CN115902237A - 用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物及其应用，属于医药技术领域。所述的生物标志物包括结合珠蛋白、胶原蛋白α‑3(VI)链、Coronin样蛋白A以及补体因子D中的至少一种。本发明还公开了所述的生物标志物在制备区分急性心梗未来发生心源性猝死患者与未来存活患者检测试剂盒或者检测试剂中的应用。该生物标志物通过对急性心肌梗死后发生心源性猝死患者的心梗入院早期血浆差异表达蛋白筛选获得，可以用于区分急性心肌梗死后发生心源性猝死的患者与幸存者。本发明的提出为心梗早期预测此后心源性猝死的发生提供了血浆蛋白生物标志物，同时为急性心肌梗死的预后评估提供了技术手段。

Description

用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一组用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物及其应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

长期以来，急性心肌梗死(AMI)是全球最主要的死亡原因之一，尽管AMI患者的早期再灌注治疗和使用二级预防性药物治疗大大降低了短期病死率，但幸存者在随后的数周、数月和数年内仍处于心源性猝死(SCD)的风险中。事实上，SCD占出院后所有死亡的20-40％之间，并且在AMI后的第一年风险特别高。因此，早期识别和治疗AMI后SCD高危患者仍然是临床优先事项。虽然一些心梗患者对适当的治疗有反应，但疾病进展是高度可变和不可预测的，尤其是支持心肌梗死后不良预后的分子驱动因素在很大程度上仍然难以捉摸。因此，并非所有心梗患者都能从相同的治疗中获益。

现有心梗后猝死可用的临床风险评分主要依赖心脏超声射血分数(LVEF)。然而，多项临床队列研究揭示LVEF在心梗后患者猝死风险分层上缺乏敏感性及特异性，其单独使用可能会忽略部分发生猝死但LVEF并未表现出显著降低的患者，并且部分表现出达到预测意义的该指标的患者或许已经发展到临床严重阶段，甚至可能迅速死亡。因此，开发新的方法来早期评估哪些病例可能会变得临床严重，以及建立更精准的风险分层策略以便早期确定治疗的时间和有效性是至关重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一组用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该生物标志物通过对急性心肌梗死患者血浆差异表达蛋白筛选获得，可以用于区分急性心肌梗死未来发生心源性猝死患者与未来存活患者，为急性心肌梗死后心源性猝死的早期预测提供血清标志物，为AMI的预后评估提供科学依据。本预测蛋白质组合方便快捷、灵敏特异，适于在临床予以推广应用。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明依赖对前期大规模临床急性心肌梗死患者队列后续发生心源性猝死或幸存的随访结局，构建在性别、年龄、靶病变部位及是否进行介入治疗这四方面相匹配的SCD组及幸存者组，并利用保存于生物样本库中的其入院早期血浆样本进行两组患者血浆中差异蛋白的筛选。本发明提供检测AMI的SCD预后生物标志物，包括：结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD,CFD)。

在上述研究的基础上，本发明提出了用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物，所述的生物标志物包括结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD，CFD)中的至少一种。

其中，优选的，所述的生物标志物由结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD,CFD)组成。

进一步的，本发明还提出了所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物在制备区分急性心肌梗死未来发生心源性猝死患者与未来存活患者检测试剂盒或者检测试剂中的应用。以及

检测所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物的试剂在制备区分急性心肌梗死未来发生心源性猝死患者与未来存活患者检测试剂盒或者检测试剂中的应用。

其中，优选的，检测所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物的试剂为分别检测结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(ComplementfactorD,CFD)的ELISA检测试剂。

其中，优选的，采用ELISA方法检测血浆样品中生物标志物的含量。

其中，优选的，所述的ELISA方法包括以下步骤：

(1)收集待测急性心肌梗死患者心梗早期的血浆样品，并以急性心肌梗死后未发生心源性猝死的幸存者在心梗早期的血浆样品作为对照；

(2)检测待测急性心肌梗死患者和急性心肌梗死后未发生心源性猝死的幸存者的心梗早期血浆样品中生物标志物的含量，并将所得结果进行比对；

(3)根据比对结果指示待测急性心肌梗死患者是否为未来会发生心源性猝死的患者；

其中，利用结合珠蛋白、胶原蛋白α-3(VI)链、Coronin样蛋白A和补体因子D四种生物标志物对所述待测对象血浆样品进行检测时，若待测对象血清样品中所用的生物标志物的含量高于对照，则指示所述待测对象为急性心梗发生未来心源性猝死风险较高的患者。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明基于前期AMI临床队列患者血浆样本的蛋白组学数据，通过从中筛选发生SCD的AMI患者在心梗入院早期最佳的血清标志物组合模型并在此后的验证队列中对其预测能力予以进一步确认。在内部ELISA队列验证中，TOP4蛋白模型在AMI后SCD患者和幸存者中表现出显著差异，AUC为0.767，而在外部队列ELISA验证中AUC能够达到0.792，相比当前临床所使用的LVEF或Risk Score显示出较优的灵敏度和特异性，对AMI早期诊断、远期预后及生活质量的改善具有较大的临床价值和实际意义。所筛选的四个蛋白可能参与AMI的发病，并可作为AMI的诊断生物标志物和新的治疗靶点，这为临床急性心肌梗死早期诊断和预后评估提供了新的技术手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HP、COL6A3、CORO1A、CFD 4个因子作为生物标志物在急性心肌梗死心梗后猝死组和存活组中表达水平浓度数值；

图2为HP、COL6A3、CORO1A、CFD 4个因子作为生物标志物在区分急性心肌梗死心梗后猝死组和存活组时的ELISA实验蛋白表达水平。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1急性心肌梗死心梗后猝死患者血清差异表达蛋白筛选

匹配性别、年龄差<＝1岁、靶病变位置、术中PCI和MVD，分别选取急性心肌梗死后1月到1年内心梗后猝死病例以及相应存活的各55例，随后采用DIA定量蛋白质组学技术(data-independent acquisition,DIA)分析两组患者血清标本的蛋白质谱的变化，筛选差异表达蛋白并对其生物学功能进行分析。具体方法如下：

(1)蛋白提取及浓度测定

每个样品取40μL血液，以结合缓冲液(试剂盒：Binding Buffer)十倍稀释。除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液。除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管。加入结合缓冲液，让其靠重力流过柱体。将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体。以600μL结合缓冲液清洗柱体。再次以600μL结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本,真空冷冻干燥后备用。将冻干的样品加入300μL SDS裂解进行复溶。将溶液在室温下12000×g离心10min,取上清，重复离心一次取上清。上清即为样品的总蛋白溶液，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。

(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

每个样品取10μg蛋白，采用12％SDS-PAGE进行分离；分离后的凝胶使用eStain LG蛋白染色仪进行考马斯亮蓝染色。染色后的凝胶应用全自动数码凝胶图像分析系统成像。

(3)胰蛋白酶酶解

根据测定的蛋白浓度，每个样品取等量的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。在以上蛋白溶液中加入DTT，使得DTT的终浓度为4.5mM，混匀，在55℃孵育30min。在冰上进行冷却直到达到室温。(注意：用手感觉时溶液不能太冷也不能太热。)加入相应体积的碘乙酰胺，使得终浓度为9mM，充分混匀，室温避光放置15min。在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置四小时以上或者过夜。4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，挥发丙酮2-3min。加入100μLTEAB2复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK，并于37℃消化过夜。加磷酸调PH值为3左右终止酶解反应。

(4)肽段除盐

酶解后的肽段采用SOLA^TM SPE 96孔板脱盐。注意：在load肽段之前，务必将样品溶液pH调节至接近7。活化：200μL甲醇活化柱子，再重复2次。平衡：200μL纯水活化柱子，再重复2次。Load样品：体积50-500μL样品，调节真空，液滴速度保持在1mL/min(约1滴/秒)。重复load一次。Wash：200μL 5％甲醇清洗，再重复2次。洗脱：150μL 60％甲醇洗脱肽段，重复2次，共3次，得到450μL洗脱液，真空挥干。

(5)LC-MS/MS高分辨质谱检测

所有酶解后的样本取等量肽段混合，使用Agilent 1100HPLC系统，在pH＝10的流动相中进行组分分离。每个样品酶解后的肽段单独上机采集，扫描范围设置为350-1250m/z，isolation window为26m/z。LC-MS/MS原始数据的处理使用Spectronaut Pulsar软件完成。

(6)生物信息学分析

在GO富集分析过程中，通过GO注释将蛋白分为生物进程、细胞组成、分子功能3大类。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库用于通路的富集分析，最后根据KEGG网站(http://www.genome.jp/kegg/)通路层级分类方法将这些通路进行分类。InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)数据库用于分析差异表达蛋白的功能结构域的富集情况。在三种功能富集分析(GO，KEGG途径和蛋白质结构域)中，采用Fisher’s精确双端检验比较差异表达的蛋白质与所有蛋白质的富集，使用标准FDR对照方法对多种假设检验进行了校正，校正后的P<0.05被认为显著富集。

(7)通过分析筛选出53个差异蛋白的生物进程、细胞组成和分子功能及通路富集，选取42个蛋白进一步扩大样本分析。

实施例2急性心肌梗死心梗后猝死患者血清生物标志物筛选

匹配性别、年龄差<＝1岁、靶病变位置、术中PCI和MVD，分别选取急性心肌梗死后1月到1年内心梗后猝死病例以及相应存活的各105例，对非标记定量蛋白质组学技术筛选的42个蛋白进行靶向蛋白组学(Parallel reaction monitoring,PRM)分析。具体方法如下：

(1)蛋白提取及浓度测定

每个样品取40μL血液，以结合缓冲液(试剂盒：Binding Buffer)十倍稀释。除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液。除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管。加入结合缓冲液，让其靠重力流过柱体。将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体。以600μL结合缓冲液清洗柱体。再次以600μL结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本,真空冷冻干燥后备用。将冻干的样品加入300μL SDS裂解进行复溶。将溶液在室温下12000×g离心10min,取上清，重复离心一次取上清。上清即为样品的总蛋白溶液，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。

(2)蛋白样品的SDS-PAGE质控

每个样品取10μg蛋白，采用12％SDS-PAGE进行分离；分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。使用ImageScanner扫描仪进行扫描。染色后的凝胶应用全自动数码凝胶图像分析系统成像。

(3)蛋白质酶解

根据测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。在以上蛋白溶液中加入DTT，使得DTT的终浓度为4.5mM，混匀，在55℃孵育30min。在冰上进行冷却直到达到室温。(注意：用手感觉时溶液不能太冷也不能太热。)加入相应体积的碘乙酰胺，使得终浓度为9mM，充分混匀，室温避光放置15min。在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置四小时以上或者过夜。4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，挥发丙酮2-3min。加入100μLTEAB2复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK，并于37℃消化过夜。加磷酸调PH值为3左右终止酶解反应。

(4)肽段除盐

酶解后的肽段采用RP-C18固相萃取柱脱盐。甲醇1mL(含0.1％TFA)冲洗1次，90％乙腈-水1mL(含0.1％TFA)冲洗1次，水(含0.1％TFA)冲洗1次；样品加1mL水(含0.1％TFA)充分溶解，上样，靠重力自然吸附3次；0.1％三氟乙酸-水冲洗3次；用90％乙腈-水(含0.1％TFA)靠重力自然洗脱3次。真空抽干，60μL 0.1％甲酸-水复溶。

(5)LC-MS/MS分析

所有样本取等量蛋白分别进行酶解、除盐，肽段使用流动相A复溶后全部混合均匀，使用Agilent 1100HPLC系统，在pH＝10的流动相中进行组分分离。收集8-50分钟的样品，依次每隔一分钟收集一管，按此顺序循环收样至梯度结束。共得到10个组份，收集好后真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待质谱上机。iRT标准肽段被溶解为浓度为10×的溶液，-20℃保存(保质期12周)，质谱进样前，按照体积比iRT：待测样品＝1:10的体积比混合。导出目标肽段的定量信息，蛋白的定量值采用软件内置mean peptide quantity(即肽段定量均值)进行计算，并用于组间的统计分析。

(6)根据分析筛选出与DIA定量蛋白质组学结果中表达一致上调的31个蛋白质，进行后续生物标志物分析。结果显示有4个蛋白与SCD发生显著相关。

(7)统计结果

上述四种蛋白在急性心梗后1月至1年心梗后猝死和存活患者中存在显著差异，差异具有统计学意义(见表1)

表1筛选的血清中相关蛋白

实施例2急性心肌梗死心梗后猝死患者血清标志物扩大样本验证

在105对患者中进行ELISA实验验证上述4种蛋白因子能否判断急性心肌梗死患者的心梗后猝死。实验步骤如下(以结合珠蛋白的ELISA实验步骤为例)：

a.准备所有试剂、工作标准品和样品。

b.从板框中去除多余的微孔板条，将它们放回含有干燥剂包的铝箔袋中，重新密封并返回4℃存储。

c.将所有样品或标准品加入50μL到适当的孔中。

d.每孔加入50μLAntibody Cocktail。

e.密封板，室温下在设为400转/分的摇床中孵育1小时。

f.用3×350μL 1X洗涤缓冲液PT清洗每孔。通过从孔中抽吸或倾析进行清洗，然后将350μL 1X洗涤缓冲液PT分配到每孔中。1X洗涤缓冲液PT应在孔中停留至少10秒。在每一步完全去除液体是良好性能的必要条件。最后一次清洗后，将盘子翻转过来，轻轻拍打干净的纸巾，去除多余的液体。

g.每孔加入100μL的TMB Development Solution，在设为400rpm的摇床上黑暗中培养10分钟。考虑到实验室环境条件的可变性，最佳孵育时间可能在5到20分钟之间。注:加入停止液后，颜色由蓝色变为黄色，信号强度增强约3X。为避免信号饱和，在高浓度的标准品浓度达到OD₆₀₀＝1.0的蓝色前进行下一步操作。

h.每孔加入100μL的终止液。在振动筛上摇盘1分钟使其混合。在450nm处记录OD值。

i.通过上述ELISA方法，以HP、COL6A3、CORO1A、CFD分别作为生物标志物对急性心肌梗死心梗后猝死组和存活组进行分析检测，所得数据采用SPSS25.0及26.0统计学软件进行分析，明确新型标志物能否成为新的AMI诊断标志物应用于临床，同时探索联合指标对AMI诊断价值。

(2)结果分析

如图1所示，该图为HP、COL6A3、CORO1A、CFD 4个因子作为生物标志物在急性心肌梗死心梗后猝死组(D)和存活组(S)中表达水平浓度数值，结果显示：4个因子均能够很好的区分急性心肌梗死心梗后猝死患者和存活患者。

如图2所示，HP、COL6A3、CORO1A、CFD4个因子作为生物标志物在区分急性心肌梗死心梗后猝死组(D)和存活组(S)时的ELISA实验蛋白表达水平，结果显示：4个因子对急性心肌梗死心梗后猝死具有很好的诊断价值。

表2最佳因子组合用于区分高危急性心肌梗死心梗后猝死患者时的ROC统计结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物包括结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD，CFD)中的至少一种。

2.如权利要求1所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物由结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagenalpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD,CFD)组成。

3.权利要求1或2所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物在制备区分急性心肌梗死未来发生心源性猝死患者与未来存活患者检测试剂盒或者检测试剂中的应用。

4.用于检测权利要求1或2所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物的试剂在制备区分急性心肌梗死未来发生心源性猝死患者与未来存活患者检测试剂盒或者检测试剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的用于检测权利要求1或2所述的用于判断急性心肌梗死后心源性猝死的生物标志物的试剂为分别检测结合珠蛋白(Haptoglobin，HP)、胶原蛋白α-3(VI)链(Collagen alpha-3(VI)chain，COL6A3)、Coronin样蛋白A(Coronin-1A，CORO1A)以及补体因子D(Complement factorD,CFD)的ELISA检测试剂。

6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，采用ELISA方法检测血浆样品中生物标志物的含量。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的ELISA方法包括以下步骤：

(1)收集待测急性心肌梗死患者心梗早期的血浆样品，并以急性心肌梗死后未发生心源性猝死的幸存者在心梗早期的血浆样品作为对照；

(2)检测待测急性心肌梗死患者和急性心肌梗死后未发生心源性猝死的幸存者的心梗早期血浆样品中生物标志物的含量，并将所得结果进行比对；

(3)根据比对结果指示待测急性心肌梗死患者是否为未来会发生心源性猝死的患者；

其中，利用结合珠蛋白、胶原蛋白α-3(VI)链、Coronin样蛋白A和补体因子D四种生物标志物对所述待测对象血浆样品进行检测时，若待测对象血清样品中所用的生物标志物的含量高于对照，则指示所述待测对象为急性心梗发生未来心源性猝死风险较高的患者。

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