验证样本、和外部验证样本进行荧光定量PCR检测，生成三个独立样本的数据集，其中训练和验证样本来自同一批，比例为2:1，外部验证来自非同一批；
所述数据的分析和模型的建立采取以下步骤：
首先，在训练数据集中，采用LASSO和MAD等方法，对步骤(4)的荧光定量PCR结果进行筛选；
然后，通过建立多变量COX比例风险模型，最终筛选出4个环状RNA分子用于中期结直肠癌的预后预测，分别为circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391(表1所示)，通过等比例风险回归模型进行建模，得到以上四个环状RNA分子的回归系数，其cDNA序列如依次如SEQ ID NO：1～4所示，用于检测上述环状RNA分子的引物如SEQ ID NO：5～12所示(表2)。
表1 4个用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子
环状RNA名称 系数 风险比 标准差 Z值 P值
circRNA13452 0.4461 1.5622 0.1559 2.86 0.0042
hsa_circ_0008039 -0.3879 0.6785 0.0884 -4.39 1.1e-05
hsa_circ_0079480 0.2159 1.2410 0.1229 1.76 0.0791
hsa_circ_0087391 0.3957 1.4854 0.1390 2.85 0.0044
表2用于预测预后的环状RNA分子的荧光定量PCR引物
所述环状RNA分子的荧光定量PCR扩增反应体系为：使用Promega的荧光定量PCR的试剂盒(qPCR Master Mix，货号：A6001)，PCR反应检测体系为10ul。
反应体系如下：
所述环状RNA分子的荧光定量PCR扩增反应体系程序为：将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于95℃预加热2min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环。重复循环40次。最后，在4℃保存。
接着，在训练集中确定这4个环状RNA中每一个环状RNA的回归系数，通过环状RNA分子荧光定量PCR检测结果计算合并后的线性预后评分指数，并在验证集中进行验证，其线性方程表示如下：预后评分指数＝(0.4461×circRNA13452)+(-0.3879×hsa_circ_0008039)+(0.2159×hsa_circ_0079480)+(0.4461×hsa_circ_0087391)；使用该预后评分指数在提供的内部中期结直肠癌组织样本和外部中期结直肠癌组织样本进行验证。
2、预后风险模型验证
通过建立多变量COX比例风险模型，用环状RNA分子(4个环状RNA分子：circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391)构建一个预后风险模型，并计算出每个样本的预后评分指数(环状RNA合并风险分数，指定为cp-score)。选取0为cut-off值，将中期结直肠癌患者分为低风险组和高风险组。无论在训练集还是验证集，低风险组患者的生存均明显优于高风险组(如图1所示)。多元变量分析表明，cp-score与死亡风险显著相关，并且是生存的独立危险因素(如表4所示)。
表4中期结直肠癌患者多变量生存分析
基于上述技术方案，本发明所述的环状RNA分子及检测方法可有效的用于预测中期结直肠癌的预后和死亡风险。该环状RNA分子标记物共包含四个环状RNA分子，通过检测患者肿瘤组织中circRNA13452，hsa_circ_0008039，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391共4个环状RNA分子的表达水平的改变，用于预测中期结直肠癌环状的预后和死亡风险，从而提高了通过中期结直肠癌患者组织标本预测预后的准确性，对患者的进一步诊治方案和延长患者生存期具有重大意义。
实施例2用于预测中期结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒
用于预测中期结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒，所述试剂盒包含下列所示检测4种环状RNA分子的荧光定量PCR引物：
所述环状RNA分子的荧光定量PCR扩增反应体系为：使用Promega的荧光定量PCR的试剂盒(qPCR Master Mix，货号：A6001)，PCR反应检测体系为10ul。
反应体系如下：
所述环状RNA分子的荧光定量PCR扩增反应体系程序为：将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于95℃预加热2min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环。重复循环40次。最后，在4℃保存。
具体地，利用上述试剂盒进行中期结直肠癌预后及死亡风险的方法为：
S1.提取中期结直肠癌组织样品RNA，逆转录成cDNA；
S2.利用上述引物组对S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，计算环状RNA分子的表达量。
S3.根据预后风险模型-预后评分指数＝(0.4461×circRNA13452)+(-0.3879×hsa_circ_0008039)+(0.2159×hsa_circ_0079480)+(0.4461×hsa_circ_0087391)计算出中期结直肠癌组织样本的预后评分指数，以预测中期结直肠癌的预后情况。
以上对本发明公开的一种用于预测中期结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子以及检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心
<120> 用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物及其应用
<130> 1715395ZBSH042
<141> 2017-12-29
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 499
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
ctggagaatg ctggaggaga ccttaaggat ggccaccacc actatgaagg agctgttgtc 60
attctggatg ctggtgctca gtacgggaaa gtcatagacc gaagagtgag ggaactgttc 120
gtgcagtctg aaattttccc cttggaaaca ccagcatttg ctataaagga acaaggattc 180
cgtgctatta tcatctctgg aggacctaat tctgtgtatg ctgaagatgc tccctggttt 240
gatccagcaa tattcactat tggcaagcct gttcttggaa tttgctatgg tatgcagatg 300
atgaataagg tatttggagg tactgtgcac aaaaaaagtg tcagagaaga tggagttttc 360
aacattagtg tggataatac atgttcatta ttcaggggcc ttcagaagga agaagttgtt 420
ttgcttacac atggagatag tgtagacaaa gtagctgatg gattcaaggt tgtggcacgt 480
tctggaaaca tagtagcag 499
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
gaaggaagca gccaccctcg ccatggcctc cccgcccgcc tgcccctcgg aggaggacga 60
gagcctgaag ggctgtgagc tgtacgtgca gctgcacggg atccagcagg tcctcaaaga 120
ctgtatcgtc cacctctgca tctccaagcc cgaacgcccc atgaagttcc tccgggagca 180
cttcgagaag ctggagaagg aagaaaacag gcagattttg gcgcggcaaa agtcaaactc 240
acagtcggac tcccatgatg aggaggtgtc gcccaccccc ccgaaccctg tggtgaaggc 300
ccgccgccgg cgaggaggcg tgagtgccga ggtgtacacc gaggaggacg ccgtgtccta 360
cgtcaggaag gtgattccca aggactacaa aaccatgact gcgctggcca aggccatctc 420
caagaacgtg ctcttcgctc acctggatga caacgagagg ag 462
<210> 3
<211> 284
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
agagaatttc ccaagagatt tgtgtagtta tggatacaga agaagataac aaacatgtag 60
gtcatcttct tgaagaagtg ctgaaaagtg aattaaatca tgtaaaagtc acatctgagg 120
ctctgggtca tgctggcaga catcttcagc aaatcatctt agatcaatgc tacaattttg 180
tttgtgtgaa tgttacaacc tctgattttc aagaaaccca gaagttactg agcatgcttg 240
aagagagtag tctttgcatt ttatatcctg ttgttgttgt ttca 284
<210> 4
<211> 548
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
attatctgca attatgaaat gaagtaactc aagatgagca agttaaaagt gataccagaa 60
aaaagcctta ccaataattc taggatcgta ggactcctgg ctcaactgga gaagatcaat 120
gctgagcctt cagaatcaga cactgcccga tatgttacat caaaaattct tcatctggct 180
cagagtcaag aaaaaacaag gagagaaatg acagccaaag gttctacagg aatggaaatt 240
ctgctgtcaa cattagagat aaaaaatttg gagtaaaggc tagaattaat ggggctctga 300
atataaccct gaatttggtc aagcagaatt tgcagaatca tcgcttggtt ctaccttgcc 360
ttcagctttt acgagtatat tctgccaact aacacaaaag atcttcaaac tacacttaat 420
atcttaagca ttcttgttga gctggtgtca gctgctgtga attcagtatc cttagggaaa 480
aatggagttg tggaactgat gtttaaaatc attggaccat ttagtaagaa gaattccagt 540
cttataaa 548
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
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<213> 人(Homo sapiens)
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acgccgtgtc ctacgtcag 19
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<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
tggctgcttc cttcctcctc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
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<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 10
tcttgggaaa ttctcttgaa ac 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
tccagtctta taaaattatc tgc 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 12
cattgatctt ctccagttga 20

Claims (8)

1.一组用于预测结直肠癌预后及死亡风险的环状RNA分子标记物，其特征在于，包括circRNA13452、hsa_circ_0008039、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391，其cDNA序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。
2.权利要求1所述的环状RNA分子标记物在制备预测结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒或构建预测结直肠癌预后及死亡风险的模型中的应用。
3.一种用于检测权利要求1所述环状RNA分子标记物的荧光定量PCR引物组，其特征在于，包括分别检测circRNA13452、hsa_circ_0008039、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391的上下游引物，其序列依次如SEQ ID NO：5～12所示。
4.一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的模型，其特征在于，所述模型为通过检测circRNA13452、hsa_circ_0008039、hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391的表达量来计算中期结直肠癌组织样本的预后评分指数，预后评分指数=（0.4461×circRNA13452）+（-0.3879×hsa_circ_0008039）+（0.2159×hsa_circ_0079480）+（0.4461×hsa_circ_0087391）。
5.一种用于预测结直肠癌预后及死亡风险的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的荧光定量PCR引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测待测样本，10µL PCR反应检测体系为：2×GoTaq qPCR Master Mix 5µL，上游引物0.2µL，下游引物0.2µL，无酶水3.6µL，cDNA 1µL，共10µL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测待测样本的PCR反应程序为：95℃2min；95℃15sec，60℃，1min，重复循环40次；4℃保存。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含荧光定量PCR所需试剂。
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