CN107973855A - 与糖肽反应的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与糖肽反应的单克隆抗体及其用途。本发明提供以糖肽的岩藻糖部分和肽部分的氨基酸这两者作为表位的单克隆抗体。所述单克隆抗体与(a)所示的糖肽反应：【化1】不与(b)所示的糖肽反应：【化2】

Description

与糖肽反应的单克隆抗体及其用途
【技术领域】
本发明涉及与糖肽反应的单克隆抗体及其用途。
【背景技术】
当从肝炎－肝硬化向肝脏癌发展时、在生物体试样中与扁豆凝集素(LCA)结合的α-胎蛋白(AFP)(LCA结合性AFP)被报告增加。专利文献1记载了用于检测LCA结合性AFP的抗体。专利文献1的抗体被记载为，对于结合性AFP显示反应性，对于LCA非结合性AFP不显示反应性。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】日本特开昭63-307900号公报
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
专利文献1记载了LCA结合的AFP的糖链存在岩藻糖(Fucose)。与生物体试样中的扁豆凝集素结合的AFP的级分被称为AFP-L3级分。AFP-L3级分由岩藻糖基化AFP(向AFP的天冬酰胺残基附加核心岩藻糖(与N型糖链的还原末端的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)α1-6结合的岩藻糖)的AFP)构成。
在专利文献1的实施例中取得了与LCA结合性AFP(AFP-LCA-R)结合、不与LCA非结合性AFP(AFP-LCA-NR)结合的抗体(参照实施例1、表1、图1)。但是，此抗体的表位不明。在实施例中，LCA结合性和非结合性，如上所述，被认为起因于岩藻糖的有无，与抗原的结合性有不依赖于肽部分的序列而依赖于岩藻糖部分的可能性。此时，不仅是AFP，有也非特异性地结合于有此外的岩藻糖的蛋白质的可能性。因此，期望以糖肽的岩藻糖部分和肽部分的氨基酸这两者作为表位的单克隆抗体的开发。
【解决课题的技术方案】
本发明提供单克隆抗体，其
与(a)所示的糖肽反应：
【化1】
不与(b)所示的糖肽反应：
【化2】
本发明提供国际保藏号是NITE BP-02349或NITE BP-02350的杂交瘤。
本发明提供使用上述抗体的岩藻糖基化AFP的测定方法。
本发明提供岩藻糖基化AFP检测用试剂盒，其含岩藻糖基化AFP的捕获用抗体、岩藻糖基化AFP的检测用抗体、固相，上述捕获用抗体或上述检测用抗体是上述抗体。
【发明效果】
本发明的抗体可将糖链部分和肽部分这两者用1种抗体并且以高的特异性识别。
【附图说明】
【图1】是显示使用抗体生产细胞的培养上清，以在表2中记载的阳性抗原(糖肽A)或阴性抗原(非岩藻糖基化糖肽A)作为抗原，进行抗原固相ELISA的结果的图。
【图2】是显示使用抗体生产细胞的培养上清，以重组体AFP-L3、非岩藻糖基化AFP、岩藻糖基化ALP作为抗原，进行抗原固相ELISA的结果的图。
【图3】是显示使用杂交瘤培养上清，以重组体AFP-L3、非岩藻糖基化AFP、岩藻糖基化ALP作为抗原，进行抗原固相ELISA的结果的图。
【图4】是显示在实施例1中得到的克隆S4-1F8及S4-4F9的蛋白印迹的结果的图(泳道1：岩藻糖基化AFP(AFP-L3/重组体)(阳性抗原)、泳道2：非岩藻糖基化AFP(人血清来源AFP(LEE biosolutions)的LCA凝集素非吸附级分)(阴性抗原)、泳道3：岩藻糖基化ALP(ORIENTAL酵母/47787055))(阴性抗原)。
【图5】是显示以阳性糖肽(Fuc+)、阴性糖肽(Fuc-)作为抗原，进行抗原固相ELISA的结果的图。
【图6】是显示S4-1F8的蛋白印迹的结果的图(泳道1：重组体AFP-L3、泳道2：非岩藻糖基化AFP、泳道3：天然人AFP(μTAS WAKO AFP-L3用校准物1)、泳道4：天然人AFP-L3(μTASWAKO AFP-L3用校准物2))。
【实施方式】
本实施方式的抗体在使用利用本实施方式的抗体的生物体试样等的测定系统中发挥特异性即可。例如，即使与生物体试样中不含的物质非特异性地结合，如果也在通常使用本实施方式的抗体的环境中发挥特异性，则发挥本发明的作用效果。具体而言，在由ELISA对全血、血清、血浆等的血液试样中的物质进行检测时，在ELISA测定系统中显示特异性即可，也可与血液试样或ELISA试剂中通常不含的物质结合。
本实施方式的抗体是单克隆抗体，其
与(a)所示的糖肽(SEQ ID NO:13)反应：
【化3】
不与(b)所示的糖肽(SEQ ID NO:14)反应：
【化4】
再者，在本说明书中，本实施方式的抗体“与糖肽反应”是指糖肽和抗体因抗原抗体反应结合。
再者，上述抗体优选与岩藻糖基化AFP反应。
再者，上述抗体可与用SDS等的变性剂或热等预处理的变性岩藻糖基化AFP结合。使用含SDS的溶液作为预处理时的用于使岩藻糖基化AFP充分地变性的SDS浓度(以下，将其称为“预处理SDS浓度”)不特别限定，优选0.03质量/质量％(以下，简称为“％”)以上，更优选0.25％。一方面，当抗原抗体反应时，如果过量地含变性剂，则由于有抗体也变性而对抗原抗体反应产生不好的影响的可能性，优选由稀释等降低变性剂的浓度。当使用含SDS作为变性剂的溶液时，抗原抗体反应时的SDS浓度(以下，将其称为“最终SDS浓度”)不特别限定，优选0.025％以下，更优选0.0015％。
再者，在本说明书中，本实施方式的抗体“与岩藻糖基化AFP反应”是指岩藻糖基化AFP和抗体因抗原抗体反应结合。岩藻糖基化AFP也可为重组体、天然的之任一者。天然的岩藻糖基化AFP是例如，在人血中存在的AFP。人AFP的序列，例如，以GenBank AccessionNo.NM_001134注册，有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
再者，上述抗体优选在SDS及DTT的存在下与变性的岩藻糖基化AFP反应。变性的条件是在2％的SDS、50mM的DTT存在下、在常温(25℃)下的反应。
再者，上述抗体优选在SDS及DTT的存在下不与变性的非岩藻糖基化AFP反应。变性的条件是在2％的SDS、50mM的DTT存在下、在常温(25℃)下的反应。
作为本实施方式的抗体的CDR，例如，可举出以下的CDR。
<CDR-A>
重链的CDR含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
轻链的CDR含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
<CDR-B>
重链的CDR含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
轻链的CDR含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
将产生有上述CDR-A、CDR-B作为CDR的本实施方式的抗体的杂交瘤各自命名为S4-1F8、S4-4F9，在2016年9月8日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8 122号室)作为NITE BP-02349、NITE BP-02350进行了国际保藏。
本实施方式的抗体由包括给动物免疫含以下的结构的糖肽抗原(SEQ ID NO:15)的工序的方法得到：
【化5】
X是任意的糖链，只要是一般与糖蛋白或糖肽结合的糖链，就不特别限定。
也可在糖肽抗原的N末端，使KLH、BSA等的生物体高分子经PEG等结合。另外，这些糖肽抗原的C末端也可酰胺化等。在N末端结合生物体高分子的方法可利用公知的方法。另外，C末端的酰胺化也可利用公知的方法。
对动物免疫糖肽抗原的工序可利用在公知的单克隆抗体的生产方法中的对动物免疫的工序。作为单克隆抗体的生产方法，例如，可举出小鼠脾脏法、小鼠肠骨淋巴节法(参照日本专利第4098796号公报)等。
免疫的动物无特别限定，从非人动物之中配合单克隆抗体的生产方法适宜选择即可。
具体而言，当作为单克隆抗体的生产方法而使用小鼠脾脏法时，根据公知的方法而给动物进行免疫即可。
对动物免疫之后，根据公知的方法而进行杂交瘤的制作、筛选等，得到本实施方式的抗体即可。
在杂交瘤的筛选时，以作为抗原的糖肽、从作为抗原的糖肽除去核心岩藻糖的物质，含作为抗原的糖肽的氨基酸残基的一部分的物质，在SDS及DTT的存在下变性的岩藻糖基化AFP、在SDS及DTT的存在下变性的非岩藻糖基化AFP、有核心岩藻糖且有与AFP不同的氨基酸序列的多肽的糖肽或糖蛋白质(例如，岩藻糖基化ALP等)等作为阳性抗原或阴性抗原适宜利用即可。
杂交瘤的筛选的基准是，例如，当使用ELISA时，阳性抗原和阴性抗原的OD450值的差是0.05以上，并且阴性抗原的OD450值是0.05以下。
本实施方式的抗体的同种型不特别限定。另外，在本实施方式的抗体中，也包括含F(ab’)2、Fab’、Fab、CDR的肽等的片段。
本实施方式的抗体也可进行生物素化、ALP化等的标记化。
本实施方式的抗体由于有上述性质，与岩藻糖基化AFP反应，不与非岩藻糖基化AFP反应。因此，本实施方式的抗体，例如，可对生物体试样中的岩藻糖基化AFP进行测定。
作为生物体试样，例如，可举出从受试者采集的全血、血清、血浆等。此生物体试样也可进行离心分离、变性处理等的预处理。生物体试样优选进行变性处理。变性处理的条件是在2％的SDS、50mM的DTT存在下、于常温(25℃)的反应。
为了使用本实施方式的抗体测定岩藻糖基化AFP，可利用公知的免疫学测定方法。作为免疫学测定法，例如，可举出酶联免疫吸附法(ELISA法)、免疫复合物转移测定方法(参照日本特开平1-254868号公报)、免疫比浊法、免疫层析法、乳胶凝集法等。作为测定工序的一例，接下来对由夹心ELISA法测定生物体试样中的岩藻糖基化AFP浓度的情况进行说明。
首先，在固相上形成含用于捕获生物体试样中的岩藻糖基化AFP的抗体(以下，也称为“捕获用抗体”)、用于检测岩藻糖基化AFP的抗体(以下，也称为“检测用抗体”)和岩藻糖基化AFP的复合物。此复合物，当在生物体试样中含岩藻糖基化AFP时，可通过将生物体试样、捕获用抗体和检测用抗体混合形成。进而，通过使含复合物的溶液与可捕获捕获用抗体的固相接触，可在固相上形成上述的复合物。或者，也可使用预先固定捕获用抗体的固相。即，通过使固定捕获用抗体的固相、生物体试样和检测用抗体接触，可在固相上形成上述的复合物。本实施方式的抗体可用于捕获用抗体及检测用抗体的至少一方。
捕获用抗体向固相的固定的实施方式不特别限定。例如，可为使捕获用抗体和固相直接结合，也可为使捕获用抗体和固相经别的物质间接结合。作为直接结合，例如，可举出物理吸附等。作为间接结合，例如，可举出经生物素和亲和素或链霉亲和素(以下，也称为“亲和素类”)的组合的结合。此时，通过将捕获用抗体预先用生物素修饰，使亲和素类预先结合于固相，可经生物素和亲和素类的结合而使捕获用抗体和固相间接结合。
固相的原料不特别限定，例如，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可使这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出颗粒、膜、微平板、微管、试管等。
通过将在固相上形成的复合物用在现有技术中公知的方法检测，可取得在生物体试样中的岩藻糖基化AFP的测定值。例如，当作为检测用抗体使用用标记物质标记的抗体时，通过检测由该标记物质发生的信号，可取得岩藻糖基化AFP的测定值。或者，当使用对于检测用抗体的标记第二抗体时，也可同样地取得岩藻糖基化AFP的测定值。
在本实施方式中，优选对岩藻糖基化AFP如上所述进行预处理。作为预处理使用含SDS的溶液时的预处理SDS浓度不特别限定，优选0.03％以上，更优选0.25％。当抗原抗体反应时，如上所述，优选由稀释等降低变性剂的浓度。当使用含SDS作为变性剂的溶液时，最终SDS浓度不特别限定，优选0.025％以下，更优选0.0015％。在本实施方式中，优选进行这样的处理而使上述抗体和上述岩藻糖基化AFP反应而取得岩藻糖基化AFP的测定值。
在本实施方式中，也可在复合物的形成工序和复合物的检测工序之间，进行除去不形成复合物的未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成复合物的成分。例如，可举出不与岩藻糖基化AFP结合的抗体、生物体试样中的岩藻糖基化AFP以外的物质(混杂物质)等。B/F分离的手段不特别限定，如果固相是颗粒，通过由离心分离仅回收捕获了复合物的固相，可进行B/F分离。如果固相是微平板或微管等的容器，通过除去含未反应的游离成分的液体，可进行B/F分离。另外，当固相是磁性粒子时，通过在用磁铁对磁性粒子进行磁约束的状态下由喷嘴吸除含未反应的游离成分的液体，可进行B/F分离。也可在除去未反应的游离成分之后，将捕获了复合物的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。
在本说明书中，“检测信号”包括定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及，对信号的强度进行半定量检测。半定量的检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
标记物质只要是发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而使信号发生的物质。作为信号发生物质，例如，可举出荧光物质、放射性同位元素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶等。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、AlexaFluor(注册商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位元素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶及过氧化物酶。
检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，适宜选择根据来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，当标记物质是酶时，可通过将通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号使用分光光度计等的公知的装置而进行测定来进行。
酶的底物可根据该酶的种类而从公知的底物适宜选择。例如，作为酶而使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。另外，作为酶而使用过氧化物酶时，作为底物，可举出LUMINOR及其衍生物等的化学发光基质、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色底物。
当标记物质是放射性同位素时，可将作为信号的放射线使用闪烁计数器等的公知的装置而进行测定。另外，当标记物质是荧光物质时，可将作为信号的荧光使用荧光酶标仪等的公知的装置而进行测定。再者，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜决定。
信号的检测结果也可作为岩藻糖基化AFP的测定值使用。例如，当还定量检测信号的强度时，可将信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为岩藻糖基化AFP的测定值使用。作为从信号强度的测定值取得的值，例如，可举出从岩藻糖基化AFP的测定值减去阴性对照试样的测定值或背景的值所得的值等。阴性对照试样可适宜选择，例如，可举出从健康者得到的生物体试样等。
在本实施方式中，也可对于岩藻糖基化AFP浓度已知的多个标准试样而取得岩藻糖基化AFP的测定值，制成表示岩藻糖基化AFP浓度和岩藻糖基化AFP的测定值的关系的标准曲线。可向此标准曲线适用从生物体试样取得的岩藻糖基化AFP的测定值，取得生物体试样中的岩藻糖基化AFP浓度的值。
在本实施方式中，也可由使用固定于磁性粒子的捕获用抗体和用标记物质标记的检测用抗体的夹心ELISA法测定生物体试样中的岩藻糖基化AFP浓度。此时，测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社制)等的市售的全自动免疫测定装置进行。
另外，本实施方式的抗体可在岩藻糖基化AFP检测用试剂盒中利用。本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒含捕获用抗体、检测用抗体、固相。作为捕获用抗体或检测用抗体，可使用本实施方式的抗体。在夹心免疫测定中，可在捕获用抗体及检测用抗体的任一者中使用本实施方式的抗体。
本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒，再者，当检测用抗体的标记物质是酶时，本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒也可还含对于酶的底物。标记物质及基质的形态不特别限定，可为固体(例如，粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如，溶液、悬浮液、乳浊液等)。
为了对上述的岩藻糖基化AFP进行预处理，本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒也可还含有含0.03％以上SDS、优选为含0.25％的SDS的预处理试剂。上述试剂与上述的含0.03％以上SDS的溶液同样。
本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒也可还适宜含生物体试样的预处理液、固相的清洗液、酶反应的停止剂、校准品等。
本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒是将捕获用抗体、检测用抗体、固相等根据试剂盒的形态收容到适宜容器中，或个别地包装即可。在本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒中，可为捕获用抗体与固相直接结合，也可为使捕获用抗体和固相经别的物质间接结合。当使捕获用抗体和固相间接结合时，也可在本实施方式的试剂盒中将捕获用抗体和固相收容到不同的容器中。当将捕获用抗体和固相，例如，经生物素和亲和素类间接结合时，将用生物素修饰的捕获用抗体收容到1个容器中，将结合亲和素类的固相收容到别的容器中即可。再者，对于生物体试样、捕获用抗体、检测用抗体、固相等的详细内容与在上述的测定方法的说明中叙述的同样。
已知岩藻糖基化AFP与肝脏癌的关联。因此，本实施方式的岩藻糖基化AFP检测用试剂盒可在肝脏癌的诊断中使用。
【实施例】
以下，对本发明利用实施例详细地说明，本发明不以任何方式限于这些实施例。
【实施例1：抗体的取得】
【(1)抗体组的取得】
由小鼠脾脏法得到产生抗体组的杂交瘤。具体而言，合成在下述表1中记载的结构的糖肽A(SEQ ID NO:16)，将其与KLH缀合，向3只小鼠免疫。确认抗体价升高之后，从小鼠的脾脏单离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤。
【表1】
圆点表示甘露糖、四角形表示N-乙酰葡萄糖胺、三角形表示岩藻糖。糖肽的N末端是KLH-PEG4，C末端被酰胺化。
【(2)第一次筛选】
从在上述(1)中得到的杂交瘤由使用表2中记载的阳性抗原(糖肽A)或阴性抗原(非岩藻糖基化糖肽A：SEQ ID NO:17)的抗原固相ELISA选定显示与阳性抗原反应、与阴性抗原的反应少的孔。抗原固相ELISA用以下的方法进行。结果示于图1。
【表2】
圆点表示甘露糖、四角形表示N-乙酰葡萄糖胺、三角形表示岩藻糖。糖肽的N末端是KLH-PEG4，C末端被酰胺化。
<方法>
(1)向96孔板(nunc Maxisoap/446612)以50μl/孔添加各筛选抗原1μg/ml(稀释液10mM磷酸缓冲液pH7)，于37℃固相化1hr。
(2)将各孔以PBST 300μl/孔清洗×5次。
(3)将各孔以1％BSA-PBS 100μl/孔、于4℃过夜封闭。
(4)将各孔以PBST 300μl/孔清洗×5次。
(5)将抗体培养上清(第一抗体)用1％BSA-PBS稀释10倍，以50μl/孔添加，于RT反应1hr。
(6)将各孔以PBST 300μl/孔清洗×5次。
(7)将抗小鼠IgG-HRP(JIR/715-035-151)及抗小鼠IgG L链-HRP(JIR/115-035-174)用1％BSA-PBS稀释20,000倍，以50μl/孔添加，于RT反应0.5hr。
(8)将各孔以PBST 300μl/孔清洗×5次。
(9)以100μl/孔添加HRP显色底物，显色。
(10)以100μl/孔添加停止液，使显色停止。
(11)测定OD450。
【(3)第二次筛选】
与第一次筛选同样地，使用抗体生产细胞的培养上清，以AFP-L3、AFP、岩藻糖修饰的ALP作为抗原，实施抗原固相ELISA。结果示于图2。
根据第一次筛选和第二次筛选的结果选择从1F8克隆和4F9克隆得到的抗体。在上述中得到的克隆之中，将1F8克隆命名为S4-1F8而进行国际保藏(NITE BP-02349)。另外，将4F9克隆命名为S4-4F9而进行国际保藏(NITE BP-02350)。
【实施例2：取得的抗体的特异性确认】
为了研究从在实施例1中选择的克隆各自生产的抗体S4-1F8、S4-4F9的反应特异性，实施以下的探讨。
【(1)抗原固相ELISA】
<材料>
固相抗原：重组体AFP-L3、非岩藻糖基化AFP、岩藻糖基化ALP
第一抗体：S4-1F8、S4-4F9(杂交瘤培养上清)
第二抗体：抗小鼠IgG-HRP(医学生物学研究所/IM-0817)
<方法>
(1)向96孔板(nunc Maxisoap/446612)以100μl/孔添加各抗原0.5μg/ml(稀释液10mMTris缓冲液pH7.4)，于RT固相化1hr。
(2)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(3)将各孔以1％BSA-TBS 300μl/孔、于4℃过夜封闭。
(4)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(5)将抗体培养上清(第一抗体)用1％BSA-TBST稀释10倍，以100μl/孔添加，于RT反应1hr。
(6)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(7)将第二抗体以1％BSA-TBST稀释10,000倍，以100μl/孔添加，于RT反应0.5hr。
(8)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(9)以100μl/孔添加HRP显色底物，显色。
(10)以100μl/孔添加停止液，使显色停止。
(11)测定OD450。
<结果>
抗原固相ELISA的结果示于图3。S4-1F8、S4-4F9均显示AFP-L3特异性地反应。
【(2)蛋白印迹】
<材料>
电泳抗原：重组体AFP-L3(泳道1)、非岩藻糖基化AFP(泳道2)、岩藻糖基化ALP(泳道3)各0.05μg
第一抗体：S4-1F8,S4-4F9(稀释10倍杂交瘤培养上清)4℃O/N
第二抗体：以下的两种混合，于RT 1hr
抗小鼠-IgG(Fc)Ab-HRP(BET/cat#A90-131P)(稀释20,000倍)
抗小鼠-IgM Ab-HRP(SBA/cat#1020-05)(稀释5,000倍)
<方法>
(1)向各抗原以1/4量添加NuPAGE LDS样品缓冲剂(4×)(Thermo/NP0008)、以1/10量添加NuPAGE样品还原剂(10×)(Thermo/NP0009)而进行混合。
(2)对分子量标志物及(1)的各抗原进行电泳(SDS-PAGE)。
(3)印迹到PVDF膜。
(4)向PVDF Blocking Reagent for Can Get Signal于室温浸1小时而进行封闭。
(5)用TBST清洗3次。
(6)将第一抗体用1％BSA-TBST稀释为下述的稀释倍率，于4℃反应过夜。
(7)用TBST清洗3次。
(8)将第二抗体用1％BSA-TBST稀释至成为在上述<材料>中记载的稀释倍率，于室温反应1小时。
(9)用TBST清洗3次。
(10)用化学发光检测。
<结果>
蛋白印迹的结果示于图4。S4-1F8、S4-4F9均显示仅与AFP-L3反应。
【(3)表位的确认】
为了研究抗体S4-1F8、S4-4F9的表位范围，实施以下的探讨。
<材料>
固相抗原：使用下表3所示的糖肽(SEQ ID NO:18～25)(Fuc+,Fuc-)
第一抗体：S4-1F8、S4-4F9(杂交瘤培养上清)
第二抗体：抗小鼠IgG-HRP(医学生物学研究所/IM-0817)
【表3】
<方法>
(1)向96孔板(nunc Maxisoap/446612)以100μl/孔添加各抗原2μg/ml(稀释液10mMTris缓冲液pH7.4)，于RT固相化1hr。
(2)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(3)将各孔以1％BSA-TBS 300μl/孔、于4℃封闭过夜。
(4)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(5)将抗体培养上清(第一抗体)用1％BSA-TBST稀释10倍，以100μl/孔添加，于RT反应1hr。
(6)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(7)将第二抗体用1％BSA-TBST稀释10,000倍，以100μl/孔添加，于RT反应0.5hr。
(8)将各孔以TBST 300μl/孔清洗×5次。
(9)以100μl/孔添加HRP显色底物，显色。
(10)以100μl/孔添加停止液，使显色停止。
(11)测定OD450。
<结果>
抗原固相ELISA的结果示于图5。S4-1F8、S4-4F9对于任何的阳性糖肽(Fuc+)显示反应性，对于阴性糖肽(Fuc-)不显示反应性。
就任何糖肽而言均因岩藻糖的有无而反应性显著地不同，从而提示表位中含岩藻糖。
对于具有岩藻糖的别的蛋白质(ALP)未显示反应性，从而提示，表位中不仅含岩藻糖，还含肽部分。由于还与肽链的最短的糖肽(7a.a.3糖)反应，肽部分的表位被认为含在“TKVNFT”中。
【(4)CDR序列的确认】
进行S4-1F8、S4-4F9的CDR解析。S4-1F8抗体的CDR序列(SEQ ID NO:1～6)示于表4。S4-4F9抗体的CDR序列(SEQ ID NO:7～12)示于表5。
【表4】
重链 轻链
CDR1 GFNIKDYY GNIHNY
CDR2 IDPEDGES DAK
CDR3 ARPLYSTYDVDWYFDV QHFWTTPLT
【表5】
重链 轻链
CDR1 GFNIKDYY GNIHNY
CDR2 IDPEDGES DVK
CDR3 ARPLYSTYDVDWYFDV QHFWTTPLT
【实施例3：夹心ELISA的构建及SDS对反应性的影响】
使用在实施例1中得到的S4-1F8或S4-4F9，尝试了如下所述的夹心ELISA的构建。另外，探讨SDS对反应性的影响。
<材料>
抗体致敏板(S4-1F8,S4-4F9/2.5μg/mL 100μL/孔)
重组体AFP-L3抗原抗AFP抗体：针对α-胎蛋白的多克隆抗体(WLS/#PAA153Hu01)
标记抗体：山羊抗兔免疫球蛋白-HRP
缓冲液A：150mM NaCl+1％BSA/10mM磷酸缓冲液(pH7)
缓冲液B：150mM NaCl+0.05％Tween20/10mM磷酸缓冲液(pH7)
<方法>
(1)(抗原预处理)向20μg/mL的AFP-L3抗原溶液等量加2％、1％、0.5％、0.25％、0.13％、0.06％的SDS溶液，混合后静置3分钟以上。(预处理SDS浓度：0.03-1％)
(2)用缓冲液A稀释至抗原浓度成为1μg/mL,0.5μg/mL,0.25μg/mL。(最终SDS浓度：0.00075％-0.1％)
(3)向抗体致敏板以100μL/孔添加抗原溶液，于室温反应60分钟。
(4)用缓冲液B清洗各孔后，以100μL/孔添加稀释400倍的抗AFP抗体，于室温反应60分钟。
(5)用缓冲液B清洗各孔后，以100μL/孔添加稀释4000倍的标记抗体，于室温反应40分钟。
(6)用缓冲液B清洗各孔后，以100μl/孔添加HRP显色底物，显色20分钟。
(7)以100μl/孔添加停止液而使显色停止，测定OD450。
<结果>
在使用S4-1F8时的各种抗原浓度、最终SDS浓度、预处理SDS浓度中的OD450的测定值示于表6。另外，在使用S4-4F9时的各种抗原浓度、最终SDS浓度、预处理SDS浓度中的OD450测定值示于表7。
【表6】
【表7】
在任一SDS浓度中均测定到信号，检测到AFP-L3。在抗原抗体反应时的SDS浓度在0.05％以下的条件下检测到强的信号，在0.025％以下的条件下检测到更强的信号。
【实施例4：夹心ELISA的特异性确认】
对于使用在实施例3中构建的S4-1F8的夹心ELISA，如以下一样确认特异性。
<材料>
抗体致敏板(S4-1F8/2.5μg/mL 100μL/孔)
阳性抗原：重组体AFP-L3抗原
阴性抗原1：非岩藻糖基化AFP(人血清来源AFP(LEE biosolutions)的LCA凝集素非吸附级分)
阴性抗原2：AFP以外的岩藻糖基化蛋白质ALP(ORIENTAL酵母)
生物素化抗AFP抗体：抗AFP,人(小鼠)(ABV/H00000174-M01)
检测试剂：HRP-缀合的链霉亲和素(Thermo/N100)
缓冲液A：150mM NaCl+1％BSA/10mM磷酸缓冲液(pH7)
缓冲液B：150mM NaCl+0.05％Tween20/10mM磷酸缓冲液(pH7)
<方法>
(1)向20μg/mL的各抗原溶液等量加入0.06％的SDS溶液(变性)、或者不加(非变性)、混合后静置3分钟以上。(预处理SDS浓度：0.03％)
(2)用缓冲液A稀释至抗原浓度成为1000ng/mL,500ng/mL,250ng/mL,125ng/mL,63ng/mL,31ng/mL。
(3)向抗体致敏板以100μL/孔添加抗原溶液，于室温反应60分钟。
(4)在用缓冲液B清洗各孔后，以100μL/孔添加稀释480倍的生物素化抗AFP抗体，于室温反应60分钟。
(5)在用缓冲液B清洗各孔后，以100μL/孔添加稀释10000倍的检测试剂，于室温反应60分钟。
(6)在用缓冲液B清洗各孔后，以100μl/孔添加HRP显色底物，显色10分钟。
(7)以100μl/孔添加停止液而使显色停止，测定OD450。
<结果>
在使用S4-1F8时的各种抗原浓度中的OD450的测定值示于表8。
【表8】
抗原浓度(ng/mL) 1000 500 250 125 63 31
变性AFP-L3 ※ ※ 3.32 2.77 1.89 1.17
非变性AFP-L3 3.15 2.57 1.77 1.13 0.71 0.47
变性AFP 0.23 0.22 0.22 0.21 0.21 0.22
非变性AFP 0.24 0.23 0.23 0.21 0.22 0.22
变性ALP 0.25 0.24 0.24 0.23 0.23 0.25
非变性ALP 0.26 0.25 0.27 0.25 0.26 0.28
※由于超测定上限而无数据。
在变性状态、非变性状态的任一者中，S4-1F8抗体均对于非岩藻糖基化AFP、及ALP不显示反应，而另一方面，对于AFP-L3，则见到抗原浓度依赖性地信号的升高。特别是，在变性状态下对于AFP-L3的反应性显著地提高。这些表示，在夹心ELISA中，S4-1F8抗体通过同时识别AFP-L3的岩藻糖和肽部分而AFP-L3特异性地反应。另外表示，通过将抗原用0.03％SDS预处理使得反应增强。
【实施例5：与天然人AFP-L3的反应性】
如以下一样用蛋白印迹确认S4-1F8是否与天然人AFP-L3反应。
<材料>
电泳抗原：
重组体AFP-L3(泳道1)50ng、
非岩藻糖基化AFP(泳道2)50ng、
μTAS WAKO AFP-L3用校准物1(泳道3)0.5ng、
μTAS WAKO AFP-L3用校准物2(泳道4)0.5ng
第一抗体：S4-1F8(稀释10倍杂交瘤培养上清)4℃O/N
第二抗体：抗小鼠-IgG(Fc)Ab-HRP(BET/#A90-131P)(稀释20,000倍)RT 1hr
<方法>
除了将电泳抗原、第一抗体及第二抗体代替为上述的之外，与实施例2的(2)同样地进行蛋白印迹。
<结果>
蛋白印迹的结果示于图6。显示S4-1F8也与μTAS WAKO AFP-L3用校准物2、即天然人AFP-L3反应。
 序列表
<110> Sysmex Corporation
<120> 与糖肽反应的单克隆抗体及其用途
<130> 16-025CN
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 2
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 3
Ala Arg Pro Leu Tyr Ser Thr Tyr Asp Val Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 4
Gly Asn Ile His Asn Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 5
Asp Ala Lys
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A
<400> 6
Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 7
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 8
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ser
1 5
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 9
Ala Arg Pro Leu Tyr Ser Thr Tyr Asp Phe Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 10
Gly Asn Ile His Asn Tyr
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 11
Asp Val Lys
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B
<400> 12
Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 式(a)所示的糖肽
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (4)..(4)
<400> 13
Thr Lys Val Asn Phe Thr
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 式(b)所示的糖肽
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (4)..(4)
<400> 14
Thr Lys Val Asn Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 式(c)所示的糖肽
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 15
Ala Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ala Gln Lys Ala Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽A
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 16
Ala Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ala Gln Lys Ala Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非-岩藻糖基化的糖肽A
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 17
Ala Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ala Gln Lys Ala Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc+
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 18
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc-
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 19
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc+
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 20
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc-
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 21
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc+
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 22
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc-
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 23
Gly Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
1 5 10
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc+
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 24
Ala Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ala Gln Lys Ala Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖肽Fuc-
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<400> 25
Ala Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ala Gln Lys Ala Ala Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 26
<211> 609
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<300>
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<309> 2016-09-10
<313> (1)..(609)
<400> 26
Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr
1 5 10 15
Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu
20 25 30
Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr
35 40 45
Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser
50 55 60
Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp
65 70 75 80
Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu
85 90 95
Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp
100 105 110
Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His
115 120 125
Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro
130 135 140
Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn
145 150 155 160
Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro
165 170 175
Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys
180 185 190
Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr
195 200 205
Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys
210 215 220
Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val
225 230 235 240
Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln
245 250 255
Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly
260 265 270
Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile
275 280 285
Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys
290 295 300
Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp
325 330 335
Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala
340 345 350
Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser
355 360 365
Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu
385 390 395 400
Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys
405 410 415
Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu
420 425 430
Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met
435 440 445
Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu
450 455 460
Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile
465 470 475 480
Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly
485 490 495
Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp
515 520 525
Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala
530 535 540
Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys
545 550 555 560
Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser
565 570 575
Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Val

Claims (10)

1.单克隆抗体，其
与(a)所示的糖肽反应：
【化1】
不与(b)所示的糖肽反应：
【化2】
2.权利要求1所述的抗体，其还与岩藻糖基化AFP反应。
3.权利要求1所述的抗体，其中
重链的CDR含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及SEQID NO:3所示的氨基酸序列，
轻链的CDR含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列及SEQID NO:6所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的抗体，其中
重链的CDR含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列及SEQID NO:9所示的氨基酸序列，
轻链的CDR含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列及SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的抗体，其与用含0.03质量/质量％以上的SDS的溶液预处理而得到的岩藻糖基化AFP在0.025质量/质量％以下的SDS的存在下反应。
6.杂交瘤，其国际保藏号是NITE BP-02349或NITE BP-02350。
7.岩藻糖基化AFP的测定方法，其使用权利要求1～5之任一项所述的抗体。
8.权利要求7所述的方法，其中
用含0.03质量/质量％以上的SDS的溶液对岩藻糖基化AFP进行预处理，
上述处理后，在0.025质量/质量％以下的SDS的存在下，使用上述抗体与上述岩藻糖基化AFP反应。
9.岩藻糖基化AFP检测用试剂盒，其含岩藻糖基化AFP的捕获用抗体、岩藻糖基化AFP的检测用抗体、固相，
上述捕获用抗体或上述检测用抗体是权利要求1～5之任一项所述的抗体。
10.权利要求9所述的试剂盒，其还含有含0.03质量/质量％以上的SDS的预处理试剂。
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