DE102020125915B3 - Immundiagnostische mittel und verfahren für den nachweis und die differenzierung von coronavirus-infektionen - Google Patents

Immundiagnostische mittel und verfahren für den nachweis und die differenzierung von coronavirus-infektionen Download PDF

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Abstract

Es werden Mittel und Verfahren für den immunologischen bzw. serologischen Nachweis und die Differenzierung von Infektionen mit humanen Coronaviren, insbesondere der Spezies Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (SARS-CoV), angegeben.

Description

  • Sequenzprotokoll
  • Diese Anmeldung beinhaltet ein elektronisches Sequenzprotokoll im txt-Format nach WIPO ST.25 Standard mit 70 Sequenzen als Teil der Beschreibung, dessen Inhalt hiermit vollinhaltlich einbezogen wird.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren für den immunologischen bzw. serologischen in vitro Nachweis und die Differenzierung von Infektionen mit humanen Coronaviren (HCoVs), insbesondere der Spezies Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (SARS-assoziiertes Coronavirus bzw. SARS-CoV) wie z. B. SARS-CoV-2 (nachfolgend auch kurz „SARS2“) und SARS-CoV-1 sowie Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (MERS-CoV) und saisonaler Coronaviren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die COVID-19-Pandemie traf die Welt unvorbereitet. Weltweit gibt es Millionen von Infektionsfällen mit weiterhin steigender Tendenz. Neben der sozialen Distanzierung ist die rasche Untersuchung von Verdachtsfällen und Kontakten eine der wichtigsten Maßnahmen, um das Infektionsgeschehen einzudämmen.
  • Die Erfahrungen aus vielen Ländern haben gezeigt, dass ungenaue oder unvollständige Kenntnisse über die Infektionsprävalenz und die Virusübertragungsraten zu einer falschen Einschätzung der epidemiologischen Situation, zu falschen Vorhersagen und zu unzureichenden Maßnahmen mit potenziell schwerwiegenden Folgen für Gesellschaften und Volkswirtschaften führen können. Diese Erkenntnisse verdeutlichen einen weltweiten Bedarf an zuverlässigen und hochspezifischen Tests für den Nachweis von Coronavirus-Infektionen.
  • Für eine labordiagnostische Abklärung des Verdachts auf eine Infektion mit dem SARS-CoV-2 wurden PCR-Systeme für den Nukleinsäurenachweis aus Abstrichen aus Nase und Rachen entwickelt. Problematisch ist jedoch, dass die Viruslast nach der akuten Infektion oft innerhalb kurzer Zeit auf diese Art nicht mehr nachweisbar ist. Eine überstandene SARS-CoV-2-Infektion lässt sich mit PCR-basierten Verfahren praktisch gar nicht nachweisen. Ein zuverlässiges serologisches Monitoring ist daher erforderlich, um den SARS-CoV-2-Infektionsstatus größerer Populationen zu bestimmen, die bestehende Immunität zu ermitteln und lokale Ausbrüche nachzuverfolgen. Darüber hinaus kann es auch einen wichtigen Beitrag zur Beurteilung der durch kommende Impfstoffe induzierten Immunität auf Bevölkerungsebene leisten.
  • Aus EP 3 715 847 A1 sind Verfahren und Reagenzien zur serologischen Diagnose von SARS-COV-2 bekannt.
  • WO 2005/118813 A2 offenbart einen Immunoassay für das SARS-Coronavirus auf Basis des Spike-Proteins.
  • US 2006/0188519 A1 offenbart einen weiteren Immunoassay für das SARS-Coronavirus auf Basis verschiedener immunreaktiver Peptide.
  • WO 2015/057666 A1 offenbart ein Verfahren zur Differenzierung von Coronaviren auf Basis von subtypischen Nukleocapsid- und Spike-Proteinen.
  • Allerdings sind die derzeit verfügbaren Antikörpertests oft nicht sehr spezifisch und können zu falschen Interpretationen führen.
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Mittel und Verfahren für den immunologischen Nachweis von HCoV-Infektionen bzw. SARS-CoV-2-Infektionen bereitzustellen.
  • Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte und bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind den Unteransprüchen, der nachfolgenden Beschreibung und den Figuren zu entnehmen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfinder haben erkannt, dass der spezifische Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern durch serologische Kreuzreaktivitäten zwischen SARS-CoV-2 und anderen HCoVs erheblich erschwert ist. Insbesondere hat sich gezeigt, dass herkömmliche Tests, die Konformationsantigene in voller Länge oder Teile davon verwenden, bei Personen, die zuvor gewöhnlichen Erkältungs-Coronaviren ausgesetzt waren, falsch positive Ergebnisse liefern können.
  • Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, indem die Erfinder verschiedene immundominante lineare Epitope identifizieren konnten, gegen die nur bei einer SARS-CoV-2-Infektion eine pathogentypische adaptive Immunreaktion nachweisbar ist. Dabei hat sich gezeigt, dass sich durch eine kombinatorische Zusammenwirkung dieser Epitope als antigenwirksame Bestandteile in einem Diagnostikum eine hohe Testspezifität für SARS-CoV-2 erreichen lässt, ohne die Nachweisempfindlichkeit (auch als Sensitivität bezeichnet) zu beeinträchtigen.
  • Dementsprechend wird in einer ersten Ausführungsform der Erfindung ein Immundiagnostikum für den Nachweis einer Coronavirus-Infektion angegebenen. Ein gattungsgemäßes Immundiagnostikum weist einen Träger auf, auf dem mehrere antigenwirksame Virusbestandteile angeordnet sind. Die Virusbestandteile können grundsätzlich natürlichen oder künstlichen Ursprungs, d. h. insbesondere rekombinant oder chemisch-synthetisch hergestellt sein. Auf diese Weise lassen sich Antikörper, die für die antigenwirksamen Virusbestandteile spezifisch sind, selektiv über Antikörper-Antigen-Wechselwirkung aus einer Patientenprobe (z. B. Blut, Serum oder Speichel) an den Träger binden und mithilfe geeigneter Detektionsverfahren nachweisen. Entsprechende Immuntestformate sind dem Fachmann einschlägig bekannt. Diesbezüglich wird auch auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele verwiesen.
  • Die antigenwirksamen Virusbestandteile des erfindungsgemäßen Immundiagnostikums umfassen mindestens ein Peptid einer ersten Gruppe, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) aufweist, sowie zusätzlich mindestens ein Peptid einer zweiten Gruppe, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) aufweist.
  • So, wie der Begriff hier verwendet wird, bezeichnet „Sequenzähnlichkeit“ gemäß dem üblichen fachmännischen Begriffsverständnis den Verwandtschaftsgrad zweier Sequenzen in Prozent, wobei das Ausmaß an Verwandtschaft von der Anzahl identischer Aminosäuren in einem Sequenzabschnitt abhängt. „Zumindest abschnittsweise“ ist dementsprechend als „zumindest in einem Sequenzabschnitt“ zu verstehen. Das Merkmal „mehr als 85% Sequenzähnlichkeit“ kann im Sinne der vorliegenden Erfindung z. B. auch mehr als 90% Sequenzähnlichkeit, mehr als 95% Sequenzähnlichkeit oder 100% Sequenzähnlichkeit bedeuten, wobei die Aminosäuresequenz bei 100% Sequenzähnlichkeit vollständig in dem Peptid enthalten ist.
  • Das mindestens eine Peptid der ersten Gruppe und das mindestens eine Peptid der zweiten Gruppe weisen jeweils nicht mehr als 30 Aminosäuren auf. Vorzugsweise weisen das mindestens eine Peptid der ersten Gruppe und das mindestens eine Peptid der zweiten Gruppe unabhängig voneinander jeweils nicht mehr als 25 Aminosäuren, nicht mehr als 20 Aminosäuren, nicht mehr als 18 Aminosäuren, nicht mehr als 17 Aminosäuren, nicht mehr als 16 Aminosäuren oder nicht mehr als 15 Aminosäuren auf. Peptide mit 15 Aminosäuren bzw. nicht mehr als 15 Aminosäuren sind besonders bevorzugt. Durch diese kurzen Peptidsequenzen wird eine erhöhte Stringenz bei der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung erreicht und die Spezifität des Diagnostikums verbessert. Ein weiterer Vorteil ist, dass sich solche kurzen Peptidsequenzen besonders einfach und kostengünstig synthetisch herstellen lassen, beispielsweise durch chemische Festphasensynthese.
  • Mit diesen erfindungsgemäßen Peptidkombinationen wird eine hohe Zuverlässigkeit des immunologischen SARS-CoV-2-Nachweises erreicht und gleichzeitig das Risiko falsch-positiver Testergebnisse gegenüber herkömmlichen, auf Konformationsantigenen basierenden Immundiagnostika deutlich verringert. Diese vorteilhafte Zusammenwirkung überrascht, da in der Regel nur ein sehr geringer Teil von Virusantigenen lineare B-Zellepitope bildet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein erstes Peptid der ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) in Kombination mit einem zweiten Peptid der ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8).
  • In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Bestandteile ein erstes Peptid der zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) in Kombination mit einem zweiten Peptid der zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11).
  • Mithilfe dieser Peptidkombinationen wird eine besonders hohe Empfindlichkeit und gleichzeitig hohe Spezifität bei dem Nachweis von SARS-CoV-2-Infektionen erreicht. Auf diese Weise kann besonders effektiv zwischen COVID-19-Patienten und Patienten mit anderen HCoV-Infektionen differenziert werden.
  • Vorzugsweise umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile zusätzlich mindestens ein Peptid einer dritten Gruppe, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6) aufweist.
  • Das mindestens eine Peptid der dritten Gruppe weist wiederum nicht mehr als 30 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 25 Aminosäuren, nicht mehr als 20 Aminosäuren, nicht mehr als 18 Aminosäuren, nicht mehr als 17 Aminosäuren, nicht mehr als 16 Aminosäuren oder nicht mehr als 15 Aminosäuren auf, wobei Peptide mit 15 Aminosäuren bzw. nicht mehr als 15 Aminosäuren besonders bevorzugt sind.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein erstes Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein zweites Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein drittes Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein viertes Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein fünftes Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6). Selbstverständlich sind auch beliebige Kombinationen von zwei oder mehr der vorgenannten Peptide möglich. In bevorzugten Ausführungsformen sind das erste, zweite, dritte, vierte und fünfte Peptid der dritten Gruppe kombiniert in den antigenwirksamen Virusbestandteilen enthalten.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile zusätzlich mindestens ein Peptid einer vierten Gruppe, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14) aufweist.
  • Das mindestens eine Peptid der vierten Gruppe weist nicht mehr als 30 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 25 Aminosäuren, nicht mehr als 20 Aminosäuren, nicht mehr als 18 Aminosäuren, nicht mehr als 17 Aminosäuren, nicht mehr als 16 Aminosäuren oder nicht mehr als 15 Aminosäuren auf, wobei Peptide mit 15 Aminosäuren bzw. nicht mehr als 15 Aminosäuren besonders bevorzugt sind.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein erstes Peptid der vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein zweites Peptid der vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14). In bevorzugten Ausführungsformen sind sowohl das erste Peptid als auch das zweite Peptid der vierten Gruppe in den antigenwirksamen Virusbestandteilen enthalten.
  • Die Erfinder haben erkannt, dass sich mit den Peptiden der dritten und vierten Gruppe spezifische Antikörperreaktionen auf eine SARS-CoV-Infektion, d. h. neben SARS-CoV-2 auch SARS-CoV-1, mit hoher Zuverlässigkeit nachweisen lassen. Das hat den Vorteil, dass sich mithilfe der erfindungsgemäßen Kombination von Peptiden der ersten und zweiten Gruppe mit einem oder mehreren Peptiden der dritten und/oder vierten Gruppe Infektionen mit SARS-CoV-2 und/oder SARS-CoV-1 gemeinsam erfassen und ggf. gleichzeitig differenzieren lassen. Beispielsweise kann eine Antikörperreaktion mit den Peptiden der ersten, zweiten und dritten bzw. vierten Gruppe eine Infektion mit SARS-CoV-2 anzeigen, während eine Reaktion mit ausschließlich einem oder mehreren Peptiden der dritten und/oder vierten Gruppe den differenzierten Nachweis für eine Infektion mit SARS-CoV-1 erbringt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die antigenwirksamen Virusbestandteile zudem mindestens ein Peptid einer fünften Gruppe umfassen, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, aufweist.
  • Das mindestens eine Peptid der fünften Gruppe weist nicht mehr als 30 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 25 Aminosäuren, nicht mehr als 20 Aminosäuren, nicht mehr als 18 Aminosäuren, nicht mehr als 17 Aminosäuren, nicht mehr als 16 Aminosäuren oder nicht mehr als 15 Aminosäuren auf, wobei Peptide mit 15 Aminosäuren bzw. nicht mehr als 15 Aminosäuren besonders bevorzugt sind.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein erstes Peptid der fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist. In einer Ausführungsform ist X3 Phe. In einer Ausführungsform ist X3 Ala. In einer Ausführungsform ist X7 Leu. In einer Ausführungsform ist X7 Ile. In einer Ausführungsform hat das erste Peptid der fünften Gruppe zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Ser-Lys-Arg-Ser-Phe-Ile-Glu-Asp-Leu-Leu-Phe (SEQ ID NO:70).
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein zweites Peptid der fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist. In einer Ausführungsform ist X2 Lys. In einer Ausführungsform ist X2 Gln. In einer Ausführungsform ist X3 Glu. In einer Ausführungsform ist X3 Asp. in einer Ausführungsform ist X7 Lys. In einer Ausführungsform ist X7 Glu. In einer Ausführungsform ist X7 Gln. In einer Ausführungsform ist X8 Tyr. In einer Ausführungsform ist X8 Phe. In einer Ausführungsform ist X8 Trp. In einer Ausführungsform hat das zweite Peptid der fünften Gruppe zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Leu-Asp-Ser-Phe-Lys-Glu-Glu-Leu-Asp-Lys-Tyr-Phe-Lys-Asn-His (SEQ ID NO:69).
  • Vorzugsweise beinhalten die antigenwirksamen Virusbestandteile sowohl das erste als auch das zweite Peptid der fünften Gruppe.
  • Es hat sich gezeigt, dass sich mithilfe der Peptide der fünften Gruppe auch andere als auf SARS-CoV-2 und SARS-CoV-1 basierende Coronavirus-Infektionen nachweisen lassen, unter anderem Infektionen mit MERS-CoV sowie herkömmlichen Erkältungs-Coronaviren wie HCoV-OC34 und HCoV-229E. Auf diese Weise können mithilfe des erfindungsgemäßen Immundiagnostikums auch solche Coronavirus-Infektionen zuverlässig nachgewiesen und durch die Kombination mit den Peptiden der ersten und zweiten Gruppe sowie gegebenenfalls der dritten und/oder vierten Gruppe von Infektionen mit SARS-CoV-2 bzw. SARS-CoV-1 unterschieden werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile zusätzlich mindestens ein Peptid einer sechsten Gruppe, das zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) aufweist.
  • Das mindestens eine Peptid der sechsten Gruppe weist nicht mehr als 30 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 25 Aminosäuren, nicht mehr als 20 Aminosäuren, nicht mehr als 18 Aminosäuren, nicht mehr als 17 Aminosäuren, nicht mehr als 16 Aminosäuren oder nicht mehr als 15 Aminosäuren auf, wobei Peptide mit 15 Aminosäuren bzw. nicht mehr als 15 Aminosäuren besonders bevorzugt sind.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein erstes Peptid der sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein zweites Peptid der sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16). In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein drittes Peptid der sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17). In bevorzugten Ausführungsformen sind das erste, zweite und dritte Peptid der sechsten Gruppe in den antigenwirksamen Virusbestandteilen enthalten.
  • Gegen diese Peptide konnten die Erfinder eine hohe spezifische Seroreaktivität bei COVID-19-Patienten feststellen, die zu einer zusätzlichen Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Immundiagnostikums beitragen kann.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid der ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) und/oder mindestens ein Peptid der zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) in Kombination mit mindestens einem Peptid der dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), mindestens einem Peptid der vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14), mindestens einem Peptid der fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, und/oder mindestens einem Peptid der sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) umfassen.
  • Diese Kombinationen von wenigstens einem Peptid aus der ersten oder zweiten Gruppe mit wenigstens einem Peptid aus der dritten, vierten, fünften oder sechsten Gruppe gewährleisten ebenfalls einen zuverlässigen Nachweis von SARS-CoV-2-Infektionen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die antigenwirksamen Virusbestandteile ausgewählt aus Peptiden, die einen Sequenzabschnitt mit zumindest 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe bestehend aus Glu-Pro-Ile-Tyr-Asp-Glu-Pro-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Val-Pro-Leu (SEQ ID NO:18), Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser-Thr-Gly-Ser-Asn (SEQ ID NO:19), Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:20), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn-Asn-Thr-Ala-Ser (SEQ ID NO:21), Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn-Asn-Thr-Ala-Ser-Trp-Phe-Thr-Ala (SEQ ID NO:22), Thr-Ala-Ser-Trp-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Gln-His-Gly-Lys-Glu-Asp (SEQ ID NO:23), Ile-Val-Leu-Gln-Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:24), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe-Tyr-Ala-Glu-Gly (SEQ ID NO:25), Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe-Tyr-Ala-Glu-Gly-Ser-Arg-Gly-Gly (SEQ ID NO:26), Ala-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:27), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu-Ser-Lys-Met-Ser (SEQ ID NO:28), Lys-Gly-Gln-Gln-Gln-Gln-Gly-Gln-Thr-Val-Thr-Lys-Lys-Ser-Ala (SEQ ID NO:29), Thr-Val-Thr-Lys-Lys-Ser-Ala-Ala-Glu-Ala-Ser-Lys-Lys-Pro-Arg (SEQ ID NO:30), Lys-Ser-Ala-Ala-Glu-Ala-Ser-Lys-Lys-Pro-Arg-Gln-Lys-Arg-Thr (SEQ ID NO:31), Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), Lys-Lys-Lys-Ala-Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:32), Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys-Lys-Gln-Gln-Thr (SEQ ID NO:33), Arg-Gln-Lys-Lys-Gln-Gln-Thr-Val-Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp (SEQ ID NO:34), Gln-Gln-Thr-Val-Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe (SEQ ID NO:35), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Met (SEQ ID NO:36), Tyr-Val-Gln-Ile-Pro-Thr-Thr-Cys-Ala-Asn-Asp-Pro-Val-Gly-Phe (SEQ ID NO:37), Gly-Val-Leu-Val-Pro-His-Val-Gly-Glu-Ile-Pro-Val-Ala-Tyr-Arg (SEQ ID NO:38), Ser-Glu-Lys-Ser-Tyr-Glu-Leu-Gln-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Lys-Leu (SEQ ID NO:39), Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Phe-Asp-Thr-Phe-Asn (SEQ ID NO:40), Ser-Phe-Leu-Glu-Met-Lys-Ser-Glu-Lys-Gln-Val-Glu-Gln-Lys-Ile (SEQ ID NO:41), Asp-Ala-Val-Thr-Ala-Tyr-Asn-Gly-Tyr-Leu-Thr-Ser-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO:42), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16), Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17), Leu-Gln-Leu-Cys-Thr-Phe-Thr-Arg-Ser-Thr-Asn-Ser-Arg-Ile-Lys (SEQ ID NO:43), Pro-Gln-Thr-Ser-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg (SEQ ID NO:44), Ser-Gln-Gly-Leu-Leu-Pro-Pro-Lys-Asn-Ser-Ile-Asp-Ala-Phe-Lys (SEQ ID NO:45), Gln-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ile-Ala-Ala-Thr-Arg-Gly-Ala-Thr-Val (SEQ ID NO:46), Ala-Thr-Arg-Gly-Ala-Thr-Val-Val-Ile-Gly-Thr-Ser-Lys-Phe-Tyr (SEQ ID NO:47), His-Arg-Leu-Tyr-Glu-Cys-Leu-Tyr-Arg-Asn-Arg-Asp-Val-Asp-Thr (SEQ ID NO:48), Leu-Gln-Phe-Thr-Ser-Leu-Glu-Ile-Pro-Arg-Arg-Asn-Val-Ala-Thr (SEQ ID NO:49), Leu-Leu-Ala-Leu-His-Arg-Ser-Tyr-Leu-Thr-Pro-Gly-Asp-Ser-Ser (SEQ ID NO:50), Thr-Gly-Val-Leu-Thr-Glu-Ser-Asn-Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln (SEQ ID NO:51), Thr-Glu-Ser-Asn-Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:52), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg-Asp-Ile-Ala-Asp (SEQ ID NO:53), His-Ala-Asp-Gln-Leu-Thr-Pro-Thr-Trp-Arg-Val-Tyr-Ser-Thr-Gly (SEQ ID NO: 54), Asn-Asn-Ser-Tyr-Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:55), Asn-Thr-Gln-Glu-Val-Phe-Ala-Gln-Val-Lys-Gln-Ile-Tyr-Lys-Thr (SEQ ID NO:56), Val-Lys-Gln-Ile-Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:57), Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly-Phe-Asn-Phe-Ser (SEQ ID NO:58), Pro-Ser-Lys-Pro-Ser-Lys-Arg-Ser-Phe-Ile-Glu-Asp-Leu-Leu-Phe (SEQ ID NO:59), Ser-Lys-Arg-Ser-Phe-Ile-Glu-Asp-Leu-Leu-Phe-Asn-Lys-Val-Thr (SEQ ID NO:60), Leu-Asp-Ser-Phe-Lys-Glu-Glu-Leu-Asp-Lys-Tyr-Phe-Lys-Asn-His (SEQ ID NO:69), Lys-Glu-Glu-Leu-Asp-Lys-Tyr-Phe-Lys-Asn-His-Thr-Ser-Pro-Asp (SEQ ID NO:61), Val-Asn-Ile-Gln-Lys-Glu-Ile-Asp-Arg-Leu-Asn-Glu-Val-Ala-Lys (SEQ ID NO:62), Ser-Cys-Gly-Ser-Cys-Cys-Lys-Phe-Asp-Glu-Asp-Asp-Ser-Glu-Pro (SEQ ID NO:63), Cys-Cys-Lys-Phe-Asp-Glu-Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly (SEQ ID NO:64), Asp-Glu-Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:65), Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His-Tyr-Thr (SEQ ID NO:66), Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Gln-Arg-Val-Ala-Gly-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr-Ser-Arg-Tyr (SEQ ID NO:67) und Gly-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Ile-Gly-Asn (SEQ ID NO:68) und beliebigen Kombinationen davon aufweisen. Diese Peptide haben sich als besonders immunreaktiv erwiesen.
  • In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die antigenwirksamen Virusbestandteile ausgewählt aus Peptiden, die einen Sequenzabschnitt mit zumindest 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66 aufweisen und beliebige Kombinationen davon, insbesondere aus Peptiden, die einen Sequenzabschnitt mit zumindest 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65 aufweisen und beliebigen Kombinationen davon.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:28.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO: 33.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:8.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:36.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:50.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:56.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:57.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:69.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:62.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:65.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:17.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:27.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:38.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:42.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:43.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:44.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:45.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:48.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:61.
  • In einer Ausführungsform umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile ein Peptid mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:66.
  • In bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die antigenwirksamen Virusbestandteile eine Kombination von mehreren der vorgenannten Peptide, sodass die Peptide Sequenzabschnitte mit mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit den folgenden drei Aminosäuresequenzen umfassen: SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:42 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:44 und SEQ ID NO:69; SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:48 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:42 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:48 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36 und SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:42 und SEQ ID NO:69; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:69; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 und SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57. Es ist auch möglich, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mehrere der vorgenannten Kombinationen enthalten.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Kombination der Peptide Sequenzabschnitte mit mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit den folgenden vier Aminosäuresequenzen: SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50 und SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:69 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:61; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:69 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:61; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:36. Es ist auch möglich, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mehrere der vorgenannten Kombinationen enthalten.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Kombination der Peptide Sequenzabschnitte mit mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit den folgenden fünf Aminosäuresequenzen: SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:61; SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:61; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:66; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:69 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:69 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:69 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:61; SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 und SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:62 und SEQ ID NO:42. Es ist auch möglich, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mehrere der vorgenannten Kombinationen enthalten.
  • Die Peptide der oben genannten Kombinationen haben sich in Zusammenwirkung für den empfindlichen und spezifischen immunologischen Nachweis von SARS-CoV-2-Infektionen als besonders vorteilhaft erwiesen. Es ist auch möglich, dass die antigenwirksamen Bestandteile aus einer oder mehreren der oben genannten Kombinationen bestehen.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die antigenwirksamen Virusbestandteile nicht mehr als 30 unterschiedliche Peptide, nicht mehr als 25 unterschiedliche Peptide, nicht mehr als 20 unterschiedliche Peptide, nicht mehr als 15 unterschiedliche Peptide, nicht mehr als zehn unterschiedliche Peptide, nicht mehr als neun unterschiedliche Peptide, nicht mehr als acht unterschiedliche Peptide, nicht mehr als sieben unterschiedliche Peptide, nicht mehr als sechs unterschiedliche Peptide, nicht mehr als fünf unterschiedliche Peptide , nicht mehr als vier unterschiedliche Peptide oder nicht mehr als drei unterschiedliche Peptide. Insbesondere können die antigenwirksamen Virusbestandteile aus den vorgenannten Peptiden bestehen. Auf diese Weise kann das Risiko unspezifischer Reaktionen vorteilhaft reduziert werden.
  • In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Träger mehrere voneinander getrennte Testbereiche oder Kavitäten aufweist, sodass die antigenwirksamen Virusbestandteile zumindest teilweise in verschiedenen Testbereichen oder Kavitäten angeordnet sein können. Eine Möglichkeit ist, dass die Peptide jeweils separat voneinander oder in Kombination mit jeweils einem weiteren Peptid oder mehreren weiteren Peptiden in einem Testbereich oder einer Kavität angeordnet sind.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist vorgesehen, dass die Peptide der ersten, zweiten und, soweit vorhanden, dritten, vierten, fünften und sechsten Gruppe zumindest teilweise in verschiedenen Testbereichen oder Kavitäten angeordnet sind. Auf diese Weise lassen sich detailliertere Informationen zur Antikörperspezifität des Patienten erhalten, die zu einem wichtigen Erkenntnisgewinn in Bezug auf den Verlauf und den klinischen Ausgang von COVID-19 beitragen können. Möglich ist z. B. jedes Peptid in einem separaten Testbereich oder einer separaten Kavität anzuordnen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform sieht eine Anordnung der Peptide nach Gruppen getrennt in verschiedenen Testbereichen oder Kavitäten vor. Durch den gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen mehrere Peptide einer Gruppe lassen sich die Messsignale in den einzelnen Testbereichen bzw. Kavitäten vorteilhaft kumulieren, ohne gleichzeitig das Risiko unspezifischer Wechselwirkungen abträglich zu erhöhen, sodass auch geringe Antikörpermengen in Zusammenwirkung noch zuverlässig nachgewiesen werden können. Auf diese Weise wird die Präzision des Nachweises gegenüber herkömmlichen Verfahren signifikant verbessert. Es ist z. B. möglich, die Peptide der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe als Gemisch zusammen in demselben Testbereich oder derselben Kavität anzuordnen, um einen besonders zuverlässigen Nachweis von SARS-CoV-2-Infektionen zu gewährleisten. In einer weiteren Ausführung ist vorgesehen, dass die Peptide der ersten und/oder zweiten Gruppe getrennt von den Peptiden der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe angeordnet sind, um eine vorteilhafte Differenzierung zwischen Infektionen mit SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 und weiteren Coronaviren zu ermöglichen. Insbesondere ist vorgesehen, dass die Peptide der dritten und/oder vierten Gruppe getrennt von den Peptiden der fünften Gruppe angeordnet sind.
  • Alternativ oder zusätzlich ist es natürlich auch möglich, dass die Peptide der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Gruppe, soweit vorhanden, als Gemisch auf dem Träger bzw. in demselben Testbereich oder derselben Kavität angeordnet sind, beispielsweise um ein besonders empfindliches Gesamtsignal zu erhalten.
  • Die Art des Trägers ist nicht sonderlich beschränkt. Geeignete Träger gattungsgemäßer Immundiagnostika sind dem Fachmann einschlägig bekannt oder können auf Grundlage dieser Beschreibung ohne Weiteres bestimmt werden. Nicht limitierende Beispiele sind Membranen z. B. aus derivatisierter Cellulose, Nylon oder Polyvinylidendifluorid, sowie Halbleitermaterialien, behandeltes oder unbehandeltes Glas und behandelter oder unbehandelter Kunststoff wie z. B. Polystyrol, Polycarbonat, Polyvinylchlorid oder dergleichen. Auch beliebige Kombinationen solcher Trägermaterialien sind möglich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine Mikrotiterplatte. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Chip bzw. ein Mikroarraysubstrat oder eine funktionalisierte Glasoberfläche.
  • Wie bereits oben ausgeführt wurde, lassen sich die erfindungsgemäßen Peptide mit Vorteil durch chemische Synthese, insbesondere durch Festphasensynthese nach Merrifield, erzeugen. Dadurch lässt sich das erfindungsgemäße Immundiagnostikum nicht nur wirtschaftlicher herstellen als herkömmliche Immundiagnostika, die auf rekombinanten Konformationsantigenen basieren, sondern stellt auch die Möglichkeit bereit, die Peptide mit zweckdienlichen, nichtnatürlichen bzw. nichtproteinogenen Modifikationen auszustatten. So, wie die Begriffe hier verwendet werden, bezeichnen nichtnatürliche bzw. nichtproteinogene Modifikationen insbesondere die Ausstattung der Peptide mit chemischen Funktionen, Gruppen und/oder Bausteinen, die keinen Bestandteil der Proteinbiosynthese bilden. Beispielsweise kann das mindestens eine Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und/oder, soweit vorhanden, das mindestens eine Peptid der dritten, vierten, fünften und/oder sechsten Gruppe C-terminal als Carbonsäureamid ausgebildet sein, insbesondere als primäres Amid oder als sekundäres Amid mit einem Acylsubstituenten. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise unspezifische Peptid-Antikörper-Wechselwirkungen deutlich reduzieren lassen und eine Verbesserung der Sensitivität und Spezifität des Diagnostikums erreicht wird. Vorzugsweise sind sämtliche der vorgenannten, in den antigenwirksamen Bestandteilen enthaltene Peptide als Carbonsäureamid ausgebildet.
  • Eine weitere Möglichkeit ist es, die Peptide mit einer nichtproteinogenen Kopplungsgruppe auszustatten, die eine gerichtete kovalente oder affine Anbindung der Peptide an den Träger erlauben. Durch die gerichtete Anbindung lassen sich mehr Peptide in einer aktiven, d. h. zur Antikörperbindung befähigten, Form an den Träger koppeln, wodurch die Zuverlässigkeit des Antikörpernachweises und die Reproduzierbarkeit des Diagnostikums verbessert wird. Geeignete Kopplungsgruppen für die gerichtete kovalente oder affine Anbindung wie z. B. Biotin, His-Tag oder chemoselektive funktionelle Gruppen sind dem Fachmann einschlägig bekannt. Selbstverständlich ist es aber auch möglich, die Peptide ungerichtet, d. h. insbesondere durch unspezifische Adsorption, auf dem Träger anzuordnen.
  • Vorzugsweise weist das Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und/oder, soweit vorhanden, das mindestens eine Peptid der dritten, vierten, fünften und/oder sechsten Gruppe ein nichtproteinogenes Spacermolekül auf, welches zwischen der nichtproteingenen Kopplungsgruppe und einer, vorzugsweise terminalen, Aminosäure des Peptids angeordnet ist. Auf diese Weise wird das Peptid vom Träger beabstandet und eine effizientere Antikörperbindung an das Peptid erreicht. Nicht beschränkende Beispiele für geeignete Spacermoleküle sind aliphatische C3-, C6-, C12- und C18-Spacer, verschiedene hydrophile Polyethylenglykol-Spacer (PEG-Spacer) und dergleichen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist die Kopplungsgruppe bzw. das Spacermolekül am N-Terminus des Peptids angeordnet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein artifizielles Polypeptid bereit. Das erfindungsgemäße Polypeptid weist mehrere unterschiedliche Sequenzabschnitte auf, wobei mindestens zwei der Sequenzabschnitte jeweils unabhängig voneinander mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) aufweisen. Auf diese Weise wird ein hochreaktives, künstliches Antigen bereitgestellt, das mit Vorteil für die Immunisierung gegen SARS-CoV-2 oder für den empfindlichen immunologischen Nachweis von SARS-CoV-2-Infektionen eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Peptidzusammensetzung mit mehreren unterschiedlichen Peptiden in einer lösbaren oder gelösten Form bereit. Die erfindungsgemäße Peptidzusammensetzung charakterisiert, dass mindestens zwei der Peptide jeweils unabhängig voneinander zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) aufweisen.
  • Es versteht sich, dass das artifizielle Polypeptid und die Peptidzusammensetzung auch ein oder mehrere weitere Sequenzabschnitte bzw. ein oder mehrere weitere Peptide umfassen kann, welche die Merkmale von einem oder mehreren Peptiden der dritten, vierten, fünften und/oder sechsten Gruppe gemäß obigen Ausführungen aufweisen.
  • Beispielsweise können mindestens zwei der Peptide der Peptidzusammensetzung jeweils unabhängig voneinander zumindest abschnittsweise jeweils mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9), und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11), Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5), Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14), Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) aufweisen.
  • Die Erfindung sieht insbesondere eine Verwendung des artifiziellen Polypeptids oder der Peptidzusammensetzung zur Herstellung eines Immundiagnostikums für eine Coronavirus-Infektion bzw. zur Herstellung eines Impfstoffs gegen SARS-CoV-2 vor.
  • Schließlich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von Coronavirus-Infektionen. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: a) Bereitstellen mindestens eines Peptids einer ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) und/oder mindestens eines Peptids einer zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11), b) Bereitstellen mindestens eines Peptids einer dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), mindestens eines Peptids einer vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14) und/oder mindestens eines Peptids einer fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, c) unterscheidbares Kontaktieren des mindestens einen Peptids der ersten und/oder zweiten Gruppe und des mindestens einen Peptids der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe mit einer Patientenprobe, die im Verdacht steht, Antikörper gegen ein Coronavirus zu enthalten, unter Bedingungen, die eine Bindung der Antikörper an die Peptide erlauben, d) Überprüfen, ob in Schritt c) eine Bindung der Antikörper an das mindestens eine Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und das mindestens eine Peptid der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe erfolgt ist, um die Coronavirus-Infektion nachzuweisen und/oder zu differenzieren.
  • Insbesondere handelt es sich bei den Antikörpern um IgG-Antikörper.
  • Es versteht sich, dass sich die verschiedenen Ausführungsformen und Vorteile des erfindungsgemäßen Immundiagnostikums, soweit anwendbar, auch auf das artifizielle Polypeptid, die Peptidzusammensetzung und deren Verwendungen sowie das Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von Coronavirus-Infektionen beziehen können. Merkmale, die vorstehend und im Folgenden im Zusammenhang mit dem Immundiagnostikum offenbart sind, können sich daher auch auf das Polypeptid, die Peptidzusammensetzung, deren Verwendungen und das Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von Coronavirus-Infektionen beziehen und umgekehrt.
  • Figurenliste
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert. Keinesfalls soll die Erfindung auf die Ausführungsbeispiele und die gezeigten Figuren beschränkt sein. Es zeigen:
    • 1 eine Peptid-Mikroarray basierte Analyse der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen das SARS-CoV-2 Nucleoprotein (N) und Spike-Glycoprotein (S);
    • 2 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen das Nucleoprotein (N) verschiedener Coronaviren;
    • 3 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen das Spike-Glycoprotein (S) verschiedener Coronaviren;
    • 4 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen das Membranprotein (M) verschiedener Coronaviren;
    • 5 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen das Envelope small membrane protein (E) verschiedener Coronaviren;
    • 6 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen Nichtstrukturproteine aus Replicase polyprotein 1ab von SARS-CoV-2;
    • 7 Peptid-Mikroarray basierte Analysen der in humanen Patientenseren gemessenen IgG-Immunantwort gegen weitere Nichtstrukturproteine von SARS-CoV-2;
    • 8 eine Auswertung der Unterscheidungskraft ausgewählter immundominanter SARS-CoV-2 Epitope mittels Wilcoxon-Rangsummentest in Bezug auf die Fähigkeit der Peptide zur Unterscheidung zwischen Patientengruppen mit und ohne SARS-CoV-Infektion;
    • 9 eine Korrelationsanalyse von den Ergebnissen der serologischen Diagnose von SARS-CoV-2 Patienten mit einem erfindungsgemäßen Immundiagnostikum im Mikroarray-Format im Vergleich zu einem herkömmlichen ELISA-Test als Referenz;
    • 10 eine grafische Darstellung der serologischen Kreuzreaktivität zwischen SARS-CoV-2 und anderen Coronaviren;
    • 11 eine grafische Darstellung verschiedener erfindungsgemäßer Epitopkombinationen.
  • Detaillierte Beschreibung von Ausführungsbeispielen
  • Für die Identifizierung von immundominanten Epitopen wurde die humorale Immunantwort gegen SARS-CoV-2 mit Serumproben von COVID-19 Patienten auf der Ebene einzelner linearer Peptidepitope mithilfe von Peptid-Mikroarrays analysiert.
  • Die Peptid-Mikroarrays umfassten eine Bibliothek von insgesamt 5513 Peptiden, welche das gesamte Proteom von SARS-CoV-2 und zusätzlich das Spike-glycoprotein (S), Nucleoprotein (N), Envelope small membrane protein (E), und Membranprotein (M) der folgenden HCoVs enthielt: SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-229E und HCoV-OC43. Alle Proteine wurden durch überlappende Peptide repräsentiert welche die gesamte Proteinsequenz abbildeten. Die Peptidlänge betrug jeweils 15 Aminosäuren bei einer Überlappung von 11 Aminosäuren zwischen aufeinanderfolgenden Peptiden. Alle in der Peptidbibliothek abgebildeten Proteine sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Aufstellung der mithilfe der Peptidbibliothek dargestellten Coronavirus-Proteine.
    UniProtKB Name Anzahl Peptide Protein Coronavirustyp
    A0A663DJA2_9BETC 7 ORF10 protein SARS-CoV-2
    AP3A WCPV 66 Protein 3a SARS-CoV-2
    NCAP WCPV 102 Nucleoprotein SARS-CoV-2
    NS6 WCPV 13 Non-structural protein 6 SARS-CoV-2
    NS7A WCPV 28 Protein 7a SARS-CoV-2
    NS7B WCPV 8 Protein non-structural 7b SARS-CoV-2
    NS8_WCPV 28 Non-structural protein 8 SARS-CoV-2
    ORF9B_WCPV 22 Protein 9b SARS-CoV-2
    R1A_WCPV 1099 Replicase polyprotein 1a SARS-CoV-2
    R1AB_WCPV 1772 Replicase polyprotein 1ab SARS-CoV-2
    SPIKE_WCPV 316 Spike glycoprotein SARS-CoV-2
    VEMP_WCPV 16 Envelope small membrane protein SARS-CoV-2
    VME1_WCPV 53 Membrane protein SARS-CoV-2
    Y14_WCPV 16 Uncharacterized protein 14 SARS-CoV-2
    NCAP_CVHSA 103 Nucleoprotein SARS-CoV
    SPIKE_CVHSA 311 Spike glycoprotein SARS-CoV
    VEMP_CVHSA 17 Envelope small membrane protein SARS-CoV
    VME1_CVHSA 53 Membrane protein SARS-CoV
    NCAP_CVHOC 110 Nucleoprotein OC43
    SPIKE_CVHOC 336 Spike glycoprotein OC43
    VEMP_CVHOC 19 Envelope small membrane protein OC43
    VME1_CVHOC 55 Membrane protein OC43
    NCAP_CVEMC 100 Nucleoprotein MERS
    SPIKE_CVEMC 336 Spike glycoprotein MERS
    VEMP_CVEMC 18 Envelope small membrane protein MERS
    VME1_CVEMC 52 Membrane protein MERS
    NCAP_CVH22 95 Nucleoprotein 229E
    SPIKE_CVH22 291 Spike glycoprotein 229E
    VEMP_CVH22 17 Envelope small membrane protein 229E
    VME1_CVH22 54 Membrane protein 229E
  • Die Peptide wurden mithilfe der SPOT-Synthesetechnologie auf Cellulosemembranen synthetisiert. Nach einem letzten Syntheseschritt, bei dem eine Kopplungsgruppe am N-Terminus jedes Peptids angefügt wurde, wurden die Seitenketten entschützt und die festphasengebundenen Peptide in 96-Well-Mikrotiter-Filtrationsplatten (Millipore, Bedford, MA, USA) überführt. Zur Abspaltung der Peptide von der Cellulosemembran wurden die einzelnen Spots mit wässrigem Triethylamin (2,5% v/v) behandelt. Die peptidhaltige Lösung wurde in Tochterplatten zentrifugenfiltriert und das Lösungsmittel durch Verdampfen unter reduziertem Druck entfernt. Zur Übertragung der Peptide auf 384-Well-Platten wurden die trockenen Peptide jeweils in 35 µL Druckpuffer (40% DMSO, 5% Glycerol in 200 mM Natriumacetat-Puffer pH 4) gelöst und mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen aliquotiert. Die Peptid-Mikroarrays wurden mit einem kontaktfreien Hochleistungs-Mikroarray-Drucker auf epoxymodifizierten Objektträgern hergestellt (PolyAn, Berlin, Deutschland). Alle Peptide und Kontrollen wurden in Triplikaten gedruckt.
  • Die Peptid-Mikroarrays wurden mit Seren in einer 1:200 Verdünnung in SuperBlock Blockierungspuffer (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) in einer HS 4800 Mikroarray-Verarbeitungsstation (Tecan, Crailsheim, Deutschland) für zwei Stunden bei 30 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit 0,1 µg/mL fluoreszenzmarkiertem Anti-Human-IgG-Detektionsantikörper (Jackson Immunoresearch, Ely, UK). Vor jedem Inkubationsschritt wurden Waschschritte mit 0,1% Tween-20 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS-Puffer) durchgeführt. Nach dem letzten Inkubationsschritt wurden die Microarrays gewaschen (0,05% Tween-20 in 0,1-fach konzentrierter Natriumcitratgepufferter Salzlösung, SSC) und in einem Stickstoffstrom getrocknet. Jeder Mikroarray wurde mit einem GenePix Autoloader 4300 SL50 (Molecular Devices, San Jose, USA) mit einer Auflösung von 10 µm gescannt. Die Signalintensitäten wurden mit der GenePix Pro 7.0-Analysesoftware (Molecular Devices) ausgewertet. Für jedes Peptid wurde der MMC2-Wert der drei Triplikate berechnet. Der MMC2-Wert entspricht dem Mittelwert aller drei Instanzen auf dem Mikroarray, außer wenn der Variationskoeffizient (CV), d. h. die Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert, größer als 0,5 war. In diesem Fall wurde der Mittelwert der beiden einander am nächsten liegenden Werte (MC2) dem MMC2 zugeordnet. Die weitere Datenanalyse und die Erstellung der Diagramme zur Visualisierung der Daten (sog. Heatmaps) erfolgte mit der statistischen Berechnungs- und Grafiksoftware R (Version 4.0.2, www.r-project.org).
  • Der für die statistische Analyse der Mikroarray-Ergebnisse und für die Erstellung der Heatmaps verwendete Datensatz basierte auf MMC2-Werten, die aus den Signalen der dreimal immobilisierten Spots jedes einzelnen Peptids berechnet wurden. In den Heatmaps wurden die MMC2-Werte in Grauwerte umkodiert, wobei weiß für kein Signal oder geringe Signalintensität steht und der Grauwert mit steigender Signalintensität (bis zu einer maximalen Intensität von 65535 Lichteinheiten, LE) zunimmt. Die rechte Spalte in jeder Heatmap repräsentiert die höchstmögliche Signalintensität.
  • 1 zeigt die Peptid-Mikroarray basierte Analyse von IgG-Reaktionen auf das SARS-CoV-2 Nucleoprotein (N) und Spike-Glycoprotein (S), gemessen in Humanseren. Die Heatmaps beinhalten zwei Gruppen von Serumproben: Seren von SARS-CoV-2-Infizierten und Seren von Kontrollgruppen ohne SARS-CoV-2-Infektion. Die Spalten repräsentieren Peptidsequenzen, die Zeilen die Proben. Die Grauwerte geben die Signalintensität an, die von dreifachen Spots erhalten wurden. Die beiden oberen Zeilen der Heatmaps reflektieren Signale, die nur mit Detektionsantikörpern (kein Serum) erhalten wurden. Die rechte Spalte in jeder Heatmap spiegelt die höchstmögliche Signalintensität wider.
  • Die ebenfalls in 1 gezeigten Box-Plots geben die Signalverteilung in den beiden Serumgruppen für ausgewählte immundominante Regionen wider. Die zentralen Rechtecke erstrecken sich vom ersten Quartil bis zum dritten Quartil (dem Interquartilsbereich oder IQR). Die Whisker repräsentieren die folgenden Werte: oberer Whisker = min(max(x), Quartil 3 + 1,5·IQR); unterer Whisker = max(min(x), Quartil 1 - 1,5·IQR). Die Punkte in den Boxplots zeigen die MMC2-Werte für die einzelnen Proben. Der statistische Vergleich von zwei Stichprobengruppen wurde mit dem Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt (R-Paket-Statistik, n=24 Patientenproben und n=12 Kontrollstichproben). Die ROC-Analyse wurde mit dem R-Paket ROCR durchgeführt. Die Auswahl der Peptide mit signifikanter Trennung zwischen den Probengruppen basierte auf dem Genauigkeitswert (ACC2), der als „wahr positiv + wahr negativ/Gesamtzahl der Befunde“ berechnet wurde. Ein Genauigkeitswert von ≥ 0.39 wurde als Hinweis auf Immunogenität angesehen. Die Immundominanz wurde den Epitopen auf der Grundlage der höchsten Genauigkeitswerte und der Sequenzen des entsprechenden überlappenden Peptids zugeordnet.
  • In Ergänzung zeigen die 2 bis 5 die Ergebnisse der Peptid-Mikroarray-Analyse der IgG-Reaktionen auf das Nucleoprotein (2), Spike-Glycoprotein (3), Membranprotein (4) und Envelope small membrane protein (5) verschiedener Coronaviren. 6 und 7 zeigen ergänzend die Peptid-Mikroarray-Analyse der IgG-Reaktionen auf Nichtstrukturproteine aus Replicase polyprotein 1ab (6) und andere Nichtstrukturproteine (7) von SARS-CoV-2.
  • Die Ergebnisse der Analysen zeigen, dass die Seren der COVID-19 Patienten ein hohes Maß an Antikörper Reaktivität aufwiesen, wohingegen in den Kontrollseren kaum oder keine Reaktivität nachgewiesen werden konnte. Es wurden mehrere immundominante Regionen in dem SARS-CoV-2 Proteom identifiziert. Diese fanden sich hauptsächlich in dem SARS2 Spike-Glycoprotein und dem SARS2 Nucleoprotein. Es wurde ebenfalls eine starke IgG-Reaktivität gegenüber mehreren Peptiden ermittelt, die aus dem SARS2 Membranprotein, Protein 3a und Replicase polyprotein 1ab abgeleitet wurden, wobei die ermittelte Immundominanz in diesen Proteinen jedoch insgesamt weniger stark ausgeprägt war. Alle übrigen SARS2-Antigene zeigten hinsichtlich der IgG-Antwort keine oder nur eine geringe Immunogenität.
  • Zur quantitativen Charakterisierung der identifizierten immundominanten Regionen wurden die Immunantworten in SARS-CoV-2-infizierten Patienten mit denen in der Kontrollgruppe für jedes Peptid durch den nichtparametrischen Wilcoxon-Rangsummentest verglichen. In 8 sind die Ergebnisse für ausgewählte Peptide dargestellt. Die statistische Auswertung zeigt, dass die Peptide eine zuverlässige Unterscheidung zwischen den Patientengruppen gewährleisten.
  • Tabelle 2 zeigt eine Auswahl der auf diese Weise identifizierten Epitope, die entweder durch einzelne Peptide oder durch gemeinsame Kernsequenzen, die von zwei oder mehr überlappenden Peptiden abgeleitet sind, repräsentiert werden. Um die identifizierten immundominanten Peptide auf die potentiellen immundominanten Epitopsequenzen einzugrenzen, wurden die Peptide mit den höchsten Genauigkeitswerten in der Reihenfolge ihres Auftretens in den entsprechenden Antigenen aufgelistet. Soweit möglich, wurden Sequenzüberlappungen durch Unterstreichung hervorgehoben. Die Peptidbezeichnung setzt sich aus der Abkürzung des jeweiligen SARS-CoV-2 Proteins (AP3A = Protein 3a; NCAP = Nucleoprotein; SPIKE = Spike glycoprotein; VME1 = Membrane protein; R1AB = Replicase polyprotein 1ab) und der Aminosäureposition im Protein zusammen. Beispielsweise bezeichnet „NCAP_0157-0171“ das Peptid, das die Aminosäuren 157 bis 171 des SARS-CoV-2 Nucleoproteins repräsentiert. VH gibt das Verhältnis aus dem Median der gemessenen Signalintensitäten von Triplikat-Spots des jeweiligen Peptids in SARS-CoV-2-infizierten Patienten und der Kontrollgruppe an. Tabelle 2: Ausgewählte erfindungsgemäße SARS-CoV-2-Epitope, die eine gute Trennung zwischen den Gruppen gewährleisten. AUC = Fläche unter der ROC-Kurve.
    Peptidbez. Sequenz VH P-Wert AUC immundominantes Epitop SEQ ID NO:
    AP3A_0253-0267 SGWNPVMEPIYDEP 1,8 1,2E-02 0,76 0261-EPIYDEP-0267 1
    AP3A_0257-0271 NPVMEPIYDEPTTTT 1,9 5,6E-03 0,78
    AP3A_0261-0275 EPIYDEPTTTTSVPL 3,0 5,0E-03 0,78
    NCAP_0009-0023 QRNAPRITFGGPSDS 2,1 6,1E-04 0,84 0013-PRITFGGPSDS-0023 2
    NCAP_0013-0027 PRITFGGPSDSTGSN 2,6 1,6E-03 0,82
    NCAP_0033-0047 SGARSKQRRPQGLPN 2,7 7,3E-03 0,78 0037-SKQRRPQGLPN-0047 3
    NCAP_0037-0051 SKQRRPQGLPNNTAS 4,6 4,0E-03 0,79
    NCAP_0157-0171 IVLQLPQGTTLPKGF 7,1 5,6E-03 0,78 0161-LPQGTTLPKGF-0171 4
    NCAP_0161-0175 LPQGTTLPKGFYAEG 5,0 8,4E-02 0,68
    NCAP_0217-0231 AALALLLLDRLNQLE 2,7 8,1E-04 0,83 0221-LLLLDRLNQLE-0231 5
    NCAP_0221-0235 LLLLDRLNQLESKMS 12,7 4,3E-07 0,96
    NCAP_0357-0371 IDAYKTFPPTEPKKD 3,2 1,7E-04 0,87 0357-IDAYKTFPPTEPKKD-0371 6
    NCAP_0373-0387 KKKADETQALPQRQK 3,1 2,1E-03 0,81 0377-DETQALPQRQK-0387 7
    NCAP_0377-0391 DETQALPQRQKKQQT 6,1 5,7E-05 0,89
    NCAP_0385-0399 RQKKQQTVTLLPAAD 6,1 3,8E-04 0,85 0393-TLLPAADLDDFSKQL-0407 8
    NCAP_0389-0403 QQTVTLLPAADLDDF 5,6 1,1E-03 0,83
    NCAP_0393-0407 TLLPAADLDDFSKQL 39,4 1,7E-05 0,91
    NCAP_0397-0411 AADLDDFSKQLQQSM 30,9 5,3E-06 0,93
    SPIKE_0553-0567 TESNKKFLPFQQFGR 3,4 5,2E-04 0,84 0557-KKFLPFQQFGR-0567 9
    SPIKE_0557-0571 KKFLPFQQFGRDIAD 5,1 9,9E-05 0,88
    SPIKE_0657-0671 NNSYECDIPIGAGIC 1,6 2,6E-02 0,73 0661-ECDIPIGAGIC-0671 10
    SPIKE_0661-0675 ECDIPIGAGICASYQ 1,8 1,9E-02 0,74
    SPIKE_0785-0799 VKQIYKTPPIKDFGG 2,8 1,1E-06 0,95 0789-YKTPPIKDFGG-0799 11
    SPIKE_0789-0803 YKTPPIKDFGGFNFS 4,8 4,5E-04 0,85
    SPIKE_0809-0823 PSKPSKRSFIEDLLF 5,5 1,6E-03 0,82 0813-SKRSFIEDLLF-0823 70
    SPIKE_0813-0827 SKRSFIEDLLFNKVT 3,0 1,2E-02 0,76
    SPIKE_1145-1159 LDSFKEELDKYFKNH 11,2 1,1E-04 0,88 1145-LDSFKEELDKYFKNH-1159 69
    SPIKE_1253-1267 CCKFDEDDSEPVLKG 2,8 6,3E-03 0,78 1259-DDSEPVLKGVKLH-1271 14
    SPIKE_1257-1271 DEDDSEPVLKGVKLH 3,3 4,7E-05 0,89
    SPIKE_1259-1273 DDSEPVLKGVKLHYT 3,1 1,7E-05 0,91
    VME1_0005-0019 NGTITVEELKKLLEQ 6,3 8,1E-04 0,83 0005-NGTITVEELKKLLEQ-0019 15
    R1AB_1657-1671 KYPOVNGLTSIKWAD 1,7 2,6E-02 0,73 1657-KYPQVNGLTSIKWAD-1671 16
    R1AB_2153-2167 TTNIVTRCLNRVCTN 1,6 1,9E-02 0,74 0005-TTNIVTRCLNRVCTN-0019 17
  • Eine vollständige Liste der erfindungsgemäßen Peptide, die eine signifikante Unterscheidung zwischen SARS-CoV-2 infizierten Patienten und der Kontrollgruppe erlaubten, ist in Tabelle 3 gezeigt. Die Peptidbezeichnungen setzen sich wiederum entsprechend der obigen Ausführungen zu Tabelle 2 zusammen. Tabelle 3: Erfindungsgemäße Peptide mit der höchsten ermittelten Unterscheidungskraft zwischen SARS-CoV-2-Infizierten und der Kontrollgruppe.
    Peptidbezeichnung Sequenz P-Wert ACC2 VH SEQ ID NO:
    AP3A_WCPV_0261-0275 EPIYDEPTTTTSVPL 0,0050 0,50 3,0 18
    NCAP_WCPV_0013-0027 PRITFGGPSDSTGSN 0,0016 0,47 2,6 19
    NCAP_WCPV_0033-0047 SGARSKQRRPQGLPN 0,0073 0,56 2,7 20
    NCAP_WCPV_0037-0051 SKQRRPQGLPNNTAS 0,0040 0,56 4,6 21
    NCAP_WCPV_0041-0055 RPQGLPNNTASWFTA 0,4969 0,39 1,2 22
    NCAP_WCPV_0049-0063 TASWFTALTQHGKED 0,0669 0,39 1,5 23
    NCAP_WCPV_0157-0171 IVLQLPQGTTLPKGF 0,0056 0,61 7,1 24
    NCAP_WCPV_0161-0175 LPQGTTLPKGFYAEG 0,0840 0,58 5,0 25
    NCAP_WCPV_0165-0179 TTLPKGFYAEGSRGG 0,3613 0,39 1,3 26
    NCAP_WCPV_0217-0231 AALALLLLDRLNQLE 0,0008 0,44 2,7 27
    NCAP_WCPV_0221-0235 LLLLDRLNQLESKMS 0,0000 0,61 12,7 28
    NCAP_WCPV_0237-0251 KGQQQQGQTVTKKSA 0,2115 0,42 1,3 29
    NCAP_WCPV_0245-0259 TVTKKSAAEASKKPR 0,0486 0,42 1,6 30
    NCAP_WCPV_0249-0263 KSAAEASKKPRQKRT 0,2951 0,44 1,6 31
    NCAP_WCPV_0357-0371 IDAYKTFPPTEPKKD 0,0002 0,42 3,2 6
    NCAP_WCPV_0373-0387 KKKADETQALPQRQK 0,0021 0,47 3,1 32
    NCAP_WCPV_0377-0391 DETQALPQRQKKQQT 0,0001 0,50 6,1 33
    NCAP_WCPV_0385-0399 RQKKQQTVTLLPAAD 0,0004 0,50 6,1 34
    NCAP_WCPV_0389-0403 QQTVTLLPAADLDDF 0,0011 0,64 5,6 35
    NCAP_WCPV_0393-0407 TLLPAADLDDFSKQL 0,0000 0,86 39,4 8
    NCAP_WCPV_0397-0411 AADLDDFSKQLQQSM 0,0000 0,81 30,8 36
    R1A_WCPV_4349-4363 YVQIPTTCANDPVGF 0,2241 0,44 1,1 37
    R1AB_WCPV_0105-0119 GVLVPHVGEIPVAYR 0,0121 0,44 1,6 38
    R1AB_WCPV_0245-0259 SEKSYELQTPFEIKL 0,0317 0,39 1,2 39
    R1AB_WCPV_0253-0267 TPFEIKLAKKFDTFN 0,3613 0,39 1,0 40
    R1AB_WCPV_1189-1203 SFLEMKSEKQVEQKI 0,3388 0,39 1,1 41
    R1AB_WCPV_1481-1495 DAVTAYNGYLTSSSK 0,2651 0,44 1,0 42
    R1AB_WCPV_1657-1671 KYPQVNGLTSIKWAD 0,0264 0,47 1,7 16
    R1AB_WCPV_2153-2167 TTNIVTRCLNRVCTN 0,0199 0,44 1,6 17
    R1AB_WCPV_2177-2191 LQLCTFTRSTNSRIK 0,3613 0,44 1,0 43
    R1AB_WCPV_3253-3267 PQTSITSAVLQSGFR 0,0121 0,44 1,5 44
    R1AB_WCPV_3825-3839 SQGLLPPKNSIDAFK 0,2681 0,44 1,4 45
    R1AB_WCPV_4965-4979 QKLLKSIAATRGATV 0,6079 0,44 0,5 46
    R1AB_WCPV_4973-4987 ATRGATWIGTSKFY 0,9341 0,44 1,0 47
    R1AB_WCPV_5117-5131 HRLYECLYRNRDVDT 0,4761 0,47 0,9 48
    R1AB_WCPV_5909-5923 LQFTSLEIPRRNVAT 0,0002 0,44 1,6 49
    SPIKE_WCPV_0241-0255 LLALHRSYLTPGDSS 0,0000 0,39 2,7 50
    SPIKE_WCPV_0549-0563 TGVLTESNKKFLPFQ 0,0779 0,42 1,8 51
    SPIKE_WCPV_0553-0567 TESNKKFLPFQQFGR 0,0005 0,67 3,4 52
    SPIKE_WCPV_0557-0571 KKFLPFQQFGRDIAD 0,0001 0,67 5,1 53
    SPIKE_WCPV_0625-0639 HADQLTPTWRVYSTG 0,0447 0,39 1,4 54
    SPIKE_WCPV_0657-0671 NNSYECDIPIGAGIC 0,0264 0,50 1,6 55
    SPIKE_WCPV_0777-0791 NTQEVFAQVKQIYKT 0,0001 0,44 2,7 56
    SPIKE_WCPV_0785-0799 VKQIYKTPPIKDFGG 0,0000 0,50 2,8 57
    SPIKE_WCPV_0789-0803 YKTPPIKDFGGFNFS 0,0004 0,61 4,8 58
    SPIKE_WCPV_0809-0823 PSKPSKRSFIEDLLF 0,0016 0,61 5,5 59
    SPIKE_WCPV_0813-0827 SKRSFIEDLLFNKVT 0,0121 0,56 3,0 60
    SPIKE_WCPV_1145-1159 LDSFKEELDKYFKNH 0,0001 0,72 11,2 69
    SPIKE_WCPV_1149-1163 KEELDKYFKNHTSPD 0,0004 0,39 2,7 61
    SPIKE_WCPV_1177-1191 VNIQKEIDRLNEVAK 0,0001 0,44 3,4 62
    SPIKE_WCPV_1249-1263 SCGSCCKFDEDDSEP 0,2115 0,44 1,2 63
    SPIKE_WCPV_1253-1267 CCKFDEDDSEPVLKG 0,0063 0,56 2,8 64
    SPIKE_WCPV_1257-1271 DEDDSEPVLKGVKLH 0,0000 0,53 3,3 65
    SPIKE_WCPV_1259-1273 DDSEPVLKGVKLHYT 0,0000 0,50 3,1 66
    VME1_WCPV_0005-0019 NGTITVEELKKLLEQ 0,0008 0,64 6,3 15
    VME1_WCPV_0185-0199 QRVAGDSGFAAYSRY 0,2509 0,44 1,2 67
    VME1_WCPV _0189-0203 GDSGFAAYSRYRIGN 0,2373 0,44 1,1 68
  • Das diagnostische Potenzial des erfindungsgemäßen, peptidbasierten Immundiagnostikums wurde durch einen Vergleich der Testergebnisse mit einem herkömmlichen, auf einem vollständigen Konformationsantigen basierenden ELISA-Test (Euroimmun, Lübeck, Deutschland) evaluiert. 9 zeigt die quantitativen Messergebnisse für die SARS-CoV-2 infizierte Patientengruppe mit dem kommerziellen ELISA Test (x-Achse) und dem erfindungsgemäßen Immundiagnostikum in einer Ausführung als Peptid-Mikroarray (y-Achse). Der Spearman'sche Korrelationskoeffizient zwischen dem ELISA-Signal und den summierten Mikroarray-Signalen für Peptide aus dem SARS-CoV-2 Spike-Glycoprotein und Nucleoprotein wurde für Seren von SARS-CoV-2-infizierten Patienten berechnet. Im ELISA-Assay, der ein rekombinantes Spike-Glycoprotein als Antigen verwendet, wurde der Quotient aus der Extinktion der Patientenprobe im Vergleich zum Kalibrator als Netto-Assay-Signal verwendet. Die gesamten Mikroarray-Signale für jede Probe wurden als Summe aller entsprechenden Signalintensitäten über dem oberen 10-16%-Quantil der Rauschverteilung berechnet. Die Tests zeigten eine hohe Korrelation mit einem Spearman'schen Korrelationskoeffizienten von 0,88.
  • Die Antikörper-Kreuzreaktivität zwischen SARS-CoV-2 und saisonalen Erkältungs-Coronaviren kann im Hinblick auf den klinischen Verlauf von COVID-19 von großer Bedeutung sein und stellt gleichzeitig eine Herausforderung für die Entwicklung eines spezifischen Immuntests für SARS-CoV-2 dar.
  • Vor diesem Hintergrund wurde ergänzend die IgG-Reaktivität auf Peptide aus den S-, N-, E- und M-Proteinen von SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43 und HCoV-229E (siehe Tabelle 1 oben) analysiert. Dabei konnten die Erfinder sehr ähnliche IgG-Bindungsprofile gegen die N- und M-Proteine von SARS-CoV-2 und SARS-CoV feststellen, während die entsprechenden Proteine der übrigen Virusstämme nur schwache und gestreute Signale zeigten (siehe 2 und 4). Insbesondere die vom S-Protein aller Virusstämme abgeleiteten Peptide zeigten bei SARS-CoV-2-positiven Patienten klare Signalmuster, die darauf hindeuteten, dass dieses Antigen potenziell kreuzreaktive Determinanten enthielt (siehe 3).
  • Diese serologische Kreuzreaktivität zwischen SARS-CoV-2 und anderen Coronaviren in Bezug auf das S-Protein ist zusätzlich in 10 gezeigt. Die Heatmaps veranschaulichen eine starke IgG-Seroreaktivität in Seren von SARS-CoV-2-infizierten Patienten gegenüber konservierten S-Protein-Regionen verschiedener Coronaviren. Die IgG-Reaktivität richtete sich vor allem gegen zwei Sequenzbereiche, die jeweils von zwei überlappenden Peptiden mit hochkonservierten kreuzreaktiven Epitopen gebildet wurden. Mithilfe dieser Ergebnisse konnten zwei hochgradig kreuzreaktive Motive abgeleitet werden. Das Konsensmotiv I, Ro8,5S-IED-LF0823 (Zahlen beziehen sich auf die Position des Epitops im SARS2-Antigen), war bei allen fünf analysierten Viren vorhanden, während ein zweites Konsensmotiv II, F1148--ELD--FKN,158, bei den Viren SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-Cov und HCoV-OC43, jedoch nicht bei HCoV-229E gefunden wurde.
  • Zur weiteren Analyse der serologischen Kreuzreaktivität von SARS-CoV-2-positiven Patienten gegen gewöhnliche Erkältungs-Coronaviren wurde ein lückenloser Abgleich der N- und S-Sequenzen aller Coronaviren durchgeführt. Daraus ergaben sich für jeden Stamm die Sequenzbereiche, die zu den zuvor identifizierten SARS-CoV-2-Epitopen komplementär waren. Schließlich wurde für jeden der Aminosäurereste der so identifizierten Sequenzenbereiche das mediane Signal aller überlappenden Peptide berechnet, die diesen Aminosäurerest enthielten, und mit den gleichen Grauwerten wie in den zuvor präsentierten Heatmaps visualisiert.
  • Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die immundominanten Epitope mit SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 des N-Proteins und SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:11 des S-Proteins von SARS-CoV-2 zeigten bei Proben von SARS-CoV-2-infizierten Personen im Vergleich zu den Kontrollproben starke Signale. Gleichzeitig wurden keine Signale für die direkt homologen Sequenzen der anderen Coronavirusstämme gefunden, was belegt, dass IgG-Reaktionen auf diese Epitope hochspezifisch für SARS-CoV-2 sind (11 oben). Die SARS-CoV-2-Epitope SEQ ID NO:2 bis SEQ ID NO:6 des N-Proteins und SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:14 des S-Proteins zeigten eine starke Homologie zu SARS-CoV, was zu einer serologischen Kreuzreaktivität mit diesem Virus führte (11 Mitte). Schließlich waren die Epitope mit SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13 des S-Proteins am wenigsten SARS-CoV-2-spezifisch und wiesen eine beträchtliche immunologische Kreuzreaktivität auf (11 unten).
  • Auf diese Weise können erfindungsgemäße Kombinationen dieser Peptidepitope mit Vorteil eingesetzt werden, um Infektionen mit SARS-CoV-2 mit hoher Zuverlässigkeit nachzuweisen und ggf. gleichzeitig von Infektionen mit SARS-CoV-1 und/oder weiteren Coronaviren zu differenzieren.
  • Die Erfindung ist nicht durch die Beschreibung anhand der Ausführungsbeispiele auf diese beschränkt. Vielmehr umfasst die Erfindung jedes neue Merkmal sowie jede Kombination von Merkmalen, was insbesondere jede Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen und der Beschreibung beinhaltet, auch wenn dieses Merkmal oder diese Kombination von Merkmalen selbst nicht explizit in den Patentansprüchen, der Beschreibung oder den Ausführungsbeispielen angegeben ist.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (20)

  1. Ein Immundiagnostikum für eine Coronavirus-Infektion mit einem Träger und mehreren antigenwirksamen Virusbestandteilen von mindestens einem Coronavirus, die auf dem Träger angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) und mindestens ein Peptid einer zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der ersten Gruppe und das mindestens eine Peptid der zweiten Gruppe jeweils nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweist.
  2. Das Immundiagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6) umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der dritten Gruppe nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweist.
  3. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14) umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der vierten Gruppe nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweist.
  4. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der fünften Gruppe nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweist.
  5. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der sechsten Gruppe nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweist.
  6. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile ausgewählt sind aus Peptiden mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66 und beliebigen Kombinationen davon.
  7. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mehrere voneinander getrennte Testbereiche oder Kavitäten aufweist, wobei die antigenwirksamen Virusbestandteile zumindest teilweise in verschiedenen Testbereichen oder Kavitäten angeordnet sind.
  8. Das Immundiagnostikum nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe als Gemisch zusammen in demselben Testbereich oder derselben Kavität angeordnet sind.
  9. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 7 oder 8, soweit zurückbezogen auf einen der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide der ersten und/oder zweiten Gruppe getrennt von den Peptiden der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe angeordnet sind.
  10. Das Immundiagnostikum nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide der dritten und/oder vierten Gruppe getrennt von den Peptiden der fünften Gruppe angeordnet sind.
  11. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Membran, Halbleiter, behandeltes oder unbehandeltes Glas, behandelter oder unbehandelter Kunststoff und beliebigen Kombinationen davon.
  12. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Mikrotiterplatte oder ein Mikroarray ist.
  13. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und/oder, soweit vorhanden, das mindestens eine Peptid der dritten, vierten fünften und/oder sechsten Gruppe C-terminal als Carbonsäureamid ausgebildet ist.
  14. Das Immundiagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Peptid der ersten und zweiten Gruppe und, soweit vorhanden, das mindestens eine Peptid der dritten, vierten, fünften und sechsten Gruppe eine nichtproteinogene Kopplungsgruppe aufweist, die das Peptid kovalent oder nichtkovalent mit dem Träger verbindet.
  15. Das Immundiagnostikum nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens Peptid der ersten und zweiten Gruppe und, soweit vorhanden, das mindestens eine Peptid der dritten, vierten, fünften und sechsten Gruppe ein nichtproteinogenes Spacermolekül aufweist, welches zwischen der nichtproteinogenen Kopplungsgruppe und einer Aminosäure des Peptids angeordnet ist.
  16. Ein Immundiagnostikum für eine Coronavirus-Infektion mit einem Träger und mehreren antigenwirksamen Virusbestandteilen von mindestens einem Coronavirus, die auf dem Träger angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenwirksamen Virusbestandteile mindestens ein Peptid einer ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) und/oder einer zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) und mindestens ein Peptid einer dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), einer vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14), einer fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, und/oder einer sechsten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) umfassen, wobei das mindestens eine Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und das mindestens eine Peptid der dritten, vierten, fünften und/oder sechsten Gruppe jeweils nicht mehr als 30 Aminosäuren aufweisen.
  17. Ein artifizielles Polypeptid mit mehreren unterschiedlichen Sequenzabschnitten, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Sequenzabschnitte jeweils unabhängig voneinander mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) aufweisen.
  18. Eine Peptidzusammensetzung mit mehreren unterschiedlichen Peptiden in einer lösbaren oder gelösten Form, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Peptide jeweils unabhängig voneinander zumindest abschnittsweise jeweils mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7), Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8), Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9),Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11), Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5), Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14), Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, Asn-Gly-Thr-Ile-Thr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Gln (SEQ ID NO:15), Lys-Tyr-Pro-Gln-Val-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Ile-Lys-Trp-Ala-Asp (SEQ ID NO:16) und Thr-Thr-Asn-Ile-Val-Thr-Arg-Cys-Leu-Asn-Arg-Val-Cys-Thr-Asn (SEQ ID NO:17) aufweisen.
  19. Eine Verwendung eines artifiziellen Polypeptids nach Anspruch 17 oder einer Peptidzusammensetzung nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Immundiagnostikums für eine Coronavirus-Infektion oder zur Herstellung eines Impfstoffs gegen SARS-CoV-2.
  20. Ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von Coronavirus-Infektionen, umfassend a) Bereitstellen mindestens eines Peptids einer ersten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Asp-Glu-Thr-Gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Arg-Gln-Lys (SEQ ID NO:7) und Thr-Leu-Leu-Pro-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-Ser-Lys-Gln-Leu (SEQ ID NO:8) und/oder mindestens eines Peptids einer zweiten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Lys-Lys-Phe-Leu-Pro-Phe-Gln-Gln-Phe-Gly-Arg (SEQ ID NO:9) und Tyr-Lys-Thr-Pro-Pro-Ile-Lys-Asp-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:11), b) Bereitstellen mindestens eines Peptids einer dritten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Pro-Arg-Ile-Thr-Phe-Gly-Gly-Pro-Ser-Asp-Ser (SEQ ID NO:2), Ser-Lys-Gln-Arg-Arg-Pro-Gln-Gly-Leu-Pro-Asn (SEQ ID NO:3), Leu-Pro-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Pro-Lys-Gly-Phe (SEQ ID NO:4), Leu-Leu-Leu-Leu-Asp-Arg-Leu-Asn-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:5) und Ile-Asp-Ala-Tyr-Lys-Thr-Phe-Pro-Pro-Thr-Glu-Pro-Lys-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), mindestens eines Peptids einer vierten Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Glu-Cys-Asp-Ile-Pro-Ile-Gly-Ala-Gly-Ile-Cys (SEQ ID NO:10) und Asp-Asp-Ser-Glu-Pro-Val-Leu-Lys-Gly-Val-Lys-Leu-His (SEQ ID NO:14) und/oder mindestens eines Peptids einer fünften Gruppe mit zumindest abschnittsweise mehr als 85% Sequenzähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus Arg-Ser-X3-Ile-Glu-Asp-X7-Leu-Phe (SEQ ID NO:12), wobei X3 aus Phe und Ala und X7 aus Leu und Ile ausgewählt ist, und Phe-X2-X3-Glu-Leu-Asp-X7-X8-Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO:13), wobei X2 aus Lys und Gln, X3 aus Glu und Asp, X7 aus Lys, Glu und Gln und X8 aus Tyr, Phe und Trp ausgewählt ist, c) unterscheidbares Kontaktieren des mindestens einen Peptids der ersten und/oder zweiten Gruppe und des mindestens einen Peptids der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe mit einer Patientenprobe, die im Verdacht steht, Antikörper gegen ein Coronavirus zu enthalten, unter Bedingungen, die eine Bindung der Antikörper an die Peptide erlauben, d) Überprüfen einer in Schritt c) erfolgten Bindung der Antikörper an das mindestens eine Peptid der ersten und/oder zweiten Gruppe und das mindestens eine Peptid der dritten, vierten und/oder fünften Gruppe, um die Coronavirus-Infektion nachzuweisen und/oder zu differenzieren.
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