ES2910184T3 - Un procedimiento y reactivos para el diagnóstico del SARS-CoV-2 - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 que comprende el paso de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgA contra SEQ ID NO1 en una muestra de sangre de un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Un procedimiento y reactivos para el diagnóstico del SARS-CoV-2

La presente invención se refiere a un procedimiento para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 que comprende el paso de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgA frente a la SEQ ID NO1 en una muestra de sangre de un sujeto y un uso de un anticuerpo de clase IgA frente a la SEQ ID NO1 para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 , donde el uso es para el diagnóstico temprano de una infección por SARS-CoV-2.

A finales de 2019, un número creciente de pacientes de neumonía con patógeno desconocido surgió de Wuhan, la capital de la provincia china de Hubei, a casi toda China. Se aisló un novedoso coronavirus y, basándose en su filogenia, taxonomía y práctica establecida, el Grupo de Estudio de Coronavirus (CSG) lo reconoció como hermano de los coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y lo etiquetó como coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2).

Aunque el SARS-CoV-2 es generalmente menos patógeno que el SARS-CoV y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), tiene una transmisibilidad relativamente alta. Dado que los síntomas pueden ser leves y confundirse con un resfriado, existe el peligro de que los pacientes no sean conscientes de que han sido infectados y puedan ayudar a que el virus se propague más.

Corman et a l. publicaron un ensayo basado en la RT-PCR en tiempo real para la detección del SARS-CoV-2 (Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time Rt -PCR, https://www.who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c 2). WO14045254 divulga ensayos para diagnosticar una infección por MERS.

El documento US2005/0112559 divulga reactivos derivados de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV para el diagnóstico del SARS-CoV.

El documento WO2005118813 divulga composiciones inmunogénicas asociadas a la proteína de espiga del SARS-CoV.

El documento US2006/0188519 divulga péptidos inmunorreactivos derivados del SARS-CoV.

Jiang et al. (Jiang, S., Du, L., Shi, Z. Emerging Microbes and Infections, 2020 Vol. 9, 275-277) discuten las estrategias terapéuticas relacionadas con el SARS-CoV-2.

Meyer et al. (Virus research 194 (2014), 175-183) discuten los ensayos serológicos relacionados con los virus corona emergentes.

Hsueh et al., informaron de que la IgG podía detectarse tan pronto como cuatro días después del inicio de una infección por SARS, simultáneamente o un día antes que la IgM y la IgA (Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., y Yang P. C. (2004) Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066.

Sin embargo, los ensayos basados en la PCR tienen varias deficiencias. En particular, se requiere una muestra del tracto respiratorio superior del paciente. La recuperación incorrecta de una muestra de este tipo puede dar lugar a resultados falsos negativos. Además, los resultados pueden no reflejar el estado de la enfermedad del paciente. Por lo tanto, sería deseable una prueba serológica.

Por lo tanto, un problema subyacente a la presente invención es proporcionar un ensayo y reactivos para la detección serológica temprana del SARS-CoV-2.

Los problemas se resuelven con el objeto de las reivindicaciones independientes y dependientes.

En un primer aspecto, el problema se resuelve mediante un procedimiento para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 que comprende el paso de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgA contra SEQ ID NO1 en una muestra de sangre de un sujeto.

En una realización preferida, se detecta la presencia de un anticuerpo de clase IgG y/o IgM contra SEQ ID NO1 además de un anticuerpo de clase IgA contra SEQ ID NO1.

En una realización preferida, la muestra se selecciona del grupo que comprende sangre entera, suero o plasma.

En una realización preferida, el anticuerpo se detecta utilizando un anticuerpo secundario marcado, preferentemente unido a anticuerpos de clase IgA.

En una realización preferida, el anticuerpo de clase IgA se detecta utilizando un procedimiento seleccionado del grupo que comprende la colorimetría, la inmunofluorescencia, la detección de actividad enzimática, la quimioluminiscencia y la radiactividad.

En una realización preferida, la infección se detecta en una etapa temprana.

En untercer aspecto, el problema se resuelve mediante el uso de un anticuerpo de clase IgA de la SEQ ID NO1, para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2, donde el uso es para el diagnóstico temprano de una infección por SARS-CoV-2.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que los anticuerpos contra SEQ ID NO1 pueden detectarse en una fase temprana de la infección, siendo los anticuerpos de clase IgA detectables antes que los anticuerpos IgG.

El término "diagnóstico", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier tipo de procedimiento destinado a obtener información instrumental en la evaluación de si un paciente sufre o es probable o más probable que la media o un sujeto comparativo, este último preferentemente con síntomas similares, de sufrir cierta enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnóstico o en el futuro, para averiguar cómo está progresando la enfermedad o es probable que progrese en el futuro o para evaluar la capacidad de respuesta de un paciente con respecto a un tratamiento. En otras palabras, el término "diagnóstico" comprende no sólo el diagnóstico, sino también el pronóstico y/o el seguimiento del curso de una enfermedad o trastorno. Es probable o más probable que el sujeto sufra una infección por SARS-CoV-2 si se detecta un anticuerpo IgA y/o IgG y/o IgM contra SEQ ID NO1 en muestras suyas.

La muestra es preferentemente un mamífero, más preferentemente una muestra humana.

Por lo tanto, el término "diagnóstico" no implica preferentemente que los procedimientos o agentes de diagnóstico según la presente invención sean definitivos y suficientes para finalizar el diagnóstico sobre la base de una sola prueba, y mucho menos de un parámetro, sino que puede referirse a una contribución a lo que se denomina "diagnóstico diferencial", es dec ir, un procedimiento de diagnóstico sistemático que considera la probabilidad de una serie de posibles afecciones sobre la base de una serie de parámetros de diagnóstico. En una realización preferida, el término "SARS-CoV-2", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un virus caracterizado por el genoma depositado en GenBank bajo el código de acceso MN908947 y sus derivados que tiene al menos 80, preferentemente 85, preferentemente 88, preferentemente 90, preferentemente 91, preferentemente 92, preferentemente 93, preferentemente 94, preferentemente 95, preferentemente 96, preferentemente 97, preferentemente 98, preferentemente 99, preferentemente 99,5, preferentemente 99,8, preferentemente 99,9 o 99,99 por ciento de identidad de secuencia en toda la secuencia de nucleótidos del genoma. Todas las entradas de la base de datos utilizadas aquí corresponden a la versión en línea en la fecha de presentación de la solicitud. En una realización preferida, el término "diagnóstico" significa que el procedimiento o el producto o el uso pueden utilizarse para ayudar en el diagnóstico de una enfermedad o para identificar a un sujeto con riesgo de padecer una enfermedad. El término "diagnóstico" también puede referirse a un procedimiento o agente utilizado para elegir el régimen de tratamiento más prometedor para un paciente. En otras palabras, el procedimiento o agente puede estar relacionado con la selección de un régimen de tratamiento para un sujeto.

En una realización preferida, el procedimiento según la presente invención comprende el paso de proporcionar el portador de utilidad diagnóstica y una muestra de un paciente sospechoso de estar infectado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un paciente humano. El portador está recubierto con el polipéptido que comprende la SEQ ID NO1 o una variante del mismo. A continuación, el portador puede ponerse en contacto con la muestra en condiciones que permitan la unión de cualquier anticuerpo al polipéptido que comprende la SEQ ID NO1 o una variante de la misma. A continuación, se puede retirar la muestra y lavar el soporte con la célula para eliminar cualquier resto de muestra. Un anticuerpo secundario o un reactivo o medio similar que se una al anticuerpo y que lleve un marcador detectable puede entonces ponerse en contacto con el portador en condiciones que permitan la formación de un complejo entre cualquier anticuerpo unido y el anticuerpo secundario. A continuación, se puede lavar el soporte para eliminar el anticuerpo secundario no unido. Por último, se detecta la presencia del anticuerpo comprobando si se puede detectar el anticuerpo secundario.

En una realización preferida, el procedimiento se utiliza más de una vez para examinar muestras del mismo paciente, preferentemente en días diferentes. Por ejemplo, la presencia o ausencia de anticuerpos puede detectarse diariamente durante una o dos semanas. En una realización preferida, se examinan al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 muestras en días diferentes.

El procedimiento según la presente invención también puede utilizarse para examinar la potencia y la utilidad de un fármaco antiviral.

El procedimiento según la presente invención también puede utilizarse para detectar si la sangre donada está contaminada con coronavirus.

El anticuerpo que se va a detectar se une preferentemente de forma específica a la SEQ ID NO1. La unión específica significa preferentemente que la reacción de unión es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 * 10-5 M, más preferentemente 1 * 10-7 M, más preferentemente 1 x 10-8 M, más preferentemente 1 * 10-9 M, más preferentemente 1 * 10-10 M, más preferentemente 1 * 10-11 M, más preferentemente 1 * 10-12 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie utilizando un equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7.

Las enseñanzas de la presente invención no sólo pueden llevarse a cabo utilizando polipéptidos que tengan las secuencias exactas a las que se hace referencia en esta solicitud de forma explícita, por ejemplo por función, nombre, secuencia o número de acceso, o de forma implícita, sino también utilizando variantes de dichos polipéptidos.

El término "variante", tal como se utiliza aquí, puede referirse a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa a la que se hace referencia o a un polipéptido que comprende dicho fragmento, más específicamente a una o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que están, en relación con la secuencia de longitud completa, truncadas en uno o ambos terminales por uno o más aminoácidos. Dicho fragmento comprende o codifica para un péptido que tiene al menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o 600 aminoácidos sucesivos de la secuencia original o para una variante de la misma. Por ejemplo, la SEQ ID NO12 es un fragmento ejemplar que puede utilizarse.

El término "variante" se refiere no sólo a al menos un fragmento, sino también a un polipéptido o a un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoácidos, preferentemente un fragmento que comprende al menos 25, más preferentemente 50, más preferentemente 200 aminoácidos sucesivos, que son al menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de referencia a la que se hace referencia o al fragmento de la misma, en los que se suprimen o sustituyen aminoácidos distintos de los esenciales para la actividad biológica, por ejemplo la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de interés, o el pliegue o la estructura del polipéptido, y/o se sustituyen uno o más de dichos aminoácidos esenciales de forma conservadora y/o se añaden o suprimen aminoácidos de forma que se preserve, al menos parcialmente, la actividad biológica del polipéptido. El estado de la técnica comprende varios procedimientos que pueden utilizarse para alinear dos secuencias dadas de ácidos nucleicos o aminoácidos y calcular el grado de identidad, véase, por ejemplo Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3a edicion. En una realización preferida, el software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W y Clustal X versión 2.0. Bioinformática, 23, 2947-2948) se utiliza aplicando la configuración por defecto.

Las publicaciones relacionadas con el SARS-CoV-2 sobre secuencias de aminoácidos específicas, tales como las de Beal et al., pueden ayudar al experto a diseñar variantes (Beal, J., Mitechell, T., Wyschogrod, W., Manthey, J, y Clore, A. (2020) Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV (Wuhan Coronavirus) doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497 así como publicaciones relacionadas con el SARS-CoV, por ejemplo Hua, R., Zhou, Y., Wang, Y., Hua, Y and Tong, T. (2004) Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein, BBR 319, 929-935, donde se pueden encontrar epítopos homólogos y se pueden identificar epítopos del SARS-CoV-2 a causa de su homología. Por ejemplo, los posibles epítopos pueden derivarse de la SEQ ID NO5.

Las variantes pueden, además, comprender modificaciones químicas, por ejemplo, marcadores tales como marcadores isotópico o marcadores detectables o modificaciones covalentes tales como glicosilación, fosforilación, acetilación, descarboxilación, citrulinación, hidroxilación y similares. El experto en la técnica está familiarizado con los procedimientos de modificación de polipéptidos. Además, las variantes también pueden generarse mediante la fusión con otros polipéptidos conocidos o variantes de los mismos, por ejemplo, enlazadores artificiales, etiquetas de afinidad, otros antígenos y similares. Por ejemplo, la SEQ ID NO3 es una proteína de fusión.

La variante del polipéptido tiene actividad biológica. Dicha actividad biológica es la capacidad de unirse al anticuerpo correspondiente. Comprende un epítopo que tiene la capacidad o tiene en sí mismo la capacidad de unirse a un anticuerpo de clase IgA a la SEQ ID NO1, preferentemente de una muestra de un paciente que sufre de SARS-CoV-2, donde más preferentemente el epítopo comprende una secuencia que comprende al menos 5, 6, 7 u 8 residuos de aminoácidos. Más preferentemente, no se une específicamente a homólogos de SEQ ID NO1 de otros coronavirus, preferentemente del grupo que comprende MERS (SEQ ID NO6), NL63 (SEQ ID N010), 229E (SEQ ID NO7), OC43 (SEQ ID N08) y HKU1 (Se Q ID NO9), más preferentemente del grupo que comprende SARS-CoV-1 (SEQ ID NO11), MERS NL63, 229E, OC43 y HKU1.

La detección del anticuerpo para el diagnóstico o los procedimientos según la presente invención comprende el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende las técnicas de inmunodifusión, las técnicas inmunoelectroforéticas, los inmunoensayos de dispersión de la luz, las técnicas de aglutinación, los inmunoensayos marcados como los del grupo que comprende los inmunoensayos radiomarcados, los inmunoensayos enzimáticos como los ensayos colorimétricos, los inmunoensayos de quimioluminiscencia y las técnicas de inmunofluorescencia. En una realización preferida, el complejo se detecta utilizando un procedimiento seleccionado del grupo que comprende técnicas de inmunodifusión, técnicas inmunoelectroforéticas, inmunoensayos de dispersión de luz, técnicas de aglutinación, inmunoensayos marcados del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos de quimioluminiscencia y técnicas de inmunofluorescencia. El experto en la técnica está familiarizado con estos procedimientos, que también se describen en el estado de la técnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, en particular en el capítulo 14. Preferentemente, el formato de la prueba es un ELISA y se utiliza una placa de microtitulación con pocilios como soporte de utilidad diagnóstica.

Un anticuerpo secundario es un anticuerpo que se une a todos los anticuerpos de una clase de anticuerpos, preferentemente una clase de anticuerpos humanos, preferentemente anticuerpos IgA e IgG e IgM, preferentemente IgA. Los anticuerpos secundarios suelen reconocer el dominio constante de dicha clase. Existe una amplia gama de ellos en el mercado.

El soporte de utilidad diagnóstica se selecciona preferentemente del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, preferentemente para microscopía, un biochip, una placa de microtitulación, un dispositivo de flujo lateral, una tira reactiva, una membrana, preferentemente una transferencia en línea, una columna de cromatografía y una perla, preferentemente una placa de microtitulación.

Un polipéptido, preferentemente el polipéptido que comprende la SEQ ID NO1 o una variante del mismo, puede ser una proteína recombinante, donde el término "recombinante", tal como se utiliza aquí, se refiere a un polipéptido producido utilizando enfoques de ingeniería genética en cualquier etapa del proceso de producción, por ejemplo, mediante la fusión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido a un promotor fuerte para la sobreexpresión en células o tejidos o mediante la ingeniería de la secuencia del propio polipéptido. El experto en la técnica está familiarizado con los procedimientos de ingeniería de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados (por ejemplo, los descritos en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH o en Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) y para producir y purificar polipéptidos nativos o recombinantes (por ejemplo, Handbooks "Estrategias para la purificación de proteínas", "Antibody Purification", publicados por GE Healthcare Life Sciencesy en Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guía para la purificación de proteínas). En otra realización preferida, el polipéptido es un polipéptido aislado, donde el término "aislado" significa que el polipéptido ha sido enriquecido en comparación con su estado de producción utilizando un enfoque biotecnológico o sintético y es preferentemente puro, es decir, al menos el 60, 70, 8o, 90, 95 o 99 por ciento del polipéptido en el líquido respectivo consiste en dicho polipéptido según se juzga por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida de tinción con azul de Coomassie e inspección visual. Preferentemente, cualquier polipéptido en un portador utilizado como medio para capturar un anticuerpo es puro.

Se puede utilizar un anticuerpo secundario que comprenda un marcador detectable para detectar anticuerpos de la clase IgA e IgG e IgM, preferentemente de la clase IgA de la SEQ ID NO1. En una realización preferida, el marcador se selecciona del grupo que comprende un marcador fluorescente, uno radiactivo o un marcador enzimáticamente activo, preferentemente uno que catalice una reacción colorimétrica. Como marcador fluorescente puede utilizarse FITC u otro derivado de la fluoresceína. Una proteína con actividad de peroxidasa puede utilizarse como marcador enzimáticamente activo. Preferentemente el anticuerpo secundario reconoce anticuerpos de mamíferos, más preferentemente humanos. Preferentemente, el anticuerpo secundario es un anticuerpo monoclonal.

Se describe además en el presente documento un kit que comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO1 o una variante del mismo, preferentemente recubierto a un soporte de utilidad diagnóstica, más preferentemente una placa de microtitulación, y uno o más, preferentemente todos los reactivos de los anticuerpos, donde el anticuerpo secundario puede comprender un marcador detectable, un tampón de muestra, una solución de detección, preferentemente una solución de cromógeno/sustrato, una solución de parada y una lámina protectora.

Un calibrador es un reactivo que se une a un polipéptido que comprende la SEQ ID NO1 o una variante del mismo y que preferentemente es reconocido por anticuerpos secundarios que reconocen anticuerpos de clase IgA. El calibrador puede ser un anticuerpo IgA frente a la SEQ ID N o i. Un control positivo es una solución que comprende un compuesto como el anticuerpo frente a la SEQ ID NO1, preferentemente del grupo que comprende anticuerpos de clase IgA, IgG e IgM, más preferentemente IgA, de la muestra de un paciente que padece SARS-coV-2 en una cantidad tal que se obtiene un resultado positivo utilizando el procedimiento según la presente invención. Un control negativo es un reactivo que carece de dicho compuesto y podría comprender suero de una persona sana. Se puede utilizar un tampón de lavado para lavar la placa de microtitulación después de la incubación para eliminar los anticuerpos inespecíficos y podría ser PBS. El medio para detectar la presencia de un anticuerpo podría ser un anticuerpo secundario que se una a la clase de anticuerpos que se va a detectar, preferentemente anticuerpos humanos de clase IgA, y que esté marcado, preferentemente con una enzima, más preferentemente con una enzima que tenga actividad de peroxidasa. El tampón de la muestra puede utilizarse para diluir la muestra del paciente y puede ser PBS. La solución de detección puede producir una señal en presencia del anticuerpo secundario marcado y es preferentemente una solución reveladora de color y más preferentemente 3,3',5,5'tetrametilbenzidina/H2O2. La solución de parada puede añadirse a una reacción para detener la reacción de la solución de detección y puede comprender un ácido fuerte, preferentemente ácido sulfúrico 0,5 M. La lámina protectora puede colocarse encima de la placa de microtitulación para evitar la evaporación.

La presente memoria descriptiva comprende una serie de novedosas secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos, más específicamente

SEQ ID NO1 (Proteína de espiga del SARS-CoV-2 S1)

VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTK RFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFL GVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYF KIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY YVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVR FPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL CFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA VRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR SEQ ID NO2 (Proteína de espiga del SARS-CoV-2 , etiquetada con his terminalmente en C, tal como se expresa en células para elejemplo) MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNV TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATN VVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGN FKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTP GDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIY QTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWN SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQ PTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKF LPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPV AIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRA RLEHHHHHHHH SEQ ID NO3 (Proteína de espiga del SARS-CoV-2 , etiquetada con his en C, como después de la escisión del péptido señal, utilizada en los ejemplos) VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTK RFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFL GVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYF KIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY YVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVR FPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL CFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL SFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA VRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARLEHHHHHHHH

SEQ ID NO4 (Proteína de espiga del SARS-CoV-2, secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO2) ATGTTCGTATTCCTTGTTCTGCTGCCTTTGGTTAGCAGTCAGTGTGTCAACCTGACAACT CGCACGCAACTGCCGCCAGCTTACACCAACTCTTTCACAAGAGGCGTCTACTACCCGGA CAAAGT GTTTCGCT CAT CAGTGCT GCACT CT ACACAAGATTT GTTT CTGCCATT CTT CT C TAACGTAACCTGGTTTCACGCGATTCATGTGTCTGGGACAAATGGGACCAAGCGCTTCG ACAACCCCGT GCTGCCATTCAAT GACGGGGT GT ATTTTGCCTCCACCGAGAAATCCAAT ATCATCCGAGGATGGATTTTCGGTACTACGCTGGACTCTAAAACGCAGTCTCTCTTGATC GTT AAT AACGCCACAAAT GTT GTC ATT AAGGTGT GCG AGTTT CAGTT CT GT AAT G ATCCC TTTCTGGGT GTGT ATT ACCACAAGAAT AACAAGTCATGGATGGAAAGCGAGTTTCGCGT GT ACTC AAGTGCCAAT AACT GCACATTCG AGT ATGT GTCCCAGCCTTTCCT G ATGGAT CT CGAAGGCAAACAGGGGAACTTCAAGAATCTGCGCGAGTTCGTGTTTAAGAACATCGACG GTT ATTT CAAG AT CT ACAGCAAACAT ACACCCATT AACCTGGT CAGGGAT CTCCCT CAGG GATTCTCCGCCCTGGAACCCTTGGTGGACTT GCCCATT GGGATT AACATCACT AGATTC CAGACCCT GCT GGCCCTTCACCGTTCCT ATCTT ACTCCTGGCGACAGT AGCAGT GGAT G GACCGCAGGAGCAGCCGCTTACTATGTAGGCTATCTGCAGCCACGGACCTTCCTCCTC AAGTACAATGAAAATGGTACCATAACTGATGCTGTGGACTGCGCTCTGGATCCACTCTC CGAAACT AAAT GCACCCTT AAAAGCTT CACGGT CGAAAAGGGAAT CT ACCAG ACAAGT A ACTTTCGGGTACAACCCACTGAGTCCATCGTGCGGTTTCCTAACATCACAAATCTCTGC CCCTTTGGTGAAGT GTTT AACGCCACT AGGTTCGCTTCT GTTT AT GCGT GGAATCGGAA GAGGATTTCCAATTGCGTGGCAGACTACTCTGTCCTGTATAATAGCGCTAGCTTCAGCA CCTT CAAAT GTT ACGGG GT AAGCCCAACT AAACT G AACGACCT CT GTTTT ACCAACGT GT AT GCCGAT AGCTTT GTCAT ACGAGG AGAT GAGGTTCGT CAGATT GCTCCTGGCCAAACG GGGAAAATCGCAGACTACAACTACAAGCTTCCCGACGACTTCACAGGATGCGTGATCGC GTGGAACTCAAAT AATCTGGAT AGCAAGGTTGGT GGCAATT AT AACT ACCT GT ATCGACT GTTCAGGAAAAGCAACCTCAAACCCTTTGAGCGCGACATCAGCACCGAGATATACCAAG CCGGTTCAACACCTTGCAAT GGGGT GGAAGGGTTT AACTGCT ATTTCCCACTTCAGAGC TATGGGTTTCAGCCAACCAATGGAGTCGGCTACCAGCCCTATCGGGTGGTAGTCCTGTC CTTTGAGCTGTTGCATGCGCCTGCCACAGTCTGTGGCCCTAAGAAGAGTACGAATCTGG T G AAG AACAAGTGCGT CAACTT CAATTTT AACGGCTT GACTGG AACAGG AGTT CT GACC GAGTCCAACAAGAAATTCCTTCCTTTTCAGCAGTTTGGAAGGGATATAGCCGACACTAC CGAT GCCGTTCGGGATCCACAGACACTGGAG ATT CT GG ACATT ACTCCGT GCT CATTT G GCGGTGTATCTGTCATCACACCTGGGACCAATACCTCAAATCAGGTGGCTGTGCTCTAC CAGGAT GT G AATTGT AC CGAAGTTCCAGT GGCAATT CATGCCGAT CAACT GACTCCCAC CTGGAGAGTGT ACAGT ACTGGCAGT AACGT GTTT CAGA CAA GAGCTGGCT GTCTCAT AG GCGCAGAACACGTCAACAACAGCT AT GAGT GT GACATTCCGATCGGCGCAGGCATCT G TGCATCCTACCAGACGCAAACCAACTCTCCCAGAAGAGCCAGGCTCGAGCACCACCAT CACCAT CACCAT CACT AA SEQ ID NO5 (posible epítopo)

NLKPFERDISTE SEQ ID NO6 (S1[MERS_CoV])

YVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGD HGDMYVYSAGHATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKI YPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTLLRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSF ATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLF SSRYVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVD GYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESGVYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSG TPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSD LSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLVN ANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGT DTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVRQQRFVYDAYQNLV GYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKRR DSTYGPLQTPVGCVLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVR SEQ ID NO7 (S1[HCoV-229E]) CQTTNGLNTSYSVCNGCVGYSENVFAVESGGYIPSDFAFNNWFLLTNTSSVVDGVVRSFQP LLLNCLWSVSGLRFTTGFVYFNGTGRGDCKGFSSDVLSDVIRYNLNFEENLRRGTILFKTSY GVVVFYCTNNTLVSGDAHIPFGTVLGNFYCFVNTTIGNETTSAFVGALPKTVREFVISRTGHF YINGYRYFTLGNVEAVNFNVTTAETTDFCTVALASYADVLVNVSQTSIANIIYCNSVINRLRCD QLSFDVPDGFYSTSPIQSVELPVSIVSLPVYHKHTFIVLYVDFKPQSGGGKCFNCYPAGVNIT LANFNETKGPLCVDTSHFTTKYVAVYANVGRWSASINTGNCPFSFGKVNNFVKFGSVCFSL KDIPGGCAMPIVANWAYSKYYTIGSLYVSWSDGDGITGVPQPVEGVSSFMNVTLDKCTKYNI YDVSGVGVIRVSNDTFLNGITYTSTSGNLLGFKDVTKGTIYSITPCNPPDQLVVYQQAVVGA MLSENFTSYGFSNVVELPKFFYA SEQ ID NO8 (S1[HCoV-OC43]) AVIGDLKCTSDNINDKDTGPPPISTDTVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLFLNGYYPTSGSTYR NMALKGSVLLSRLWFKPPFLSDFINGIFAKVKNTKVIKDRVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVV QPRTINSTQDGDNKLQGLLEVSVCQYNMCEYPQTICHPNLGNHRKELWHLDTGVVSCLYK RNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDTGVVTKFLFNVYLGMALSHYYVMPLTCNSKLTL EYWVTPLTSRQYLLAFNQDGIIFNAEDCMSDFMSEIKCKTQSIAPPTGVYELNGYTVQPIADV YRRKPNLPNCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIY GMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNPS TWNKRFGFIEDSVFKPRPAGVLTNHDVVYAQHCFKAPKNFCPCKLNGSCVGSGPGKNNGI GTCPAGTNYLTCDNLCTPDPITFTGTYKCPQTKSLVGIGEHCSGLAVKSDYCGGNSCTCRP QAFLGWSADSCLQGDKCNIFANFILHDVNSGLTCSTDLQKANTDIILGVCVNYDLYGILGQGI FVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYIINRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRN IKCNYVFNNSLTRQLQPINYFDSYLGCVVNAYNSTAISVQTCDLTVGSGYCVDYSKNRRSRG SEQ ID NO9 (S1[HCoV-HKU1]) AVIGDFNCTNSFINDYNKTIPRISEDVVDVSLGLGTYYVLNRVYLNTTLLFTGYFPKSGANFRD LALKGSIYLSTLWYKPPFLSDFNNGIFSKVKNTKLYVNNTLYSEFSTIVIGSVFVNTSYTIVVQP HNGILEITACQYTMCEYPHTVCKSKGSIRNESWHIDSSEPLCLFKKNFTYNVSADWLYFHFY QERGVFYAYYADVGMPTTFLFSLYLGTILSHYYVMPLTCNAISSNTDNETLEYWVTPLSRRQ YLLNFDEHGVITNAVDCSSSFLSEIQCKTQSFAPNTGVYDLSGFTVKPVATVYRRIPNLPDCD IDNWLNNVSVPSPLNWERRIFSNCNFNLSTLLRLVHVDSFSCNNLDKSKIFGSCFNSITVDKF AIPNRRRDDLQLGSSGFLQSSNYKIDISSSSCQLYYSLPLVNVTINNFNPSSWNRRYGFGSF NLSSYDVVYSDHCFSVNSDFCPCADPSVVNSCAKSKPPSAICPAGTKYRHCDLDTTLYVKN WCRCSCLPDPISTYSPNTCPQKKVVVGIGEHCPGLGINEEKCGTQLNHSSCFCSPDAFLGW SFDSCISNNRCNIFSNFIFNGINSGTTCSNDLLYSNTEISTGVCVNYDLYGITGQGIFKEVSAA YYNNWQNLLYDSNGNIIGFKDFLTNKTYTILPCYSGRVSAAFYQNSSSPALLYRNLKCSYVLN NISFISQPFYFDSYLGCVLNAVNLTSYSVSSCDLRMGSGFCIDYALPSSRRKRR SEQ ID NO10 (S1[HCoV-NL63]) FFTCNSNANLSMLQLGVPDNSSTIVTGLLPTHWFCANQSTSVYSANGFFYIDVGNHRSAFAL HTGYYDANQYYIYVTNEIGLNASVTLKICKFSRNTTFDFLSNASSSFDCIVNLLFTEQLGAPLG ITISGETVRLHLYNVTRTFYVPAAYKLTKLSVKCYFNYSCVFSVVNATVTVNVTTHNGRVVNY TVCDDCNGYTDNIFSVQQDGRIPNGFPFNNWFLLTNGSTLVDGVSRLYQPLRLTCLWPVPG LKSSTGFVYFNATGSDVNCNGYQHNSVVDVMRYNLNFSANSLDNLKSGVIVFKTLQYDVLF YCSNSSSGVLDTTIPFGPSSQPYYCFINSTINTTHVSTFVGILPPTVREIVVARTGQFYINGFK YFDLGFIEAVNFNVTTASATDFWTVAFATFVDVLVNVSATNIQNLLYCDSPFEKLQCEHLQFG LQDGFYSANFLDDNVLPETYVALPIYYQHTDINFTATASFGGSCYVCKPHQVNISLNGNTSV CVRTSHFSIRYIYNRVKSGSPGDSSWHIYLKSGTCPFSFSKLNNFQKFKTICFSTVEVPGSCN FPLEATWHYTSYTIVGALYVTWSEGNSITGVPYPVSGIREFSNLVLNNCTKYNIYDYVGTGIIR SSNQSLAGGITYVSNSGNLLGFKNVSTGNIFIVTPCNQPDQVAVYQQSIIGAMTAVNESRYG LQNLLQLPNFYYV SEQ ID NO11 (S1[SARS_CoV]) SGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTIN HTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNP FFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYK GYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTF MLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPF GEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSF VVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKL RPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATV CGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILD ISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAG CLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRL

SEQ ID NO12 (fragmento de la SEQ ID NO1)

NSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGV

YFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNWIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWM

ESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDL

PQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY

NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFN

ATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGD

EVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFER

DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVWLSFELLHAPATVCGP

KKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPC

SFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIG

AEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQT

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, secuencias y figuras de los que pueden extraerse otras características, realizaciones, aspectos y ventajas de la presente invención. Todos los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, describiéndose en el presente documento los procedimientos y materiales adecuados.

Ejemplos

Muestras

Ocho muestras de pacientes resultaron positivas al SARS-coV-2 por PCR, tal como lo describen Corman et al. (Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/defaultsource/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c 2), que se obtuvieron entre 6 y 14 días después de la infección, y 14 muestras de dichos pacientes obtenidas en un momento anterior después de la infección.

Además, se disponía de una serie de muestras que contenían diversos coronavirus, incluyendo 18 muestras de pacientes infectados con MERS, tres muestras de pacientes infectados con SARS-CoV-1, cuatro pacientes con NL63, tres pacientes con 229E, seis pacientes con OC43 y tres pacientes con HKU1.

Preparación de placas de microtitulación recubiertas con antígeno

La SEQID NO2 se expresó en células HEK293T utilizando la clonación estándar de la SEQ ID NO4 en el plásmido pTriEx-1 con una secuencia señal artificial y una etiqueta His C-terminal, lo que dio como resultado la expresión de la SEQ ID NO2 y, tras la eliminación del péptido señal, la SEQ ID NO3. Las células transfectadas se cultivaron a 37°C y 8,5% de CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal de ternera, 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina durante tres a cinco días. Las células fueron recolectadas, se resuspendieron en 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 10% (p/v) de sacarosa, 5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y se almacenaron a -80°C hasta su uso posterior.

Para preparar la SEQ ID NO3, el sobrenadante del cultivo celular se ajustó a 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8,0, 164 mmol/I de cloruro de sodio, 50 mmol/I de cloruro de magnesio, 20 mmol/I de imidazol, 0,1% de Tritón X-100, se aclaró por centrifugación durante 30 minutos a 17.600xg, 4°C, se aplicó a Nickel Rapid Run (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA) equilibrado con 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8.0, 300 mmol/I de cloruro de sodio, 20 mmol/I de imidazol y se eluyó aumentando la concentración de imidazol a 150 mmol/I. Todas las fracciones que contenían SEQ ID NO3 se agruparon y concentraron porultrafiltración (VivaSpin, Sartorius, Gottingen, Alemania). La preparación final se almacenó a -80°C hasta su uso posterior.

La preparación proteica final de la SEQ ID NO3 se trató con o sin 16 mmol/I de ditiotreitol y se incubó a 70°C o a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de electroforesis en gel SDS y tinción de Coomassie.

La identidad de las proteínas se verificó por espectrometría de masas.

Para su uso en ELISA de microtitulación, la proteína purificada se diluyó en PBS hasta concentraciones finales de aproximadamente 1,5 ^g/ml y se utilizó para recubrir placas de microtitulación ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante la noche.

Procedimiento experimental

Las muestras se diluyeron 1:101 en tampón de muestra de IgG, se aplicaron a placas de microtitulación y se incubaron como se describe para los kits de prueba EUROIMMUN ELISA comerciales, utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, El 2260-9601 G/A). Se siguió el manual de El 2260-9601 G/A. En resumen: 60 min a 37 °C; 3 lavados con tampón de lavado; adición de 100 ^l de conjugado anti-IgG humana (conejo) o conjugado anti-IgA humana (conejo) marcado con peroxidasa por pocilio; incubación durante 30 min a 37 °C; 3 pasos de lavado utilizando tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 |jl de solución de cromógeno/sustrato (TMB/H2O2) por pocilio; incubación durante 30 min a temperatura ambiente; adición de 100 j l de solución de parada (ácido sulfúrico 05 M de ácido sulfúrico); medición de la densidad óptica a 450 nm frente a 630 nm como referencia.

La calibración se llevó a cabo utilizando calibradores disponibles en el mercado (número de producto El 2606-9601 A, EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG). Se calculó una relación dividiendo la extinción de la muestra de control o del paciente por la extinción del calibrador. Los resultados inferiores a 0,8 se consideraron negativos, los resultados entre 0,8 y 1,1 dudosos y los resultados superiores a 1,1 positivos.

Resultados

Los datos primarios se muestran en la Tabla 1

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 que comprende el paso de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgA contra SEQ ID NO1 en una muestra de sangre de un sujeto.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que se detecta la presencia de un anticuerpo de clase IgG y/o IgM contra la SEQ ID NO1 además de un anticuerpo de clase IgA contra la SEQ ID NO1.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende sangre total, suero o plasma.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un anticuerpo de clase IgA de la SEQ ID NO1 se detecta utilizando un anticuerpo secundario marcado que se une a anticuerpos de clase IgA, preferentemente anticuerpos de clase IgA humanos.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo IgA se detecta utilizando un procedimiento seleccionado del grupo que comprende la colorimetría, la inmunofluorescencia, la detección de la actividad enzimática, la quimioluminiscencia y la radiactividad.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la infección se detecta en una fase temprana, que es de 5 o menos días después de la aparición de los síntomas de la enfermedad.

7. Un uso de un anticuerpo de clase IgA frente a la SEQ ID NO1 para ayudar en el diagnóstico de una infección por SARS-CoV-2 en una fase temprana, que es 5 o menos días después de la aparición de los síntomas de la enfermedad, en la que es probable que un sujeto sufra una infección por SARS-CoV-2 si se detecta un anticuerpo de clase IgA frente a la SEQ ID NO1 en una muestra de sangre del sujeto.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra es un mamífero, preferentemente una muestra humana.