CN105466912B

CN105466912B - 一种检测阿尔法突触核蛋白的方法

Info

Publication number: CN105466912B
Application number: CN201510772846.1A
Authority: CN
Inventors: 鲁伯埙; 赵洪丽; 王坚; 丁滪; 侯家鹏; 王思清; 李长春; 王彬
Original assignee: Thousands Of Plans Changzhou Medical Device Industry Research Institute Co ltd; Changzhou Furuite Biotechnology Co ltd
Current assignee: Thousands Of Plans Changzhou Medical Device Industry Research Institute Co ltd; Changzhou Furuite Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2035-11-12
Also published as: CN105466912A

Abstract

本发明提供一种检测阿尔法突触核蛋白的方法，所述方法步骤如下：步骤1，收集病人脑脊液对病人进行腰穿，收集病人脑脊液，收集到的脑脊液必要时进行冷冻；步骤2，用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量；所测得的聚集体信号和总量的比值可应用于帕金森疾病及类似疾病的诊断。

Description

一种检测阿尔法突触核蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白含量的检测方法，特别涉及一种检测阿尔法突触核蛋白纯化蛋白以及病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体和总量的方法，并可用两者之比值用于帕金森疾病及类似疾病的诊断。

背景技术

AlphaScreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)技术是一种基于微粒与微粒之间靠近的效应用于分析物均相检测方法，是由1994年发明的LOCI(luminescent oxygen channeling immunoassay)这种技术的基础上演化而来。供体含包裹有光敏剂分子，受特殊波长680nm光激发，每秒产生6万个以上单线态氧分子，放大信号，但单线态氧半衰期仅为4μs，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等接近抗体，则受体中的荧光基团可迅速吸收单线态氧，以上转换方式产生520nm-620nm光信号，为检测器探测到。

AlphaLISA是在AlphaScreen技术的基础上，与经典的ELISA技术有相似之处的均相检测方法，我们称之为均相化学发光技术。因为这种方法不用洗涤，反应在均相中进行，其过程其实是个化学发光过程，已广泛用于药物筛选。

AlphaLISA方法的核心是供体(感光颗粒)和受体(发光颗粒)这两种直径约为200nm的微珠，在两种微珠表面与生物分子(抗体或抗原蛋白)相偶联，每一个颗粒表面可以覆盖成百上千个生物分子，可捕获待测分子。当微粒受到680nm的激光照射后，供体表面的光敏剂就会将溶液(AlphaLISA反应液)中的氧气转化为单线态氧。单线态氧在溶液中的传播距离约为200nm，如果供体和受体之间的距离小于200nm，单线态氧就能扩散至受体微粒，受体中的光敏化合物就能和单线态氧发生化学反应，其中Eu配合物就产生高能级的发光。相反，如果发光微粒和感光微粒之间的距离大于200nm，单体氧无法扩散至发光微粒，就不会有光信号的产生。AlphaLISA均相反应就是基于以上原理，如果包被在两种微粒表面的生物分子存在相互作用时，就拉近了两种微粒之间的距离，产生光信号。通过对光信号的强度检测，来判断实际检测样品中有无待测目标物以及目标物的含量。

基于AlphaLISA技术的原理，分子复合物小于200nm的范围内都可被检测到。而其他均相技术，例如时间分辨荧光(HTRF)、荧光偏振(FP)，供体和受体之间的距离只能在10nm内，仅限于小分子的检测。AlphaLISA可以应用于酶活性、受体配体反应、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳水化合物等检测。

帕金森病是神经退行性疾病，有复杂的运动障碍，为人熟知的有震颤麻痹，表现为休息震颤，运动迟缓，僵硬和姿势异常。此外，很多非运动特征也逐渐被认为是症状的完整组成部分。帕金森病的神经病理标志是多巴胺能神经元在黑质体(SN)的缺失以及路易体(LB)的神经内蛋白包涵体的形成，LB主要含有阿尔法突触核蛋白(Alpha Synuclein，α-syn)。阿尔法突触核蛋白错误折叠是导致帕金森病形成的病原，也被认为是脑脊液(CSF)可被检测的潜在生物标志物(biomarker)。患有突触核蛋白相关疾病包括帕金森病(PD)，多系统萎缩症(MSA)和路易体痴呆症(DLB)病人的脑脊液中阿尔法突触核蛋白单体浓度可能低于其他神经疾病的病人，而聚集体可能增多。但由于检测手段所限，结果一直有争议。

正如以上所述，AlphaLISA技术可以检测蛋白，多肽，核酸等物质，但是否能够用简易方法，以灵敏度高的方式检测阿尔法突触核蛋白，仍属于未知领域。

本发明发明人通过对检测条件以及分离方法的涉及，成功的研究出一种用AlphaLISA技术检测纯化的阿尔法突触核蛋白，包括检测其聚集体及蛋白总含量，用该方法获得的结果可以对帕金森病人体内阿尔法突触核蛋白的含量和正常人体内的含量进行对比从而用于帕金森疾病的诊断。

发明内容

本发明提供一种用AlphaLISA方法检测阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体及蛋白总含量的方法，可用于帕金森疾病的诊断。

本发明所述方法，步骤如下：

步骤1，收集病人脑脊液

对病人进行腰穿，收集病人脑脊液，收集到的脑脊液必要时进行冷冻。

步骤2，用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体及蛋白总含量。

其中，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量，方法如下：

取脑脊液样品，加入结合抗体的AlphaLISA受体微珠；再加入生物素化抗体；再加入链霉素亲和素供体微珠；用AlphaLISA测定仪器获取测定信号，用所得信号计算样品中的寡聚体和蛋白总量的比值。

优选的，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量，方法如下：

脑脊液样品4-6μL，加入5μL结合抗体的AlphaLISA受体微珠；室温避光孵育0.5—2小时；然后加入5μL生物素化抗体；室温避光孵育0.5—2小时；再加入10μL链霉素亲和素供体微珠；室温避光孵育0.5—2小时；AlphaLISA测定仪器获取测定信号，用所得信号计算样品中的聚集体和蛋白总含量比值。

最优选的，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量，方法如下：

脑脊液样品5μL以及5μL结合抗体的AlphaLISA受体微珠；室温避光孵育1小时；加入5μL生物素化抗体；室温避光孵育1小时；加入10μL链霉素亲和素供体微珠；室温避光孵育30分钟；AlphaLISA测定仪器获取测定信号计算样品中的Ab2-A/Ab2-B信号与Ab1-A/Ab2-B信号的比值。

本发明的方法可以分开进行，如：

一种检测阿尔法突触核蛋白聚集体的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)将阿尔法突触核蛋白的C端抗体Ab2分别标记AlphaLISA受体微珠和生物素得到Ab2-A和Ab2-B；

(2)在样品中加入步骤(1)标记好的Ab2-A和Ab2-B，并加入链霉亲和素供体微珠进行AlphaLISA实验；得到阿尔法突触核蛋白的聚集体AlphaLISA信号，测定Ab2-A/Ab2-B。

一种检测阿尔法突触核蛋白蛋白总量的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)将一种阿尔法突触核蛋白的C端抗体Ab2标记生物素得到Ab2-B，并将另一种阿尔法突触核蛋白抗体Ab1标记AlphaLISA受体微珠Ab1-A；

(2)在样品中加入步骤(1)标记好的抗体微珠Ab2-B和Ab1-A，并加入链霉亲和素供体微珠进行AlphaLISA实验；得到阿尔法突触核蛋白的总量AlphaLISA信号，测定Ab1-A/Ab2-B

有关的抗体说明：

检测过程中，需要将Ab1抗体和Ab2抗体分别交联上AlphaLISA受体微珠以及生物素化。该技术属于现有技术，即最常见的AlphaLISA免疫检测方法，其以传统的“三明治”结构为基础，采用链霉亲和素供体微珠和偶联了抗体的AlphaLISA受体微珠。将一个抗体生物素化，并与链霉亲和素包被的供体微珠结合。另一个抗体与AlphaLISA受体微珠直接偶联(用于直接测定方法)。利用两种抗体，一种是阿尔法突触核蛋白整体作为抗原的抗体，称为Ab1，另一种是识别阿尔法突触核蛋白C端的抗体，称为Ab2。其中，标记了的抗体有四种，分别命名为：AlphaLISA受体微珠标记的Ab1，称为Ab1-A；生物素标记的Ab1，称为Ab1-B；AlphaLISA受体微珠标记的Ab2，称为Ab2-A；生物素标记的Ab2，称为Ab2-B；

本发明进一步对有关术语解释如下：

脑脊液：由脑室中的脉络丛产生的无色透明的液体，充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内，属于细胞外液

阿尔法突触核蛋白聚集体：阿尔法突触核蛋白不以单体存在，而是聚集成多聚体，分子量在～146kD以上的复合物

阿尔法突触核蛋白蛋白：SNCA基因表达的含有146个氨基酸的蛋白

Western-blot检测阿尔法突触核蛋白：一种依赖抗原抗体特异性结合检测蛋白含量的方法

大肠杆菌表达阿尔法突触核蛋白：将阿尔法突触核蛋白基因克隆到原核表达载体上转化到大肠杆菌中表达阿尔法突触核蛋白蛋白

链霉素亲和素供体微珠：是一种交联上链霉素亲和素的直径为200nm的微珠，其包含了光敏剂苯二甲蓝(phthalocyanine)，在680nm激光照射下，它可以使周围的环境中的氧分子转化成一种高能活跃的单体氧(singlet oxygen)

AlphaLISA受体微珠：链霉素亲和素供体微珠使周围氧转化成单体氧后，单体氧在4μs的半衰期，单体氧可扩散200nm。如果受体微珠在此距离范围内，单体氧会触发受体微珠上的二甲基噻吩衍生物，继而通过激发一系列化学反应后最终产生615nm的光信号。

阿尔法突触核蛋白的C端抗体是已知物，描述在J.MOL.BIOL.(2010)402,326-343的文章中。

本发明采用的是本实验室的技术制备的，即使用如下基因序列通过蛋白重组技术制备：

GGTCAGCTGG TTGAATCTGG TGGTGGTTCT GTTCAGGCTG GTGGTTCTCT GCGTCTGTCT

TGCGCTGCTT CTGGTATCGA CTCTTCTTCT TACTGCATGG GTTGGTTCCG TCAGCGTCCG

GGTAAAGAAC GTGAAGGTGT TGCTCGTATC AACGGTCTGG GTGGTGTTAA AACCGCTTAC

GCTGACTCTG TTAAAGACCG TTTCACCATC TCTCGTGACA ACGCTGAAAA CACCGTTTAC

CTGCAGATGA ACTCTCTGAA ACCGGAAGAC ACCGCTATCT ACTACTGCGC TGCTAAATTC

TCTCCGGGTT ACTGCGGTGG TTCTTGGTCT AACTTCGGTT ACTGGGGTCA GGGTACCCAG

GTTACCGTTT CTTCTCAC

本发明制备的用于识别阿尔法突触核蛋白C端9个氨基酸的抗体，本发明中称为Ab2。具体制备方法如下：全基因合成表达Ab2的基因，与原核表达载体pT7N10C6载体连接，并在大肠杆菌BL21中表达所述的DNA片段编码Ab2；采用Ni2+亲和层析、阳离子交换柱、分子筛等方法对重组蛋白进行纯化，获得Ab2。

另一种阿尔法突触核蛋白抗体：商业购买的阿尔法突触核蛋白蛋白全长获得的抗体鼠来源IgG，本发明中称为Ab1。

生物素化抗体：标记上生物素的抗体，可以与链霉素亲和素受体微珠上的链霉亲和素结合。

结合抗体的AlphaLISA受体微珠，称为Ab2-A：阿尔法突触核蛋白C端的抗体Ab2与AlphaLISA受体微珠交联后所得产物。

结合抗体的AlphaLISA受体微珠，称为Ab1-A：阿尔法突触核蛋白蛋白全长获得的抗体Ab1与AlphaLISA受体微珠交联后所得产物。

生物素化抗体，称为Ab2-B：阿尔法突触核蛋白C端的Ab2抗体交联上生物素

Ab2-A/Ab2-B 其值用于检测阿尔法突触核蛋白蛋白寡聚体

Ab1-A/Ab2-B 其值用于检测阿尔法突触核蛋白蛋白总含量

本发明在得到仪器检测的信号后，用数学方法计算样品中的Ab2-A/Ab2-B信号与Ab1-A/Ab2-B信号的比值，数学的计算方法如下：

信号比值＝Ab2-A/Ab2-B信号/Ab1-A/Ab2-B信号

本方所述的AlphaLISA测定，仪器型号：PerkinElmer公司的EnVision MultilabelReader安装ALPHA检测模块

标准参数设置如下：

Total Measurement Time：550ms，Laser 680nm Excitation Time：180ms，Mirror：D640as，Emission Filter：M570w，Center Wavelength 570nm，Bandwidth 100nm，Transmittance 75％)

本发明所述的检测人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下

一、将Ab1抗体和Ab2抗体分别交联上AlphaLISA受体微珠以及生物素化

最常见的AlphaLISA免疫检测方法以传统的“三明治”结构为基础，采用链霉素亲和素供体微珠和偶联了抗体的AlphaLISA受体微珠。将一个抗体生物素化，并与链霉素亲和素供体微珠结合。另一个抗体与AlphaLISA受体微珠直接偶联(用于直接测定方法)。利用两种抗体，一种是阿尔法突触核蛋白整体作为抗原的抗体，Ab1，一种是识别阿尔法突触核蛋白C端的抗体，Ab2。标记了的抗体有四种，分别命名为：

受体微珠标记的Ab1：Ab1-A；生物素标记的Ab1：Ab1-B；受体微珠标记的Ab2：Ab2-A；生物素标记的Ab2：Ab2-B；

二、制备阿尔法突触核蛋白纯化蛋白

在大肠杆菌中表达阿尔法突触核蛋白，并利用其融合的多聚组氨酸标签纯化。纯化蛋白利用银染及Western-blot检测。并利用生化手段使其聚集，以制备包含聚集体的样品。

三、利用纯化蛋白检测不同抗体对分别识别阿尔法突触核蛋白多聚体及总体，并测量其灵敏度。Ab1-A/Ab1-B及Ab2-A/Ab2-B应识别阿尔法突触核蛋白聚集体，Ab1-A/Ab2-B及Ab2-A/Ab1-B应测量阿尔法突触核蛋白总量(图1)。经过尝试，因为病人脑脊液中阿尔法突触核蛋白含量在1～10ng左右，因此选取可识别6.25ng/mL或以下的浓度纯化阿尔法突触核蛋白的抗体对。

四、收集病人及对照的脑脊液

利用导管收集帕金森病人，及对照的病人的脑脊液样品，并立即-80度冷冻保存。五、检测脑脊液样品的AlphaLISA信号。

利用Ab2-A/Ab2-B及Ab1-A/Ab2-B检测病人脑脊液样品的AlphaLISA信号，并分析两种抗体对得到信号的比值。见图1、利用不同AlphaLISA抗体检测阿尔法突触核蛋白的示意图。

左：Ab1-A/Ab2-B抗体对；聚集体和单体均可形成配对结合，因此均可检测。类似原理，Ab2-A/Ab1-B也可检测总体蛋白。

右：Ab2-A/Ab2-B抗体对；单体由于抗原表位被Ab2占据，无法结合另一个Ab2抗体，因此无法被检测。只有聚集体可被检测。类似原理，Ab1-A/Ab1-B也只能检测聚集体。

本发明通过以下实验进一步验证本发明的筛选结果：

1：抗体标记

(1)两种抗体生物素化

1.制备抗体溶液

2.标记当天，制备浓度为2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚氨基-ChromaLink-生物素的PBS新鲜溶液。

3.将NHS-ChromaLink-生物素加入抗体溶液中。采用一定比例的生物素与抗体摩尔比，最后用pH7.4的磷酸盐缓冲液将体积调整到200μL。

4.室温孵育2小时。

(2)抗体与AlphaLISA受体微珠直接结合

1.微珠洗涤在1.5mL Eppendorf试管中，洗涤AlphaLISA受体微珠：加入一定体积PBS，高速离心15min，弃掉上清液。此操作重复三次。

2.偶联配置新鲜的NaBH₃CN工作溶液。在装有1mg AlphaLISA受体微珠沉淀的Eppendorf试管中依次加入：抗体，10％Tween-20，NaBH₃CN水溶液，

HEPES储存液，用dH₂O补足至200μL。

用移液器将沉淀重悬，然后在涡旋振荡器温和振荡孵育过夜。

3.封闭用NaOH溶液配制新鲜的羧甲基羟胺(CMO)溶液；向反应中加入足量CMO溶液用于封闭未反应位点；振荡漩涡后孵育1小时。

4.洗涤离心后用微量移液器移除上清液，并将微珠沉淀重悬于200μL的Tris-HCl(pH 8.0)中；离心后去上清；重复洗涤步骤一次，最后一次离心后，将微珠重悬于储存缓冲液中。

5.结合的受体微珠溶液放置于棕色小瓶中，在4℃下储存备用。

2：蛋白纯化及检测

将阿尔法突触核蛋白WT(野生型)和突变体A53T编码片段与原核表达载体pT₇N₁₀C₆连接并加入TEV酶切位点，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

采用Ni-NTA亲和层析、TEV蛋白酶切除多聚组氨酸蛋白标签、分子筛、阴离子交换柱等方法对阿尔法突触核蛋白野生型与突变型蛋白进行纯化。

(1)银染

挑取几种蛋白样品，按照以下体系

样品处理后上样，用非变性胶4℃条件下150V电泳1小时之后调大电压到250V继续电泳25分钟。小心取下胶，用固定液1洗3次，每次10分钟；水洗一次，用固定液2固定2小时；50％甲醇洗胶，洗3次，每次20分钟；超纯水轻轻洗两次，然后用硫代硫酸钠溶液准确孵育1分钟；迅速用超纯水洗两次，然后用硝酸银染色液室温振荡孵育20分钟；超纯水洗一次；配制显影液，先用显影液浸没一次，倒掉后再加入新鲜的显影液直到条带出现；用超纯水洗一次，然后用终止液终止3分钟。

(2)Western-blot

挑取几种蛋白样品，按照以下体系

样品处理后上样，用非变性胶4℃条件下150V电泳1小时后调大电压到250V继续电泳25分钟。小心取下胶，用1×转膜缓冲液泡胶10分钟，制备三明治结构后湿转。湿转完成后先用冰醋酸溶液固定20分钟，用甲醇洗膜；5％脱脂牛奶室温封闭1小时；3d5抗体4℃孵育过夜；次日PBST(含1‰吐温20)洗膜3次，每次5分钟；二抗室温孵育1小时；PBST(含1‰Tween-20)洗膜3次，每次10分钟；ECL发光并将蛋白印迹情况反映在X光片上。结果如下图所示(图2)：

图2、纯化蛋白的银染及蛋白免疫沉淀结果。由银染和蛋白免疫沉淀结果可知，

纯化蛋白AU7样品主要含有高聚体以及部分分子量约146kD相对低聚体和少量15kD左右单体阿尔法突触核蛋白。纯化蛋白AC9蛋白主要含有分子量约146kD相对低聚体和少量15kD左右单体阿尔法突触核蛋白。

3：纯化蛋白的AlphaLISA检测

纯化蛋白(AU7，AC9)用各种抗体对(Ab1-A/Ab1-B，Ab1-A/Ab2-B，

Ab2-A/Ab2-B)做AlphaLISA检测，步骤如下：

蛋白定量测浓度后，依次稀释到200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.25ng/mL共6种浓度，PBS作对照。准备缓冲液，配制Ab1-A和Ab2-A，5μL样品分别和5μLAb1-A以及Ab2-A室温孵育1小时；加入5μL Ab1-B以及Ab2-B室温避光孵育1小时；暗室中每个样品孔加入10μL链霉素亲和素供体微珠避光条件下室温孵育1小时后读板(读板用PerkinElmer公司的EnVision Multilabel Reader安装ALPHA检测模块，按照标准参数读板)。

检测结果如下：

Ab1-A/Ab1-B抗体对(图3，应检测聚集体)：

图3、左，不同浓度阿尔法突触核蛋白样品AU7梯度稀释得到的AlphaLISA信号；右，6.25ng/mL的样品相比空白样品没有显著性差异。n.s.:T检验无显著差异。

从图中可以看出，Ab1/Ab1抗体对可以检测到阿尔法突触核蛋白多聚体，但灵敏度不够检测6.25ng/mL，因此不够理想。

Ab2-A/Ab2-B抗体对(图4，应检测聚集体)：

图4：0.02ng/mL的样品相比空白样品有显著信号。“*”:T检验有显著差异，P<0.05。

Ab1-A/Ab2-B抗体对(图5，应检测AlphaLISA总量):

图5，Ab1-A/Ab2-B检测含高聚的阿尔法突触核蛋白样品AU7及不含高聚阿尔法突触核蛋白的纯化蛋白样品AC9，均有明显线性信号，并且可以检测到6.25ng/mL浓度。“**”，与空白样相比，6.25ng/mL样品有明显信号，经过T检验，P<0.01。

综上所述，选择Ab2-A/Ab2-B检测聚集体，而Ab1-A/Ab2-B检测阿尔法突触核蛋白总量。

本发明根据本发明的以上检测方法，设计了一种检测试剂盒，

所述试剂盒包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠

结合抗体Ab2的AlphaLISA受体微珠即Ab2-A

生物素化的抗体Ab2即Ab2-B

或包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠

结合抗体Ab1的AlphaLISA受体微珠即Ab1-A

生物素化的抗体Ab2即Ab2-B

或包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠

结合抗体Ab2的AlphaLISA受体微珠即Ab2-A

生物素化的抗体Ab2即Ab2-B

结合抗体Ab1的AlphaLISA受体微珠即Ab1-A

本发明的试剂盒，必要时包括相关的溶剂或试剂，如有机溶剂，无机溶剂，生理缓冲液，生理盐水，卫生棉球，检测试纸，检测用具等物品。

上述物品除本发明方法制备的物品外均为常用产品，可以从市场上购买得到。必要时可以根据现有技术制备。

以上试剂按照需要以及方便使用的目的，可以混合在一起或分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作即可。有关试剂的用量以一人一次的用量为宜。

在本发明涉及的基础上，本发明进一步包括一种制备用AlphaLISA方法检测阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体及蛋白总含量以检测帕金森病(PD)，多系统萎缩症(MSA)和路易体痴呆症(DLB)疾病的试剂盒中的用途。

本发明的优点如下：

本试剂盒操作简单方便，可以快速做出诊断

本方法可以检测ng/mL级(即每个样品只需pg级)阿尔法突触核蛋白蛋白含量，灵敏度高

附图说明：

图1、利用不同AlphaLISA抗体检测阿尔法突触核蛋白的示意图；

图2、纯化蛋白的银染及Western-blot结果。由银染和蛋白免疫沉淀结果可知，

图3、左，不同浓度阿尔法突触核蛋白样品AU7梯度稀释得到的AlphaLISA信号；

图6、左：各类病人的两种AlphaLISA信号比值的统计结果。帕金森病人显著高于对照(T检验，P<0.05)。右：根据AlphaLISA信号比值所做ROC曲线。线下面积97.9％。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例：以下实施例用于说明本发明各步骤，但并不限制本发明的使用范围。

实施例1：收集病人及对照的脑脊液

提前一天准备好9个冻存管(2ml/支，聚丙烯材质)，置于-20℃冰箱中预冷备用。第二天8:00-10:00进行腰穿。留取最初的2ml送常规、生化，接下来的脑脊液用一支带刻度的15ml离心管(聚丙烯材质)收集10ml后，盖上螺口盖后，立即轻柔地颠倒混匀3-4次。在脑脊液收集好后的15分钟内，离心10分钟(20℃，2000g)。用前一天预冷的2ml冻存管分装，每只分装1.1ml左右，立即置入-80℃低温冰箱冻存。

实施例2：病人脑脊液的AlphaLISA检测

脑脊液样品13例(其中4例对照，5例MSA，4例PD)

AlphaLISA检测步骤：

加入5μL样品以及5μL结合抗体的AlphaLISA受体微珠；

室温避光孵育1小时；

加入5μL生物素化抗体；

室温避光孵育1小时；

加入10μL链霉素亲和素供体微珠；

室温避光孵育30分钟；

读取AlphaLISA信号：读板用PerkinElmer公司的EnVisionMultilabel Reader安装ALPHA检测模块，按照标准参数；

计算每个样品Ab2-A/Ab2-B信号与Ab1-A/Ab2-B信号的比值。

测量结果如下(图6)：

左：各类病人的两种AlphaLISA信号比值的统计结果。多系统萎缩症及帕金森病人显著高于对照(T检验，P<0.05)。右：根据AlphaLISA信号比值所做ROC曲线。线下面积97.9％。

Claims

1.一种检测试剂盒，该试剂盒用于检测阿尔法突触核蛋白聚集体及蛋白总含量，该试剂盒包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠，

结合抗体Ab2的AlphaLISA受体微珠即Ab2-A，

生物素化的抗体Ab2 即Ab2-B，

或包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠，

结合抗体Ab1的AlphaLISA受体微珠即Ab1-A，

生物素化的抗体Ab2 即Ab2-B，

或包括以下成分：

链霉素亲和素供体微珠，

结合抗体Ab2的AlphaLISA受体微珠即Ab2-A，

生物素化的抗体Ab2 即Ab2-B，

结合抗体Ab1的AlphaLISA受体微珠即Ab1-A。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括相关的溶剂或试剂。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括卫生棉球，检测用具。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂按照需要以及方便使用的目的，混合在一起或分别盛装，再一同包装在同一包装盒内。