TW202237626A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２免疫顯性肽構築體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供經由誘導針對所鑑別之SARS-COV-2免疫顯性肽的免疫反應來治療及/或預防COVID-19之方法及組合物。

Description

SARS-COV-2免疫顯性肽構築體及其用途
2019年冠狀病毒疾病或COVID-19係由嚴重急性呼吸道症候群(SARS)-CoV-2 (SARS-CoV-2)病毒感染引起的全球流行病，其已在全球奪走了＞500,000條生命且已影響數百萬人。SARS-CoV-2係已知感染人類之第七種冠狀病毒；SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2可引起嚴重疾病，而HKU1、NL63、OC43及229E引起輕微症狀。開發有效疫苗及療法需要瞭解適應性免疫反應如何識別及清除該病毒，以及該病毒與免疫系統之間的相互作用如何影響該疾病之病理。迄今為止，大多數工作集中在B細胞介導之對病毒的抗體反應上，但對細胞毒性CD8+ T細胞如何識別及清除受感染細胞之瞭解較少。
CD8 T細胞在提供抵抗各種病原體之保護方面起到關鍵作用，且愈來愈多的證據證明SARS-CoV-2就是這種情況。密切相關之SARS-CoV的研究揭露，CD8 T細胞在動物模型之急性感染期間提供保護且記憶CD8 T細胞在人類之急性感染之後的持續時間比體液反應更長。在SARS-CoV-2感染期間，CD8 T細胞反應之幅度與較輕疾病過程相關，表明具有保護作用。值得注意的是，在暴露於SARS-CoV-2且無症狀地清除該病毒之患者中，在抗病毒抗體不存在下已觀察到SARS-CoV-2反應性T細胞，這進一步證明了T細胞之保護作用。
目前SARS-CoV-2疫苗開發工作主要集中在產生針對S蛋白之中和抗體。臨床開發中之絕大多數疫苗(及美國的所有Ph II/III候選物)僅使用S蛋白作為抗原。因此，此等疫苗候選物在天然感染期間缺失由CD8 T細胞識別之大多數抗原。實際上，仔細追蹤接種SARS-CoV-2 S蛋白疫苗之患者的T細胞反應，已揭露可變且微弱之CD8 T細胞反應。需要併入更廣泛抗原之新一代疫苗來更好地參與CD8 T細胞反應，以期提供抵抗SARS-CoV-2之更穩固且持久的保護。迄今為止，開發中之SARS-CoV-2疫苗已在疫苗接種之後導致微弱且可變之CD8反應(Mateus等人 (2021) Science374:eabj9853)。
本發明至少部分地基於SARS-CoV-2免疫顯性肽之發現。重要的是，此等免疫原性肽中之一些可引出患者之T細胞反應，例如當其經串接時，當其以其他方式安排於多肽中時，或者當其與其他肽組合於構築體(例如核酸載體構築體，諸如藉由包裝於用於細胞內抗原表現之最佳免疫顯性抗原決定基中而使載體尺寸對T細胞反應功效增至最大的彼等)上時。
在一些態樣中，免疫原性多肽包含至少兩個選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。在某些態樣中，該至少兩個肽抗原決定基以串接次序位於免疫原性多肽中，視情況其中至少一或多個免疫顯性抗原決定基存在於超過一個複本中。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。例如，在一些實施例中，至少一或多個免疫顯性抗原決定基存在於超過一個複本中，諸如存在於2個複本、3個複本、4個複本、5個複本、6個複本或更多個或者其間任何範圍(包括其)之複本中，諸如一種免疫顯性抗原決定基為2個複本，另一免疫顯性抗原決定基為3個複本，第三免疫顯性抗原決定基為單一複本，等。在一些實施例中，免疫原性多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個或更多個該等肽抗原決定基，視情況其中該免疫原性多肽包含HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07中之每一者至少一個、兩個及/或三個免疫顯性抗原決定基(例如，每一個列出之HLA一個免疫顯性抗原決定基，每一個列出之HLA兩個免疫顯性抗原決定基，每一個列出之HLA三個免疫顯性抗原決定基，或者其間任何範圍(包括其)，諸如對於HLA-A*02及HLA-A*03中之每一者一個免疫顯性抗原決定基，加上對於HLA-A*01及HLA-A*11中之每一者兩個免疫顯性抗原決定基，且對於HLA-A*24及HLA-B*07中之每一者三個免疫顯性抗原決定基，等)。在一些實施例中，免疫原性多肽包含3個來自表1A、1B、1C、1D、1E及1F中之每一者之肽抗原決定基。在一些實施例中，免疫原性多肽進一步包含該等肽抗原決定基之間的連接子。在某些實施例中，該連接子包含用於該等肽抗原決定基中之每一者的至少三個胺基酸，其中該至少三個胺基酸係與其各別肽抗原決定基鄰接之彼等。在某些實施例中，該連接子為蛋白酶體裂解基序。在一些實施例中，該等免疫原性多肽進一步包含一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多种全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白。在一些實施例中，該等免疫原性多肽進一步包含核糖體停止/再啟動區段、IRES區段及/或轉譯後裂解區段，視情況其中該轉譯後裂解區段為P2A區段。在一些實施例中，該等免疫原性多肽包含本文所述之表(諸如表1G或表1I)中所提供之胺基酸序列中的任一者。
在某些態樣中，該等免疫原性多肽包含至少兩個肽片段，該至少兩個肽片段各自包含該等肽抗原決定基中之至少兩者，其中每一個肽片段中的該等肽抗原決定基中之該至少兩者係源自同一SARS-CoV-2蛋白。
如上文所述，進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。例如，在一些實施例中，該至少兩個肽片段係源自SARS-CoV-2之N蛋白、M蛋白、ORF1a/b蛋白或ORF3a蛋白。在一些實施例中，該等免疫原性多肽包含至多6個該等肽片段。在一些實施例中，該等免疫原性多肽進一步包含一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多种全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白。在一些實施例中，該等免疫原性多肽進一步包含核糖體停止/再啟動區段、IRES區段及/或轉譯後裂解區段，視情況其中該轉譯後裂解區段為P2A區段。在一些實施例中，該等免疫原性多肽包含本文所述之表(諸如表1H或表1J)中所提供之胺基酸序列中的任一者。在一些實施例中，該等免疫原性多肽能夠活體外或活體內引出T細胞反應，視情況其中藉由四聚體染色分析、T細胞活化分析、CD137染色分析、細胞內IFNγ (IFNg)染色分析、細胞介素釋放分析及/或T細胞增生分析來測定該T細胞反應。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該免疫原性肽係源自SARS-CoV-2蛋白，視情況其中該免疫原性肽為8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸長。在另一實施例中，該SARS-CoV-2蛋白係選自由orf1a/b、S蛋白、N蛋白、M蛋白、orf3a及orf7a組成之群。在又一實施例中，該免疫原性肽能够引出個體之T細胞反應。在一些實施例中，該等免疫原性肽包含選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。
在又一態樣中，提供一種免疫原性組合物，其包含至少一種本文所述之免疫原性肽(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127種或更多種，或者其間任何範圍(包括其)，諸如1-5種肽)，視情況其中該免疫原性組合物進一步包含1)一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多種全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白，及/或2)佐劑。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該免疫原性組合物能夠活體外及/或活體內引出T細胞反應。在另一實施例中，藉由四聚體染色分析、T細胞活化分析、CD137染色分析、細胞內IFNg染色分析、細胞介素釋放分析及/或T細胞增生分析來測定該T細胞反應。
在又一態樣中，提供一種組合物，其包含免疫原性多肽及MHC分子，該免疫原性多肽包含至少兩個選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。在另一實施例中，該MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。針對此等及其他HLA等位基因之序列、特徵、結構資訊、功能資訊、結合搭配物及其類似物係此項技術中熟知的(參見例如全球資訊網：hla.alleles.org/nomenclature/index.html、hla.alleles.org/data/hla-a.html，及hla.alleles.org/data/hla-b.html)。
在另一態樣中，提供一種穩定MHC-肽複合物，其在MHC分子之背景中包含選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。在另一實施例中，該MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。在又一實施例中，該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。在另一實施例中，該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。
在又一態樣中，提供一種免疫原性組合物，其包含本文所述之穩定MHC-肽複合物及佐劑。
在又一態樣中，提供一種經分離核酸，其編碼本文所述之免疫原性多肽或其補體，視情況其中該經分離核酸為DNA、RNA、mRNA、cDNA、自複製的、環化的、多聯體化的，包含源自所關注之基因(諸如血紅素A)的5’非轉譯區(5’UTR)及/或3’UTR，包含表現啟動子，包含內部核糖體進入位點(IRES)，及/或包含自裂解2A肽(諸如P2A或T2A)。
在另一態樣中，提供一種載體，其包含本文所述之經分離核酸。在一些實施例中，該載體為表現載體。
預期編碼本文所述之免疫原性多肽的基礎核酸或者包含該核酸之載體可用於其中需要該免疫原性多肽之本發明之任何態樣或實施例中(例如，該核酸編碼且產生該免疫原性多肽)。由於所編碼且產生之免疫原性多肽且並非歸因於核酸本身，該核酸為免疫原性組合物。
在又一態樣中，提供一種細胞，其a)包含本文所述之經分離核酸，b)包含本文所述之載體，及/或c)産生一或多種本文所述之免疫原性多肽及/或將一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物呈遞於細胞表面，視情況其中該細胞係經遺傳工程改造。
在又一態樣中，提供一種結合部分，其特异性結合本文所述之免疫原性肽及/或本文所述之穩定MHC-肽複合物，視情況其中該結合部分為抗體、抗體之抗原結合片段、TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應子域(視情況進一步包含跨膜域及細胞內效應子域)之融合蛋白。
在又一態樣中，提供一種器件或套組，其包含a)一或多種本文所述之免疫原性多肽及/或b)一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物，該器件或套組視情況包含偵測a)及/或b)與T細胞受體之結合的試劑。
在另一態樣中，提供一種偵測結合穩定MHC-肽複合物之T細胞之方法，其包含：(a)使包含T細胞之樣品與本文所述之穩定MHC-肽複合物接觸；及(b)偵測T細胞與該穩定MHC-肽複合物之結合，視情況進一步測定與該穩定MHC-肽複合物結合之穩定MHC-肽特异性T細胞之百分率。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，樣品包含外周血單核細胞(PBMC)。在另一實施例中，T細胞為CD8+ T細胞。在又一實施例中，使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點或細胞內流式分析來執行偵測及/或測定。在又一實施例中，樣品包含接觸或懷疑接觸過一或多種SARS-CoV-2蛋白或其片段之T細胞。
在又一態樣中，提供一種確定個體是否已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護的方法，該方法包含a)將包含自個體獲得之T細胞之細胞群體與本文所述之免疫原性多肽或本文所述之穩定MHC-肽複合物一起培育；及b)偵測反應性之存在或水準，其中存在反應性或與對照水準相比反應性水準較高指示該個體已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護。
在又一態樣中，提供一種用於預測罹患SARS-CoV-2感染之個體之臨床結果的方法，該方法包含a)測定自個體獲得之T細胞與一或多種本文所述之免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準；及b)將該反應性之存在或水準與來自對照之反應性之存在或水準進行比較，其中該對照係獲自具有良好臨床結果之個體，其中個體樣品中存在反應性或如與對照相比反應性水準較高指示該個體具有良好臨床結果。
在另一態樣中，提供一種評估SARS-CoV-2療法之功效之方法，該方法包含a)在向個體提供至少一部分SARS-CoV-2療法之前自個體獲得之第一樣品中，測定自個體獲得之T細胞與一或多種本文所述之免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準，及b)測定一或多種本文所述之免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物與自個體獲得之T細胞之間的反應性之存在或水準，該等T細胞存在於提供部分SARS-CoV-2療法之后自個體獲得之第二樣品中，其中第二樣品中存在反應性或相對於第一樣品反應性水準較高指示該療法對治療個體之SARS-CoV-2有效。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，反應性水準由a)結合之存在及/或b) T細胞活化及/或效應子功能指示，視情況其中T細胞活化或效應子功能為T細胞增生、殺死或細胞介素釋放。在另一實施例中，該方法進一步包含在後續時間點重複步驟a)及b)，視情況其中個體在第一時間點與後續時間點之間已經歷治療以改善SARS-CoV-2感染。在又一實施例中，使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點或細胞內流式分析來偵測T細胞結合、活化及/或效應子功能。在又一實施例中，對照水準為參考數字。在另一實施例中，對照水準係未暴露於SARS-CoV-2之個體水準。
在又一態樣中，提供一種預防及/或治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的包含及/或編碼一或多種免疫原性多肽之免疫原性組合物，及/或本文所述之細胞。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。例如，在一實施例中，該免疫原性組合物包含編碼本文所述之免疫原性多肽(諸如包含至少兩個選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基的免疫原性多肽)之核酸。在一實施例中，該免疫原性肽係源自SARS-CoV-2蛋白，視情況其中該免疫原性肽為8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸長。在一實施例中，該SARS-CoV-2蛋白係選自由orf1a/b、S蛋白、N蛋白、M蛋白、orf3a及orf7a組成之群。在一實施例中，該免疫原性多肽能够引出個體之T細胞反應。在一實施例中，該免疫原性組合物包含超過一種免疫原性多肽。在又一實施例中，該免疫原性組合物進一步包含佐劑。在又一實施例中，該免疫原性組合物能够引出個體之T細胞反應。在另一實施例中，所投與之免疫原性組合物誘導個體針對SARS-CoV-2之免疫反應。在又一實施例中，所投與之免疫原性組合物誘導個體針對SARS-CoV-2之T細胞免疫反應。在又一實施例中，該T細胞免疫反應為CD8+ T細胞免疫反應。
在又一態樣中，提供一種鑑別與至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的肽結合分子或其抗原結合片段之方法，該方法包含a)提供細胞，該細胞在MHC分子之背景中將該至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基呈遞於該細胞之表面上，視情況其中該細胞包含編碼且表現該至少一種免疫原性多肽之核酸；b)測定複數種候選肽結合分子或其抗原結合片段在MHC分子之背景中與細胞上之肽抗原決定基的結合；及c)鑑別在MHC分子之背景中與肽抗原決定基結合的一或多種肽結合分子或其抗原結合片段。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，步驟a)包含使MHC分子在細胞表面上與選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基接觸。在另一實施例中，步驟a)包含用編碼本文所述之免疫原性多肽之核酸轉染細胞，該核酸呈編碼本文所述之免疫原性多肽之基礎核酸形式或呈包含此類基礎核酸之載體形式，諸如包含編碼選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基的異源序列。
在另一態樣中，提供一種鑑別與至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的肽結合分子或其抗原結合片段之方法，該方法包含a)提供在MHC分子之背景中包含該至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基的穩定MHC-肽複合物；b)測定複數種候選肽結合分子或其抗原結合片段與該穩定MHC-肽複合物之結合；及c)鑑別與該穩定MHC-肽複合物結合之一或多種肽結合分子或其抗原結合片段。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。在另一實施例中，該MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。在又一實施例中，該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。在另一實施例中，該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。在又一實施例中，該複數種候選肽結合分子包含一或多種T細胞受體(TCR)，或TCR之一或多個抗原結合片段。在又一實施例中，該複數種候選肽結合分子包含至少2、5、10、100、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9種或更多種不同的候選肽結合分子。在另一實施例中，該複數種候選肽結合分子包含自個體或個體群體之樣品獲得的一或多種候選肽結合分子；或該複數種候選肽結合分子包含包括自個體樣品獲得之親本支架肽結合分子之突變的一或多種候選肽結合分子。在又一實施例中，該個體或個體群體a)未感染SARS-CoV-2及/或已自COVID-19中恢復或b)感染SARS-CoV-2及/或具有COVID-19。在又一實施例中，該個體或個體群體已接種一或多種免疫原性多肽，其中該等免疫原性多肽包含選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。在另一實施例中，該個體為哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒動物。在又一實施例中，該個體為HLA轉殖基因小鼠及/或為人類TCR轉殖基因小鼠。在又一實施例中，樣品包含T細胞。在另一實施例中，樣品包含外周血單核細胞(PBMC)或CD8+記憶T細胞。在又一實施例中，TCR之抗原結合片段為單鏈TCR (scTCR)。
在另一態樣中，提供根據本文所述之方法鑑別之肽結合分子或其抗原結合片段，視情況其中結合部分為抗體、抗體之抗原結合片段、TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應子域之融合蛋白。
在又一態樣中，提供一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現藉由本文所述之方法鑑別的TCR。
在又一態樣中，提供一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現與至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的TCR。
在另一態樣中，提供一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現與在MHC分子之背景中包含至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基的穩定MHC-肽複合物結合之TCR。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。在另一實施例中，該MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。在又一實施例中，該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。在另一實施例中，該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。在又一實施例中，T細胞係自a)個體、b)未感染SARS-CoV-2之供體或c)自COVID-19中恢復之供體分離。
在又一態樣中，提供一種預防及/或治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向該個體輸注抗原特异性T細胞，其中該等抗原特异性T細胞係藉由以下產生：a)用本文所述之免疫原性多肽、編碼本文所述之免疫原性多肽的核酸、包含至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽抗原決定基的穩定MHC-肽複合物或者在MHC分子之背景中編碼及/或在細胞表面上呈遞至少一種本文所述之免疫原性多肽之肽的細胞，諸如用表現本文所述之構築體的免疫原性多肽刺激個體之PBMC或T細胞；及b)活體外擴增抗原特异性T細胞，視情況在刺激PBMC或T細胞之前自該個體分離該等PBMC或T細胞。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一實施例中，T細胞為原生T細胞、中央記憶T細胞或效應子記憶T細胞。在另一實施例中，T細胞為CD8+記憶T細胞。在又一實施例中，使該等劑在適合於在肽抗原決定基、免疫原性多肽、穩定MHC-肽複合物、T細胞受體及/或T細胞之間形成至少一種免疫複合物的條件下及時間內接觸置放。在又一實施例中，肽抗原決定基、免疫原性多肽、穩定MHC-肽複合物及/或T細胞受體由細胞表現，且該等細胞在一或多個步驟期間經擴增及/或分離。在另一實施例中，該個體為哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒動物。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年11月12日申請之美國臨時申請案第63/113,024號的權益；該申請案之完整內容以引用之方式整體併入本文中。
本發明至少部分基於發現SARS-CoV-2病毒特异性免疫原性多肽構築體，該等構築體例如可用作疫苗。進行系統性綜合調查以對由恢復期COVID-19患者識別之精確T細胞標靶定位。引人注目地，該研究揭露在患者中反復地識別出之高度免疫顯性肽抗原之有限集合，包括若干看來得到普遍認可之抗原。
為了提供關於此類具有免疫原性肽之疫苗之設計的資訊，對感染SARS-CoV-2之後CD8 T細胞識別之標靶進行全面的全基因組分析。對六種最常見的HLA等位基因(HLA-A:02、HLA-A01、HLA-A03、HLA-A11、HLA-A24及HLA-B07 – 其中全球＞85%的人表現此等等位基因中之至少一者之集合)上識別之標靶之景觀定位。鑑別且驗證大多數具有適當HLA等位基因之患者反復識別的每一個等位基因之免疫顯性抗原決定基之核心集合。已揭露此等抗原決定基強力呈現於MHC分子上，由患者之原生CD8 T細胞譜系有效地識別，且有可能具保護性(基於其對總體CD8 T細胞反應之巨大貢獻，其有可能具保護性)。除了鑑別特定HLA等位基因上呈現之精確抗原決定基，亦揭露T細胞對SARS-CoV-2基因組之反應性的模式。發現在HLA等位基因中反復識別之基因組區域(包括N、M及ORF3a蛋白，以及ORF1ab之部分)，且此等區域代表有吸引力的疫苗抗原，該等抗原亦有可能產生受限於額外等位基因上之CD8 T細胞反應。亦鑑別了CD8 T細胞對SARS-CoV-2基因組中與地方性乙型冠狀病毒具有交叉反應性之特定區段的反應。此等區域受到特別關注，因為靶向此等區域之疫苗將有可能加強CD8 T細胞對地方性乙型冠狀病毒之任何現有反應性且具有產生更強反應之潛力。
此數據已使得能夠設計疫苗候選物，該等候選物含有CD8 T細胞抗原之廣泛集合以更精確地再現對SARS-CoV-2之天然免疫性。特定言之，所設計之疫苗包括多抗原決定基疫苗及基於片段之疫苗。
在多抗原決定基疫苗中，多個免疫顯性CD8 T細胞抗原決定基經串接以作為單一多蛋白表現。此方法具有提供最大密度之經驗證T細胞抗原決定基之優勢。設計了介於6-29個總抗原決定基範圍內之變異體。多抗原決定基疫苗之關鍵設計特徵在於能夠使免疫顯性抗原決定基之有效加工及呈遞增至最大，同時使任何非天然接合抗原決定基減至最少。亦設計了含有最佳蛋白酶體裂解序列之多抗原決定基，其係源自天然蛋白序列(直接地圍繞全長蛋白中之每一個抗原決定基之胺基酸，基於吾人的篩選數據，其經驗證導致有效呈遞)或使用合成蛋白酶體裂解序列作為抗原決定基間連接子。亦使用生物資訊方法來選擇最佳抗原決定基次序以使經預測之高親和力接合抗原決定基之產生減至最少(自數百萬個測試變異體中選擇最佳次序)。
在基於片段之疫苗中，來自SARS-CoV-2之較長基因組區段之集合經串接，已鑑別該等區段在一系列HLA等位基因中具免疫顯性。此方法具有包括SARS-CoV-2蛋白序列之較長延伸段的優勢，這增加了編碼由吾人未研究之其他HLA等位基因呈遞之額外CD8 T細胞抗原決定基的可能性。對於此等疫苗，2與6個之間的區段經串接。
就更廣泛背景及遞送而言，兩類疫苗均為高度模塊化的。其可用作集中於加強CD8 T細胞反應之獨立疫苗，或可與經設計以產生中和抗體反應之抗原一起共引入。在後一種情況下，其可與核糖體再啟動位點(諸如P2A序列)之後的其他抗原一起表現。該等設計中之數種包括最佳化S蛋白(含有兩個脯胺酸突變，該等突變經設計以增強蛋白穩定性)、隨後P2A序列及多抗原決定基或多片段蛋白。其可使用mRNA、DNA、病毒載體或作為經純化蛋白來遞送。
作為與該等構築體之特定抗原決定基相關的一個實例，本文中確定CD8+ T細胞反應由SARS-CoV-2中由具有相同HLA類型之患者共享之少數(3-8個)高度抗原性(免疫顯性)抗原決定基佔主導。此等抗原決定基主要為SARS-CoV-2所獨有(亦即，不存在於「普通感冒」冠狀病毒中)，在病毒分離物中係不變的，且頻繁地由每一名患者內之多個純系型靶向。在所研究之六個HLA類型中，鑑別出至少二十九個共享抗原決定基。值得注意的是，僅約10% (29個中的3個)抗原決定基出現於S蛋白中(亦即，約90% SARS-CoV-2免疫顯性抗原決定基位於S蛋白外部)，突出顯示了對經設計以引出更廣泛CD8+ T細胞反應之新疫苗類別的需要。實際上，在這29個抗原決定基中未出現UK、南非、巴西或δ變異體之突變且當分析感染SARS-CoV-2之患者時，一些HLA類型未產生任何刺突蛋白抗原決定基(例如，針對五名A*01:01患者及五名A*11:01患者篩選數據未鑑別出刺突蛋白中之任何抗原決定基)。值得注意的是，已確定94%之經篩選患者具有識別既定HLA之三個最主要抗原決定基中之至少一者的T細胞且53%之患者具有識別既定HLA之最主要抗原決定基中之全部三者的T細胞。對18名額外A*02:01患者進行之額外確認分析重申了對前六個已鑑別A*02:01抗原決定基具特異性之記憶CD8+ T細胞的存在，且單細胞測序揭露患者通常具有＞5種不同的靶向每一個抗原決定基之T細胞純系，但同一T細胞受體Va及Vb區主要用於識別此等抗原決定基，甚至跨患者。靶向此等免疫顯性抗原決定基中之大多數(29個中之27個)的T細胞不會與引起普通感冒之地方性冠狀病毒交叉反應，且該等抗原決定基不會出現在具有高突變變异之區域中。此等結果為更好地瞭解COVID-19中之CD8+ T細胞反應提供有用工具，且對疫苗設計及開發具有重要意義。
因此，本發明部分地係關於經鑑別免疫原性多肽構築體、包含單獨或與MHC分子一起的此等免疫原性多肽構築體之組合物、穩定MHC-肽複合物、診斷、預後及監測T細胞對SARS-CoV-2之反應的方法，以及藉由投與包含及/或編碼經鑑別免疫原性多肽構築體之免疫原性組合物來預防及/或治療SARS-CoV-2感染的方法。 I. 定義
為方便起見，此處收集了本說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語。
冠詞「一(a/an)」在本文中用於指該冠詞之一個或超過一個(亦即，至少一個)語法對象。舉例而言，「一要素」意謂一種要素或超過一種要素。
如本文所用，術語「投與」意謂向個體提供醫藥劑或組合物，且包括但不限於由醫學專業人員投與及自我投與。
術語「免疫反應」包括T細胞介導及/或B細胞介導之免疫反應。例示性免疫反應包括T細胞反應，例如細胞介素産生及細胞毒性。此外，術語免疫反應包括受T細胞活化間接影響之免疫反應，例如抗體産生(體液反應)及細胞介素反應性細胞(例如巨噬細胞)之活化。
習知T細胞(亦稱為Tconv或Teff)具有效應子功能(例如，細胞介素分泌、細胞毒性活性、抗自我識別及其類似功能)以藉助於其對一或多種T細胞受體之表現來增加免疫反應。Tcon或Teff一般係定義為任何非Treg之T細胞群體且包括例如原生T細胞、經活化T細胞、記憶T細胞、靜息Tcon或已分化為例如Th1或Th2譜系之Tcon。在一些實施例中，Teff為非Treg T細胞之子集。在一些實施例中，Teff為CD4+ Teff或CD8+ Teff，諸如CD4+輔助T淋巴球(例如，Th0、Th1、Tfh或Th17)及CD8+細胞毒性T淋巴球。如本文進一步所描述，細胞毒性T細胞為CD8+ T淋巴球。「原生Tcon」為CD4 +T細胞，該等T細胞已在骨髓中分化，且在胸腺中成功地經歷了正向及負向中央選擇過程，但尚未藉由暴露於抗原而活化。原生Tcon之特徵通常在於L-選擇素(CD62L)之表面表現、活化標記物(諸如CD25、CD44或CD69)之缺乏以及記憶標記物(諸如CD45RO)之缺乏。因此，咸信原生Tcon為靜止且非分裂的，需要用於體内恆定存活之介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15) (至少參見WO 2010/101870)。在抑制免疫反應之背景下，此類細胞之存在及活性為非所需的。與Treg不同，Tcon并非無反應性的且可回應於基於抗原之T細胞受體活化而增生(Lechler等人 (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci.356:625-637)。在腫瘤中，耗竭細胞可呈現無反應性之標記。
術語「疫苗」係指引出對所關注抗原之免疫反應的醫藥組合物。疫苗亦可對個體賦予保護性免疫。
「載體」係指能够轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一種類型之較佳載體為游離基因體，亦即能够進行染色體外複製之核酸。較佳載體係能够自主複製及/或表現與其連接之核酸的彼等載體。能够引導可操作性連接之基因之表現的載體在本文中稱為「表現載體」。一般而言，在重組DNA技術中使用之表現載體通常呈「質體」形式，質體一般係指環狀雙股DNA環，其載體形式不與染色體結合。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，因為質體為最常用之載體形式。然而，如熟習此項技術者將瞭解，本發明意欲包括此類其他形式之表現載體，其提供等效功能且隨後在此項技術中為人所知。
術語「免疫治療劑」可包括可刺激宿主免疫系統以在個體中産生對病毒感染之免疫反應的任何分子、肽、抗體或其他劑。各種免疫治療劑可用於本文所述之組合物及方法。
「經分離蛋白」係指在自細胞中分離或藉由重組DNA技術産生時實質上不含其他蛋白質、細胞材料、分離介質及培養基的蛋白質，或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質的蛋白質。「經分離」或「經純化」蛋白或其生物活性部分實質上不含來自產生抗體、多肽、肽或融合蛋白之細胞或組織來源的細胞材料或其他污染蛋白，或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質。用語「實質上不含細胞材料」包括生物標記物多肽或其片段之製劑，其中蛋白質係自分離出或重組産生該蛋白質之細胞的細胞組分中分離。在一實施例中，用語「實質上不含細胞材料」包括生物標記物蛋白或其片段之製劑，其具有小於約30% (以乾重計)之非生物標記物蛋白(本文中亦稱為「污染蛋白」)，更佳地小於約20%之非生物標記物蛋白，更佳地小於約10%之非生物標記物蛋白，且最佳地小於約5%之非生物標記物蛋白。當重組産生抗體、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)時，其亦較佳地實質上不含培養基，亦即，培養基代表小於蛋白質製劑之體積之約20%，更佳地小於約10%且最佳地小於約5%。
如本文所用，術語「同型」係指由重鏈恒定區基因編碼之抗體類別(例如，IgM、IgG1、IgG2C及其類似類別)。
如本文所用，術語「K D」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數。可藉由標準抗體-抗原分析，例如競爭分析、飽和分析或諸如ELISA或RIA之標準免疫分析來量測或測定本發明所涵蓋之抗體的結合親和力。
「套組」係包含至少一種試劑，例如探針或小分子之任何製品(例如，包裝或容器)，該至少一種試劑用於特异性地偵測及/或影響本發明所涵蓋之標記物之表現。該套組可作為用於執行本發明所涵蓋之方法之單元來推銷、分售或銷售。該套組可包含表現可用於本發明所涵蓋之方法之組合物所必需之一或多種試劑。在某些實施例中，該套組可進一步包含參考標準，例如編碼不影響或調控控制細胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡之信號傳導路徑的蛋白質之核酸。熟習此項技術者可設想許多此類對照蛋白，包括但不限於常見分子標籤(例如，綠色螢光蛋白及β-半乳糖苷酶)、未藉由GeneOntology參考歸類於任何涵蓋細胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡之路徑中之蛋白質或者普遍存在之持家蛋白。套組中之試劑可在個別容器中提供，或在單一容器中以兩種或兩種以上試劑之混合物形式提供。此外，可包括描述套組內之組合物之用途的指導性材料。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」、「預防性治療」及其類似術語係指降低個體發展疾病、病症或疾患之概率，該個體未患但有風險或容易發展疾病、病症或疾患。
術語「預後」包括對病毒感染之可能過程及結果或自疾病恢復之可能性的預測。在一些實施例中，使用統計算法提供個體之病毒感染之預後。舉例而言，預後可為手術、病毒感染之臨床亞型之發展、一或多種臨床因素之發展或自疾病恢復。
用於偵測或測定至少一種生物標記物之存在或水準之術語「樣品」通常為腦組織、腦脊液、全血、血漿、血清、唾液、尿液、糞樣(stool) (例如糞便(feces))、淚液及任何其他體液(例如，如上文在「體液」之定義下所描述)，或組織樣品(例如，活體組織切片)，諸如小腸、結腸樣品或手術切除組織。在某些情况下，本發明所涵蓋之方法進一步包含在偵測或測定樣品中之至少一種標記物之存在或水準之前自個體獲得樣品。
術語「小分子」為此項技術之術語且包括分子量小於約1000或分子量小於約500之分子。在一實施例中，小分子不僅僅包含肽鍵。在另一實施例中，小分子并非寡聚物。可針對活性進行篩選之例示性小分子化合物包括但不限於肽、肽模擬物、核酸、碳水化合物、小有機分子(例如聚乙醯類) (Cane等人 (1998) Science282:63)及天然産物提取物文庫。在另一實施例中，該等化合物為小有機非肽化合物。在另一實施例中，小分子并非生物合成的。
術語「特异性結合」係指抗體與預定抗原結合。通常，當使用所關注抗原作為分析物且抗體作為配位體，在BIACORE®分析儀器中藉由表面電漿子共振(SPR)技術測定時，抗體以大約小於10 -7M，諸如大約小於10 -8M、10 -9M或10 -10M或甚至更低之親和力(K D)結合，且與預定抗原結合之親和力係其與除預定抗原或密切相關抗原以外之非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)結合之親和力的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0倍或更多倍。片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具特异性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特异性結合之抗體」互換使用。選擇性結合為相對術語，其係指抗體區分對一種抗原及另一抗原之結合的能力。
術語「個體」係指任何健康動物、哺乳動物或人類，或任何罹患病毒感染(例如SARS-CoV-2感染)之動物、哺乳動物或人類。術語「個體」可與「患者」互換。
如本文所用，胺基酸序列之間的「一致性百分比」與「同源性百分比」同義，其可使用由Karlin及Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993)修改的Karlin及Altschul算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268, 1990)測定。將所提及之算法併入至Altschul等人之NBLAST及XBLAST程式(J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990)中。用NBLAST程式執行BLAST核苷酸搜索，分數=100，字長=12，以獲得與本文所描述之聚核苷酸同源之核苷酸序列。用XBLAST程式執行BLAST蛋白搜索，分數=50，字長=3，以獲得與參考多肽同源之胺基酸序列。為了獲得間隙比對以用於比較目的，使用間隙BLAST，如Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)所述。當使用BLAST及間隙BLAST程式時，使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受之載劑」意謂參與將本發明化合物自身體之一個器官或部分携帶或轉運至身體之另一個器官或部分的醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封材料。
「經轉錄聚核苷酸」或「核苷酸轉錄物」係與成熟mRNA之全部或一部分互補或同源的聚核苷酸(例如，mRNA、hnRNA、cDNA或此類RNA或cDNA之類似物)，該成熟mRNA藉由生物標記物核酸之轉錄及(若存在) RNA轉錄物之正常轉錄後加工(例如剪接)以及RNA轉錄物之逆轉錄製成。
術語「T細胞」包括CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。術語T細胞亦包括T輔助1型T細胞及T輔助2型T細胞兩者。術語「抗原呈遞細胞」包括專職抗原呈遞細胞(例如，B淋巴球、單核細胞、樹突狀細胞、朗格漢斯細胞(Langerhans cell))，以及其他抗原呈遞細胞(例如，角質細胞、內皮細胞、星形細胞、纖維母細胞及寡樹突細胞)。
術語「T細胞受體」或「TCR」應理解為涵蓋完整TCR以及其抗原結合部分或抗原結合片段。在一些實施例中，TCR為完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。在一些實施例中，TCR係小於全長TCR但與MHC分子中結合之特定肽結合，諸如與MHC-肽複合物結合的抗原結合部分。在一些情况下，TCR之抗原結合部分或片段可僅含有全長或完整TCR之部分結構域，但仍能够結合完整TCR所結合之肽抗原決定基，諸如MHC-肽複合物。在一些情况下，抗原結合部分含有TCR之可變域，諸如TCR之可變α鏈及可變β鏈，該等可變域足以形成與特定MHC-肽複合物結合之結合位點。一般而言，TCR之可變鏈含有參與識別肽、MHC及/或MHC-肽複合物之互補決定區(CDR)。
術語「治療效應」係指由藥理學活性物質在動物，特定言之哺乳動物，且更特定言之人類中引起之局部或全身效應。因此，該術語意謂意欲用於診斷、治愈、緩解、治療或預防動物或人類之疾病或用於增强其所需身體或精神發育及狀況之任何物質。片語「治療有效量」意謂以適於任何治療之合理效益/風險比産生一些所需局部或全身效應的此類物質之量。在某些實施例中，化合物之治療有效量將取决於其治療指數、溶解度及其類似因素。舉例而言，藉由本發明所涵蓋之方法發現的某些化合物可以足以産生適於此類治療之合理效益/風險比的量進行投與。
如本文所用，術語「治療有效量」及「有效量」意謂化合物、材料或包含本發明所涵蓋之化合物之組合物的量，該量以適於任何醫學治療之合理效益/風險比在動物之至少一個細胞亞群中有效産生一些所需治療效應。可在細胞培養物或實驗動物中藉由例如用於測定LD 50及ED 50之標準醫藥學程序來測定本發明化合物之毒性及治療功效。展現大治療指數之組合物為較佳的。在一些實施例中，可量測LD 50(致死劑量)，且相對於不投與劑，其在投與該劑時可例如降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。同樣，可量測ED 50(亦即，達成症狀之半最大抑制的濃度)，且相對於不投與劑，其在投與該劑時可例如增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。同樣，亦可量測IC 50，且相對於不投與劑，其在投與該劑時可例如增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，在一種分析中，T細胞免疫反應可增加至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%。在另一實施例中，可實現病毒負載之至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%降低。
「治療」個體之疾病或「治療」患有疾病之個體係指使個體經受醫藥治療，例如藥物投與，使得該疾病之至少一種症狀有所减輕或得以預防以免惡化。
術語「體液」係指自身體排泄或分泌之流體以及通常不分泌之流體(例如，羊水、水樣液、膽汁、血液及血漿、腦脊液、耵聹及耳垢、考珀液(cowper’s fluid)或射精前液、乳糜、食糜、糞便、女性射液、間隙液、細胞內液、淋巴液、月經、母乳、黏液、胸水、膿液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、淚液、尿液、陰道潤滑液、玻璃體液、嘔吐物)。
術語「編碼區」係指核苷酸序列中包含轉譯成胺基酸殘基之密碼子之區域，而術語「非編碼區」係指核苷酸序列中未轉譯成胺基酸之區域(例如，5'及3'非轉譯區)。
術語「互補」係指兩條核酸股之區域之間或同一核酸股之兩個區域之間的序列互補性之廣泛概念。已知第一核酸區之腺嘌呤殘基能够與第二核酸區之殘基形成特定氫鍵(「鹼基配對」)，若第二核酸區之殘基為胸腺嘧啶或尿嘧啶，則該第二核酸區與第一區反平行。同樣，已知第一核酸股之胞嘧啶殘基能够與第二核酸股之殘基鹼基配對，若第二核酸股之殘基為鳥嘌呤，則該第二核酸股與第一股反平行。若當核酸之第一區與相同或不同核酸之第二區以反平行方式排列時，第一區之至少一個核苷酸殘基能够與第二區之殘基鹼基配對，則該兩個區域互補。較佳地，第一區包含第一部分且第二區包含第二部分，由此，當第一部分及第二部分以反平行方式排列時，第一部分之核苷酸殘基之至少約50%且較佳地至少約75%、至少約90%或至少約95%能够與第二部分之核苷酸殘基鹼基配對。更佳地，第一部分之所有核苷酸殘基均能够與第二部分中之核苷酸殘基鹼基配對。
如本文所用，關於經活化免疫細胞之術語「共刺激」包括共刺激分子提供誘導增生或效應子功能之第二、非活化受體介導之信號(「共刺激信號」)的能力。舉例而言，共刺激信號可導致細胞介素分泌，例如，在已接收T細胞受體介導之信號之T細胞中。已例如經由活化受體接收細胞受體介導之信號之免疫細胞在本文中稱為「經活化免疫細胞」。
術語「確定適合個體之治療方案」意謂確定用於個體之治療方案(亦即，用於預防及/或治療個體之病毒感染之單一療法或不同療法之組合)，該治療方案係基於或基本上基於或至少部分基於根據本發明之分析結果開始、進行修改及/或結束。一個實例係在手術之後開始輔助療法，其目的為降低復發風險，另一實例將為修改特定化學療法之劑量。除了根據本發明之分析結果以外，該確定亦可基於待治療個體之個人特徵。在大多數情况下，將由主治醫師或醫生執行對適合個體之治療方案之實際確定。
如本文所用，術語「佐劑」係指與單獨投與抗原相比，當在投與抗原之前、同時或之後投與時促進、延長及/或增强對抗原之免疫反應之品質及/或强度的物質。佐劑可增加由疫苗接種誘導之免疫反應之量級及持續時間。
如本文所用，「同源」係指同一核酸股之兩個區域之間或兩個不同核酸股之區域之間的核苷酸序列相似性。當兩個區域中之核苷酸殘基位置由相同核苷酸殘基佔據時，則該等區域在彼位置處係同源的。若每一個區域之至少一個核苷酸殘基位置由相同殘基佔據，則第一區與第二區同源。兩個區域之間的同源性以兩個區域之核苷酸殘基位置由相同核苷酸殘基佔據之比例表述。舉例而言，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3’之區域及具有核苷酸序列5'-TATGGC-3’之區域共享50%同源性。較佳地，第一區包含第一部分且第二區包含第二部分，由此，該等部分中之每一者的核苷酸殘基位置之至少約50%且較佳地至少約75%、至少約90%或至少約95%由相同核苷酸殘基佔據。更佳地，該等部分中之每一者的所有核苷酸殘基位置由相同核苷酸殘基佔據。
術語「免疫細胞」係指在免疫反應中起作用之細胞。免疫細胞具有造血起源，且包括淋巴球，諸如B細胞及T細胞；天然殺手細胞；骨髓細胞，諸如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、嗜鹼性球及顆粒球。
術語「SARS-CoV-2」或「嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2」係指2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)之病原體。SARS-CoV-2在2020年3月11日被世界衛生組織(WHO)鑑別為流行病。在支持病毒進入宿主細胞中之過程中，SARS-CoV2與在下呼吸道中高度表現的ACE2接收者，諸如肺之II型肺泡細胞(AT2)、食管上端及分層上皮細胞以及其他細胞(諸如來自迴腸及結腸之吸收性腸上皮細胞、膽管細胞、心肌細胞、腎近端小管細胞及膀胱上皮細胞)結合。因此，感染此病毒之患者不僅經歷導致急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之呼吸道問題(諸如肺炎)，而且經歷心臟、腎臟及消化道病症。
尚無根除患者之SARS-CoV2病毒之特定治療。可使用另一β-冠狀病毒方法之治療方法，諸如SARS-CoV或MERS-CoV治療。此等方法中之一些包括洛匹那韋(lopinavir)/利托那韋(ritonavir)、氯喹及羥氯喹。亦可使用每晚兩次干擾素α之氣霧劑吸入。在一些情况下，干擾素-α與利巴韋林(ribavirin)之組合常用於冠狀病毒(諸如MERS-CoV)。亦發現干擾素與類固醇藥物之組合可加速肺修復且增加氧存活水準。然而，使用干擾素α之療法已顯示不一致之結果。
SARS-CoV-2病毒係一種有包膜的非分段正義RNA病毒，該病毒包括於廣泛分佈於人類及其他哺乳動物中之沙貝病毒(sarbecovirus)、正冠狀病毒(ortho corona virinae)亞科中。其直徑為約65-125 nm，含有單股RNA，且在外表面上具有冠狀刺突。SARS-CoV2係在先前鑑別之SARS-CoV及MERS-CoV之後的一種新穎β-冠狀病毒，其導致肺功能衰竭及潜在致命呼吸道感染，且主要在中國廣東及沙特阿拉伯暴發。
SARS-CoV-2之基因組尺寸自29.8 kb至29.9 kb變化，且其基因組結構遵循已知CoV之特定基因特徵。基因組中超過三分之二的5'包含編碼orf1a/b多蛋白之orf1a/b，而三分之一的3’由編碼四種主要結構蛋白之基因組成，該等結構蛋白包括刺突(S)醣蛋白、小包膜(E)醣蛋白、膜(M)醣蛋白及核衣殼(N)蛋白。另外，SARS-CoV-2含有6種輔助蛋白，其由ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b及ORF8基因編碼(Khailany等人 (2020) Gene Rep19:100682)。
ORF1ab基因係該冠狀病毒之最大基因區段，且其構成兩種ORF，亦即ORF1a及ORF1b，以藉由促成核糖體移框事件産生兩種較大的重疊多蛋白pp1a (orf1a多蛋白)及pp1ab (orf1ab多蛋白)。該等多蛋白由蛋白酶，即木瓜酶樣蛋白酶(PLpro)及絲胺酸型Mpro (胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro))蛋白酶補充，該等蛋白酶在nsp3及nsp 5中編碼。隨後，pp1a及pp1ab分別裂解成非結構蛋白(nsps) 1-11及1-16。nsps在病毒及宿主細胞中之許多過程中發揮著重要作用。orf1a多蛋白及orf1ab多蛋白之代表性序列呈現於下文表1K中。
ORF3a係由SARS-CoV-2基因組編碼的輔助蛋白之一。最近研究已顯示，SARS-CoV-2 ORF3a蛋白之功能域與毒力、傳染性、離子通道形成及病毒釋放有關(Issa等人 (2020) mSystems 5:e00266-20)。ORF3a之代表性序列呈現於下文表1K中。
ORF7a係另一SARS-CoV-2基因組編碼之輔助蛋白，該輔助蛋白由主要位於高爾基體(Golgi apparatus)中，但可在細胞表面上發現的I型跨膜蛋白構成。SARS-CoV ORF7a之病毒基因組與ORF7b重疊，其中它們共享轉錄調控序列(TRS)。在一些實施例中，ORF7a具有15-胺基酸(aa) N端信號肽、81-aa魯米那域、21-aa跨膜域及5-aa細胞質尾(Taylor等人 (2015) J. Virol.89:11820-11833)。ORF7a之代表性序列呈現於下文表1K中。
刺突或S醣蛋白係在病毒之外部部分中發現的分子量為約150 kDa之跨膜蛋白。S蛋白具有位於病毒S1亞單元中之RBD，該RBD藉由與宿主細胞上之其受體ACE2結合來促使病毒進入宿主細胞中。S蛋白形成在病毒表面突出之同源三聚體，且藉由吸引在下呼吸道細胞中表現之血管緊張素轉換酶2 (ACE2)來促進包膜病毒與宿主細胞之結合。此醣蛋白由宿主細胞弗林蛋白酶樣蛋白酶裂解成2個亞單元，亦即S1及S2。S1部分負責利用受體結合域構成來決定宿主病毒範圍及細胞趨向性，而S2用於在傳輸宿主細胞時介導病毒融合。S醣蛋白之代表性序列呈現於下文表1K中。
稱為N蛋白之核衣殼係位於在結構上與病毒之核酸材料結合的內質網-高爾基體區中的CoV之結構組分。因為該蛋白質與RNA結合，故該蛋白質參與與病毒基因組、病毒複製週期及宿主細胞對病毒感染之細胞反應相關的過程。N蛋白亦在很大程度上磷酸化，且表明其導致結構變化，從而增强對病毒RNA之親和力。N醣蛋白之代表性序列呈現於下文表1K中。
此病毒之另一重要部分為膜或M蛋白，其為結構上最大程度結構化之蛋白質，且在決定病毒包膜之形狀方面起作用。此蛋白質可與所有其他結構蛋白結合。與M蛋白結合有助於使核衣殼或N蛋白穩定化，且藉由使內部病毒粒子內之N蛋白-RNA複合物穩定化來促進病毒組裝之完成。M蛋白之代表性序列呈現於下文表1K中。
最後一個組分為包膜或E蛋白，其為SARS-CoV-2結構中之最小蛋白，在此病毒之産生及成熟中起作用。
SARS-CoV-2之基因組資訊為公開可獲得的且可例如自NCBI嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2資料庫(可在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/獲得)及NGDC基因組數據中心(可在bigd.big.ac.cn/gwh/獲得)以及已定序分離株之流行病學資料獲得。特定蛋白質之胺基酸序列與可編碼該蛋白質之核苷酸序列之間存在已知且確定的對應關係，如由遺傳密碼所限定(如下所示)。同樣，特定核酸之核苷酸序列與由彼核酸編碼之胺基酸序列之間存在已知且確定的對應關係，如由遺傳密碼所限定。 遺傳密碼 丙胺酸(Ala, A)               GCA、GCC、GCG、GCT 精胺酸(Arg, R)               AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT 天冬醯胺(Asn, N)           AAC、AAT 天冬胺酸(Asp, D)           GAC、GAT 半胱胺酸(Cys, C)           TGC、TGT 麩胺酸(Glu, E)                GAA、GAG 麩醯胺(Gln, Q)               CAA、CAG 甘胺酸(Gly, G)               GGA、GGC、GGG、GGT 組胺酸(His, H)                CAC、CAT 異白胺酸(Ile, I)               ATA、ATC、ATT 白胺酸(Leu, L)               CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG 離胺酸(Lys, K)               AAA、AAG 甲硫胺酸(Met, M)          ATG 苯丙胺酸(Phe, F )TTC、TTT 脯胺酸(Pro, P)                CCA、CCC、CCG、CCT 絲胺酸(Ser, S)                AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT 酥胺酸(Thr, T)                ACA、ACC、ACG、ACT 色胺酸(Trp, W)               TGG 酪胺酸(Tyr, Y)               TAC、TAT 纈胺酸(Val, V)               GTA、GTC、GTG、GTT 終止信號(末端)               TAA、TAG、TGA
遺傳密碼之一個重要且眾所周知的特徵為其冗餘性，由此，對於用於製備蛋白質之大多數胺基酸而言，可使用多於一個編碼核苷酸三聯體(如上文所說明)。因此，許多不同核苷酸序列可編碼既定胺基酸序列。此類核苷酸序列被視為在功能上等效，因為其使得在所有生物體中産生相同胺基酸序列(儘管某些生物體可比其他生物體更有效地轉譯一些序列)。此外，有時可在既定核苷酸序列中發現嘌呤或嘧啶之甲基化變異體。此類甲基化不影響三核苷酸密碼子與對應胺基酸之間的編碼關係。
鑑於前述，可使用編碼生物標記物核酸(或其任何部分)之DNA或RNA之核苷酸序列來衍生多肽胺基酸序列，從而使用遺傳密碼將DNA或RNA轉譯成胺基酸序列。同樣，對於多肽胺基酸序列，可自遺傳密碼推斷出可編碼該多肽之對應核苷酸序列(由於其冗餘性，其將產生用於任何既定胺基酸序列之多個核酸序列)。因此，本文中對編碼多肽之核苷酸序列之描述及/或揭示應被視為亦包括對由該核苷酸序列編碼之胺基酸序列之描述及/或揭示。同樣，本文中對多肽胺基酸序列之描述及/或揭示應被視為亦包括對可編碼該胺基酸序列之所有可能核苷酸序列之描述及/或揭示。 II. 肽及構築體
在某些態樣中，本文提供經由投與經鑑別SARS-COV-2免疫顯性肽或編碼經鑑別SARS-COV-2免疫顯性肽之核酸來誘導針對SARS-CoV-2之免疫反應，從而治療及/或預防COIVD-19的方法及組合物。
在一些態樣中，本文提供包含至少兩個肽抗原決定基或至少兩個肽片段之免疫原性多肽，該等肽片段中之每一者包含至少兩個肽抗原決定基。下文描述與此等免疫原性多肽之肽抗原決定基相關的多個實施例(例如，關於免疫顯性肽描述之肽抗原決定基亦可為免疫原性多肽之組成性肽抗原決定基)。
某些例示性免疫原性多肽(例如，構築體)顯示於圖1、圖2、圖5A-圖5C、圖6A-圖6C、圖7、圖8、圖9A及圖9B中。如所見，該等免疫原性多肽可包括多個(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個)肽抗原決定基(例如，表1A至1F中之彼等)，可包括SARS-CoV-2蛋白中具有至少兩個此類抗原決定基之片段，且可進一步具有額外區段，諸如S蛋白區段及/或核糖體停止/再啟動區段、IRES區段及/或轉譯後裂解區段，視情況其中該轉譯後裂解區段為P2A區段。在一些實施例中，SARS-CoV-2蛋白中包含所關注之抗原決定基之片段可由尺寸定義，諸如在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、1、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、419、420、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000、1005、1010、1015、1020、1025、1030、1035、1040、1045、1050、1055、1060、1065、1070、1075、1080、1085、1090、1095、1100、1105、1110、1115、1120、1125、1130、1135、1140、1145、1150、1155、1160、1165、1170、1175、1180、1185、1190、1195、1200、1205、1210、1215、1220、1235、1240、1245、1250、1255、1260、1265、1270、1271個胺基酸(AA)之間或者其間任何範圍(包括其)，諸如8-1271、30-40、15-30、15-40、30-112、8-38、8-96、8-104、8-107、8-112、8-88、8-87、8-85、8-66、8-55、222-275、222-419、275-419、222-1271及其類似範圍。在一些實施例中，最小片段為8 AA抗原決定基。在一些實施例中，非抗原決定基片段之代表性14個片段之疫苗構築體介於30-40 AA範圍內且14個片段中之最小片段= [3+9+3]抗原決定基[3aa + 抗原決定基 + 3aa])。在一些實施例中，蛋白質跨越片段之最大片段為112 AA。在一些實施例中，S蛋白(1271 AA由38個胺基酸之片段覆蓋。在一些實施例中，N蛋白(419 AA)由96 AA、104 AA及/或107 AA之一或多個片段(例如，N_Frag1 = 96 AA，N_Frag2 = 104 AA及/或N_Frag3 = 107 AA)覆蓋。在一些實施例中，Orf3a蛋白(275 AA)由85 AA、87 AA及/或88 AA之一或多個片段(例如，3a_Frag1 = 88 AA，3a_Frag2 = 87 AA，及/或3a_Frag 3 = 85 AA)覆蓋。在一些實施例中，M蛋白(222 AA)由55 AA及/或66 AA之一或多個片段(例如，M_Frag1 = 66及/或M_Frag2 = 55)覆蓋。
在某些實施例中，SARS-COV-2免疫顯性肽包含選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基(例如，由該肽抗原決定基組成)。本文所述之肽抗原決定基可與MHC分子，諸如具有特定α鏈等位基因之特定HLA分子組合。舉例而言，表1A之肽經鑑別與α鏈具有HLA-A*02血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260及/或HLA-A*0274等位基因編碼之MHC；表1C之肽經鑑別與α鏈具有HLA-A*03血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305及/或HLA-A*0307編碼之MHC；表1B之肽經鑑別與α鏈具有HLA-A*01血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103及/或HLA-A*0116等位基因編碼之MHC；表1D之肽經鑑別與α鏈具有HLA-A*11血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105及/或HLA-A*1119等位基因編碼之MHC；表1E之肽經鑑別與α鏈具有HLA-A*24血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426及/或HLA-A*2458等位基因編碼之MHC；且表1F之肽經鑑別與α鏈具有HLA-B*07血清型之MHC相關聯，諸如由HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及/或HLA-B*0721等位基因編碼之MHC，如工作實例中進一步所描述。在一些實施例中，SARS-COV-2免疫顯性肽係源自選自表1K之SARS-COV-2蛋白。在一些實施例中，單獨投與或與佐劑組合投與一或多個SARS-COV-2免疫顯性肽。
在某些態樣中，本文提供組合物，其包含一或多種本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽及佐劑。 表 1A (HLA-A02)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
KLWAQCVQL ORF1ab
YLQPRTFLL S
LLYDANYFL ORF3a
ALWEIQQVV ORF1ab
LLLDRLNQL N
YLFDESGEFKL ORF1ab
表 1B (HLA-A01)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
FTSDYYQLY ORF3a
TTDPSFLGRY ORF1ab
PTDNYITTY ORF1ab
ATSRTLSYY M
CTDDNALAYY ORF1ab
NTCDGTTFTY ORF1ab
DTDFVNEFY ORF1ab
GTDLEGNFY ORF1ab
表 1C (HLA-A03)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
KTFPPTEPK N
KCYGVSPTK S
MVTNNTFTLK ORF1ab
KTIQPRVEK ORF1ab
表 1D (HLA-A11)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
KTFPPTEPK N
VTDTPKGPK ORF1ab
ATEGALNTPK N
ASAFFGMSR N
ATSRTLSYYK M
表 1E (HLA-A24)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
QYIKWPWYI S
VYFLQSINF ORF3a
VYIGDPAQL ORF1ab
表 1F (HLA-B07)
肽抗原決定基 源自 SARS-CoV-2 蛋白
SPRWYFYYL N
RPDTRYVL ORF1ab
IPRRNVATL ORF1ab
表 1G ＞19_抗原決定基_3aa_連接子(288 aa)
Figure 02_image001
＞19_抗原決定基_kaa_連接子(228 aa)
Figure 02_image003
＞19_抗原決定基_無_連接子(174 aa)
Figure 02_image005
＞27_抗原決定基_3aa_連接子(412 aa)
Figure 02_image007
＞27_抗原決定基_kaa_連接子(328 aa)
Figure 02_image009
＞27_抗原決定基_無連接子(250 aa)
Figure 02_image011
表 1H ＞11_frag (500 aa)
Figure 02_image013
表 1I ＞s-pp-p2a-19_抗原決定基_3aa (1588 aa)
Figure 02_image015
＞s-pp-p2a-27_抗原決定基_3aa (1712 aa)*
Figure 02_image017
* 注意：圖2 (續)中指定為#2之27個抗原決定基之片段係第35頁標記為「27_抗原決定基_3aa_連接子」的構築體之更精確描繪。圖2中之構築體描繪係圖2 (續)所示之構築體描繪的更早版本且此等構築體描繪中之每一者均為圖5-9中提供之精確構築體描繪的更早描繪。 ＞14_片段(546 aa)
Figure 02_image019
＞B.1.617.2_S.PP_Epi-M/N/ORF3a (1099 aa)
Figure 02_image021
＞B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3a (1221 aa)
Figure 02_image023
表 1J ＞s-pp-p2a-11_frag (1800 aa)
Figure 02_image025
表 1K ＞YP_009724389 (SARS-CoV-2 ORF1a/b蛋白) MESLVPGFNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEVLSEARQHLKDGTCGLVEVEKGVLPQLEQPYVFIKRSDARTAPHGHVMVELVAELEGIQYGRSGETLGVLVPHVGEIPVAYRKVLLRKNGNKGAGGHSYGADLKSFDLGDELGTDPYEDFQENWNTKHSSGVTRELMRELNGGAYTRYVDNNFCGPDGYPLECIKDLLARAGKASCTLSEQLDFIDTKRGVYCCREHEHEIAWYTERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKTIQPRVEKKKLDGFMGRIRSVYPVASPNECNQMCLSTLMKCDHCGETSWQTGDFVKATCEFCGTENLTKEGATTCGYLPQNAVVKIYCPACHNSEVGPEHSLAEYHNESGLKTILRKGGRTIAFGGCVFSYVGCHNKCAYWVPRASANIGCNHTGVVGEGSEGLNDNLLEILQKEKVNINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQIVESCGNFKVTKGKAKKGAWNIGEQKSILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITILDGISQYSLRLIDAMMFTSDLATNNLVVMAYITGGVVQLTSQWLTNIFGTVYEKLKPVLDWLEEKFKEGVEFLRDGWEIVKFISTCACEIVGGQIVTCAKEIKESVQTFFKLVNKFLALCADSIIIGGAKLKALNLGETFVTHSKGLYRKCVKSREETGLLMPLKAPKEIIFLEGETLPTEVLTEEVVLKTGDLQPLEQPTSEAVEAPLVGTPVCINGLMLLEIKDTEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGDDTVIEVQGYKSVNITFELDERIDKVLNEKCSAYTVELGTEVNEFACVVADAVIKTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCSFYPPDEDEEEGDCEEEEFEPSTQYEYGTEDDYQGKPLEFGATSAALQPEEEQEEDWLDDDSQQTVGQQDGSEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTDNVYIKNADIVEEAKKVKPTVVVNAANVYLKHGGGVAGALNKATNNAMQVESDDYIATNGPLKVGGSCVLSGHNLAKHCLHVVGPNVNKGEDIQLLKSAYENFNQHEVLLAPLLSAGIFGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSEKQVEQKIAEIPKEEVKPFITESKPSVEQRKQDDKKIKACVEEVTTTLEETKFLTENLLLYIDINGNLHPDSATLVSDIDITFLKKDAPYIVGDVVQEGVLTAVVIPTKKAGGTTEMLAKALRKVPTDNYITTYPGQGLNGYTVEEAKTVLKKCKSAFYILPSIISNEKQEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPVCVETKAIVSTIQRKYKGIKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVTHGLNLEEAARYMRSLKVPATVSVSSPDAVTAYNGYLTSSSKTPEEHFIETISLAGSYKDWSYSGQSTQLGIEFLKRGDKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNINLHTQVVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHNSHEGKTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQVNGLTSIKWADNNCYLATALLTLQQIELKFNPPALQDAYYRARAGEAANFCALILAYCNKTVGELGDVRETMSYLFQHANLDSCKRVLNVVCKTCGQQQTTLKGVEAVMYMGTLSYEQFKKGVQIPCTCGKQATKYLVQQESPFVMMSAPPAQYELKHGTFTCASEYTGNYQCGHYKHITSKETLYCIDGALLTKSSEYKGPITDVFYKENSYTTTIKPVTYKLDGVVCTEIDPKLDNYYKKDNSYFTEQPIDLVPNQPYPNASFDNFKFVCDNIKFADDLNQLTGYKKPASRELKVTFFPDLNGDVVAIDYKHYTPSFKKGAKLLHKPIVWHVNNATNKATYKPNTWCIRCLWSTKPVETSNSFDVLKSEDAQGMDNLACEDLKPVSEEVVENPTIQKDVLECNVKTTEVVGDIILKPANNSLKITEEVGHTDLMAAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANYAKPFLNKVVSTTTNIVTRCLNRVCTNYMPYFFTLLLQLCTFTRSTNSRIKASMPTTIAKNTVKSVGKFCLEASFNYLKSPNFSKLINIIIWFLLLSVCLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISSFKWDLTAFGLVAEWFLAYILFTRFFYVLGLAAIMQLFFSYFAVHFISNSWLMWLIINLVQMAPISAMVRMYIFFASFYYVWKSYVHVVDGCNSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGVRRSFYVYANGGKGFCKLHNWNCVNCDTFCAGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVTVKNGSIHLYFDKAGQKTYERHSLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCEESSAKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSAEVAVKMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTFISAARQGFVDSDVETKDVVECLKLSHQSDIEVTGDSCNNYMLTYNKVENMTPRDLGACIDCSARHINAQVAKSHNIALIWNVKDFMSLSEQLRKQIRSAAKKNNLPFKLTCATTRQVVNVVTTKIALKGGKIVNNWLKQLIKVTLVFLFVAAIFYLITPVHVMSKHTDFSSEIIGYKAIDGGVTRDIASTDTCFANKHADFDTWFSQRGGSYTNDKACPLIAAVITREVGFVVPGLPGTILRTTNGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCRHGTCERSEAGVCVSTSGRWVLNNDYYRSLPGVFCGVDAVNLLTNMFTPLIQPIGALDISASIVAGGIVAIVVTCLAYYFMRFRRAFGEYSHVVAFNTLLFLMSFTVLCLTPVYSFLPGVYSVIYLYLTFYLTNDVSFLAHIQWMVMFTPLVPFWITIAYIICISTKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGSDVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQSAVKRTIKGTHHWLLLTILTSLLVLVQSTQWSLFFFLYENAFLPFAMGIIAMSAFAMMFVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLDMVDTSLSGFKLKDCVMYASAVVLLILMTARTVYDDGARRVWTLMNVLTLVYKVYYGNALDQAISMWALIISVTSNYSGVVTTVMFLARGIVFMCVEYCPIFFITGNTLQCIMLVYCFLGYFCTCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKNSIDAFKLNIKLLGVGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINKLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEISMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDAAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLKNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPMLQSADAQSFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNDKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEDDNLIDSYFVVKRHTFSNYQHEETIYNLLKDCPAVAKHDFFKFRIDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQALLKTVQFCDAMRNAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFIQTTPGSGVPVVDSYYSLLMPILTLTRALTAESHVDTDLTKPYIKWDLLKYDFTEERLKLFDRYFKYWDQTYHPNCVNCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCSLSHRFYRLANECAQVLSEMVMCGGSLYVKPGGTSSGDATTAYANSVFNICQAVTANVNALLSTDGNKIADKYVRNLQHRLYECLYRNRDVDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAKCWTETDLTKGPHEFCSQHTMLVKQGDDYVYLPYPDPSRILGAGCFVDDIVKTDGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDELTGHMLDMYSVMLTNDNTSRYWEPEFYEAMYTPHTVLQAVGACVLCNSQTSLRCGACIRRPFLCCKCCYDHVISTSHKLVLSVNPYVCNAPGCDVTDVTQLYLGGMSYYCKSHKPPISFPLCANGQVFGLYKNTCVGSDNVTDFNAIATCDWTNAGDYILANTCTERLKLFAAETLKATEETFKLSYGIATVREVLSDRELHLSWEVGKPRPPLNRNYVFTGYRVTKNSKVQIGEYTFEKGDYGDAVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGLYPTLNISDEFSSNVANYQKVGMQKYSTLQGPPGTGKSHFAIGLALYYPSARIVYTACSHAAVDALCEKALKYLPIDKCSRIIPARARVECFDKFKVNSTLEQYVFCTVNALPETTADIVVFDEISMATNYDLSVVNARLRAKHYVYIGDPAQLPAPRTLLTKGTLEPEYFNSVCRLMKTIGPDMFLGTCRRCPAEIVDTVSALVYDNKLKAHKDKSAQCFKMFYKGVITHDVSSAINRPQIGVVREFLTRNPAWRKAVFISPYNSQNAVASKILGLPTQTVDSSQGSEYDYVIFTQTTETAHSCNVNRFNVAITRAKVGILCIMSDRDLYDKLQFTSLEIPRRNVATLQAENVTGLFKDCSKVITGLHPTQAPTHLSVDTKFKTEGLCVDIPGIPKDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDVEGCHATREAVGTNLPLQLGFSTGVNLVAVPTGYVDTPNNTDFSRVSAKPPPGDQFKHLIPLMYKGLPWNVVRIKIVQMLSDTLKNLSDRVVFVLWAHGFELTSMKYFVKIGPERTCCLCDRRATCFSTASDTYACWHHSIGFDYVYNPFMIDVQQWGFTGNLQSNHDLYCQVHGNAHVASCDAIMTRCLAVHECFVKRVDWTIEYPIIGDELKINAACRKVQHMVVKAALLADKFPVLHDIGNPKAIKCVPQADVEWKFYDAQPCSDKAYKIEELFYSYATHSDKFTDGVCLFWNCNVDRYPANSIVCRFDTRVLSNLNLPGCDGGSLYVNKHAFHTPAFDKSAFVNLKQLPFFYYSDSPCESHGKQVVSDIDYVPLKSATCITRCNLGGAVCRHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQSLENVAFNVVNKGHFDGQQGEVPVSIINNTVYTKVDGVDVELFENKTTLPVNVAFELWAKRNIKPVPEVKILNNLGVDIAANTVIWDYKRDAPAHISTIGVCSMTDIAKKPTETICAPLTVFFDGRVDGQVDLFRNARNGVLITEGSVKGLQPSVGPKQASLNGVTLIGEAVKTQFNYYKKVDGVVQQLPETYFTQSRNLQEFKPRSQMEIDFLELAMDEFIERYKLEGYAFEHIVYGDFSHSQLGGLHLLIGLAKRFKESPFELEDFIPMDSTVKNYFITDAQTGSSKCVCSVIDLLLDDFVEIIKSQDLSVVSKVVKVTIDYTEISFMLWCKDGHVETFYPKLQSSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVTKENDSKEGFFTYICGFIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCNYLGKPREQIDGYVMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNN ＞YP_009724390 (SARS-CoV-2 S蛋白) MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT ＞YP_009724397 (SARS-CoV-2 N蛋白) MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA ＞YP_009724391 (SARS-CoV-2 orf3a蛋白) MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL ＞ YP_009724393.1 (SARS-CoV-2 M蛋白) MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ ＞ YP_009724395.1 (SARS-CoV-2 orf7a蛋白) MKIILFLALITLATCELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE * 表1A-1K中包括肽抗原決定基，以及包含其全長與表1A-1K中列出之任何SEQ ID NO之胺基酸序列或其部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性或者其間任何範圍(包括其)，諸如85-99%一致性之胺基酸序列的多肽分子。此類多肽可具有本文所進一步描述之全長肽或多肽之功能。 表 2＞19_抗原決定基_3aa_連接子(870 nt) AtgtacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgctgatcacagctacttcacctctgattactaccagctttattctacacagaagcactacgtgtatatcggcgaccccgcccaactgcctgcccctgacgcctacaaaaccttcccccccacagaacccaaaaaggacaaaatctgggtcgccaccgagggcgccctgaacacccctaaagaccatatcatcaccgtggccacaagcagaaccctgagctattacaagctgggcgcttacgccctggtgtactttctgcagagcatcaacttcgtgcggatctccctggaaatccctaggcggaacgttgctaccctgcaggccgagcctaatatgatggtgaccaacaacaccttcaccctcaagggcggagccaagaaccccctgctgtacgacgccaattacttcctgtgctggcacaaggacctgtctccaagatggtatttctactacctgggcaccggctactaccacaccacagatccaagcttcctgggaagatacatgagcgctgaaagcctgagacctgataccagatacgtgctgatggacggcagaaaggtgcctaccgacaactacattaccacataccccggccagtgtagattcgtgacagacacccctaagggacctaaggtgaagtacagcacattcaagtgctacggcgtgtccccaacaaagctgaatgataaatacgagcagtacatcaagtggccttggtacatctggctgggcagcagctccaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgactacgtcggctacctgcaacctcggacatttctgctgaagtacaacTAG ＞19_抗原決定基_kaa_連接子(690 nt) AtggccctgtgggagatccagcaggttgtgaaggctgcattcacctctgattactaccagctgtacaaggccgccgtgtacatcggcgaccccgcccagctgaaggccgctaaaaccttcccccccaccgagcctaagaaagctgctgcaacagaaggcgccctgaatacacctaagaaagccgccgccacaagcagaacactgagctactacaagaaggccgctgtgtatttcctccagagcatcaacttcaaggccgctatccccaggcggaacgtggccaccctgaaagctgccatggtcaccaacaacacctttaccctgaagaaggccgccctgctgtacgacgccaattactttctgaaggccgcatctccacggtggtacttctactacctgaaggccgccaccaccgaccctagcttcctgggcagatacaaggccgccagacctgacaccagatacgtgctgaaagccgcccctaccgacaactacattacaacctacaaggccgccgtgacagatacccctaagggacctaaaaaggccgccaagtgctacggcgtgtccccaacaaagaaggccgctcagtacatcaagtggccttggtatatcaaggccgccaagctgtgggcccaatgtgtgcagctgaaggccgcctatctgcagcctagaaccttcctgctgTAG ＞19_抗原決定基_無_連接子(528 nt) AtggccctgtgggagatccagcaggtggtgttcaccagcgactactaccagctgtacgtgtacatcggcgaccccgctcagctgaagaccttcccacctaccgaacccaaggccaccgagggagccctgaacacccctaaggctacatctagaaccctgagctactacaaggtgtacttcctgcagtctatcaacttcatcccccggagaaacgtggccaccctgatggttaccaacaacacctttaccctgaagctgctgtacgacgccaattacttcctcagccctcggtggtatttctactaccttacaaccgaccctagcttcctgggcagatacagacctgacacaagatatgtgctgcctacagataattacatcaccacatacgtcaccgatacccccaaaggccctaaaaagtgctacggcgtgtcccctacaaagcagtacattaagtggccttggtacatcaagctgtgggcccagtgtgtgcagctgtatctgcaaccacggacatttctgctgTAG ＞27_抗原決定基_3aa_連接子(1248 nt) atgcacagctacttcaccagcgactactaccagctgtacagcacccagaagcactacgtgtacatcggcgaccccgcccagctgcccgccccctacgccctggtgtacttcctgcagagcatcaacttcgtgaggatcgccacctactacctgttcgacgagagcggcgagttcaagctggccagccacaagaaccccctgctgtacgacgccaactacttcctgtgctggcacaggaaggtgcccaccgacaactacatcaccacctaccccggccagatcaccgtggccaccagcaggaccctgagctactacaagctgggcgcccccaacatgatggtgaccaacaacaccttcaccctgaagggcggcgccagcatcatcaagaccatccagcccagggtggagaagaagaagctgaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcaaggacctgagccccaggtggtacttctactacctgggcaccggcacctacaagaacacctgcgacggcaccaccttcacctacgccagcgccgtgcacgccggcaccgacctggagggcaacttctacggccccttcgagagcctgaggcccgacaccaggtacgtgctgatggacggccagaccgcctgcaccgacgacaacgccctggcctactacaacaccaccagcagcagcaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgactacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgccgacgacgcctacaagaccttcccccccaccgagcccaagaaggacaagagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacgcccccagcgccagcgccttcttcggcatgagcaggatcggcatgctggccctgctgctgctggacaggctgaaccagctggagagcaagagcctggagatccccaggaggaacgtggccaccctgcaggccgagtactaccacaccaccgaccccagcttcctgggcaggtacatgagcgccagggacgtggacaccgacttcgtgaacgagttctacgcctacctgtgcaggttcgtgaccgacacccccaagggccccaaggtgaagtacatctgggtggccaccgagggcgccctgaacacccccaaggaccacatctacgtgggctacctgcagcccaggaccttcctgctgaagtacaacTGATAATAG ＞27_抗原決定基_kaa_連接子(990 nt) AtgtttacgtcagactactatcagctttacaaagcagccgtctatatcggggatcccgcccagcttaaagccgccgtgtatttcctgcagtccatcaacttcaaagcagcgtatttgttcgatgagtctggggagtttaaattgaaagctgccctcctctacgacgccaattattttcttaaagcggccccaacggataactatataacgacctacaaagcagctgccacatcccgaacactcagttattataagaaagcagccatggttacgaataacacttttacgctgaaaaaagctgcaaaaacgattcagccgcgggttgaaaagaaagctgcgcagtacataaagtggccatggtatatcaaagccgcctcccccagatggtacttctattatttgaaagcggccaacacatgcgacggtaccacgtttacatataaagctgcggggacagacttggaagggaatttttacaaggcggctcgcccagatacacgctacgttttgaaagccgcttgtactgatgataacgcattggcttactataaagcagcaaagctttgggcccagtgcgttcagctgaaggccgcagcgctctgggaaatccaacaggttgtgaaagccgcaaaaactttcccgccgacagaaccgaaaaaggcggcgaagtgctatggagtcagtcctactaaaaaggccgccgcgtcagccttctttggcatgagtcgcaaggctgctctgcttttggatcggctcaatcaactcaaagccgcaataccgagaaggaacgttgcgacattgaaggcggccacaacagacccgtcattcctgggcagatacaaggcagctgataccgacttcgtcaatgagttttacaaggcggcggtcactgacacaccgaaaggccccaaaaaggccgctgcgaccgagggtgcgttgaatacaccaaaaaaggcagcatatctccagccaaggacgttcctgctgTAG ＞27_抗原決定基_無連接子(756 nt) atgttcacctctgattactaccagctttatgtgtacattggagatcctgctcagctggtgtacttcctgcagagcatcaacttctacctgttcgacgagagcggcgaattcaagctgctgctgtacgacgccaactacttcctgcctaccgataattacatcaccacatacgccacatctcggaccctgagctactacaagatggtcaccaacaacacctttaccctgaagaagaccatccagcctcgggtggaaaagcagtacatcaagtggccttggtatatcagccctagatggtacttttactacctgaacacctgcgacggcaccacctttacatacggcacagatctggaaggcaacttctacagacctgacaccagatacgtgctgtgcaccgacgacaatgccctggcctactataagctgtgggcccaatgtgtgcagctggctctgtgggagatccagcaggtggtgaagacattcccccccaccgagcccaagaaatgctacggcgtgtccccaacaaaggccagcgccttcttcggcatgagccggctgctgctggacagactgaaccagctgatcccccgcaggaacgtggccaccctgaccaccgacccctccttcctgggaagatacgacacagacttcgtgaacgagttctacgttacagatacaccaaaaggccctaaagctacagagggcgccctgaatacccctaagtacctgcaacctagaacctttctgctcTAG ＞11_frag (1506 nt) 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＞s-pp-p2a-19_抗原決定基_3aa (4767 nt) 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＞s-pp-p2a-27_抗原決定基_3aa (5139 nt) 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＞14_片段(1647 nt) 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＞B.1.617.2_S.PP_Epi-M/N/ORF3a (3306 nt) 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＞B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3a (3672 nt) atggccacctactacctgttcgacgagagcggcgagttcaagctggccagccacagcaagctgatcgagtacaccgacttcgccaccagcgcctgcgtgctggccgccgagtgcaccatcttcaaggacgccagcggcaagcccgtgccctactgctacgacaccaacgtgctggagggcagcgtggcctacgagagcctgagacccgacaccagatacgtgctgatggacggcagaaaggtgcccaccgacaactacatcaccacctaccccggccagcagaccgcctgcaccgacgacaacgccctggcctactacaacaccaccaagggcggcagattcgtgctggccctgctgagcgacctgcaggacctgaagtgggccagattccccaagagcgacggcaccggcaccatctacaccgagctggagcccccctgcagattcgtgaccgacacccccaagggccccaaggtgaagtacagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacagagacgtggacaccgacttcgtgaacgagttctacgcctacctgacctacaagaacacctgcgacggcaccaccttcacctacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgccgacctgagagtggaggccttcgagtactaccacaccaccgaccccagcttcctgggcagatacatgagcgccctgaaccacaccaagaagtggaagcactacgtgtacatcggcgaccccgcccagctgcccgcccccagcctggagatccccagaagaaacgtggccaccctgcaggccgaggtgctgcagcagctgagagtggagagcagcagcaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgacatcctgctggccaaggacaccgtgcacgccggcaccgacctggagggcaacttctacggccccttcagcatcatcaagaccatccagcccagagtggagaagaagaagctggagaagtactgcgccctggcccccaacatgatggtgaccaacaacaccttcaccctgaagggcggcgcccccaccaaggtgaccttcggctacgtgggctacctgcagcccagaaccttcctgctgaagtacaacggcgacggcaagatgaaggacctgagccccagatggtacttctactacctgggcaccggccccgaggccggcctgccctacggcgccaacaaggacggcatcatctgggtggccaccgagggcgccctgaacacccccaaggaccacatcggcaccagaaaccccgccaacaacgccgccatcgtgctgcagctgccccagggcaccaccctgcccaagggcttctacgccgagggcagcagaggcggcagccaggccagcagcagaagcagcagcagaagcagaaacagcagcagaaacagcacccccggcgagaagtgggagagcggcgtgaaggactgcgtggtgctgcacagctacttcaccagcgactactaccagctgtacagcacccagctgagcaccgacaccggcgtggagcacgtgaccttcttcatctacaacaagatcgtggacgagcccgaggagcacgtgcagatccacaccatcgacggcagcagcggcgtggtgaaccccgtgatggagcccatctacgacgagcccaccaccaccaccagcgtgcccctgagcagcatgggcaccagccccgccagaatggccggcaacggcggcgacgccgccctggccctgctgctgctggacagactgaaccagctggagagcaagatgagcggcaagggccagcagcagcagggccagaccgtgaccaagaagagcgccgccgaggccagcaagaagcccagacagaagagaaccgccaccaaggcctacaacgtgacccaggccttcggcagaagaggccccgagcagacccagggcaacttcggcgaccaggagctgatcagacagggcaccgactacaagcactggccccagatcgcccagttcaagcagggcgagatcaaggacgccacccccctggacttcgtgagagccaccgccaccatccccatccaggccagcctgcccttcggctggctgatcgtgggcgtggccctgctggccgtgttccagagcgccagcaagatcatcaccctgaagaagagatggcagctggccctgagcaagggcgtgcacttcgtgtgcaacctgctgctgctgttcgtgaccgtgtacagccacctgctgctggtggccgccggcctggaggccatgagcgacaacggcccccagaaccagagaaacgcccccagaatcaccttcggcggccccagcgacagcaccggcagcaaccagaacggcgagagaagcggcgccagaagcaagcagagaagaccccagggcctgcccaacaacaccgccagctggttcaccgccctgacccagcacggcaaggagggcctgaagttccccagaggccagggcgtgcccatcaacaccaacagcagccccgacgaccagatcggctactacagaagagccaccagaagaatcagaggcctgttcgccagaaccagaagcatgtggagcttcaaccccgagaccaacatcctgctgaacgtgcccctgcacggcaccatcctgaccagacccctgctggagagcgagctggtgatcggcgccgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccggccaccacctgggcagatgcgacatcaaggacctgcccaaggagcccttcctgtacctgtacgccctggtgtacttcctgcagagcatcaacttcgtgagaatcatcatgagactgtggctgtgctggaagtgcagaagcaagaaccccctgctgtacgacgccaactacttcctgtgctggcacaccaactgctacgactactgcatcccctacaacagcgtgaccagcagcatcgtgatcaccagcggcgacggcaccaccagccccatcagcgagcacgactaccagatcggcggctacaccgcccccagcgccagcgccttcttcggcatgagcagaatcggcatggaggtgacccccagcggcacctggctgacctacaccggcgccatcaagctggacgacaaggaccccaacttcaaggaccaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagaccttcccccccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggcctacgagacccaggccctgccccagagacagaagaagcagcagaccgtgaccctgctgcccgccgccgacctggacgacttcagcaagcagctgcagcagagcatgagcagcgccgacagcacccaggccatcaccgtggccaccagcagaaccctgagctactacaagctgggcgccagccagagagtggccggcgacagcggcttcgccgcctacagcagatacagaatcggcaactacaagctgaacaccgaccacagcagcagcagcgacaacatcgccctgctggtgcagctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgTGATAATAG ＞s-pp-p2a-11_frag (5403 nt) atgttcgtttttctggttctgctgccactcgtgtcaagtcagtgcgtgaaccttactacaaggactcagctcccaccagcatacacgaatagttttacgcggggcgtgtactatccagacaaagtgtttcgcagctctgttctacattcaactcaagacctgtttttgcctttcttctccaatgtgacctggttccacgccatccacgtgagtggcacgaacgggaccaaacggtttgataacccagtgctgccttttaacgacggggtatatttcgcctctactgaaaaatccaacatcatccgcggctggattttcgggaccactcttgactccaagacccagtcactcctgatcgtaaacaatgcgaccaacgtcgtgattaaggtgtgcgagtttcaattctgtaacgaccctttcctgggtgtatattaccacaagaataataagtcctggatggaatcagagtttagagtatactctagcgctaacaactgtacttttgaatatgtgtcccaacccttcttgatggacttggagggaaaacagggaaattttaagaatctccgagagttcgtgtttaaaaacattgacggctatttcaagatatactctaagcatacacccatcaatctggtccgcgatctgccacaggggtttagcgcactggaaccgttggtggatctccccattgggattaatatcacccgtttccagacacttttagccttgcatcggagctacctaacccccggggactcaagtagcggctggactgcgggagcggccgcctattatgtcggatatctgcagcctcggacattcctcctgaagtacaatgagaatggcacaattacagacgcagtagactgtgccctggatccgctctccgaaaccaaatgcacgctgaaatcatttacggtggaaaaaggtatataccagaccagcaatttcagggtgcagcctacggagtccattgtccgtttccccaatatcaccaatctgtgtcctttcggcgaagtgtttaacgcaactaggttcgcgagtgtctacgcctggaaccgaaagagaatctcaaactgtgtggccgattacagcgtcctgtacaactccgcatctttcagtaccttcaagtgctacggggtcagccccaccaaacttaacgatctttgcttcactaacgtttatgccgatagttttgtcatcaggggcgacgaagtgcgacagattgcccctggacagacgggaaagatcgccgactataactataagctgccagacgatttcacaggatgcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggactctaaggtgggggggaattataattatttgtatagactgtttcgaaagtcaaaccttaagccatttgagagggatatcagcacagagatttaccaggcaggaagcaccccatgtaacggggtagaaggcttcaactgctacttccccctccagtcatatgggttccagcctaccaatggtgtgggttaccagccgtacagagtagtggttctttcatttgagctgctgcatgcccctgccaccgtctgcggacctaaaaaatctaccaatttagtgaaaaataagtgcgtgaattttaatttcaacggccttacgggcaccggcgtgctgactgagagcaataagaaattcttaccatttcagcagttcggccgcgacatagctgataccaccgatgcagttcgcgacccccagaccctggagatccttgacatcactccttgcagtttcggaggagtctcggtcatcacacctggaacaaacacatccaaccaggtggcagttctttaccaggatgtgaactgtaccgaagtgccagtggcaatccacgccgatcagttaactcccacctggagagtgtactctacaggctctaacgtcttccagactcgggccggttgccttattggggctgagcacgtgaacaactcctacgagtgcgacatacctattggtgccggcatctgtgccagctaccagacccaaaccaattcgccaaggcgagcgcgttctgtagcaagccagtcgattattgcctacactatgtccttaggtgctgagaactctgtggcttactctaacaactccatagcaattccaacaaactttacaattagtgttactactgaaatcttgcccgtcagcatgactaaaacctctgtcgattgtaccatgtacatttgtggggactctacagagtgcagcaatcttctgctccagtacggctctttttgtacgcagctgaaccgtgctctgactgggattgccgtcgagcaagataagaacacccaggaggtgtttgcccaagttaagcagatttataagacaccacccatcaaagacttcggcggatttaacttttctcagattctgcccgacccctccaagcccagcaagaggagctttatcgaggacctgctgttcaataaggtcacactcgctgatgcaggattcatcaagcagtatggcgattgcctcggagacatcgctgcgagagacctcatatgcgctcagaaattcaatggcctgacggtgctacctccgctactgactgacgaaatgatagctcagtacacgtcggctctcttggccggaacaatcacctccggatggacctttggcgcgggagcagcactacagatcccttttgcaatgcaaatggcttaccggttcaatggcataggggtaactcaaaatgtgctgtacgagaaccaaaaattgatcgctaaccagttcaacagcgccattgggaagatccaggattctttgtcctcaaccgccagtgcattgggcaagctccaggacgtcgttaaccagaacgctcaggccttaaacacgctggtcaaacagttgtcctccaattttggcgctatatccagcgttctcaatgatatcctttcccgcttagatccaccagaagctgaggtccaaattgataggttaataaccggcagactccagagcctgcaaacttacgtcacccagcaactcatacgcgccgcggagatccgcgctagcgcaaacctagctgccactaaaatgagtgagtgtgttctcggacagtctaagcgggtggacttttgcggcaaaggctatcacctcatgagcttcccccaaagcgcaccacatggcgttgtgttcttgcacgtgacttacgttcccgcacaggagaaaaatttcaccacagcccccgccatctgccatgatgggaaagctcattttccacgagaaggggtgttcgtgtcaaacggtacacactggtttgtcacacaaagaaatttttatgaacctcaaattatcacaactgacaataccttcgtgagcggaaactgtgatgtcgtaattgggatcgtaaacaacactgtgtatgacccccttcagcccgaactggacagtttcaaggaagagcttgacaagtatttcaagaaccatacttcaccagacgtagaccttggtgatatttcaggaatcaacgctagtgtggtgaacatccagaaagaaattgatcgcctcaatgaggtcgcgaaaaatctgaatgagtctctgatcgacctgcaagagttggggaagtacgaacagtatattaaatggccctggtacatttggctgggatttatagctggactcattgccattgttatggtcacaataatgctgtgttgcatgactagctgttgctcatgcctaaaagggtgctgcagttgcggctcctgttgcaagtttgatgaagacgatagcgagccggtccttaaaggcgttaagctacattatactagggctaagagatccggcagtggggcgaccaactttagcttgttgaagcaagcaggggacgtggaagaaaaccccggcccttacgccctagtgtactttctgcagtccattaacttcgttcggattatcatgaggttgtggctgtgttggaagtgtcggtcgaagaatccactcctgtacgatgcaaattactttctgtgctggcacggagacggcaaaatgaaagacctgtccccgagatggtatttttattatctgggtaccggtcccgaggcggggctgccctacggggcaaacaaagacggaatcatctgggtcgcaacagagggagctcttaatacacctaaagatcacattggcacccgcaatcccgagaagtactgtgccctggcccccaatatgatggtgacaaataacacctttacattaaagggcggggccccaaccaaggtgacattcggtacatacaagaatacctgtgacggcacaacgttcacgtatgcaagcgctctgtgggagatccaacaggtggtggacgccgacctgaatgaaagtctgattgatctccaggaactcggcaaatatgagcagtatatcaagtggccttggtacatctggctcggttttatcgctggtcttatcgccatcgtgatggtgcagactgcttgcaccgatgataatgcactcgcgtactacaacaccacaaaaggaggacgatttgtgctagccctgctcagtgatctgcaagatctcaaatgggcccgcttcccgaagtccgatggaaccggcacaatctatacagaattggaacctccttgtaggttcgtgaccgatactcccaagggtcccaaggtaaaatacctgcgggtagaagcttttgaatactaccacactactgacccatcttttctgggcagatatatgtctgcattaaatcacaccaaaaagtggataacagtggccacctcccggacactgtcatactataaactgggtgcatcccagcgggttgctggtgattccggattcgccgcctattcgcggtatagaatagggaattacaagttgaataccgaccactccagttctagtgataacatagccctgctggttcaggttcttcagcagctgagagtagaatcttccagcaagctgtgggcccagtgtgttcaactccacaatgatattttactcgccaaggacactgcaccgtcagcctctgccttcttcgggatgtctcgtattggtatggaggttactcctagcggcacatggctgacgtacaccggggctataaagttggacgacaaggacccaaacttcaaggaccaagtgatcttactgaacaaacatatcgatgcttataagacattccctcctactgagcctaaaaaagataaatcaaagctcattgagtacacagattttgctacaagcgcttgtgtcctggcggccgagtgcaccatcttcaaagacgctagtggcaagcccgtgccgtattgctatgacaccaatgtgctcgagggttcagtcgcctatgagtcattaaggccagatacgaggtacgtcctaatggatgggTAG ＞YP_009724389 (SARS-CoV-2 ORF1a/b蛋白) ＞YP_009724390 (SARS-CoV-2 S蛋白) ＞YP_009724397 (SARS-CoV-2 N蛋白) ＞YP_009724391 (SARS-CoV-2 orf3a蛋白) ＞ YP_009724393.1 (SARS-CoV-2 M蛋白) ＞ YP_009724395.1 (SARS-CoV-2 orf7a蛋白) * 表2中包括核酸序列，其全長與編碼表1A-1K中之任一者中列出的多肽之核酸或其部分具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性或者其間任何範圍(包括其)，諸如85-99%一致性。此類核酸序列可編碼具有如本文進一步描述之全長肽或多肽之一或多種功能的多肽且亦可表示RNA核酸分子(例如，經尿苷置換之胸腺嘧啶)。
在一些實施例中，本文提供orf1a/b多肽及/或編碼orf1a/b多肽之核酸。Orf1a/b多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於orf1a/b多蛋白之胺基酸序列及/或該orf1a/b胺基酸序列中具有足以引出orf1a/b特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，orf1a/b多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含orf1a/b胺基酸序列及對應於非orf1a/b蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，orf1a/b多肽僅包括對應於orf1a/b多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在一些實施例中，orf1a/b多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之orf1a/b蛋白胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之orf1a/b之胺基酸序列一致。在一些實施例中，orf1a/b多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之orf1a/b肽抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供S蛋白多肽及/或編碼S蛋白多肽之核酸。S蛋白多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於S蛋白多蛋白之胺基酸序列及/或該S蛋白胺基酸序列中具有足以引出S蛋白特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，S蛋白多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含S蛋白胺基酸序列及對應於非S蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，S蛋白多肽僅包括對應於S蛋白多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在某些實施例中，S蛋白多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之S蛋白胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或1250個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之S蛋白之胺基酸序列一致。在一些實施例中，S多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之S肽抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供N蛋白多肽及/或編碼N蛋白多肽之核酸。N蛋白多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於N蛋白多蛋白之胺基酸序列及/或該N蛋白胺基酸序列中具有足以引出N蛋白特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，N蛋白多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含N蛋白胺基酸序列及對應於非N蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，N蛋白多肽僅包括對應於N蛋白多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在某些實施例中，N蛋白多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之N蛋白胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之N蛋白之胺基酸序列一致。在一些實施例中，N多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之N肽抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供M蛋白多肽及/或編碼M蛋白多肽之核酸。M蛋白多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於M蛋白多蛋白之胺基酸序列及/或該M蛋白胺基酸序列中具有足以引出M蛋白特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，M蛋白多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含M蛋白胺基酸序列及對應於非M蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，M蛋白多肽僅包括對應於N蛋白多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在某些實施例中，M蛋白多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之M蛋白胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之M蛋白之胺基酸序列一致。在一些實施例中，M多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之M肽抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供orf3a多肽及/或編碼orf3a多肽之核酸。Orf3a多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於orf3a多蛋白之胺基酸序列及/或該orf3a胺基酸序列中具有足以引出orf3a特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，orf3a多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含orf3a胺基酸序列及對應於非orf3a蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，orf3a多肽僅包括對應於orf3a多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在某些實施例中，orf3a多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之orf3a胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之orf3a蛋白之胺基酸序列一致。在一些實施例中，orf3a多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之orf3a肽抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供orf7a多肽及/或編碼orf7a多肽之核酸。Orf7a多肽係包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列對應於orf7a多蛋白之胺基酸序列及/或該orf7a胺基酸序列中具有足以引出orf7a特异性免疫反應的長度之一部分。在某些實施例中，orf7a多肽亦包括不對應於該胺基酸序列之胺基酸(例如，包含orf7a胺基酸序列及對應於非orf7a蛋白或多肽之胺基酸序列之融合蛋白)。在一些實施例中，orf7a多肽僅包括對應於orf7a多蛋白或其片段之胺基酸序列。
在某些實施例中，orf7a多肽具有包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的胺基酸序列：表1K中闡述之orf7a胺基酸序列之至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110或120個連續胺基酸。在一些實施例中，該等連續胺基酸與表1K中闡述之orf7a蛋白之胺基酸序列一致。在一些實施例中，orf7a多肽包含一或多個選自由以下組成之群的肽抗原決定基，基本上由該等肽抗原決定基組成，或由該等肽抗原決定基組成：表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之orf7a肽抗原決定基。
如熟習此項技術者所熟知，具有顯著序列相似性之多肽可在宿主動物中引起一致或非常相似的免疫反應。因此，在一些實施例中，本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽或其片段之衍生物、等效物、變異體、片段或突變體亦可適用於本文所提供之方法及組合物。
在一些實施例中，本文提供SARS-CoV-2免疫原性多肽之變化形式或衍生物。改變之多肽可具有例如藉由保守取代改變之胺基酸序列，但仍然引出與未改變蛋白抗原反應之免疫反應，且被視為功能等效物。如本文所使用，術語「保守取代」表示胺基酸殘基由另一生物學相似殘基置換。此項技術中已熟知，同一保守基團內之胺基酸通常可彼此替代而不實質上影響蛋白質之功能。根據某些實施例，SARS-CoV-2免疫原性肽之配位體結合域之衍生物、等效物、變異體或突變體係與本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽或其片段之序列至少85%同源的多肽。在一些實施例中，同源性為至少90%、至少95%、至少98%或更高。
本發明所涵蓋之免疫原性肽可包含源自SARS-CoV-2蛋白之肽抗原決定基，諸如表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中列出之彼等肽抗原決定基。在一些實施例中，免疫原性肽為8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸長。在一些實施例中，肽胺基酸序列係經修飾，其可包括保守或非保守突變。肽可包含至多1、2、3、4個或更多個突變。在一些實施例中，肽可包含至少1、2、3、4個或更多個突變。
在一些實施例中，肽可經化學修飾。舉例而言，可使肽發生突變以修飾肽特性，諸如可偵測性、穩定性、生物分佈、藥物動力學、半衰期、表面電荷、疏水性、結合位點、pH、功能及其類似特性。N-甲基化係可在本發明所涵蓋之肽中發生的甲基化之一個實例。在一些實施例中，可藉由對游離胺進行甲基化，諸如藉由用甲醛及氰基硼氫化鈉進行還原甲基化來修飾肽。
化學修飾可包含聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、兩性離子聚合物、聚胺基酸、脂肪酸、樹枝狀聚合物、Fc區、簡單飽和碳鏈(諸如棕櫚酸酯或肉豆蔻酸酯)或白蛋白。具有Fc區之肽之化學修飾可為融合Fc-肽。聚胺基酸可包括例如具有重複之單個胺基酸之聚胺基酸序列(例如聚甘胺酸)，及具有可遵循或可不遵循模式之混合聚胺基酸序列之聚胺基酸序列，或前述的任何組合。在一些實施例中，本發明所涵蓋之肽可經修飾，使得該修飾增加肽之穩定性及/或半衰期。在一些實施例中，可使用疏水部分之附接(諸如至N端、C端或內部胺基酸)來延長本發明所涵蓋之肽的半衰期。在其他實施例中，肽可包括轉譯後修飾(例如，甲基化及/或醯胺化)，其可影響例如血清半衰期。在一些實施例中，簡單碳鏈(例如，藉由肉豆蔻醯化及/或棕櫚醯化)可與融合蛋白或肽結合。在一些實施例中，簡單碳鏈可使融合蛋白或肽易於與未結合材料分離。舉例而言，可用於使融合蛋白或肽與未結合材料分離之方法包括但不限於溶劑萃取及逆相層析。親脂部分可經由與血清白蛋白可逆結合來延長半衰期。經結合部分可為經由與血清白蛋白可逆結合來延長肽之半衰期的親脂部分。在一些實施例中，親脂部分可為膽固醇或膽固醇衍生物，包括膽甾烯、膽甾烷、膽甾二烯及氧化膽固醇。在一些實施例中，肽可與肉豆蔻酸(十四酸)或其衍生物結合。在其他實施例中，肽可與半衰期修飾劑偶合(例如，結合)。半衰期修飾劑之實例包括但不限於：聚合物，聚乙二醇(PEG)，羥乙基澱粉，聚乙烯醇，水溶性聚合物，兩性離子水溶性聚合物，水溶性聚(胺基酸)，脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物，含有甘胺酸、麩胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物，Fc區，脂肪酸，棕櫚酸，或與白蛋白結合之分子。在一些實施例中，間隔子或連接子可偶合至肽，諸如1、2、3、4個或更多個用作間隔子或連接子之胺基酸殘基，以便促進與另一分子之結合或融合，以及促進肽自此類結合或融合分子裂解。在一些實施例中，融合蛋白或肽可與例如可修飾或影響肽之特性之變化的其他部分結合。
肽可與用於成像、研究、治療、治療診斷學、醫藥學、化學療法、螯合療法、靶向藥物遞送及放射療法之劑結合。在一些實施例中，肽可與可偵測劑結合或融合，該等劑諸如螢光團、近紅外染料、對比劑、奈米粒子、含金屬奈米粒子、金屬螯合物、X射線對比劑、PET劑、金屬、放射性同位素、染料、放射性核素螯合劑或可用於成像之另一合適材料。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個可偵測部分可連接至肽。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212。在一些實施例中，近紅外染料不容易由生物組織及流體淬滅。在一些實施例中，螢光團係發射波長在650 nm與4000 nm之間的電磁輻射之螢光劑，此類發射係用於偵測此類劑。可用作結合分子之螢光染料之非限制性實例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800或靛青綠(ICG)。在一些實施例中，近紅外染料通常包括花青染料(例如，Cy7、Cy5.5及Cy5)。用作本發明所涵蓋之結合分子的螢光染料之額外非限制性實例包括吖啶橙或吖啶黃、Alexa Fluor (例如，Alexa Fluor 790、750、700、680、660及647)及其任何衍生物、7-放線菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料及其任何衍生物、金胺-若丹明染色劑及其任何衍生物、苯蒽酮(bensantrhone)、比曼恩(bimane)、9-10-雙(苯基乙炔基)蒽、5,12-雙(苯基乙炔基)萘、雙苯甲醯亞胺、腦彩虹、鈣黃綠素、羧基螢光素(carbodyfluorescein)及其任何衍生物、1-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight Fluor及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙錠、FlAsH-EDT2、Fluodye及其任何衍生物、FluoProbe及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、Fura及其任何衍生物、GelGreen及其任何衍生物、GelRed及其任何衍生物、螢光蛋白及其任何衍生物、m同型蛋白及其任何衍生物(諸如mCherry)、赫他明(hetamethine)染料及其任何衍生物、郝思特(hoeschst)染色劑、亞胺基香豆素(iminocoumarin)、印度黃、indo-1及其任何衍生物、來若丹(laurdan)、螢光黃及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、螢光素酶及其任何衍生物、部花青(mercocyanine)及其任何衍生物、尼羅(nile)染料及其任何衍生物、苝、焰红染料、藻染料(phycodye)及其任何衍生物、碘化丙啶、比染因(pyranine)、若丹明及其任何衍生物、核糖綠(ribogreen)、RoGFP、紅螢烯、二苯乙烯及其任何衍生物、磺醯若丹明(sulforhodamine)及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、tris四鈉、Texas Red、Titan Yellow、TSQ、繖形酮、紫蒽酮、黃色螢光蛋白及YOYO-1。其他合適螢光染料包括但不限於螢光素及螢光素染料(例如，异硫氰酸螢光素或FITC、萘基螢光素、4', 5'-二氯-2',7'-二甲氧基螢光素、6-羧基螢光素或FAM等)、羧花青、部花青、苯乙烯染料、氧雜菁染料(oxonol dye)、藻紅蛋白、紅螢素、曙紅、若丹明染料(例如，羧基四甲基-若丹明或TAMRA、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、麗絲胺若丹明B (lissamine rhodamine B)、若丹明6G、若丹明綠、若丹明紅、四甲基若丹明(TMR)等)、香豆素及香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基胺基香豆素、羥基香豆素、胺基甲基香豆素(AMCA)等)、Oregon Green染料(例如，Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514等)、Texas Red、Texas Red-X、SPECTRUM RED、SPECTRUM GREEN、花青染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、ALEXA FLUOR染料(例如，ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、A LEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680等)、BODIPY染料(例如，BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRDye (例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)及其類似物。額外合適之可偵測劑描述於PCT/US14/56177中。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212。
肽可與放射增敏劑或光敏劑結合。放射增敏劑之實例包括但不限於：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、太平洋紫杉醇、卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、吉西他濱、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明及核酸鹼基衍生物(例如，鹵化嘌呤或嘧啶，諸如5-氟去氧尿苷)。光敏劑之實例包括但不限於：發光時産生熱之螢光分子或珠粒、奈米粒子、卟啉及卟啉衍生物(例如，二氫卟酚、細菌綠素(bacteriochlorin)、异細菌綠素、酞青及萘酞青)、金屬卟啉、金屬酞青、白芷素、硫屬元素哌喃鹽染料(chalcogenapyrrillium dye)、葉綠素、香豆素、黃素及相關化合物(諸如咯嗪及核黃素)、富勒烯(fullerene)、去鎂葉綠素酸(pheophorbide)、焦去鎂葉綠素酸、花青(例如，部花青540)、去鎂葉綠素、藍寶石、特沙弗林(texaphyrin)、紫紅素(purpurin)、卟啉烯、吩噻嗪鎓(phenothiazinium)、亞甲藍衍生物、萘二甲醯亞胺、尼羅藍衍生物、醌類、苝醌(例如金絲桃素(hypericin)、竹紅菌素(hypocrellin)及尾孢菌素(cercosporin))、補骨脂素(psoralen)、醌類、類視色素(retinoid)、若丹明、噻吩、威爾丁(verdin)、呫噸染料(xanthene dye) (例如曙紅、紅螢素、孟加拉玫紅)、卟啉之二聚物及寡聚物形式，以及諸如5-胺基乙醯丙酸之前藥。有利地，此方法允許同時使用治療劑(例如，藥物)及電磁能(例如，輻射或光)兩者對所關注細胞(例如，免疫細胞)進行高特异性靶向。在一些實施例中，該肽與該劑融合，或與該劑共價或非共價連接，例如直接連接或經由連接子連接。
肽可諸如藉由固相肽合成或溶液相肽合成而以重組或合成方式産生。可藉由已知合成方法，諸如使用茀基甲氧羰基(Fmoc)化學或藉由丁氧羰基(Boc)化學來執行肽合成。肽片段可以酶或合成方式接合在一起。
在一些實施例中，本文提供編碼本文所述之SARS-CoV-2免疫原性多肽或其片段之核酸，諸如編碼SARS-CoV-2免疫原性肽之DNA分子。在一些實施例中，該組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽或其片段之開放閱讀框。在一些實施例中，該核酸包括表現開放閱讀框所必需之調控元件。此類元件可包括例如啟動子、起始密碼子、終止密碼子及聚腺苷酸化信號。另外，可包括增强子。此等元件可與編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽或其片段之序列可操作性連接。
啟動子之實例包括但不限於來自猿病毒40 (SV40)之啟動子；小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；來自人類免疫缺乏病毒(HIV)之啟動子，諸如HIV長末端重複序列(LTR)啟動子；來自莫洛尼病毒之啟動子；來自巨細胞病毒(CMV)之啟動子，諸如CMV即刻早期啟動子；來自Epstein Barr病毒(EBV)之啟動子；來自勞斯肉瘤病毒(RSV)之啟動子；以及來自諸如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸及人類金屬硫蛋白之人類基因的啟動子。合適聚腺苷酸化信號之實例包括但不限於SV40聚腺苷酸化信號及LTR聚腺苷酸化信號。
除了表現所需之調控元件以外，核酸分子中亦可包括其他元件。此類額外元件包括增强子。增强子包括上文所述之啟動子。較佳增强子/啟動子包括例如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸及病毒增强子，諸如來自CMV、RSV及EBV之彼等增强子/啟動子。
在一些實施例中，可單獨使用核酸(例如，呈裸核酸形式)或如下文進一步描述，將核酸可操作性併入載劑或遞送載體中。可用遞送載體包括但不限於生物可降解微膠囊、免疫刺激複合物(ISCOM)或脂質體以及經遺傳工程改造之减毒活載劑，諸如病毒或細菌。
在一些實施例中，載體為病毒載體，諸如慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘瘡病毒、桿狀病毒、鷄痘(Fowl pox)病毒、禽痘(AV-pox)病毒、經修飾安卡拉痘瘡(MVA)病毒及其他重組病毒。舉例而言，慢病毒載體可用於感染T細胞。 III. 核酸、載體及細胞
本發明之另一目的係關於編碼所述之免疫原性多肽、SARS-CoV-2免疫原性肽及其片段、MHC分子以及TCR及其片段的核酸序列。在一些態樣中，本文揭示藉由包裝於用於細胞內抗原表現之最佳免疫顯性抗原決定基中而使載體尺寸對T細胞反應功效增至最大的核酸載體構築體。一般而言，如下文進一步描述，本發明所涵蓋之核酸(無論裸核酸抑或併入載體內)可為直接疫苗構築體(或用於製造該等構築體之載體)，包括mRNA (或者產生mRNA之活體外轉錄表現載體)、用作DNA疫苗之哺乳動物表現載體及其類似物。本發明所涵蓋之核酸可出於某些目的，諸如人類個體中之高表現而經密碼子最佳化。本發明所涵蓋之核酸可經工程改造以具有高鳥嘌呤及胞嘧啶(G-C)含量，諸如至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高一致性或者其間任何範圍(包括其)，諸如60-70% G-C含量。
在一特定實施例中，本發明係關於一種編碼本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽之核酸序列。在一特定實施例中，本發明係關於一種編碼本文所述之免疫原性多肽之核酸序列。
通常，該核酸為DNA (例如，cDNA)或RNA (例如，mRNA)分子，其可呈鹼性或包括於任何合適載體，諸如質體、黏質體、游離基因體、人工染色體、噬菌體、病毒或病毒載體中。
此類鹼性核酸可為「初級構築體」，諸如初級mRNA構築體，其係指編碼一或多種所關注多肽且保留足以允許轉譯其中編碼之所關注多肽之結構及/或化學特徵的聚核苷酸轉錄本。初級構築體可為本發明所涵蓋之聚核苷酸。當經結構或化學修飾時，該初級構築體可稱作經修飾核酸，諸如經修飾mRNA。除多肽編碼序列以外，核酸構築體亦可包含此項技術中熟知之序列，諸如加帽序列、拖尾序列、環化序列及其類似序列。例如，拖尾序列可介於不存在至500個核苷酸長之範圍內(例如，至少60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個核苷酸)。在拖尾序列為聚腺苷酸尾時，可以聚腺苷酸結合蛋白結合為單位或隨聚腺苷酸結合蛋白結合而變來確定長度。在此實施例中，聚腺苷酸尾足夠長以結合至少4個聚腺苷酸結合蛋白單體。聚腺苷酸結合蛋白單體與大約38個核苷酸之延伸段結合。因而，已觀察到約80個核苷酸及160個核苷酸之聚腺苷酸尾具功能性。加帽區可包含單一帽或形成該帽之一系列核苷酸。在此實施例中，加帽區可為1至10個(例如，2-9、3-8、4-7、1-5、5-10個或至少2個或10個或更少個核苷酸長)。在一些實施例中，該帽不存在。因此，本發明所涵蓋之核酸可因此包含2至40個或更多個(例如，2-19、2-28個等)之蛋白編碼區，且可進一步包含一或多個本文所述之額外元件，諸如起始及/或終止密碼子、轉譯序列、內部核糖體進入序列、蛋白裂解序列、信號序列、加帽序列、拖尾序列、限制序列、自複製序列及其類似元件。在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸可諸如經由此項技術中熟知之化學、酶及/或核酶催化方式經環化及/或多聯體化。新近形成之5'-/3'-鍵聯可為分子內或分子間的。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸係自複製的，諸如自複製RNA，如mRNA。RNA之大量產生具有成本效益且可由來自商業合成之DNA前驅體之任何既定的已發現序列以幾乎同一天快速性產生，而無內毒素。它一般比DNA更安全且更容易投與，因為它不會造成基因組整合風險，且僅需要進入細胞質即可起作用。此外，由於基於α病毒或黃病毒基因組可獲得自複製RNA (repRNA)，可使用極低劑量來實現最大免疫原性及抗原產生水準。在一些實施例中，repRNA係缺乏後代病毒粒子之產生所需的病毒結構蛋白之減毒病毒基因組，但保留轉譯及複製能力且因此可有效增加RNA轉譯之半衰期。舉例而言，相對於將等莫耳量之編碼一或多種外源基因之習知mRNA遞送至細胞所產生的轉譯及表現，將編碼一或多種外源基因之RepRNA遞送至細胞可以有效地增加該等外源基因在該等細胞中之轉譯及表現。在一些實施例中，RepRNA為非致細胞病變性RepRNA。在一些實施例中，repRNA為α病毒自擴增repRNA (例如，包括5'帽；5'非轉譯區(5' UTR)、在第一開放閱讀框內編碼之非結構基因(例如，NSP1-4)、基因組啟動子區(例如，26S亞基因組啟動子)、第二開放閱讀框、3'非轉譯區(3' UTR)及3'聚腺苷酸化尾。repRNA分子通常在9,000與20,000個核苷酸之間長，視經編碼基因序列之尺寸而定)。非結構基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。通常，RdRp不耐受用於保護習知RNA免受核酸內切酶及自催化降解之經典核苷酸修飾。因此，奈米囊封(例如，奈米粒子、脂質、脂質奈米粒子、陽離子分子、聚合物及其類似物)可用於表現平台之有效部署。repRNA係模塊化的且開放閱讀框可經工程改造以適應所關注之外源序列。當repRNA沈積於宿主細胞之細胞質中時，由repRNA NS基因編碼之RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)在該細胞內表現。該RdRp接著可複製整個repRNA，或者僅複製repRNA編碼抗原之RdRp複本(亦即，藉助於亞基因組啟動子)。複製子RNA增加RNA介導之基因遞送的總體效率，因為repRNA可合成全長複製子之更多複本，以及編碼包括於第二開放閱讀框內之基因的mRNA之更多複本。宿主細胞核糖體繼續轉譯全長複製子複本或較短的僅抗原mRNA，導致增強由repRNA編碼之基因之表現。
為了進一步增強蛋白質產生，可將本發明所涵蓋之核酸設計為與其他聚核苷酸、染料、嵌入劑(例如，吖啶)、交聯劑(例如，補骨脂素及絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林及藍寶石)、多環芳烴(例如，啡嗪及二氫啡嗪)、人工核酸內切酶(例如，EDTA)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG (例如，PEG-40K)、MPEG、MPEG 2、聚胺基、烷基、經取代烷基、經放射性標記之標記物、酶、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹靈、維生素E及葉酸)、合成核糖核酸酶、蛋白質(例如，醣蛋白)或肽(例如，對共配位體具有特定親和力之分子)或抗體(例如，與諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞之特定細胞類型結合的抗體)、激素及激素受體及/或非肽物質(例如，脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子及藥物)結合。本發明所涵蓋之核酸的代表性實例描述於本文中，諸如工作實例及圖中，且係此項技術中熟知的(至少參見美國專利公開案2020/0354423、美國專利公開案2020/0254086及美國專利公開案2020/0155660)。
術語「載體」、「選殖載體」及「表現載體」意謂藉由該媒劑可將DNA或RNA序列(例如，外來基因)引入至宿主細胞中，以便轉化宿主且促進所引入序列之表現(例如，轉錄及轉譯)。因此，本發明所涵蓋之另一目的係關於一種包含本發明所涵蓋之核酸的載體。
此類載體可包含調控元件，諸如啟動子、增强子、終止子及其類似物，以在向個體投與後引起或引導該多肽之表現。用於動物細胞表現載體之啟動子及增强子的實例包括SV40之早期啟動子及增强子(Mizukami T等人 1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒之LTR啟動子及增强子(Kuwana Y等人 1987)、免疫球蛋白H鏈之啟動子(Mason J O等人 1985)及增强子(Gillies S D等人 1983)及其類似物。
可使用任何動物細胞表現載體。合適載體之實例包括pAGE107 (Miyaji H等人 1990)、pAGE103 (Mizukami T等人 1987)、pHSG274 (Brady G等人 1984)、pKCR (O'Hare K等人 1981)、pSG1 β d2-4-(Miyaji H等人 1990)及其類似物。質體之其他代表性實例包括包含複製起點之複製質體，或整合質體，諸如pUC、pcDNA、pBR及其類似物。病毒載體之代表性實例包括腺病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒及AAV載體。此類重組病毒可藉由此項技術中已知的技術産生，諸如藉由轉染包裝細胞或藉由用輔助質體或病毒瞬時轉染產生。病毒包裝細胞之典型實例包括PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv陽性細胞、293細胞等。用於産生此類複製缺陷型重組病毒之詳細方案可見於例如WO 95/14785、WO 96/22378、美國專利第5,882,877號、美國專利第6,013,516號、美國專利第4,861,719號、美國專利第5,278,056號及WO 94/19478中。在一些實施例中，可使用基於病毒載體之平台。代表性、非限制性實例包括牛痘、禽痘、自複製α病毒、馬拉巴病毒、腺病毒及慢病毒，包括但不限於第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒以及經設計以靶向特定細胞類型或受體之任一代重組慢病毒(至少參見Hu等人 (2011) Immunol Rev.239:45-61，Sakuma等人 (2012) Biochem J.443:603-618，Cooper等人 (2015) Nucl. Acids Res.43:682-690，Zufferey等人 (1998) J. Virol.72:9873-9880，及美國專利公開案2020/0010849)。
本發明之另一目的係關於一種已由根據本發明之核酸及/或載體轉染、感染或轉化之細胞。術語「轉化」意謂將「外來」(亦即，外部或細胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞，使得宿主細胞將表現所引入之基因或序列，從而産生所需物質，通常為由所引入之基因或序列編碼之蛋白質或酶。接收且表現所引入之DNA或RNA之宿主細胞已「經轉化」。
本發明所涵蓋之核酸可用於在合適表現系統中産生本發明所涵蓋之重組多肽。術語「表現系統」意謂在合適條件下之宿主細胞及相容性載體，例如用於表現由載體所携帶且引入至宿主細胞之外來DNA編碼之蛋白質。
常見表現系統包括大腸桿菌宿主細胞及質體載體、昆蟲宿主細胞及桿狀病毒載體以及哺乳動物宿主細胞及載體。宿主細胞之其他實例包括但不限於原核細胞(諸如細菌)及真核細胞(諸如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)。特定實例包括大腸桿菌；克魯維酵母屬( Kluyveromyces)或酵母屬( Saccharomyces)酵母；哺乳動物細胞株(例如，Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞等)；以及初代或所建立之哺乳動物細胞培養物(例如，由淋巴母細胞、纖維母細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等産生)。實例亦包括小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(下文稱為「DHFR基因」)缺陷型CHO細胞(Urlaub G等人；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL 1662，下文稱為「YB2/0細胞」)及其類似細胞。YB2/0細胞為較佳的，因為當在此細胞中表現時，嵌合或人源化抗體之ADCC活性有所增强。
本發明亦係關於一種根據本發明産生表現本發明所涵蓋之SARS-CoV-2免疫原性肽及其片段、MHC分子以及TCR及其片段之重組宿主細胞的方法，該方法包含由以下組成之步驟：(i)將如上文所述之重組核酸或載體活體外或離體引入至勝任宿主細胞中，(ii)活體外或離體培養所獲得的重組宿主細胞，及(iii)視情況，選擇表現該等SARS-CoV-2免疫原性肽及其片段、MHC分子以及TCR及其片段之細胞。此類重組宿主細胞可用於本發明所涵蓋之診斷、預後及/或治療方法。
在另一態樣中，本發明提供在選擇性雜交條件下與本文所揭示之聚核苷酸雜交的經分離核酸。因此，此實施例之聚核苷酸可用於分離、偵測及/或定量包含此類聚核苷酸之核酸。舉例而言，本發明所涵蓋之聚核苷酸可用於鑑別、分離或擴增寄存文庫中之部分或全長純系。在一些實施例中，該等聚核苷酸係自人類或哺乳動物核酸文庫分離或以其他方式與來自該文庫之cDNA互補的基因組序列或cDNA序列。較佳地，cDNA文庫包含至少80%之全長序列，較佳地至少85%或90%之全長序列，且更佳地至少95%之全長序列。可使該等cDNA文庫標準化以增加稀有序列之表示。低嚴格度或中等嚴格度雜交條件通常但非排他地用於相對於互補序列具有降低之序列一致性的序列。中等嚴格度及高嚴格度條件可視情況用於具更高一致性之序列。低嚴格度條件允許選擇性雜交具有約70%序列一致性之序列，且可用於鑑別異種同源或同種同源序列。視情況，本發明所涵蓋之聚核苷酸將編碼由本文所述之聚核苷酸編碼的抗體之至少一部分。本發明所涵蓋之聚核苷酸包括可用於與編碼本發明所涵蓋之抗體之聚核苷酸選擇性雜交的核酸序列。參見例如Ausubel, 同上；Colligan, 同上，各自完整地以引用之方式併入本文中。 IV. MHC- 肽複合物
在某些態樣中，本文提供包含本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽及MHC分子之組合物。在一些實施例中，SARS-CoV-2免疫原性肽與MHC分子形成穩定複合物。
在本發明所涵蓋之組合物及方法中提供且使用之MHC蛋白可為此項技術中已知的任何合適MHC分子。一般而言，該等分子具有式(α-β-P) n，其中n至少為2，例如在2-10之間，例如4。α為I類或II類MHC蛋白之α鏈。β係本文中定義為II類MHC蛋白之β鏈或MHC I類蛋白之β 2微球蛋白的β鏈。P為肽抗原。
在一些實施例中，MHC蛋白為MHC I類複合物，諸如HLA I複合物。
MHC蛋白可來自任何哺乳動物或鳥類物種，例如靈長類物種，尤其人類；嚙齒動物，包括小鼠、大鼠及倉鼠；兔；馬、牛、犬、猫等。舉例而言，MHC蛋白可源自人類HLA蛋白或鼠科動物H-2蛋白。HLA蛋白包括II類亞單元HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα及HLA-DRβ，及I類蛋白HLA-A、HLA-B、HLA-C，以及β2-微球蛋白。H-2蛋白包括I類亞單元H-2K、H-2D、H-2L，及II類亞單元I-Aα、I-Aβ、I-Eα及I-Eβ，以及β2-微球蛋白。一些代表性MHC蛋白之序列可見於Kabat等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH公開案第91-3242號, 第724-815頁中。適合根據本發明使用之MHC蛋白亞單元係正常膜結合蛋白之可溶性形式，其如此項技術中已知來製備，例如藉由跨膜域及細胞質域之缺失來製備。
對於I類蛋白，可溶性形式可包括α1、α2及α3域。可溶性II類亞單元可包括α亞單元之α1及α2域，以及β亞單元之β1及β2域。
α及β亞單元可分開産生且允許活體外締合以形成穩定异源雙股複合物，或兩個亞單元可在單一細胞中表現。用於産生MHC亞單元之方法係此項技術中已知的。
在某些實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1A之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-A*02血清型的MHC，諸如由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260及/或HLA-A*0274等位基因編碼之MHC。在其他實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1C之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-A*03血清型之MHC，諸如由HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305及/或HLA-A*0307等位基因編碼之MHC。在其他實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1B之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-A*01血清型之MHC，諸如由HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103及/或HLA-A*0116等位基因編碼之MHC。在其他實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1D之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-A*11血清型之MHC，諸如由HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105及/或HLA-A*1119等位基因編碼之MHC。在其他實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1E之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-A*24血清型之MHC，諸如由HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426及/或HLA-A*2458等位基因編碼之MHC。在其他實施例中，MHC-肽複合物包含選自表1F之肽抗原決定基以及α鏈具有HLA-B*07血清型之MHC，諸如由HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及/或HLA-B*0721等位基因編碼之MHC。
為了製備MHC-肽複合物，該等亞單元可與抗原肽組合，且允許活體外折疊以形成具有鏈內二硫鍵鍵結域之穩定异源二聚體複合物。肽可包括於初始折疊反應中，或可在隨後步驟中添加至空的异源二聚體中。在本發明所涵蓋之組合物及方法中，此肽為SARS-CoV-2免疫原性肽或其片段。允許亞單元及肽之折疊及締合之條件係此項技術中已知的。作為一個實例，可將大致等莫耳量之經溶解α及β亞單元混合在脲溶液中。藉由稀釋或透析至不含脲之經緩衝溶液中來起始再折疊。可在約pH 5至5.5下將肽裝載至空的II類异源二聚體中持續約1至3天，接著進行中和、濃縮及緩衝液交換。然而，特定折疊條件對於本發明之實踐并非關鍵的。
單體複合物(α-β-P) (本文為單體)可經多聚化，例如MHC四聚體。所得多聚體在較長時段內穩定。較佳地，可藉由使單體經由α或β亞單元上之特定附接位點與多價實體結合來形成多聚體，如此項技術中已知(例如，如美國專利第5,635,363號中所述)。無論單體形式抑或多聚體形式，MHC蛋白亦可與珠粒或任何其他支撐物結合。
多聚體複合物可經標記，以便在用於免疫染色或此項技術中已知之其他方法時可直接進行偵測，或可如此項技術中已知與特异性結合該複合物(例如，與MHC蛋白亞單元結合)之第二經標記免疫試劑聯合使用。舉例而言，可偵測標記可為螢光團，諸如异硫氰酸螢光素(FITC)、若丹明、Texas Red、藻紅蛋白(PE)、異藻藍蛋白(APC)、Brilliant Violet™ 421、Brilliant UV TM395、Brilliant Violet TM480、Brilliant Violet TM421 (BV421)、Brilliant Blue TM515、APC-R700或APC-Fire750。在一些實施例中，多聚體複合物由能够特异性結合另一部分之部分標記。舉例而言，標記可為生物素、卵白素、寡核苷酸或配位體。其他所關注標記可包括螢光染料、染料、酶、化學發光劑、粒子、放射性同位素或其他直接或間接可偵測劑。
在一些實施例中，藉由用包含將重組或异源抗原編碼至細胞中之核酸的載體(例如，病毒載體)轉染或轉導細胞來産生在MHC分子之背景中將免疫原性肽呈遞於細胞表面上之細胞。在一些實施例中，該載體係在如下條件下引入至該細胞中，其中一或多種肽抗原(在一些情况下，包括經表現异源蛋白之一或多種肽抗原)在主要組織相容性複合物(MHC)分子之背景中由該細胞表現、經加工且呈遞於細胞表面上。
一般而言，與載體接觸之細胞係表現MHC之細胞，亦即MHC表現細胞。該細胞可為如下細胞，其通常在細胞表面上表現MHC，經誘導在細胞表面上表現MHC及/或上調MHC表現，或經工程改造以在細胞表面上表現MHC分子。在一些實施例中，MHC含有在一些情况下可與多肽之肽抗原複合的多型性肽結合位點或結合槽，該等肽抗原包括由細胞機制加工之肽抗原。在一些情况下，MHC分子可在細胞表面上呈現或表現，包括呈肽複合物，亦即MHC-肽複合物之形式，從而呈遞呈可由T細胞上之TCR或其他肽結合分子識別的構形之抗原。
在一些實施例中，細胞為有核細胞。在一些實施例中，細胞為抗原呈遞細胞。在一些實施例中，細胞為巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞、內皮細胞或纖維母細胞。在一些實施例中，細胞為內皮細胞，諸如內皮細胞株或原代內皮細胞。在一些實施例中，細胞為纖維母細胞，諸如纖維母細胞細胞株或原代纖維母細胞。
在一些實施例中，細胞為人工抗原呈遞細胞(aAPC)。通常，aAPC包括天然APC之特徵，包括表現MHC分子、刺激及共刺激分子、Fc受體、黏附分子及/或産生或分泌細胞介素(例如，IL-2)之能力。通常，aAPC係缺乏上述一或多者之表現的細胞株，且藉由引入(例如，藉由轉染或轉導)以下一或多者而產生：MHC分子中缺失之元件、低親和力Fc受體(CD32)、高親和力Fc受體(CD64)、一或多個共刺激信號(例如，CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、ILT3、ILT4、3/TR6或B7-H3配位體；或與CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、Toll配位體受體或CD83配位體特异性結合之抗體)、細胞黏附分子(例如，ICAM-1或LFA-3)及/或細胞介素(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、干擾素-α (IFNα)、干擾素-β (IFNβ)、干擾素-γ (IFNγ)、腫瘤壞死因子-α (TNFα)、腫瘤壞死因子-β (TNFβ)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及顆粒球群落刺激因子(GCSF))。在一些情况下，aAPC通常不表現MHC分子，但可經工程改造以表現MHC分子，或者在一些情况下，經誘導或可經誘導以表現MHC分子，諸如藉由用細胞介素刺激。在一些情况下，aAPC亦可裝載有刺激配位體，該刺激配位體可包括例如抗CD3抗體、抗CD28抗體或抗CD2抗體。可用作産生aAPC之骨架之例示性細胞株為K562細胞株或纖維母細胞細胞株。各種aAPC係此項技術中已知的，參見例如美國專利第8,722,400號；公開申請案第US2014/0212446號；Butler及Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129；Suhoshki 等人 (2007) Mol. Ther., 15:981-988)。
測定或鑑別由細胞表現之特定MHC或等位基因係充分在熟練技術人員之水準內。在一些實施例中，在使細胞與載體接觸之前，可評估或確認特定MHC分子之表現，諸如藉由使用對特定MHC分子具有特异性之抗體。MHC分子之抗體係此項技術中已知的，諸如下文所述之任何抗體。
在一些實施例中，可選擇細胞以表現所需MHC限制之MHC等位基因。在一些實施例中，細胞(諸如細胞株)之MHC分型係此項技術中已知的。在一些實施例中，可使用此項技術中熟知之程序，諸如藉由使用分子單倍型分析(BioTest ABC SSPtray, BioTest Diagnostics Corp., Denville, N.J.；SeCore Kits, Life Technologies, Grand Island, N.Y.)執行組織分型來測定細胞(諸如自個體獲得之原代細胞)之MHC分型。在一些情况下，執行標準細胞分型以諸如藉由使用基於序列之分型(SBT)來測定HLA基因型係充分在熟練技術人員之水準內(Adams等人 (2004) J. Transl. Med., 2:30；Smith (2012) Methods Mol Biol., 882:67-86)。在一些情况下，已知細胞(諸如纖維母細胞)之HLA分型。舉例而言，人類胎兒肺纖維母細胞細胞株MRC-5為HLA-A*0201、A29、B13、B44 Cw7 (C*0702)；人類包皮纖維母細胞細胞株Hs68為HLA-A1、A29、B8、B44、Cw7、Cw16；且WI-38細胞株為A*6801、B*0801 (Solache等人 (1999) J Immunol, 163:5512-5518；Ameres等人 (2013) PloS Pathog. 9:e1003383)。人類轉染子纖維母細胞細胞株M1DR1/Ii/DM表現HLA-DR及HLA-DM (Karakikes等人 (2012) FASEB J., 26:4886-96)。
在一些實施例中，與載體接觸或引入至載體之細胞係經工程改造或經轉染以表現MHC分子之細胞。在一些實施例中，可藉由遺傳修飾親本細胞株來製備細胞株。在一些實施例中，細胞通常缺乏特定MHC分子且經工程改造以表現此類特定MHC分子。在一些實施例中，使用重組DNA技術對細胞進行遺傳工程改造。
在一些實施例中，使用本文所述之穩定MHC-肽複合物來偵測結合穩定MHC-肽複合物之T細胞。在一些實施例中，使用本文所述之穩定MHC-肽複合物，例如藉由偵測與經螢光標記之MHC-肽複合物特异性結合的T細胞(例如，CD8+ T細胞)之量及/或百分率來監測個體之T細胞反應。用於産生、標記及使用用於偵測MHC-肽複合物特异性T細胞之MHC-肽複合物(例如，MHC-肽四聚體)的方法係此項技術中熟知的。額外描述可見於例如美國專利第7,776,562號；美國專利第8,268,964號；及美國專利公開案第2019/0085048號，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。 V. 免疫原性組合物
在一些態樣中，本文提供醫藥組合物(例如，疫苗組合物)，其包含SARS-CoV-2免疫原性肽及/或編碼SARS-CoV-2免疫原性肽之核酸以及佐劑。在一些態樣中，本文提供醫藥組合物(例如，疫苗組合物)，其包含免疫原性多肽及/或編碼免疫原性多肽之核酸以及佐劑。在一些態樣中，本文提供包含穩定MHC-肽複合物及佐劑之醫藥組合物(例如疫苗組合物)，該MHC-肽複合物在MHC分子之背景中包含SARS-CoV-2免疫原性肽。在一些實施例中，該組合物包括多種(例如，兩種或兩種以上) SARS-CoV-2免疫原性肽或核酸及佐劑之組合。在一些實施例中，該組合物包括多種(例如兩種或兩種以上)穩定MHC-肽複合物及佐劑之組合，該等穩定MHC-肽複合物在MHC分子之背景中包含SARS-CoV-2免疫原性肽。在一些實施例中，上文所述之組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
本文所揭示之醫藥組合物可特殊地經調配用於以固體或液體形式投與，包括經調適用於以下之彼等形式：(1)經口投與，例如灌服劑(水性或非水性溶液或懸浮液)；錠劑，例如以經頰、舌下及全身吸收為目標之彼等錠劑；施用於舌頭之大丸劑、散劑、顆粒、糊劑；或(2)非經腸投與，例如呈例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放調配物形式藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射。
製備此等調配物或組合物之方法包括使本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽及/或核酸與佐劑、載劑及視情況選用的一或多種輔助成分結合的步驟。一般地，藉由以下方式來製備該等調配物：使本文所述之劑與液體載劑或精細分散之固體載劑或兩者均勻且緊密地結合，且接著必要時使產物成型。
適於非經腸投與之醫藥組合物包含本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽及/或核酸與佐劑以及一或多種醫藥學上可接受之無菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液或者可能僅在使用之前重構為無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末之組合，其可含有糖、醇、抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、使調配物與預期接受者之血液等滲的溶質或者懸浮劑或增稠劑。
可用於該等醫藥組合物之合適水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)以及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣材料，藉由在分散液之情况下維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
無論所選擇之投與途徑如何，可呈合適水合形式使用的本文所提供之劑及/或本文所揭示之醫藥組合物均係藉由熟習此項技術者已知的習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。
在一些實施例中，當投與至個體時，所述醫藥組合物可引出針對感染SARS-CoV-2之細胞之免疫反應。此類醫藥組合物可用作用於預防性及/或治療性治療COIVD-19之疫苗組合物。
在一些實施例中，該醫藥組合物進一步包含生理學上可接受之佐劑。在一些實施例中，所用佐劑對該醫藥組合物提供增加之免疫原性。此另一免疫反應刺激化合物或佐劑可(i)在重構肽且視情況用如上文所定義之油基佐劑乳化之後混合至根據本發明之醫藥組合物，(ii)可為上文所定義之本發明所涵蓋之重構組合物的一部分，(iii)可實體連接至待重構之肽，或(iv)可分開投與至待治療之個體、哺乳動物或人類。該佐劑可為提供抗原之緩慢釋放的佐劑(例如，該佐劑可為脂質體)，或其可為自身具免疫原性，由此與抗原(亦即，存在於SARS-CoV-2免疫原性肽中之抗原)協同地起作用之佐劑。舉例而言，該佐劑可為已知佐劑，或促進抗原攝取、將免疫系統細胞募集至投與位點或促進起反應之淋巴樣細胞的免疫活化之其他物質。佐劑包括但不限於免疫調節分子(例如，細胞介素)、油及水乳液、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、褐藻酸鈉、Bacto-Adjuvant、合成聚合物(諸如聚胺基酸及胺基酸共聚物)、皂苷、石蠟油及胞壁醯二肽。在一些實施例中，該佐劑為佐劑65、α-GalCer、磷酸鋁、氫氧化鋁、磷酸鈣、β-葡聚糖肽、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、脂質A、脂多糖、Lipovant、Montanide、N-乙醯基-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-异麩醯胺酸、Pam3CSK4、quil A、海藻糖二黴菌酸酯或酵母聚糖。
在一些實施例中，該佐劑為免疫調節分子。舉例而言，該免疫調節分子可為重組蛋白細胞介素、趨化介素或免疫刺激劑或編碼細胞介素、趨化介素或免疫刺激劑之核酸，經設計以增强免疫反應。
免疫調節細胞介素之實例包括干擾素(例如，IFNα、IFNβ及IFNγ)、介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17及IL-20)、腫瘤壞死因子(例如，TNFα及TNFβ)、紅血球生成素(EPO)、FLT-3配位體、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、Rantes、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，以及前述任一者之功能片段。
在一些實施例中，與趨化介素受體(亦即，CXC、CC、C或CX3C趨化介素受體)結合之免疫調節趨化介素亦可包括於此處提供之組合物中。趨化介素之實例包括但不限於Mip1α、Mip-1β、Mip-3α (Larc)、Mip-3β、Rantes、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1及Bca-1 (Blc)，以及前述任一者之功能片段。
在一些實施例中，該組合物包含編碼本文所述之SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸，諸如編碼SARS-CoV-2免疫原性肽之DNA分子。在一些實施例中，該組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼SARS-CoV-2免疫原性肽之開放閱讀框。
當由細胞(例如，肌肉細胞、抗原呈遞細胞(APC)，諸如樹突狀細胞、巨噬細胞等)吸收時，DNA分子可作為染色體外分子存在於細胞中及/或可整合至染色體中。DNA可呈質體形式引入至細胞中，該質體形式可保持作為獨立遺傳材料。替代地，可將可整合至染色體中之線性DNA引入至細胞中。視情況，當將DNA引入至細胞中時，可添加促進DNA整合至染色體中之試劑。 VI. 結合部分
在一些態樣中，提供一種結合部分，其結合本文所述之肽及/或本文所述之穩定MHC-肽複合物。舉例而言，提供與肽及/或穩定MHC-肽複合物特异性結合之結合蛋白，如T細胞受體(TCR)、抗體及其類似物，諸如具有小於或等於約10 -7M之K d(例如，約10 -7、約10 -8、約10 -9、約10 10、約10 -11、約10 -12、約10 -13、約10 -14)。
在一些實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該MHC α鏈係選自由以下組成之群之HLA血清型：HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及/或HLA-B*07。在一些實施例中，HLA等位基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260及HLA-A*0274等位基因。在一特定實施例中，HLA等位基因為HLA-A*0201。在一些實施例中，該等結合蛋白係經遺傳工程改造、經分離及/或經純化。
在一些實施例中，本文所提供之結合蛋白包含嵌合、人類化、人類、靈長類動物或嚙齒動物(例如，大鼠或小鼠)恒定區。舉例而言，人類可變區可與鼠科動物恒定區嵌合，或鼠科動物可變區可用人類恒定區及/或人類構架區人類化。在一些實施例中，可使恒定區突變以修飾功能性(例如，在TCR α及β鏈中之相對殘基位置中引入非天然存在之半胱胺酸取代以提供可用於增加TCR α與β鏈之間的親和力之二硫鍵)。同樣，可在恒定區之跨膜域中進行突變以修飾功能性(例如，藉由用疏水性胺基酸引入非天然存在之殘基取代來增加疏水性)。
在一些實施例中，如與參考CDR序列相比，該結合蛋白之每一個CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。
在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可包含T細胞受體(TCR)、TCR之抗原結合片段或嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可包含兩個多肽鏈，其中每一者均包含可變區，該可變區包含TCR α鏈之CDR3及TCR β鏈之CDR3，或TCR α鏈及TCR β鏈兩者之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合蛋白包含單鏈TCR (scTCR)，其包含TCR V α及TCR V β域兩者，但僅包含單個TCR恒定域(C α或C β) 。術語「嵌合抗原受體」(CAR)係指一種融合蛋白，其經工程改造以含有兩個或兩個以上天然存在之胺基酸序列，該等序列以非天然存在或非天然存在於宿主細胞中之方式連接在一起，當存在於細胞表面上時，該融合蛋白可用作受體。本發明所涵蓋之CAR可包括細胞外部分，其包含抗原結合域(亦即，獲自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，諸如抗體或TCR，或者源自或獲自來自NK細胞之殺手免疫受體的抗原結合域)，該抗原結合域與跨膜域及一或多個細胞內信號傳導域(視情況含有共刺激域)連接(參見例如Sadelain 等人 (2013 ) Cancer Discov. 3:388，Harris及Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci.37:220，及Stone等人 (2014) Cancer Immunol. Immunother.63:1163)。
在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或嵌合抗原受體(CAR))為嵌合的(例如，包含來自多於一個供體或物種之胺基酸殘基或基序)、人類化(例如，包含來自非人類生物體之殘基，該等殘基發生改變或經取代以降低人類之免疫原性風險)或人類的。
用於産生經工程改造之結合蛋白(諸如TCR、CAR及其抗原結合片段)之方法係此項技術中熟知的(例如Bowerman等人 (2009) Mol. Immunol.5:3000，美國專利第6,410,319號，美國專利第7,446,191號，美國專利公開案第2010/065818號；美國專利第8,822,647號，PCT公開案第WO 2014/031687號，美國專利第7,514,537號，及Brentjens等人 (2007) Clin. Cancer Res.73:5426)。
在一些實施例中，本文所述之結合蛋白係在細胞表面上表現之TCR或其抗原結合片段，其中如與內源性TCR相比，細胞表面表現之TCR能够更有效地與CD3蛋白締合。當在如T細胞之細胞的表面上表現時，如與內源性結合蛋白(諸如內源性TCR)相比，本發明所涵蓋之結合蛋白(諸如TCR)亦可具有細胞上之較高表面表現。在一些實施例中，本文提供一種CAR，其中CAR之結合域包含抗原特异性TCR結合域(參見例如Walseng等人 (2017) Scientific Reports7:10713) 。
亦提供經修飾之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)，其可根據熟知方法使用本文所揭示之具有一或多個V α及/或V β序列之結合蛋白作為起始材料對經修飾之結合蛋白進行工程改造來製備，該經修飾之結合蛋白可具有與起始結合蛋白相比發生改變的特性。可藉由修飾一個或兩個可變區(亦即，V α及/或V β)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內之一或多個殘基來對結合蛋白進行工程改造。或者或另外，可藉由修飾恒定區內之殘基來對結合蛋白進行工程改造。
另一類型之可變區修飾係使V α及/或V βCDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變，由此改良所關注之結合蛋白的一或多種結合特性(例如，親和力)。可執行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且可在如本文所述及實例中所提供之活體外或活體內分析中評估對蛋白結合或其他所關注之功能特性的影響。在一些實施例中，可引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。在一些實施例中，突變為取代。此外，CDR區內之不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基通常經修飾。
在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)相對於天然存在之TCR可具有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。在一些實施例中，如與參考CDR序列相比，該結合蛋白之每一個CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。胺基酸之保守取代為熟知的，且可天然發生，或可在重組産生結合蛋白時經引入。可使用此項技術中已知之突變誘發方法將胺基酸取代、缺失及添加引入至蛋白質中(參見例如Sambrook等人 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)。可使用寡核苷酸定點特异性(或區段特异性)突變誘發程序來提供經改變聚核苷酸，該經改變聚核苷酸具有根據所需取代、缺失或插入發生改變之特定密碼子。或者，可使用隨機或飽和突變誘發技術，諸如丙胺酸掃描突變誘發、易錯聚合酶鏈反應突變誘發及寡核苷酸定向突變誘發來製備免疫原多肽變異體(參見例如Sambrook等人, 同上)。
一般技術人員已知的多種準則指示在肽或多肽中之特定位置處經取代之胺基酸是否為保守的(或相似的)。舉例而言，相似胺基酸或保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。相似胺基酸可包括於以下類別中：具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)；具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)；具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、組胺酸)；具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)；具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如，酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)，及具有芳族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。脯胺酸被視為更難以歸類，與具有脂族側鏈之胺基酸(例如，白胺酸、纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸)共享特性。在一些實施例中，用麩醯胺酸取代麩胺酸或用天冬醯胺取代天冬胺酸可被視為相似取代，因為麩醯胺酸及天冬醯胺分別為麩胺酸及天冬胺酸之醯胺衍生物。如此項技術中應理解，藉由使多肽之胺基酸序列及其上保守胺基酸取代與第二多肽之序列進行比較來測定兩種多肽之間的「相似性」(例如，使用GENEWORKS™、Align、BLAST算法或描述於本文中且在此項技術中實踐之其他算法)。
在本文所述之實施例中的任一者中，經編碼結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)可包含「信號肽」(亦稱為前導序列、前導肽或轉運肽)。信號肽使新進合成之多肽靶向其在細胞內部或外部的適當位置。在定位或分泌期間或者一旦定位或分泌已完成，可自多肽中移除信號肽。具有信號肽之多肽在本文中稱作「前蛋白」且已移除信號肽之多肽在本文中稱作「成熟」蛋白或多肽。在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)包含成熟V α域、成熟V β域或兩者。在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)包含成熟TCR β-鏈、成熟TCR α-鏈或兩者。
在一些實施例中，該等結合蛋白為融合蛋白，其包含：(a)包含TCR或其抗原結合片段之細胞外組分；(b)包含效應子域或其功能部分之細胞內組分；及(c)連接細胞外及細胞內組分之跨膜域。在一些實施例中，該融合蛋白能够與MHC-肽抗原複合物特异性結合，該MHC-肽抗原複合物在MHC分子(例如，MHC I類分子)之背景中包含本文所述之肽抗原決定基。
如本文所用，「效應子域」或「免疫效應子域」係融合蛋白或受體之細胞內部分或域，當接收到適當信號時，其可直接或間接促進細胞中之免疫反應。在一些實施例中，效應子域係來自免疫細胞蛋白或其部分或免疫細胞蛋白複合物，當進行結合(例如，CD3ζ)時，或當該免疫細胞蛋白或其部分或免疫細胞蛋白複合物直接與標靶分子結合且觸發免疫細胞中之效應子域之信號轉導時，該效應子域接收信號。
當效應子域含有一或多個信號傳導域或基序，諸如基於細胞內酪胺酸之活化基序(ITAM)，諸如在共刺激分子中發現之彼等時，其可直接地促進細胞反應。不希望受理論束縛，咸信在T細胞受體或包含T細胞效應子域之融合蛋白與配位體銜接之後，ITAM可用於T細胞活化。在一些實施例中，細胞內組分或其功能部分包含ITAM。例示性免疫效應子域包括但不限於來自以下之彼等域：CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任何組合。在一些實施例中，效應子域包含淋巴球受體信號傳導域(例如，CD3ζ或其功能部分或變異體)。
在其他實施例中，該融合蛋白之細胞內組分包含選自以下之共刺激域或其功能部分：CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD2、CD5、ICAM-l (CD54)、LFA-l (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFF-R、HVEM、LIGHT、MKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體或其功能變異體，或其任何組合。在一些實施例中，該細胞內組分包含CD28共刺激域或其功能部分或變異體(其可視情況包括在原生CD28蛋白之位置186-187處之LL-GG突變(例如，Nguyen等人 (2003) Blood702:4320)、4-1BB共刺激域或其功能部分或變異體，或兩者。
在一些實施例中，效應子域包含CD3ε胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應子域包含CD27胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含CD28胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含4-1BB胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含OX40胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含CD2胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含CD5胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含ICAM-l胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含LFA-l胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。在其他實施例中，效應子域包含ICOS胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體 。
本發明所涵蓋之細胞外組分及細胞內組分藉由跨膜域連接。如本文所用，「跨膜域」係跨膜蛋白中可插入至細胞膜中或橫跨細胞膜之部分。跨膜域具有三維結構，該結構在細胞膜中熱力學穩定且一般介於約15個胺基酸至約30個胺基酸之長度範圍內。跨膜域之結構可包含α螺旋、β桶、β折疊、β螺旋或其任何組合。在一些實施例中，跨膜域包含或源自已知跨膜蛋白(例如，CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD27跨膜域、CD28跨膜域或其任何組合)。
在一些實施例中，該融合蛋白之細胞外組分進一步包含安置於結合域與跨膜域之間的連接子。如本文中當提及融合蛋白中連接結合域與跨膜域之組分時所用，「連接子」可為具有約兩個胺基酸至約500個胺基酸之胺基酸序列，其可為藉由連接子連接之兩個區域、域、基序、片段或模塊之間的構形移動提供靈活性及空間。例如，本發明所涵蓋之連接子可使結合域遠離表現該融合蛋白之宿主細胞的表面定位以使得能夠實現宿主細胞與標靶細胞之間的適當接觸、抗原結合及活化(Patel等人 (1999) Gene Therapy6:412-419) 。連接子長度可基於所選標靶分子、所選結合抗原決定基或抗原結合域捕獲及親和力而變化以使抗原識別增至最大(參見例如Guest等人 (2005) Immunother.28:203-11，及PCT公開案第WO 2014/031687號)。例示性連接子包括具有甘胺酸-絲胺酸胺基酸鏈之彼等連接子，該甘胺酸-絲胺酸胺基酸鏈具有一個至約十個Gly xSer y重複序列，其中x及y各自獨立地為0至10之整數，其限制條件在於x及y不同時為0 (例如，(Gly 4Ser) 2、(Gly 3Ser) 2、Gly 2Ser或其組合，諸如((Gly 3Ser) 2Gly 2Ser))。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合部分可為經工程改造之蛋白支架、抗體或其抗原結合片段、TCR模擬抗體及其類似物。可使用常規免疫學方法針對本文所述之肽及/或MHC-肽複合物來設計及/或産生此類結合部分，該等方法諸如使宿主免疫、獲得産生抗體之細胞及/或其抗體，及産生可用於産生單株抗體之融合瘤(例如，Watt等人 (2006) Nat. Biotechnol.24:177-183；Gebauer及Skerra (2009) Curr. Opin. Chem Biol.13:245-255；Skerra等人 (2008) FEBS J.275:2677-2683；Nygren等人 (2008) FEBS J.275:2668-2676；Dana等人 (2012) Exp. Rev. Mol. Med.14:e6；Sergeva等人 (2011) Blood117:4262-4272；PCT公開案第WO 2007/143104號、第PCT/US86/02269號及第WO 86/01533號；美國專利第4,816,567號；Better等人 (1988) Science240:1041-1043；Liu等人 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84:3439-3443；Liu等人 (1987) J. Immunol.139:3521-3526；Sun等人 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.84:214-218；Nishimura等人 (1987) Cancer Res.47:999-1005；Wood等人 (1985) Nature314:446-449；Shaw等人 (1988) J. Natl. Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison, S. L. (1985) Science229:1202-1207；Oi等人 (1986) Biotechniques4:214；美國專利第5,225,539號；Jones等人 (1986) Nature321:552-525；Verhoeyan等人 (1988) Science239:1534；及Beidler等人 (1988) J. Immunol.141:4053-4060。必要時，可使用習知程序來分離或純化結合部分，該等程序諸如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、親和力層析、硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、羥基磷灰石層析、凝集素層析及高效液相層析(HPLC) (例如，Current Protocols in Immunology，或者Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y.)。
術語「抗體(antibody/antibodies)」廣泛涵蓋天然存在之抗體形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)及重組抗體，諸如單鏈抗體、嵌合及人類化抗體以及多特异性抗體，以及所有前述抗體之片段及衍生物，該等片段及衍生物具有至少一個抗原結合位點。抗體衍生物可包含與抗體結合之蛋白質或化學部分。
此外，內抗體為熟知的抗原結合分子，其具有抗體特徵，但能够在細胞內表現以便結合及/或抑制所關注之細胞內標靶(Chen等人 (1994) Human Gene Ther.5:595-601)。用於使抗體適於靶向(例如，抑制)細胞內部分之方法係此項技術中熟知的，諸如使用單鏈抗體(scFv)、修飾免疫球蛋白VL域以獲得超穩定性、修飾抗體以抵抗還原細胞內環境、産生增加細胞內穩定性及/或調節細胞內定位之融合蛋白及其類似方法。細胞內抗體亦可經引入且表現於多細胞生物體之一或多個細胞、組織或器官中，例如用於預防及/或治療目的(例如，作為基因療法) (至少參見PCT公開案第WO 08/020079號、第WO 94/02610號、第WO 95/22618號及第WO 03/014960號；美國專利第7,004,940號；Cattaneo及Biocca (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications(Landes and Springer-Verlag publs.)；Kontermann (2004) Methods34:163-170；Cohen等人 (1998) Oncogene17:2445-2456；Auf der Maur等人 (2001) FEBS Lett.508:407-412；Shaki-Loewenstein等人 (2005) J. Immunol. Meth.303:19-39)。
如本文所用，術語「抗體」亦包括抗體之「抗原結合部分」(或簡稱為「抗體部分」)。如本文所用，術語「抗原結合部分」係指抗體中保留與抗原(例如，本文所述之肽及/或MHC-肽複合物)特异性結合之能力的一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」内之結合片段的實例包括(i) Fab片段，其係由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其係包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單一臂之VL及VH域組成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature341:544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離之互補决定區(CDR)。此外，雖然Fv片段之兩個域VL及VH係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子使得其能够被製成單個蛋白鏈，其中VL與VH區配對以形成單價多肽(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人 (1988) Science242:423-426；及Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883；及Osbourn等人 1998, Nature Biotechnology 16: 778)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內。特定scFv之任何VH及VL序列均可與人類免疫球蛋白恒定區cDNA或基因組序列連接，以便産生編碼完整IgG多肽或其他同型之表現載體。VH及VL亦可用於使用蛋白質化學或重組DNA技術産生Fab、Fv或其他免疫球蛋白片段。亦涵蓋諸如雙功能抗體之其他形式之單鏈抗體。雙功能抗體為二價、雙特异性抗體，其中VH及VL域在單個多肽鏈上表現，但使用之連接子過短以致於無法在同一鏈上之兩個域之間進行配對，從而迫使該等域與另一鏈之互補域配對且産生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:6444-6448；Poljak等人 (1994) Structure2:1121-1123)。
另外，抗體或其抗原結合部分可為由該抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價締合形成的較大免疫黏附多肽之一部分。此類免疫黏附多肽之實例包括使用卵白素核心區製成四聚體scFv多肽(Kipriyanov等人 (1995) Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、蛋白質亞單元肽及C端聚組胺酸標籤製成二價且生物素化scFv多肽(Kipriyanov等人 (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。諸如Fab及F(ab') 2片段之抗體部分可使用習知技術自完整抗體製備，諸如分別對完整抗體進行木瓜蛋白酶消化或胃蛋白酶消化。此外，如本文所述，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附多肽。
抗體可為多株或單株的；异種、同種异體或同基因的；或其經修飾形式(例如人類化、嵌合等)。抗體亦可為全人類的。較佳地，本發明所涵蓋之抗體特异性地或實質上特异性地與本文所述之肽及/或MHC-肽複合物結合。如本文所用，術語「單株抗體」及「單株抗體組合物」係指僅含有一種能够與抗原之特定抗原決定基發生免疫反應之抗原結合位點的抗體多肽群體，而術語「多株抗體」及「多株抗體組合物」係指含有多種能够與特定抗原相互作用之抗原結合位點的抗體多肽群體。單株抗體組合物通常對與其發生免疫反應之特定抗原展現出單一結合親和力。
與本文所述之其他結合部分相似，抗體亦可為「人類化的」，其意欲包括由具有可變區及恒定區之非人類細胞製成之抗體，該等可變區及恒定區已改變為與將由人類細胞製成的抗體更密切相似。舉例而言，藉由改變非人類抗體胺基酸序列以併入在人類生殖系免疫球蛋白序列中發現之胺基酸。本發明所涵蓋之人類化抗體可例如在CDR中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特异性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。如本文所用，術語「人類化抗體」亦包括其中源自另一哺乳動物物種之生殖系之CDR序列已植入人類構架序列上的抗體。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白可共價連接至部分。在一些實施例中，該共價連接之部分包含親和力標籤或標記。親和力標籤可選自由麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)、蛋白C標籤、Myc標籤、HaloTag、HA標籤、Flag標籤、His標籤、生物素標籤及V5標籤組成之群。標記可為螢光蛋白。在一些實施例中，該共價連接之部分係選自由發炎劑、消炎劑、細胞介素、毒素、細胞毒性分子、放射性同位素或諸如單鏈Fv之抗體組成之群。
結合蛋白可與用於成像、研究、治療、治療診斷學、醫藥學、化學療法、螯合療法、靶向藥物遞送及放射療法之劑結合。在一些實施例中，結合蛋白可與可偵測劑結合或融合，該等劑諸如螢光團、近紅外染料、對比劑、奈米粒子、含金屬奈米粒子、金屬螯合物、X射線對比劑、PET劑、金屬、放射性同位素、染料、放射性核素螯合劑或可用於成像之另一合適材料。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個可偵測部分可連接至結合蛋白。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212 。在一些實施例中，近紅外染料不容易由生物組織及流體淬滅。在一些實施例中，螢光團係發射波長在650 nm與4000 nm之間的電磁輻射之螢光劑，此類發射係用於偵測此類劑 。可用作結合分子之螢光染料之非限制性實例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800或靛青綠(ICG)。在一些實施例中，近紅外染料通常包括花青染料(例如，Cy7、Cy5.5及Cy5) 。用作根據本發明之結合分子的螢光染料之額外非限制性實例包括吖啶橙或吖啶黃、Alexa Fluors® (例如，Alexa Fluor® 790、750、700、680、660及647)及其任何衍生物、7-放線菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO®染料及其任何衍生物、金胺-若丹明染色劑及其任何衍生物、苯蒽酮、比曼恩、9-10-雙(苯基乙炔基)蒽、5,12-雙(苯基乙炔基)萘、雙苯甲醯亞胺、腦彩虹、鈣黃綠素、羧基螢光素及其任何衍生物、1-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight® Fluors®及其任何衍生物、艾吡可酮、溴化乙錠、FlAsH-EDT2®、Fluodye及其任何衍生物、FluoProbe®及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、Fura®及其任何衍生物、GelGreen®及其任何衍生物、GelRed®及其任何衍生物、螢光蛋白及其任何衍生物、m同型蛋白及其任何衍生物(諸如mCherry)、赫他明染料及其任何衍生物、郝思特染色劑、亞胺基香豆素、印度黃、indo-1及其任何衍生物、來若丹、螢光黃及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、螢光素酶及其任何衍生物、部花青及其任何衍生物、尼羅染料及其任何衍生物、苝、焰红染料、藻染料及其任何衍生物、碘化丙啶、比染因、若丹明及其任何衍生物、核糖綠、RoGFP、紅螢烯、二苯乙烯及其任何衍生物、磺醯若丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、tris四鈉、Texas Red、Titan Yellow、TSQ、繖形酮、紫蒽酮、黃色螢光蛋白及YOYO-1 。其他合適螢光染料包括但不限於螢光素及螢光素染料(例如，异硫氰酸螢光素或FITC、萘基螢光素、4', 5'-二氯-2',7'-二甲氧基螢光素、6-羧基螢光素或FAM等)、羧花青、部花青、苯乙烯染料、氧雜菁染料、藻紅蛋白、紅螢素、曙紅、若丹明染料(例如，羧基四甲基-若丹明或TAMRA、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、麗絲胺若丹明B、若丹明6G、若丹明綠、若丹明紅、四甲基若丹明(TMR)等)、香豆素及香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基胺基香豆素、羥基香豆素、胺基甲基香豆素(AMCA)等)、Oregon Green™染料(例如，Oregon Green™ 488、500、514等)、Texas Red®、Texas Red®-X、SPECTRUM RED®、SPECTRUM GREEN®、花青染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、Alexa Fluor®染料(例如，Alexa Fluor® 350、488、532、546、568、594、633、660、680等)、BODIPY®染料(例如，BODIPY® FL、R6G、TMR、TR、 530/550、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650、650/665等)、IRD染料(例如，IRD40™、IRD700™、IRD800™等)及其類似物 。額外的合適可偵測劑係此項技術中熟知的(例如，PCT公開案第PCT/US14/56177號)。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212。
結合蛋白可與放射增敏劑或光敏劑結合。放射增敏劑之實例包括但不限於：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、太平洋紫杉醇、卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、吉西他濱、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明及核酸鹼基衍生物(例如，鹵化嘌呤或嘧啶，諸如5-氟去氧尿苷) 。光敏劑之實例包括但不限於：發光時産生熱之螢光分子或珠粒、奈米粒子、卟啉及卟啉衍生物(例如，二氫卟酚、細菌綠素、异細菌綠素、酞青及萘酞青)、金屬卟啉、金屬酞青、白芷素、硫屬元素哌喃鹽染料、葉綠素、香豆素、黃素及相關化合物(諸如咯嗪及核黃素)、富勒烯、去鎂葉綠素酸、焦去鎂葉綠素酸、花青(例如，部花青540)、去鎂葉綠素、藍寶石、特沙弗林、紫紅素、卟啉烯、吩噻嗪鎓、亞甲藍衍生物、萘二甲醯亞胺、尼羅藍衍生物、醌類、苝醌(例如金絲桃素、竹紅菌素及尾孢菌素)、補骨脂素、醌類、類視色素、若丹明、噻吩、威爾丁、呫噸染料(例如曙紅、紅螢素、孟加拉玫紅)、卟啉之二聚物及寡聚物形式，以及諸如5-胺基乙醯丙酸之前藥 。有利地，此方法允許同時使用治療劑(例如，藥物)及電磁能(例如，輻射或光)兩者對所關注細胞(例如，免疫細胞)進行高特异性靶向 。在一些實施例中，該結合蛋白與該劑融合，或與該劑共價或非共價連接，例如直接連接或經由連接子連接。
在一些實施例中，該結合蛋白可經化學修飾。舉例而言，可使結合蛋白發生突變以修飾肽特性，諸如可偵測性、穩定性、生物分佈、藥物動力學、半衰期、表面電荷、疏水性、結合位點、pH、功能及其類似特性 。N-甲基化係可在本發明所涵蓋之結合蛋白中發生的甲基化之一個實例 。在一些實施例中，可藉由對游離胺進行甲基化，諸如藉由用甲醛及氰基硼氫化鈉進行還原甲基化來修飾結合蛋白。
化學修飾可包含聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、兩性離子聚合物、聚胺基酸、脂肪酸、樹枝狀聚合物、Fc區、簡單飽和碳鏈(諸如棕櫚酸酯或肉豆蔻酸酯)或白蛋白。具有Fc區之結合蛋白之化學修飾可為融合Fc-蛋白。聚胺基酸可包括例如具有重複之單個胺基酸之聚胺基酸序列(例如聚甘胺酸)，及具有可遵循或可不遵循模式之混合聚胺基酸序列之聚胺基酸序列，或前述的任何組合。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白可經修飾。在一些實施例中，該等修飾與親本結合蛋白具有實質或顯著序列一致性以産生維持親本結合蛋白之一或多種生物物理及/或生物學活性(例如，維持結合特异性)之功能變異體。在一些實施例中，該突變為保守胺基酸取代。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白可包含替代一或多個天然存在之胺基酸的合成胺基酸。此類合成胺基酸係此項技術中熟知的，且包括例如胺基環己烷甲酸、正白胺酸、a-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-羥基脯胺酸及反式-4-羥基脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸β-羥基苯丙胺酸、苯基甘胺酸、a-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫异喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苯甲基-N'-甲基-離胺酸、Ν',Ν'-二苯甲基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、a-胺基環戊烷甲酸、oc-胺基環己烷甲酸、a-胺基環庚烷甲酸、a-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及oc-第三丁基甘胺酸。
本發明所涵蓋之結合蛋白可經修飾，諸如糖基化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-醯化、環化(例如，經由二硫橋)，或轉化為酸加成鹽及/或視情況二聚化或聚合或結合。
在一些實施例中，可使用疏水性部分之附接(諸如至N端、C端或內部胺基酸)來延長本發明所涵蓋之肽的半衰期 。在其他實施例中，結合蛋白可包括轉譯後修飾(例如，甲基化及/或醯胺化)，其可影響例如血清半衰期 。在一些實施例中，簡單碳鏈(例如，藉由肉豆蔻醯化及/或棕櫚醯化)可與結合蛋白結合 。在一些實施例中，簡單碳鏈可使結合蛋白容易與未結合材料分離 。舉例而言，可用於使結合蛋白與未結合材料分離之方法包括但不限於溶劑萃取及逆相層析 。親脂部分可經由與血清白蛋白可逆結合來延長半衰期。經結合部分可為經由與血清白蛋白可逆結合來延長肽之半衰期的親脂部分。在一些實施例中，親脂部分可為膽固醇或膽固醇衍生物，包括膽甾烯、膽甾烷、膽甾二烯及氧化膽固醇 。在一些實施例中，結合蛋白可與肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物結合。在其他實施例中，結合蛋白可與半衰期修飾劑偶合(例如，結合) 。半衰期修飾劑之實例包括但不限於：聚合物，聚乙二醇(PEG)，羥乙基澱粉，聚乙烯醇，水溶性聚合物，兩性離子水溶性聚合物，水溶性聚(胺基酸)，脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物，含有甘胺酸、麩胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物，Fc區，脂肪酸，棕櫚酸，或與白蛋白結合之分子 。在一些實施例中，間隔子或連接子可偶合至結合蛋白，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個用作間隔子或連接子之胺基酸殘基，以便促進與另一分子之結合或融合，以及促進肽自此類結合或融合分子裂解 。在一些實施例中，結合蛋白可與例如可修飾或影響該等結合蛋白之特性之變化的其他部分結合。
結合蛋白可諸如藉由固相肽合成或溶液相肽合成而以重組或合成方式産生。可藉由已知合成方法，諸如使用茀基甲氧羰基(Fmoc)化學或藉由丁氧羰基(Boc)化學來執行多肽合成 。多肽片段可以酶或合成方式接合在一起。
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供産生本文所述之結合蛋白的方法，其包含以下步驟：(i)在適合使本文所述之結合蛋白表現的條件下培養經轉型宿主細胞，該宿主細胞已藉由包含編碼該結合蛋白之序列之核酸轉型；及(ii)回收經表現之結合蛋白。
舉例而言，可用於分離及純化重組産生之結合蛋白之方法可包括自將結合蛋白分泌至培養基中的合適宿主細胞/載體系統獲得上清液，及接著使用市售過濾器濃縮培養基。濃縮後，可將濃縮物應用於單一合適純化基質或一系列合適基質，諸如親和力基質或離子交換樹脂。可使用一或多個逆相HPLC步驟來進一步純化重組多肽。當自其天然環境中分離免疫原時，亦可使用此等純化方法。用於大規模製造本文所述之一或多種結合蛋白之方法包括批量細胞培養，對其進行監測及控制以維持適當培養條件。可根據描述於本文中且在此項技術中已知之方法執行結合蛋白之純化。
熟知多種用於評估結合親和力及/或確定結合分子是否與特定配位體(例如，肽抗原-MHC複合物)特异性結合之分析。諸如藉由使用此項技術中熟知之多種結合分析中之任一者來測定結合蛋白對標靶(諸如標靶多肽之T細胞肽抗原決定基)之結合親和力係在熟練技術人員之水準內。舉例而言，在一些實施例中，可使用Biacore™機器來測定兩種蛋白質之間的複合物之結合常數。可藉由監測當緩衝液傳遞通過晶片時折射率相對於時間之變化來測定該複合物之解離常數(K D)。用於量測一種蛋白質與另一蛋白質之結合的其他合適分析包括例如免疫分析，例如酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)，或藉由經由螢光、UV吸收、圓二色性或核磁共振(NMR)監測蛋白質之光譜或光學特性之變化來測定結合。其他例示性分析包括但不限於西方墨點、ELISA、分析性超速離心、光譜分析及表面電漿子共振(Biacore™)分析(參見例如Scatchard等人 (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660；Wilson (2002) Science295:2103；Wolff等人(1993) Cancer Res.53:2560，及美國專利第5,283,173號及第5,468,614號)、流式細胞術、測序及用於偵測經表現核酸之其他方法。在一實例中，藉由使用經標記多聚體，諸如MHC-抗原肽四聚體，例如藉由流式細胞術評估與各種濃度之四聚體的結合來量測對標靶之表觀親和力。在一代表性實例中，使用在濃度範圍內之經標記四聚體之2倍稀釋來量測結合蛋白之表觀K D，接著藉由非線性回歸來確定結合曲線，表觀K D係經測定為産生半最大結合之配位體濃度。 VII. 用途及方法 a. 診斷方法
在一些態樣中，本文提供用於確定個體是否已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護的診斷方法，該等診斷方法包含：(a)使自個體獲得之樣品(例如，血液、經分離PBMC或經分離T細胞)與諸如來自本文所述之免疫原性多肽構築體的本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽(例如，選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基)、本文所述之MHC-肽複合物或者編碼及/或呈遞本文所述之MHC-肽複合物的細胞一起培育；及(b)偵測反應性水準；其中反應性水準高於對照水準指示該個體已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護。
在一些實施例中，反應性水準係由T細胞活化或效應子功能，諸如但不限於T細胞增生、殺死或細胞介素釋放指示。對照水準可為參考數字或未暴露於SARS-CoV-2之健康個體之水準。 b. 治療方法
在一些態樣中，本文提供用於預防及/或治療COVID-19 (亦即，SARS-CoV-2感染)及/或用於誘導針對SARS-CoV-2蛋白或其片段之免疫反應的方法。在某些實施例中，該方法包含向個體投與本文所述之免疫原性組合物。
可使用本文所述之方法來治療任何有需要之個體。如本文所用，「有需要之個體」包括具有COVID-19、已具有COVID-19及/或易具有COVID-19之任何個體。舉例而言，在一些實施例中，個體具有COVID-19。在一些實施例中，個體已經歷針對COVID-19之治療。在一些實施例中，個體由於年齡或免疫系統受損或其他使個體易具有COVID-19之嚴重基礎醫學疾患而易具有COVID-19。
本文所揭示之醫藥組合物可藉由任何合適投與途徑(包括經口及非經腸)遞送。在某些實施例中，一般地遞送該等醫藥組合物(例如，經由經口或非經腸投與)。在特定實施例中，藉由皮下注射來投與該等醫藥組合物。
本發明劑之劑量可藉由參考該劑之血漿濃度來確定。舉例而言，可使用最大血漿濃度(Cmax)及自時間0至無窮大之血漿濃度-時間曲線下面積(AUC(0-4))。劑量包括産生上述Cmax及AUC (0-4)值之彼等劑量及產生彼等參數之較大或較小值之其他劑量。
醫藥組合物中之活性成分之實際劑量水準可變化以便獲得針對特定患者、組合物及投與模式有效實現所需治療反應而不會對患者産生毒性的活性成分之量。
所選劑量水準將取决於多種因素，包括所用特定劑之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄或代謝速率、治療持續時間、與所用特定化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀况及既往病史以及醫學領域中熟知之類似因素。
一般熟習此項技術之醫師或獸醫可容易地確定所需醫藥組合物之有效量且開具處方。例如，醫師或獸醫可能以低於為了實現所需治療效應而需要之水準的水準開具處方及/或投與醫藥組合物中所用之劑的劑量且逐漸增加劑量，直至實現所需效應。
一般而言，本文所述之劑之合適日劑量將係作為該劑有效産生治療效應之最低劑量的量。此類有效劑量一般將取决於上文所述之因素。
在一些實施例中，該免疫原性組合物包含一定量之SRS-CoV-2免疫原性肽與構成醫藥劑量單位之佐劑的組合。醫藥劑量單位在本文中係定義為在既定時間點應用於個體之活性成分(例如，SRS-CoV-2免疫原性肽及/或佐劑)之量。醫藥劑量單位可以單一體積(例如單次注射)應用於個體，或可以2、3、4、5個或更多個分開體積或注射應用於身體之不同位置，例如右肢及左肢。以分開體積應用單一醫藥劑量單位之原因可為多方面的，諸如避免不良副作用、避免抗原競爭及/或組成分析考慮因素。本文中應瞭解，分開體積之醫藥劑量在組成上可不同，亦即，可包含不同種類或組成之活性成分及/或佐劑。
醫藥劑量單位可為有效量或有效量之一部分。「有效量」在本文中應理解為相對於未經治療之患者預防及/或減少疾病(例如，COVID-19)之症狀所需的活性成分之量或劑量。用於實踐本發明以預防性及/或治療性治療COVID-19之活性化合物之有效量視投與方式、個體之年齡、體重及一般健康狀况而變化。最終，主治醫師或獸醫將决定適當量及劑量方案。此類量係稱為「有效」量。此有效量亦可為能够在待治療個體中誘導有效細胞T細胞反應或更佳地有效全身性細胞T細胞反應之量。
在一態樣中，本文提供一種在個體中引出對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應的方法。該方法包含：向個體投與本文所述之醫藥組合物，其中當投與至個體時，該藥物組合物引出對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應。
一般而言，免疫反應可包括體液免疫反應、細胞介導之免疫反應或兩者。
可藉由標準免疫分析來測定體液反應以測定來自接受該醫藥組合物之個體之血清樣品中的抗體水準。細胞免疫反應係涉及T細胞且可活體外或活體内測定之反應。舉例而言，可將全身細胞免疫反應測定為在投與醫藥組合物之後的合適時間自個體取樣之細胞(例如，外周血白血球(PBL))中之T細胞增生活性。在使例如PBMC與刺激物一起培育適當時段之後，可測定[ 3H]胸苷併入。可使用流式細胞術來測定正在增生之T細胞子集。
在某些態樣中，本文所提供之方法包括投與至人類及非人類哺乳動物。亦考慮了獸醫應用。在一些實施例中，個體可為其中可引出其免疫反應之任何活生物體。個體之實例包括但不限於人類、家畜、犬、猫、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。
在一些實施例中，可在任何適當時間投與該醫藥組合物。舉例而言，可在治療具有COVID-19之個體之前或期間進行投與，且在SARS-CoV-2感染變得臨床上不可偵測之後繼續投與。亦可在顯示復發迹象之個體中繼續投與。
在一些實施例中，可以治療或預防有效量投與該醫藥組合物。可使用已知程序且以足以實現所需效應之劑量及時段向個體投與該醫藥組合物。
在一些實施例中，可在任何合適位點向個體投與該醫藥組合物。投與途徑可為非經腸、肌肉內、皮下、皮內、腹膜內、鼻內、靜脈內(包括經由留置導管)、經由傳入淋巴管或藉由任何其他適合於個體之疾患之途徑。較佳地，將以有效産生所需反應(引出免疫反應抑或預防性或治療性治療SARS-CoV-2感染及/或相關症狀)之量及時段投與該劑量。
該醫藥組合物可在其他療法之後、之前或同時給予，該等其他療法包括亦引出個體之免疫反應之療法。舉例而言，個體可預先或同時由其他形式之免疫調節劑治療，此類其他療法較佳以不干擾本文所述之組合物之免疫原性的方式提供。
投與可由護理人員(例如，醫師、獸醫)適當地計時，且可取决於個體之臨床疾患、投與目的及/或亦考慮或投與之其他療法。在一些實施例中，可投與初始劑量，且監測個體之免疫學及/或臨床反應。免疫監測之合適手段包括使用患者之外周血淋巴球(PBL)作為回應者且使用本文所述之免疫原性肽或MHC-肽複合物作為刺激物。亦可藉由在投與位點處之延遲發炎反應來確定免疫反應。適當時可在初始劑量之後給予一或多個劑量，通常每月、每半月或每週一次，直至實現所需效應。此後，可根據需要給予額外的加强劑量或維持劑量，尤其當免疫學或臨床益處顯示減弱時。 c. 鑑別在 MHC 分子之背景中與肽結合之分子的方法
在一些態樣中，本文提供鑑別與選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基結合之肽結合分子或其抗原結合片段的方法。
在一些實施例中，肽結合分子(亦即，MHC-肽結合分子)係具有與在MHC分子(MHC-肽複合物)之背景中呈遞或呈現於諸如細胞表面上之肽抗原決定基結合(例如特异性結合)之能力的分子或其部分。例示性肽結合分子包括展現出與MHC-肽複合物結合之特异性能力的T細胞受體或抗體或其抗原結合部分，包括其單鏈免疫球蛋白可變區(例如，scTCR、scFv)。在一些實施例中，肽結合分子為TCR或其抗原結合片段。在一些實施例中，肽結合分子為抗體，諸如TCR樣抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，肽結合分子為TCR樣CAR，該TCR樣CAR含有抗體或其抗體結合片段，諸如TCR樣抗體，諸如已經工程改造以與MHC-肽複合物結合之抗體。在一些實施例中，肽結合分子可源自天然來源，或其可部分地或全部以合成或重組方式産生。
在一些實施例中，可藉由使一或多種候選肽結合分子(諸如一或多種候選TCR分子、抗體或其抗原結合片段)與MHC-肽複合物接觸且評估該一或多種候選結合分子中之每一者是否與MHC-肽複合物結合(諸如特异性結合)來鑑別與肽抗原決定基結合之結合分子。該等方法可活體外、離體或活體内執行。用於篩選之方法係此項技術中熟知的，諸如描述於美國專利公開案2020/0102553中。
在一些實施例中，該等方法包括使複數個結合分子或結合分子文庫(諸如複數個TCR或抗體或者TCR或抗體文庫)與MHC限制性抗原決定基接觸，及鑑別或選擇特异性結合此類抗原決定基之分子。在一些實施例中，可篩選或評估含有複數個不同結合分子(諸如複數個不同TCR或複數個不同抗體)之文庫或集合與MHC限制性抗原決定基的結合。在一些實施例中，諸如為了選擇特异性結合MHC限制性肽之抗體分子，可使用融合瘤方法。
在一些實施例中，可使用篩選方法，其中複數個候選結合分子(諸如候選結合分子文庫或集合)同時或依次個別地與肽結合分子接觸。可鑑別或選擇與特定MHC-肽複合物特异性結合之文庫成員。在一些實施例中，候選結合分子之文庫或集合可含有至少2、5、10、100、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9個或更多個不同肽結合分子。
在一些實施例中，可使用該等方法來鑑別展現出結合多於一種MHC單倍型或多於一種MHC等位基因之肽結合分子，諸如TCR或抗體。在一些實施例中，諸如TCR或抗體之肽結合分子特异性結合或識別在複數個MHC I類單倍型或等位基因之背景中呈遞之肽抗原決定基。在一些實施例中，諸如TCR或抗體之肽結合分子特异性結合或識別在複數個MHC II類單倍型或等位基因之背景中呈遞之肽抗原決定基。
已知多種用於評估結合親和力及/或確定結合分子是否與特定配位體(例如，MHC-肽複合物)特异性結合之分析。諸如藉由使用此項技術中熟知之多種結合分析中之任一者來測定TCR對標靶多肽之T細胞抗原決定基的結合親和力係在熟練技術人員之水準內。舉例而言，在一些實施例中，可使用BIAcore機器來測定兩種蛋白質之間的複合物之結合常數。可藉由監測當緩衝液傳遞通過晶片時折射率相對於時間之變化來測定該複合物之解離常數(K D)。用於量測一種蛋白質與另一蛋白質之結合的其他合適分析包括例如免疫分析，例如酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)，或藉由經由螢光、UV吸收、圓二色性或核磁共振(NMR)監測蛋白質之光譜或光學特性之變化來測定結合。其他例示性分析包括但不限於西方墨點、ELISA、分析性超速離心、光譜分析及表面電漿子共振(Biacore®)分析(參見例如Scatchard等人(1949) Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660；Wilson (2002) Science295:2103；Wolff等人 (1993) Cancer Res.53:2560；及美國專利第5,283,173號、第5,468,614號或等效物)、流式細胞術、測序及用於偵測經表現核酸之其他方法。在一實例中，藉由使用經標記四聚體，例如藉由流式細胞術評估與各種濃度之四聚體的結合來量測對TCR之表觀親和力。在一實例中，使用在濃度範圍內之經標記四聚體之2倍稀釋來量測TCR之表觀K D，接著藉由非線性回歸來確定結合曲線，表觀K D係經測定為産生半最大結合之配位體濃度。
在一些實施例中，可使用該等方法來鑑別僅在特定肽存在於複合物中時，而非特定肽不存在或存在另一非重疊或不相關肽時結合的結合分子。在一些實施例中，該結合分子在不存在所結合肽之情况下實質上不結合MHC，及/或在不存在MHC之情况下實質上不結合該肽。在一些實施例中，該等結合分子為至少部分特异性的。在一些實施例中，若存在特定肽，則例示性經鑑別結合分子可與MHC-肽複合物結合，且若存在相對於特定肽具有一個或兩個取代之相關肽，則亦結合。
在一些實施例中，可使用諸如TCR樣抗體之經鑑別抗體來製造或産生嵌合抗原受體(CAR)，該等受體含有與MHC-肽複合物特异性結合之非TCR抗體。
在一些實施例中，可使用鑑別肽結合分子(諸如TCR或TCR樣抗體或TCR樣CAR)之方法來對表現或含有肽結合分子之細胞進行工程改造。在一些實施例中，細胞或經工程改造之細胞為T細胞。在一些實施例中，該T細胞為CD4+或CD8+ T細胞。在一些實施例中，肽結合分子識別MHC I類肽複合物、MHC II類肽複合物及/或MHC-E肽複合物。在一些實施例中，可使用在MHC I類之背景中特异性識別肽之肽結合分子(諸如TCR或抗體或CAR)來對CD8+ T細胞進行工程改造。在一些實施例中，亦提供表現或含有用於識別在MHC I類之背景中呈遞之肽的TCR、抗體或CAR之經工程改造之CD8+ T細胞之組合物。在此類實施例中之任一者中，該等細胞可用於過繼性細胞療法之方法中。
在一些實施例中，可藉由擴增自個體分離之T細胞之Vα及Vβ譜系來産生TCR文庫，該等細胞包括存在於PBMC、脾臟或其他淋巴器官中之細胞。在一些情况下，T細胞可自腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增。在一些實施例中，可由CD4+或CD8+細胞産生TCR文庫。在一些實施例中，TCR可自正常健康個體之T細胞來源(亦即，正常TCR文庫)擴增。在一些實施例中，TCR可自患病個體之T細胞來源(亦即，患病TCR文庫)擴增。在一些實施例中，使用簡併引子來擴增Vα及VP之基因譜系，諸如藉由在自人類獲得之樣品(諸如T細胞)中進行RT-PCR而擴增。在一些實施例中，可由原生Vα及Vβ文庫組裝scTv文庫，其中擴增産物經選殖或經組裝以由連接子分開。視個體及細胞之來源而定，該等文庫可為HLA等位基因特异性的。
或者，在一些實施例中，可藉由親本或支架TCR分子之突變誘發或多樣化來産生TCR文庫。舉例而言，在一些態樣中，個體(例如人類或其他哺乳動物，諸如嚙齒動物)可接種肽，諸如藉由本發明方法鑑別之肽。在一些實施例中，可自個體獲得樣品，諸如含有血液淋巴球之樣品。在一些情况下，例如TCR之結合分子可自樣品擴增，例如樣品中所含之T細胞。在一些實施例中，可諸如藉由篩選選擇抗原特异性T細胞以評估針對肽之CTL活性。在一些態樣中，可諸如藉由結合活性，例如對抗原之特定親和力或親合力來選擇例如存在於抗原特异性T細胞上之TCR。在一些態樣中，使TCR經受定向演化，諸如藉由例如α或β鏈之突變誘發來進行。在一些態樣中，TCR之CDR內之特定殘基發生改變。在一些實施例中，可藉由親和力成熟來修飾所選TCR。在一些態樣中，所選TCR可用作針對抗原之親本支架TCR。
在一些實施例中，個體為人類，諸如具有COVID-19之人類。在一些實施例中，個體為嚙齒動物，諸如小鼠。在一些此類實施例中，小鼠為轉殖基因小鼠，諸如表現人類MHC (亦即，HLA)分子(諸如HLA-A2)之小鼠。參見Nicholson等人Adv Hematol. 2012; 2012: 404081。
在一些實施例中，個體係表現人類TCR之轉殖基因小鼠或為抗原陰性小鼠。參見Li等人 (2010) Nat Med.161029-1034；Obenaus等人 (2015) Nat Biotechnol.33:402-407。在一些態樣中，個體係表現人類HLA分子及人類TCR之轉殖基因小鼠。
在一些實施例中，諸如在個體為轉殖基因HLA小鼠之情況下，將經鑑別TCR修飾為例如嵌合或人類化的。在一些態樣中，諸如類似於已知的抗體人類化方法，修飾TCR支架。
在一些實施例中，使用此類支架分子來産生TCR文庫。
舉例而言，在一些實施例中，該文庫包括與親本或支架TCR分子相比已經修飾或經工程改造之TCR或其抗原結合部分。在一些實施例中，可使用定向演化方法來産生具有經改變特性，諸如對特定MHC-肽複合物具有更高親和力之TCR。在一些實施例中，呈現方法涉及工程改造或修飾已知、親本或參考TCR。舉例而言，在某些情况下，野生型TCR可用作用於産生突變誘發TCR之模板，其中CDR之一或多個殘基發生突變，且選擇具有所需經改變特性，諸如對所需標靶抗原具有更高親和力之突變體。在一些實施例中，藉由包括但不限於以下之呈現方法實現定向演化：酵母呈現(Holler等人 (2003) Nat Immunol4:55-62；Holler等人 (2000) Proc Natl Acad Sci USA97:5387-5392)、噬菌體呈現(Li等人 (2005) Nat Biotechnol23:349-354)或T細胞呈現(Chervin等人 (2008) J Immunol Methods339:175-184)。
在一些實施例中，該等文庫可為可溶性的。在一些實施例中，該等文庫為呈現文庫，其中TCR呈現於噬菌體或細胞之表面上，或附著於粒子或分子，諸如細胞、核糖體或核酸，例如RNA或DNA。通常，包括正常及疾病TCR文庫或多樣化文庫之TCR文庫可以任何形式産生，包括呈异源二聚體形式或呈單鏈形式。在一些實施例中，TCR之一或多個成員可為雙鏈异源二聚體。在一些實施例中，可藉由引入二硫鍵來促進Vα及Vβ鏈之配對。在一些實施例中，TCR文庫之成員可為TCR單鏈(scTv或ScTCR)，在一些情况下，其可包括由連接子分開之Vα及Vβ鏈。另外，在一些情况下，在自文庫篩選及選擇TCR之後，所選成員可以任何形式産生，諸如全長TCR异源二聚體或單鏈形式或其抗原結合片段。
在美國專利申請案2020/0182884中亦描述了鑑別在MHC分子之背景中與肽結合之分子之其他方法，該申請案以引用之方式整體併入本文中。 d. 臨床試驗期間之效應監測
監測SARS-CoV-2療法(例如化合物、藥物、疫苗或細胞療法)對T細胞反應性(例如，結合及/或T細胞活化及/或效應子功能之存在)之影響，不僅可應用於基礎候選肽-結合分子篩選，亦可應用於臨床試驗。舉例而言，可在罹患COVID-19之個體之臨床試驗中監測如本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽或組合物、編碼此類SARS-CoV-2免疫原性肽之核酸、MHC-肽複合物或者表現核酸、載體、免疫原性肽或MHC-肽複合物之細胞增加針對SARS-CoV-2感染之免疫反應(例如，T細胞免疫反應)的有效性。在此類臨床試驗中，結合及/或T細胞活化及/或效應子功能(例如，T細胞增生、殺死或細胞介素釋放)之存在可用作特定細胞、組織或系統之表型之「讀出」或標記物。同樣，可在罹患COVID-19之個體之臨床試驗中監測適應性T細胞療法之有效性，該療法利用經工程改造以表現藉由如本文所述之篩選分析確定之TCR的T細胞，或利用用免疫原性肽、MHC-肽複合物或者編碼及/或呈遞如本文所述之MHC-肽複合物之細胞刺激的T細胞來增加對感染SARS-CoV-2之細胞之免疫反應。在此類臨床試驗中，結合及/或T細胞活化及/或效應子功能(例如，T細胞增生、殺死或細胞介素釋放)之存在可用作特定細胞、組織或系統之表型之「讀出」或標記物。
在一實施例中，本發明提供一種用於監測SARS-CoV-2療法(例如，化合物、藥物、疫苗或細胞療法)治療個體之有效性之方法，該方法包括步驟a)在向個體提供至少一部分SARS-CoV-2療法之前自個體獲得之第一樣品中，測定自個體獲得之T細胞與一或多種免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準，及b)測定一或多種免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物與自個體獲得之T細胞之間的反應性之存在或水準，該等T細胞存在於提供部分SARS-CoV-2療法之后自個體獲得之第二樣品中，其中第二樣品中存在反應性或相對於第一樣品反應性水準較高指示該療法對治療個體之SARS-CoV-2有效。
舉例而言，增加SARS-CoV-2療法之投與可合適地增加自個體獲得之T細胞與一或多個種疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準，亦即增加SARS-CoV-2療法之有效性。根據此類實施例，自個體獲得之T細胞與一或多種免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準可用作SARS-CoV-2療法之有效性之指示，即使在缺乏可觀測表型反應之情况下亦如此。同樣，亦可使用對T細胞與一或多種免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準之分析(諸如藉由直接結合分析、螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點或細胞內流式分析)來選擇將接受SARS-CoV-2療法之患者。
舉例而言，在直接結合分析中，免疫原性肽或MHC-肽複合物可與放射性同位素或酶標記偶合，使得可藉由偵測經標記免疫原性肽或MHC-肽複合物來測定結合。舉例而言，免疫原性肽或MHC-肽複合物可直接地或間接地用 125I、 35S、 14C或 3H標記，且藉由對放射性發射直接計數或藉由閃爍計數來偵測放射性同位素。或者，可用例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶以酶法標記免疫原肽或MHC-肽複合物，且藉由測定適當受質至產物之轉化來偵測酶標記。亦可使用標準結合或酶分析分析來實現測定免疫原肽或MHC-肽複合物與T細胞之間的相互作用。在上述分析方法之一或多個實施例中，可需要固定免疫原性肽或MHC-肽複合物以適應該分析之自動化。
可在適合容納反應物之任何容器中實現免疫原肽或MHC-肽複合物與T細胞之結合。此類容器之非限制性實例包括微量滴定板、試管及微量離心管。本文所述之免疫原性肽或MHC-肽複合物之經固定形式亦可包括與固相結合之免疫原性肽或MHC-肽複合物，該固相如多孔、微孔(具有小於約一微米之平均孔直徑)或大孔(具有超過約10微米之平均孔直徑)材料，諸如膜、纖維素、硝基纖維素或玻璃纖維；珠粒，諸如由瓊脂糖或聚丙烯醯胺或乳膠製成之珠粒；或皿、板或孔之表面，諸如由聚苯乙烯製成之表面。
在一些實施例中，T細胞對一或多種免疫原性肽或一或多種本文所述之穩定MHC-肽複合物之反應性，結合及/或T細胞活化及/或效應子功能之存在。術語「T細胞活化」係指選自增生、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應子分子之釋放、細胞毒性活性及活化標記物之表現的T淋巴球，尤其係指細胞毒性T淋巴球之一或多種細胞反應。
可根據本文所述之T細胞功能參數中之任一者(例如，增生、細胞介素釋放、細胞毒性、細胞表面標記物表型之變化等)來量測T細胞對一或多種免疫原性肽或一或多種穩定MHC-肽複合物之反應性。
可藉由此項技術中熟知之方法，例如ELISA、酶聯免疫吸收點(ELISPOT)、Luminex®分析、細胞內細胞介素染色及流式細胞術及其組合(例如，細胞內細胞介素染色及流式細胞術)來量測細胞介素産生及/或釋放。其可根據所實施之方法來測定。
如本文所用，術語「細胞介素」係指介導及/或調控生物或細胞功能或過程(例如，免疫、發炎及造血)之分子。如本文所用，術語「細胞介素」包括「淋巴介質」、「趨化介素」、「單核因子」及「介白素」。可用細胞介素之實例為GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10.、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。
可例如經由併入諸如氚化胸苷分析或MTT分析之非放射性分析來測定由抗原特异性誘導或刺激免疫反應引起之T細胞之增生及純系擴增。
可使用此項技術中常規實踐之數種技術及方法中之任一者來執行測定CTL活性之細胞毒性分析(例如，Henkart等人 (2003) Fundamental Immunology1127-1150)。用於量測抗原特异性T細胞反應性之方法之額外描述可見於例如美國專利10,208,086及美國專利申請案2017/0209573中，該等專利中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。 VIII. 細胞療法
在某些態樣中，該等方法包括過繼性細胞療法，藉此向個體投與表現靶向MHC限制性抗原決定基之所提供分子的經遺傳工程改造細胞(例如，表現TCR或TCR樣CAR之細胞)。此類投與可以抗原靶向方式促進細胞活化(例如，T細胞活化)，使得感染SARS-CoV-2之細胞成為破壞目標。
因此，所提供之方法及用途包括用於過繼性細胞療法之方法及用途。在一些實施例中，該等方法包括將細胞或含有細胞之組合物投與至個體、組織或細胞，諸如患有、有風險患上或疑似患有疾病、疾患或病症之個體、組織或細胞。在一些實施例中，例如經由過繼性細胞療法，諸如過繼性T細胞療法，將該等細胞、群體及組合物投與至患有待治療之特定疾病或疾患之個體。在一些實施例中，將該等細胞或組合物投與至個體，諸如患有疾病或疾患或有患上疾病或疾患之風險之個體。在一些態樣中，該等方法由此治療(例如，改善)疾病或疾患之一或多種症狀。
用於過繼性細胞療法之細胞投與方法為已知的且可與所提供之方法及組合物聯合使用。舉例而言，過繼性T細胞療法方法描述於例如Gruenberg等人之美國專利申請公開案第2003/0170238號；Rosenberg之美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.8:577-585)中。參見例如Themeli等人 (2013) Nat Biotechnol.31: 928-933；Tsukahara等人 (2013) Biochem Biophys Res Commun438: 84-89；Davila等人 (2013) PLoS ONE8:e61338。
在一些實施例中，藉由自體轉移進行細胞療法，例如過繼性細胞療法，例如過繼性T細胞療法，其中自欲接受細胞療法之個體或自源自此類個體之樣品分離及/或以其他方式製備細胞。因此，在一些態樣中，該等細胞係源自需要治療之個體，例如患者，且在分離及加工之後將該等細胞投與至同一個體。
在一些實施例中，藉由同種異體轉移進行細胞療法，例如過繼性細胞療法，例如過繼性T細胞療法，其中自除了欲接受或最終接受細胞療法之個體以外之個體(例如，第一個體)分離及/或以其他方式製備細胞。在此類實施例中，隨後將該等細胞投與至相同物種之不同個體，例如第二個體。在一些實施例中，第一及第二個體在遺傳上一致。在一些實施例中，第一及第二個體在遺傳上相似。在一些實施例中，第二個體表現與第一個體相同之HLA類別或超類型。
在一些實施例中，投與該等細胞、細胞群體或組合物之個體為靈長類動物，諸如人類。在一些實施例中，靈長類動物為猴子或猿。個體可為雄性或雌性且可為任何合適的年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成人及老年個體。在一些實施例中，個體為非靈長類哺乳動物，諸如嚙齒動物。在一些實例中，患者或個體係用於疾病、過繼性細胞療法及/或用於評估諸如細胞介素釋放症候群(CRS)之毒性結果的經驗證動物模型。
可藉由任何合適方式，例如藉由注射，例如靜脈内或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射(subconjectval injection/subconjuntival injection)、眼球筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、眼球後注射、球周注射或後鞏膜旁遞送來投與該等結合分子，諸如TCR、TCR樣抗體及含有TCR樣抗體之嵌合受體(例如，CAR)及表現其之細胞。在一些實施例中，藉由非經腸、肺內及鼻內投與該等結合分子，且若需要局部治療，則藉由病變內投與進行投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥及投與可部分地取决於投與為短暫的抑或長期的。各種給藥方案包括但不限於在各種時間點單次或多次投與、推注投與及脈衝輸注。
對於疾病之預防或治療，該結合分子或細胞的適當劑量可取決於欲治療疾病之類型、結合分子之類型、疾病之嚴重程度及過程、投與結合分子係用於預防性抑或治療性目的、先前療法、患者的臨床病史及對結合分子之反應以及主治醫師之決定。在一些實施例中，該等組合物及分子以及細胞適合一次性或經一系列治療投與至患者。
在某些實施例中，可將細胞或細胞亞型之個別群體以約一百萬至約一千億個細胞之範圍及/或以下細胞量/公斤體重投與至個體：諸如100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞，或由前述值中之任兩者限定之範圍)，諸如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或由前述值中之任兩者限定之範圍)，及在一些情况下，約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或此等範圍及/或每公斤體重之間的任何值。劑量可視該疾病或病症及/或患者及/或其他治療所特有之屬性而變化。
在一些實施例中，例如，在個體為人類之情況下，劑量包括少於約1×10 8個總的重組受體(例如，CAR)表現細胞、T細胞或外周血單核細胞(PBMC)，例如在約1×10 6至1×10 8個此類細胞之範圍內，諸如2×10 6、5×10 6、1×10 7、5×10 7或1×10 8個或總的此類細胞，或在前述值中之任兩者之間的範圍。
在一些實施例中，該等細胞或結合分子(例如，TCR或TCR樣抗體)係作為組合治療之一部分投與，諸如與另一治療介入(諸如另一抗體或經工程改造之細胞或受體或劑，諸如細胞毒性或治療劑)同時或以任何次序依序投與。
在一些實施例中，該等細胞或結合分子(例如，TCR或TCR樣抗體)與一或多種額外治療劑共投與，或與另一治療介入聯合，同時或以任何次序依序投與。在一些情况下，該等細胞與時間上足够接近之另一療法共同投與，使得細胞群體增强一或多種額外治療劑之效應，反之亦然。在一些實施例中，該等細胞或結合分子(例如，TCR或TCR樣抗體)在一或多種額外治療劑之前投與。在一些實施例中，該等細胞或結合分子(例如，TCR或TCR樣抗體)在一或多種額外治療劑之後投與。
在一些態樣中，一旦將該等細胞投與至哺乳動物(例如，人類)，即藉由多種已知方法中之任一種來量測經工程改造之細胞群體及/或結合分子(例如，TCR或TCR樣抗體)之生物活性。欲評估之參數包括活體內例如藉由成像或者離體例如藉由ELISA或流式細胞術量測的經工程改造或天然T細胞或其他免疫細胞與抗原之特異性結合。在某些實施例中，可使用此項技術中已知之任何合適方法，諸如描述於例如Kochenderfer等人 (2009) J. Immunotherapy32:689-702及Herman等人 (2004) J. Immunological Methods285:25-40中之細胞毒性分析來量測經工程改造細胞破壞標靶細胞之能力。在某些實施例中，亦可藉由分析諸如CD 107a、IFNγ、IL-2及TNF之某些細胞介素之表現及/或分泌來量測該等細胞之生物活性。在一些態樣中，藉由評估諸如腫瘤負荷或負載减少之臨床結果來量測生物活性。
在某些實施例中，經工程改造細胞以多種方式經修飾，使得其治療或預防功效增加。舉例而言，由群體表現之經工程改造CAR或TCR可直接或間接藉由連接子與靶向部分結合。使例如CAR或TCR之化合物與靶向部分結合之實踐係此項技術中已知的。參見例如Wadwa等人 (1995) J. Drug Targeting3: 111及美國專利第5,087,616號。
在某些態樣中，可在用於提供SARS-CoV-2引發的抗原呈遞細胞及/或用此等抗原呈遞細胞産生之SARS-CoV-2特异性淋巴球之組合物及方法中使用本文所述之SARS-CoV-2免疫原性肽或編碼此類SARS-CoV-2免疫原性肽之核酸。在一些實施例中，使用此類抗原呈遞細胞及/或淋巴球來治療及/或預防COIVD-19 (亦即，SARS-CoV-2感染)。
在一些態樣中，本文提供用於製造SARS-CoV-2引發的抗原呈遞細胞之方法，該等方法藉由在足以使至少一種SARS-CoV-2免疫原性多肽由抗原呈遞細胞呈遞之條件下使抗原呈遞細胞與單獨或與佐劑組合的本文所述之SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼至少一種SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸接觸來進行。
在一些實施例中，可使單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸與包含抗原呈遞細胞之同源、實質上同質或异源組合物接觸。舉例而言，該組合物可包括但不限於全血、新鮮血液或其部分，諸如但不限於外周血單核細胞、全血之膚色血球層部分、濃縮紅細胞、輻射血液、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、中性顆粒球、淋巴球、天然殺手細胞及天然殺手T細胞。若視情況使用抗原呈遞細胞之前驅物，則可在足以使該等前驅物分化成抗原呈遞細胞之合適培養條件下培養該等前驅物。在一些實施例中，抗原呈遞細胞(或其前驅物)係選自單核球、巨噬細胞、髓系細胞、B細胞、樹突狀細胞或朗格漢斯細胞。
與抗原呈遞細胞接觸置放之單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸的量可由一般技術者藉由常規實驗測定。一般而言，使抗原呈遞細胞與單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸接觸，持續足以使細胞呈遞用於調節T細胞之抗原之經加工形式的時段。在一實施例中，在單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸存在下培育抗原呈遞細胞持續少於約一週，說明性地，持續約1分鐘至約48小時、約2分鐘至約36小時、約3分鐘至約24小時、約4分鐘至約12小時、約6分鐘至約8小時、約8分鐘至約6小時小時、約10分鐘至約5小時、約15分鐘至約4小時、約20分鐘至約3小時、約30分鐘至約2小時以及約40分鐘至約1小時。可例如使用脈衝追踪方法來測定抗原呈遞細胞加工及呈遞抗原所必需之單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸的時間及量，其中在接觸之後為洗淨期及暴露於讀出系統(例如，抗原反應性T細胞)。
在某些實施例中，可使用用於將抗原遞送至抗原呈遞細胞之內源加工路徑之任何適當方法。此類方法包括但不限於涉及pH敏感性脂質體之方法、抗原與佐劑之偶合、凋亡細胞遞送、將細胞脈衝輸送至樹突狀細胞上、將包含抗原之重組嵌合病毒樣粒子(VLP)遞送至樹突狀細胞株之MHC I類加工路徑。
在一實施例中，使經溶解SARS-CoV-2免疫原性多肽與抗原呈遞細胞一起培育。在一些實施例中，可使SARS-CoV-2免疫原性多肽與細胞溶素偶合以增强抗原至抗原呈遞細胞之細胞溶質中的轉移，從而遞送至MHC I類路徑。例示性細胞溶素包括皂苷化合物，諸如含皂苷之免疫刺激複合物(ISCOM5)、成孔毒素(例如，α-毒素)以及革蘭氏陽性細菌之天然細胞溶素，諸如李斯特菌溶血素O (LLO)、鏈球菌溶血素O (SLO)及穿孔球菌溶血素O (PFO)。
在一些實施例中，可根據此項技術中已知之方法分離抗原呈遞細胞(諸如樹突狀細胞及巨噬細胞)，且藉由此項技術中已知的用於將編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸引入至抗原呈遞細胞中之方法用聚核苷酸進行轉染。轉染試劑及方法係此項技術中已知的且可購得。舉例而言，可在合適培養基中提供編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之RNA且與脂質(例如，陽離子脂質)組合，接著與抗原呈遞細胞接觸。此類脂質之非限制性實例包括LIPOFECTIN TM及LIPOFECTAMINE TM。隨後可使所得聚核苷酸-脂質複合物與抗原呈遞細胞接觸。或者，可使用諸如電穿孔或磷酸鈣轉染之技術將聚核苷酸引入至抗原呈遞細胞中。接著可使用裝載聚核苷酸之抗原呈遞細胞在活體内或離體刺激T淋巴球(例如，細胞毒性T淋巴球)增生。在一實施例中，以過繼性免疫療法方法將離體擴增之T淋巴球投與至個體。
在某些態樣中，本文提供一種包含抗原呈遞細胞之組合物，該等細胞已在足以使SARS-CoV-2免疫原性抗原決定基由抗原呈遞細胞呈遞之條件下與單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸活體外接觸。
在一些態樣中，本文提供一種用於製備對SARS-CoV-2蛋白具有特异性之淋巴球之方法。該方法包含在足以産生能够引出針對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應的SARS-CoV-2蛋白特异性淋巴球之條件下，使淋巴球與上文所述之抗原呈遞細胞接觸。因此，亦可使用抗原呈遞細胞來提供淋巴球，包括T淋巴球及B淋巴球，用於引出針對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應。
在一些實施例中，使T淋巴球製劑與上文所述之抗原呈遞細胞接觸一個時段(例如，至少約24小時)以將T淋巴球引至由抗原呈遞細胞呈遞之SARS-CoV-2免疫原性抗原決定基。
在一些實施例中，抗原呈遞細胞群體可與外周血T淋巴球之异源群體以及單獨或與佐劑組合的SARS-CoV-2免疫原性多肽或編碼SARS-CoV-2免疫原性多肽之核酸一起共培養。該等細胞可在足以使SARS-CoV-2多肽中包括之SARS-CoV-2抗原決定基由抗原呈遞細胞呈遞之條件下共培養持續一個時段，且引發T淋巴球群體對細胞作出反應之抗原呈遞細胞經SARS-CoV-2病毒感染。在某些實施例中，本文提供引發對感染SARS-CoV-2病毒之細胞作出反應之T淋巴球及B淋巴球。
T淋巴球可獲自任何合適來源，諸如外周血、脾臟及淋巴結。T淋巴球可用作粗製劑或部分經純化或實質上經純化製劑，其可藉由標準技術獲得，該等技術包括但不限於涉及使用抗體之免疫磁性或流式細胞術技術之方法。
在某些態樣中，本文提供一種組合物(例如，醫藥組合物)，其包含上文所述之抗原呈遞細胞或淋巴球以及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑。在一些實施例中，該組合物進一步包含如上所述之佐劑。
在某些態樣中，本文提供一種用於引出對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應的方法，該方法包含向個體投與足以引出免疫反應之有效量的上文所述之抗原呈遞細胞或淋巴球。在一些實施例中，本文提供一種用於治療或預防COVID-19之方法，該方法包含向個體投與有效量之上文所述之抗原呈遞細胞或淋巴球。在一實施例中，抗原呈遞細胞或淋巴球係全身投與，較佳藉由注射投與。或者，吾人可例如經由直接注射至組織中來進行局部而非全身性投與，諸如在儲槽或持續釋放調配物中。
在某些實施例中，本文所述之抗原引發之抗原呈遞細胞及由此等抗原呈遞細胞産生的抗原特异性T淋巴球可用作免疫調節組合物中之活性化合物，用於預防性或治療性治療COVID-19。在一些實施例中，本文所述之SARS-CoV-2引發之抗原呈遞細胞可用於産生CD8 +T淋巴球、CD4 +T淋巴球及/或B淋巴球以用於過繼性轉移至個體。因此，例如，SARS-CoV-2特异性淋巴球可進行過繼性轉移以用於罹患COVID-19之個體之治療目的。
在某些實施例中，本文所述之抗原呈遞細胞及/或淋巴球可單獨或組合投與至個體，用於引出免疫反應，尤其引出對感染SARS-CoV-2病毒之細胞之免疫反應。在一些實施例中，抗原呈遞細胞及/或淋巴球可源自個體(亦即，自體細胞)或源自與個體MHC匹配或錯配之不同個體(例如，同種异體)。
可進行抗原呈遞細胞及淋巴球之單次或多次投與，其中細胞數目及治療係由護理人員(例如，醫師)選擇。在一些實施例中，抗原呈遞細胞及/或淋巴球係在醫藥學上可接受之載劑中投與。合適載劑可為其中生長有細胞之生長培養基，或任何合適緩衝培養基，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水。該等細胞可單獨或作為與其他治療劑聯合之輔助療法投與。 IX. 套組
本發明亦涵蓋套組。舉例而言，該套組可包含封裝於合適容器中之免疫原性肽、包含編碼免疫原性肽之序列之載體、如本文所述之穩定MHC-肽複合物、佐劑及其組合，且可進一步包含使用此類試劑之說明書。該套組亦可含有其他組件，諸如封裝於單獨容器中之投與工具。
藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例不應解釋為限制性的。本申請案中引用之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容以及附圖均以引用之方式併入本文中。 實例 實例 1 ： SARS-CoV-2 疫苗構築體
進行研究以建構將產生對SARS-CoV-2之最強可能CD8 T細胞反應之疫苗。這包括使對各個別抗原決定基之反應的量級以及總靶向抗原決定基之寬度增至最大。同時，疫苗設計面臨數種限制。一個重要考慮因素係整個疫苗構築體之有限尺寸；尺寸過大對疫苗遞送系統(諸如mRNA或病毒載體)構成挑戰且可阻礙完整構築體之有效表現。
該領域中對多抗原決定基疫苗產生真正強大的T細胞反應之能力存在相當大的懷疑。此懷疑集中於兩個主要挑戰上。第一個挑戰涉及疫苗中包括之抗原決定基的有限集合。多抗原決定基疫苗主要僅包括個別經編碼肽抗原決定基。相比之下，包括完整蛋白質之疫苗可加工成數千個不同抗原決定基–其中不同抗原決定基在不同MHC等位基因上呈遞。SARS-CoV-2 S蛋白尺寸之蛋白質含有如此多的潛在抗原決定基，使得針對每個可能的MHC等位基因存在多種經預測高親和力結合劑。多抗原決定基疫苗之挑戰係針對有限、MHC限制、預定義之抗原決定基集合引出比針對完整蛋白質將天然地獲得的反應更強之反應。第二個挑戰涉及在多抗原決定基疫苗之背景中該等抗原決定基之加工及呈遞。僅因為所發現之抗原決定基在SARS-CoV-2感染之背景中有效呈遞，並不意謂其將在多抗原決定基疫苗之背景中呈遞。由於多抗原決定基疫苗中包括之抗原決定基的數目有限，這一問題尤為嚴重；該疫苗中即使一小部分之抗原決定基未能呈遞亦可對該疫苗在特定MHC等位基因上引出反應之能力造成巨大影響。
此等挑戰在該領域中得到廣泛理解且已阻礙成功開發針對其他病毒之多抗原決定基疫苗。實際上，即使考慮到最近開展了SARS-CoV-2抗原決定基定位工作且鑑別了在各MHC等位基因上識別之高度免疫顯性抗原決定基之有限集合，人們仍對此等生物見解是否可能轉譯為克服此等基本挑戰之有效疫苗持相當大的懷疑態度。
在多抗原決定基疫苗之設計中作出兩組開放式決策，其包括1)該疫苗中包括之內容物及2)其中表現該內容物之背景。
探索這兩項決策之廣泛選擇。利用先前產生之獨特試劑(來自一組恢復期COVID19患者之高度活性記憶CD8 T細胞)，設計多種疫苗以進行實驗檢查。
詳言之，由所設計之蛋白質疫苗序列回譯DNA序列且接著使用GenSmart™密碼子最佳化算法(GenScript, Inc.；亦參見PCT公開案WO 2020/0024917)進行序列最佳化。訂購呈gBlocks (Integrated DNA Technologies Inc.)形式之DNA且使用NEBuilder® HiFi DNA組裝主混合液(New England Biolabs；目錄#E2621S)將其組裝成EcoRI線性化pHAGE-CMV-IRES-Puro載體(Kula等人 (2019) Cell178:1016-1028)。將總成轉化成Mix & Go!化學勝任細胞(Zymo Research；目錄#T3007)且選擇個別群落用於Sanger測序。
用各疫苗構築體以感染複數(MOI) 1轉導表現A*02:01之HEK293細胞且使用嘌呤黴素(1.5 ug/mL, Gibco)進行選擇。將5×10 4個細胞接種於96孔板中且靜置16 h。以2:1之效應子:標靶比率添加自恢復期COVID-19患者分離之記憶CD8 T細胞(Ferretti等人 (2020) ImmunityS1074-7613(20)30447-7；在doi.org/10.1016/j.immuni.2020.10.006可獲得)且培育持續16-18小時。在培育之後，藉由移液管吸移使該等細胞混合，轉移至V型底96孔板，且藉由在300xg下離心持續5分鐘使其集結成粒。收集上清液且使用Ella (Protein Simple)來量測IFNγ。用BV421結合之抗CD8 (BioLegend)、AF647結合之抗CD69 (Biolegend)及PE結合之抗CD137 (Miltenyi)抗體對細胞集結粒進行染色，且在Cytoflex S (Beckman Coulter)上進行分析。
結果證明，該疫苗之背景及內容物均已以未預測之方式對其效能產生深刻影響。此外，據觀察，與臨床試驗中之當前疫苗候選物相比，所設計之疫苗構築體很有希望產生更強的CD8 T細胞反應。
鑑別了在六個最常見MHC等位基因上呈遞之免疫顯性抗原決定基：HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02及HLA-B*07:02。設計了多抗原決定基疫苗，其編碼全部29個已鑑別之免疫顯性抗原決定基(6個A2、8個A1、4個A3、5個A11、3個A24、3個B7)或19個免疫顯性抗原決定基(每個MHC有3-4個)。當選擇該19個抗原決定基時，包括在多個MHC等位基因上具有經預測或驗證之呈遞的抗原決定基。此19個抗原決定基包括下文所鑑別之表L1的子集。
下文表L由表L1及表L2構成，鑑別了可用於所揭示之構築體中的29個肽抗原決定基(例如表L1中之序列，及表L2中之額外數據)。應注意，表L清楚地證明orf3a、M及N以及orf1ab蛋白係用於容納T細胞抗原決定基之熱點。 表 L1
等位基因 肽名稱 肽 蛋白質 開始 結束 多個HLA等位基因 用於19個抗原決定基之構築體
0 A02 KLW KLWAQCVQL ORF1ab 3886 3894 是
1 A02 YLQ YLQPRTFLL S 269 277 是
2 A02 LLY LLYDANYFL ORF3a 139 147 是
3 A02 ALW ALWEIQQVV ORF1ab 4094 4102 是
4 A02 LLL LLLDRLNQL N 222 230
5 A02 YLF YLFDESGEFKL ORF1ab 906 916
6 A01 FTS FTSDYYQLY ORF3a 207 215 是
7 A01 TTD TTDPSFLGRY ORF1ab 1637 1646 是
8 A01 PTD PTDNYITTY ORF1ab 1321 1329 是
9 A01 ATS ATSRTLSYY M 171 179 是(A01及A11)
10 A01 CTD CTDDNALAYY ORF1ab 4163 4172
11 A01 NTC NTCDGTTFTY ORF1ab 4082 4091
12 A01 DTD DTDFVNEFY ORF1ab 5130 5138
13 A01 GTD GTDLEGNFY ORF1ab 3437 3445
14 A03 KTF KTFPPTEPK N 361 369 是(A03及A11) 是
15 A03 KCY KCYGVSPTK S 378 386 是
16 A03 MVT MVTNNTFTLK ORF1ab 807 816 是
17 A03 KTI KTIQPRVEK ORF1ab 282 290
18 A11 KTF KTFPPTEPK N 361 369 是(A03及A11)
19 A11 VTD VTDTPKGPK ORF1ab 4216 4224 是
20 A11 ATE ATEGALNTPK N 134 143 是
21 A11 ASA ASAFFGMSR N 311 319
22 A11 ATS ATSRTLSYYK M 171 180 是(A01及A11) 是
23 A24 QYI QYIKWPWYI S 1208 1216 是
24 A24 VYF VYFLQSINF ORF3a 112 120 是
25 A24 VYI VYIGDPAQL ORF1ab 5721 5729 是
26 B07 SPR SPRWYFYYL N 105 113 是
27 B07 RPD RPDTRYVL ORF1ab 2949 2956 是
28 B07 IPR IPRRNVATL ORF1ab 5916 5924 是
表 L2
   等位基因 肽名稱 親和力(nM) 部分% (螢幕M+ 2SD) 部分% (四聚體)
0 A02 KLW 17.7 88.9 77.8
1 A02 YLQ 5.4 77.8 44.4
2 A02 LLY 3.1 88.9 55.6
3 A02 ALW 7.8 88.9 25.9
4 A02 LLL 14.8 33.3 22.2
5 A02 YLF 22.2 44.4 18.5
6 A01 FTS 3.2 100   
7 A01 TTD 7.2 100   
8 A01 PTD 6.1 80   
9 A01 ATS 16.7 60   
10 A01 CTD 5.3 100   
11 A01 NTC 121.8 60   
12 A01 DTD 2.8 40   
13 A01 GTD 6 40   
14 A03 KTF 20.8 100   
15 A03 KCY 152.6 100   
16 A03 MVT 19.8 40   
17 A03 KTI 113.2 40   
18 A11 KTF 6.3 100   
19 A11 VTD 160.6 60   
20 A11 ATE 55.5 80   
21 A11 ASA 14.4 40   
22 A11 ATS 7.9 60   
23 A24 QYI 13.2 60   
24 A24 VYF 47.4 80   
25 A24 VYI 206 40   
26 B07 SPR 6.3 80   
27 B07 RPD 56.9 80   
28 B07 IPR 5.1 20   
就疫苗背景而言，一個重要因素為抗原決定基之間的連接子。該連接子係該等抗原決定基是否有可能經有效加工及呈遞之關鍵決定因素。所測試之構築體完全不具有連接子(直接串接)，在每個抗原決定基上游及下游具有3aa (相鄰抗原決定基之間總計6aa間距)，或者在每個抗原決定基集合之間具有最佳化蛋白酶體裂解序列「KAA」。額外工作亦包括最佳化多抗原決定基疫苗內之抗原決定基次序。此處，目的係使以高親和力結合MHC但未在SARS-CoV-2基因組中發現之接合抗原決定基的產生減至最少；此類抗原決定基將與所需抗原決定基競爭呈遞。開發一種算法以迭代地改變抗原決定基次序，從而移除多抗原決定基構築體內之最高親和力的經預測抗原決定基。將此算法應用於10,000個不同的起始構築體且選擇具有最佳最終效能之變異體。詳言之，已確定促成差異之變數係在評估接合新抗原決定基時考慮哪些HLA等位基因之選擇。出於該算法之目的，選擇呈遞表L中之抗原決定基的6個HLA等位基因。接著，產生在所選擇之抗原決定基之間的所有可能接合之廣泛集合。使用NetMHC4.0算法(Jurtz等人 (2017) J. Immunol.199:3360-3368)來確定所檢查之6個MHC等位基因上之MHC結合抗原決定基。對於每個接合，鑑別出未源自天然病毒序列(亦即，由於接合自身而產生)之最高親和力的經預測結合劑。接著，分配該等抗原決定基之隨機起始次序。對於既定次序，鑑別出最高親和力的經預測接合抗原決定基。評估可能在該構築體內交換兩個抗原決定基之所有可能方式，且選擇導致最低親和力的剩餘接合抗原決定基之抗原決定基交換。重複此過程，直至無抗原決定基交換可能進一步改良該構築體。此完整算法以10,000個隨機起始次序運行，且選擇表現最佳之最終次序(亦即，其中最高親和力的接合抗原決定基具有最低可能親和力之次序)。
在設計不同構築體之過程中，多抗原決定基疫苗內之個別抗原決定基的位置亦發生變化。最終，所設計之多抗原決定基疫苗係經建構為在細胞質中表現之獨立構築體，或在多順反子表現背景中經建構為在原生SARS-CoV-2 S蛋白之後(使用P2A序列使得在該S蛋白使用其天然信號序列進行跨膜表現之後，吾人之多抗原決定基疫苗能夠直接進行細胞質表現)。
為了評估此等構築體，使用慢病毒轉導(在低MOI下)在僅表現HLA-A*02:01之HEK293T細胞中表現各構築體。接著使經修飾HEK293T細胞與來自一組恢復期COVID-19患者(例如，A*02:01陽性COVID-19患者)之記憶CD8 T細胞進行共培養。使用IFNγ (IFNg)分泌來評估針對任何經呈遞抗原決定基之T細胞反應的強度。這提供了該等抗原決定基在每種疫苗之背景中呈遞之效率如何的讀數。基於先前的工作，已知大多數COVID19恢復期患者針對所測試之抗原決定基產生記憶CD8 T細胞，因此反應強度提供了該等抗原決定基在各疫苗構築體中有效呈遞之效率如何的直接讀數。
包括數個重要對照。首先，單獨測試HEK293T細胞(無任何病毒序列)，該等細胞充當陰性對照(「A2 Screps」)。其次，使用用三個免疫顯性HLA-A*02:01 SARS-CoV-2抗原決定基之集合產生脈衝之肽作為陽性對照(由於肽脈衝以高效率直接裝載至MHC上) (「A2 Screps + KLW/YLQ/LLY」)。第三，單獨使用S蛋白。這是目前在臨床試驗中測試最佳之先導構築體，其允許使藉由多抗原決定基構築體引出之T細胞反應的量級與此基線進行比較。最後，跨越該三個免疫顯性HLA-A*02:01抗原決定基中之每一者的約500 aa大片段亦包括於脈衝實驗中。
實驗結果顯示於圖3及圖4中且測定了數個關鍵結果。
首先，觀察到抗原決定基呈遞之效率之間存在顯著差異，視各疫苗之背景而定。詳言之，使用在各抗原決定基上游及下游之三個胺基酸係經鑑別為優於不存在連接子或使用KAA連接子。其次，觀察到該構築體之細胞質表現至關重要。實際上，儘管S蛋白含有一個免疫顯性HLA-A*02:01抗原決定基，在任何患者中均觀察到對全長S蛋白之極其微弱反應。事實上，S蛋白中跨越此抗原決定基之500 aa片段(「ORF S-1」)之表現導致較強反應，由此突出顯示全長S蛋白導致特別差的呈遞。第三，觀察到多抗原決定基疫苗之直接表現導致比使用P2A序列更強之表現。一般而言，27個抗原決定基之表現導致比19個抗原決定基之表現更強的反應。
然而，最引人注目之收穫係整個疫苗構築體之效率。與單獨S蛋白相比，所有所測試之多抗原決定基構築體均導致顯著更強之T細胞反應，且數種最佳構築體比陽性對照肽脈衝表現更好。此結果非常令人驚訝，且強調了在使用適當抗原決定基、連接子及蛋白質背景時多抗原決定基疫苗之潛力。
此等結果與對多抗原決定基構築體之效用持懷疑態度的先前技術形成鮮明對比。舉例而言，Korber等人 (2009) J. Virol.(2009) 83: 8300–8314提供了用於HIV之基於T-細胞之疫苗方法的廣泛概述，且在其關於多抗原決定基疫苗之部分中突出顯示了利用此理論方法所觀察到的免疫原性缺乏。
基於所進行之研究，已發現以下兩項很重要。首先，該等抗原決定基自身之身份。所包括之抗原決定基係具有最高水準之功能性驗證的彼等抗原決定基–其在實際SARS-CoV-2感染之背景中具有免疫顯性。已鑑別出其他抗原決定基，其係經預測的，藉由質譜分析在受感染細胞中偵測到，或在敏感抗原特異性擴增之後由恢復期患者識別出；這未顯示其具有免疫顯性(且因此在疫苗背景中，有可能最具免疫原性且由免疫系統有效地識別)。其次，所包括之抗原決定基的數目。在一些實施例中，選擇抗原決定基以涵蓋多種多樣的HLA類型(例如，每一個該6種最常見的HLA至少一個免疫顯性抗原決定基)。應注意，一些抗原決定基由多個HLA等位基因呈遞，因此有可能僅用4或5個抗原決定基在6種等位基因中之每一者上獲得單一免疫顯性抗原決定基。例如，因此可能用4、5、6個或更多個抗原決定基實現每一個該6種最常見的HLA至少一個免疫顯性抗原決定基之最低覆蓋，由此提供群體中之HLA多樣性的合理覆蓋–低於此類HLA多樣性覆蓋之疫苗將具有大的盲點且錯過具有次最佳HLA等位基因之患者。更廣泛地，咸信藉由添加更多抗原決定基顯著增加該疫苗之價值。在一些實施例中，該等構築體具有每一個該6種最常見的HLA至少兩個免疫顯性抗原決定基。所測試之構築體具有最少18個抗原決定基(在6個HLA等位基因中之每一者上大約3個)，且咸信此舉增加產生強烈且廣泛反應。
咸信每一個HLA等位基因具有多個抗原決定基很重要，因為1)並非始終知曉哪些抗原決定基(或蛋白質)最具保護性，2)更有可能將針對所包括之抗原決定基中的至少一者產生強烈T細胞反應，及3)針對多個抗原決定基之T細胞反應對於功效及預防抗原逃逸變異體而言很重要。
以下因素經確定為具有可量測但相對較低之重要性。
一個因素係該等抗原決定基之間的連接子之身份。雖然多種連接子顯示一些功效，但使用3個胺基酸之連接子所見的抗原決定基呈遞之約2倍增強很有意義，不過更長連接子亦合適。
另一因素係該等抗原決定基之次序。使該等抗原決定基之次序最佳化以限制接合抗原決定基，但咸信具有多種抗原決定基次序之構築體顯示可相當的結果。對於何種接合抗原決定基被視為有問題，沒有硬性截止。一般而言，咸信高親和力的接合抗原決定基與所需抗原決定基競爭，且由此降低所觀察到之免疫反應的量級。對於該等疫苗構築體，移除經預測結合親和力＜ 77 nM (諸如≤ 75 nM、≤ 70 nM、≤ 65 nM、≤ 60 nM、≤ 55 nM、≤ 50 nM、≤ 45 nM、≤ 40 nM、≤ 35 nM、≤ 30 nM、≤ 25 nM、≤ 20 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 5 nM或更低或者其間任何範圍(包括其)，諸如50-75 nM)之所有接合抗原決定基。在所揭示之29個抗原決定基之疫苗的情況下，此意謂整個構築體中之22個最高親和力的經預測結合劑係尤為需要之抗原決定基。咸信具有經預測高親和力結合之單一抗原決定基將不具有顯著效應，且一般難以量測移除接合抗原決定基之益處。
此外，相關背景中之研究表明取向對呈遞效率幾乎無影響。理論上，N端抗原決定基可能更有效地呈遞片段，因為將始終合成N端，而一些缺陷蛋白產物可缺乏C端。然而，實驗數據表明抗原決定基在多個取向中之呈遞一般可相當。
由於整體疫苗構築體之尺寸限制，在添加抗原決定基重複對包括額外的新穎抗原決定基之間存在取捨。優先考慮額外的新穎抗原決定基以提供更廣泛HLA覆蓋及更多抗原決定基(從而提供更多病毒蛋白之覆蓋)。
根據初步分析，3aa連接子看來相對最有效。更長連接子可能與3aa同樣有效，但其需要更大的整體疫苗構築體且甚至無連接子疫苗亦顯示一些功效。因此，具有連接子總體上係有用的。
在一些實施例中，核糖體停止/再啟動位點為較佳的，因為其最強且最小。在某些實施例中，亦可使用IRES或轉譯後裂解序列。在一些實施例中，可使S蛋白與多抗原決定基疫苗共表現以使得能夠產生抗體反應。咸信該兩種蛋白質可能以任一次序表現。通常，第一種蛋白質將具有較高表現水準，且具有S蛋白之較高表現可能更為重要(若僅為了與單獨S蛋白疫苗進行直接比較)。預期該疫苗將以任一取向起作用。
一般而言，多順反子表現之替代方案係同時遞送兩種疫苗(使用如mRNA之遞送系統尤其容易進行)。
多種偵測方法可用於此等研究中。舉例而言，可使用四聚體染色來定量針對個別抗原決定基之T細胞，使用T細胞活化分析(例如，CD137染色、細胞內IFNg染色等)來定量反應性T細胞，且使用TCR測序來證明該疫苗再現了在天然感染中產生之TCR譜系。 實例 2 ：額外 SARS-CoV-2 疫苗構築體及確認結果
為了進一步確認上述結果，設計額外SARS-CoV-2疫苗構築體，諸如圖9C-9E中所述之彼等。
亦執行額外分析以進一步確認上述結果。舉例而言，使用經調配為脂質奈米粒子(LNP)之疫苗構築體來進行多種活體外分析。圖10顯示自SARS-CoV-2患者分離之記憶T細胞與用圖9C中所述之疫苗構築體的代表性LNP調配物處理之細胞反應，由此證明細胞可有效地加工且呈遞抗原決定基，使得可以與受SARS-CoV-2感染之細胞相似的方式識別該等細胞。簡言之，根據製造商之說明書，使用CD8+記憶T細胞分離套組(Miltenyi, 目錄#130-094-412)自最近恢復之SARS-CoV-2患者(Tmem池)分離記憶T細胞。使Tmem池與表現HLA-A*02:01或HLA-B*07:02之無HLA I類HEK293T細胞進行共培養，該等細胞經圖9C中之構築體的1 ug/mL mRNA-LNP複合物處理。24小時之後，根據製造商之說明書，使用人類IFN-γ第3代Simple Plex Ella分析(Protein Simple, 目錄#SPCKB-PS-002574)來量測干擾素γ。
此外，可使用個別TCR純系作為試劑來評估特定抗原決定基之加工及呈遞(諸如圖11中所示之彼等代表性純系及數據)。例如，圖11顯示出圖6A中所述之27個抗原決定基之構築體中所含的四個個別抗原決定基以能夠由對SARS-CoV-2抗原決定基具特異性之TCR識別的方式經加工及呈遞。簡言之，使用EasySep™人類CD14陽性選擇套組II (StemCell Technologies, 17858)自HLA-A*02:01及HLA-B*07:02陽性健康供體分離單核球，且在介白素-4及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子存在下培養48小時以分化成單核球源性樹突狀細胞(moDC)。用含有來自圖6A中所述之構築體的1 ug/mL mRNA之LNP處理MoDC持續四小時，接著用TNFα、IL-1β、IL-6及PGE2處理。48小時後，使moDC與用個別TCR轉導之T細胞進行共培養，該等TCR各自識別表1A及表1F中所述之LLY、SPR、KLW或YLQ抗原決定基。藉由用AF647結合之抗CD69 (Biolegend, 目錄#310918)及PE結合之抗CD137 (Biolegend, 目錄#309804)抗體染色來量測TCR之活化，藉由流式細胞術(Cytoflex S, Beckman Coulter)進行偵測。
有趣的是，亦確定圖9C中所述之疫苗構築體的LNP調配物利用共同TRAV基因產生SARS-CoV-2抗原決定基特異性TCR (圖13-16)。
回應於天然SARS-CoV-2感染，識別SARS-CoV-2之相同免疫顯性抗原決定基的TCR共享共同TRAV基因且係自感染恢復之後不久由SARS-CoV-2患者之記憶T細胞(Tmem)利用的顯性TRAV基因(圖12)。為了確認疫苗構築體由使用與來自COVID患者之Tmem細胞相同的TCR基因之原生譜系擴增T細胞，執行活體外疫苗模型(圖13)。簡言之，使經含有來自圖9C中所述之構築體的1 ug/mL mRNA之LNP處理之moDC與自健康供體血液分離之原生CD8 T細胞進行共培養，該等健康供體血液係在SARS-CoV-2廣泛感染之前，在2019年使用EasySep™人類原生CD8+ T細胞分離套組II (StemCell, 17968)收集的。在96孔板之多個孔中分離共培養物以偵測來自原生譜系之特定純系的擴增。在10天擴增之後，將各孔分成四個複本且用所指示之肽的經螢光標記四聚體(Tetramer Shop, 目錄#HA02-070及HB07-017)對一個複本之每一個孔進行染色，且藉由流式細胞術(Cytoflex S, Beckman Coulter)進行量測。匯集剩餘之複本且用分別以來自表1A及表1F之1 ug/mL各肽產生脈衝之HLA-A*02:01或HLA-B*07:02單等位基因HEK293T細胞進行再刺激(圖13)。藉由流式細胞術(MoFlo Astrios EQ)對利用CD69及CD137染色鑑別之再活化T細胞進行分選且測序以測定由經擴增T細胞利用之TRAV基因。結果證明，產生脈衝之SARS-CoV-2免疫顯性肽(諸如YLQ肽)在該分析中誘導肽特異性T細胞之擴增(圖14)且圖9C中所述之疫苗構築體在該分析中誘導SARS-CoV特異性T細胞之擴增(圖15)。有趣的是，亦確定圖9C中所述之疫苗構築體的LNP調配物利用共同TRAV基因產生SARS-CoV-2抗原決定基特異性TCR (圖16)。
可執行額外確認實驗。
在一代表性實施例中，執行加工及呈遞分析。舉例而言，將構築體(例如，經調配為封裝mRNA之脂質奈米粒子(mRNA-LNP))引入樹突狀細胞(DC)，該等樹突狀細胞係該構築體之標靶細胞。使經處理DC與抗原決定基特異性T細胞進行共培養且量測T細胞之反應性，諸如藉由分析表面活化標記物及IFNg。當T細胞作出反應時，該等抗原決定基可能適當地經加工及呈遞。為了比較構築體之抗原決定基加工及呈遞，使用EasySep™人類CD14陽性選擇套組II (StemCell Technologies, 17858)自具有匹配所關注之抗原決定基的HLA類型之健康供體分離單核球。在粒細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4 (IL-4)存在下培養單核球持續72 h以分化成moDC。72小時後，用含有各構築體之1 ug/mL mRNA之LNP處理moDC持續四小時且接著用TNFα、IL-1β、IL-6及PGE2處理。48小時後，以1:1 moDC:T細胞比率將經抗原決定基特異性TCR轉導之T細胞添加至培養物中且共培養持續24小時。藉由AIM CD69 (Biolegend, 目錄#309804)及CD137 (Biolegend, 目錄#309804)之流式細胞術染色來量測T細胞活化且藉由流式細胞術(Cytoflex S, Beckman Coulter)進行量測。能夠引出抗原決定基特異性T細胞之活化的構築體顯示，由TCR識別之抗原決定基充分地經加工及呈遞以誘導T細胞活化。此外，當在構築體之間比較單一抗原決定基之加工及呈遞時，由特定構築體引出之T細胞活化的較高水準係解釋為對於所量測之抗原決定基較高水準之加工及呈遞。
在另一代表性實施例中，執行活體外疫苗分析。舉例而言，再次將構築體(例如，mRNA-LNP調配物)引入至DC mRNA-LNP且使該等DC與來自2019年或更早收集之供體血液的原生T細胞(亦即，無COVID暴露)進行共培養。在96孔板之數百個孔中分離經共培養之細胞且藉由肽結合之MHC四聚體染色來量測抗原特異性擴增。藉由用抗原特異性純系鑑別之孔的數目來量測反應之量級(圖13)。在10天擴增之後，匯集T細胞且用表現所關注之單一HLA的HEK細胞進行再活化，再次用具有用於引出初始反應之構築體的1 ug/mL mRNA之LNP處理。用AIM CD69 (Biolegend, 目錄#309804)及CD137 (Biolegend, 目錄#309804)對細胞染色且對AIM雙陽性細胞進行分選，且對經重排TCR基因進行測序。該分析可比較對共培養作出反應之T細胞與來自COVID患者之記憶T細胞且分析經擴增T細胞之譜系。
在另一代表性實施例中，執行MHC擴增分析。例如，將構築體(例如，mRNA-LNP調配物)引入至表現匹配COVID患者記憶T細胞之HLA的單一HLA之細胞，諸如人類胚胎腎(HEK)細胞，以便確定SARS-CoV-2蛋白(諸如N、Orf3a及M)中之免疫原性區域是否含有在額外HLA上呈遞之抗原決定基，使得疫苗接種將在具有除上文所述之彼等HLA以外的HLA之個體中有效。為了評估將對該等構築體作出反應之人的理論百分率，使用CD8+記憶T細胞分離套組(Miltenyi, 目錄#130-094-412)自最近自SARS-CoV-2感染恢復且表現除表1中所述之已知抗原決定基的HLA以外之HLA之患者分離CD8 Tmem細胞且加以儲存。使Tmem細胞與表現匹配HLA之單等位基因HEK細胞進行共培養且藉由使用人類IFN-γ第3代Simple Plex Ella分析(Protein Simple, 目錄#SPCKB-PS-002574)量測IFNγ釋放來測定T細胞活化。因為經該等構築體處理之HEK含有單一HLA，故Tmem細胞之活化顯示該構築體上之抗原決定基係經加工且呈遞於所測試之HLA上。此外，對COVID患者Tmem細胞之識別說明，未定義之抗原決定基足以在暴露於SARS-CoV-2之患者的記憶譜系中產生特定T細胞，且具有所測試之HLA的患者將可能能夠產生T細胞對由該構築體遞送之抗原決定基的反應。
在另一代表性實施例中，執行活體內疫苗分析。例如，可用構築體使動物模型(例如經工程改造以表現人類TCR譜系及人類MHC之人類化小鼠模型，諸如VELOCI-T®小鼠模型；Regeneron, Inc.)及人類個體免疫以測定抗SARS-CoV-2免疫性且可使用肽結合之MHC四聚體染色、ELISPOT分析或共培養分析來量測抗原決定基特異性T細胞反應，其中使來自接種疫苗之小鼠或患者的Tmem細胞與經攜帶相應疫苗構築體之mRNA的LNP處理之單等位基因HEK進行共培養。 以引用之方式併入
本文所提及之所有出版物、專利及專利申請案均由此以引用之方式整體併入，就如同各個別出版物、專利或專利申請案特定地且個別地經指示以引用之方式併入一般。在發生衝突之情况下，將以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。
亦以全文引用之方式併入引用與進入公共數據庫相關的寄存編號之任何聚核苷酸及多肽序列，諸如由美國基因組研究院(The Institute for Genomic Research；TIGR)在全球資訊網tigr.org處及/或美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov處所維持之彼等數據庫。 等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之本發明所涵蓋的特定實施例之多種等效物。此類等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。
申請文件之專利含有至少一張以彩色繪製的圖式。帶有彩色圖之本專利或專利申請公開案之副本將在必要費用之請求及支付後由專利局提供。
圖 1顯示編碼免疫顯性抗原決定基之代表性多抗原決定基疫苗構築體(例如，免疫原性多肽之實施例)。 圖 2顯示代表性下一代SARS-CoV-2疫苗構築體(例如，免疫原性多肽之實施例)。 圖 3顯示COVID-19患者記憶CD8 T細胞對多種疫苗構築體之反應。數據係兩名患者之平均值(以個別點顯示)。 圖 4顯示與單獨S蛋白相比，所選疫苗構築體顯示優異CD8 T細胞活化。測試9名患者之記憶CD8 T細胞對SARS-CoV-2疫苗構築體之反應性以產生數據。 圖 5A- 圖 5C顯示代表性19-抗原決定基構築體。 圖 5A顯示具有3aa連接子之代表性19-抗原決定基構築體。 圖 5B顯示具有KAA連接子之代表性19-抗原決定基構築體。 圖 5C顯示不具有連接子之代表性19-抗原決定基構築體。 圖 6A- 圖 6C顯示代表性27-抗原決定基構築體。 圖 6A顯示具有3aa連接子之代表性27-抗原決定基構築體。 圖 6B顯示具有KAA連接子之代表性27-抗原決定基構築體。 圖 6C顯示不具有連接子之代表性27-抗原決定基構築體。 圖 7顯示代表性片段構築體(例如至少兩個肽片段之實施例，該等肽片段中之每一者均包含至少兩個肽抗原決定基)。 圖 8顯示與S蛋白區段及P2A融合之代表性片段構築體。 圖 9A- 圖 9E顯示代表性多抗原決定基構築體融合。 圖 9A顯示與S蛋白區段及P2A融合之具有3aa連接子之代表性19-抗原決定基構築體。 圖 9B顯示與S蛋白區段及P2A融合之具有3aa連接子之代表性27-抗原決定基構築體。 圖 9C顯示包含於來自SARS-CoV-2 N、Orf1a、M、Orf3a及S蛋白之14個片段中的代表性19-抗原決定基構築體。每一個片段由介於27個核苷酸至195個核苷酸之範圍內的核酸序列編碼且含有所發現之抗原決定基中的一或多者，涵蓋總計19種已知抗原決定基。設計14個片段之構築體以使其包括可由與所發現之抗原決定基相同的蛋白酶體片段呈遞之任何潛在免疫原性抗原決定基且包括可在除已知結合且呈遞所發現之抗原決定基之MHC分子以外的MHC分子上呈遞之潛在未發現抗原決定基。 圖 9D顯示包含於片段內之代表性多抗原決定基構築體，該等片段跨越整個(完整) SARS-CoV-2 M、N及Orf3a蛋白，但以非連續片段以及S蛋白片段表示，與來自SARS-CoV-2 Orf1ab及S蛋白之17個抗原決定基組合。此構築體係多抗原決定基構築體及基於片段之構築體的組合。例如，該構築體之5’部分係來自SARS-CoV-2之刺突及orf1ab蛋白的17個抗原決定基之多聯體，該等抗原決定基由周圍3個原生胺基酸連接在一起。該構築體之3’部分係共同跨越N、Orf3a及M蛋白且含有S蛋白的一個片段之片段之多聯體。為了避免產生功能性蛋白(例如，已知Orf3a蛋白具有免疫抑制活性)，將N、Orf3a及M蛋白分成2-3個片段且藉由交替每一個片段之次序使其分散於序列中。所有27種發現之抗原決定基均在此構築體中表示。包括SARS-CoV-2基因組之整個(完整) N、Orf3a及M區，因為在針對該區域之尺寸進行調節時，N、Orf3a及M蛋白含有最高豐度之抗原決定基。不受理論束縛，咸信此區域具有引起免疫原性抗原決定基之加工及呈遞的生物學驅動因子，且因此有可能含有可由多種不同MHC呈遞之抗原決定基，從而潛在地擴大可回應於該構築體之患者的數目。圖中之標題B.1.617.2_S.PP係指來自δ變異體(B.1.617.2)之S蛋白的PP穩定化形式。此代表性構築體中包括之S蛋白的片段係來自SARS-CoV-2之δ變異體。 圖 9E顯示包含於片段內之代表性多抗原決定基構築體，該等片段跨越整個(完整) SARS-CoV-2 M、N及Orf3a蛋白，但以非連續片段表示，與來自SARS-CoV-2 ORF1ab及S蛋白之片段組合。B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3a含有與圖9D中描述之Epi-M/N/ORF3a構築體相同的3’ N、Orf3a、M及S片段，除了5’ 17epi片段部分由來自圍繞圖9D之17個抗原決定基之Orf1ab及S蛋白的片段置換。其係來自14_片段抗原決定基之相同片段。圖中之標題B.1.617.2_S.PP係指來自δ變異體(B.1.617.2)之S蛋白的PP穩定化形式。此代表性構築體中包括之S蛋白的片段係來自SARS-CoV-2之δ變異體。圖9C-圖9E所示之代表性序列不包括額外序列，諸如連接子。舉例而言，3AA連接子係非必需的，因為較大片段為所鑑別之抗原決定基提供連接子空間，且未鑑別之抗原決定基係未定義的，以致連接子不存在確保了抗原決定基未直接處於區段之末端。該等區段未直接置於P2A位點處。一個例外係圖9D之多抗原決定基部分，其含有3AA連接子。 圖 10顯示來自SARS-CoV-2患者之記憶T細胞(Tmem)池識別圖9C之疫苗構築體。將十四(14)個片段之mRNA構築體(描述於圖9C中)與脂質奈米粒子一起引入至經修飾以表現單一MHC-I分子之單等位基因HEK293T細胞。使自恢復之SARS-CoV-2患者分離的記憶T細胞與構築體處理之單等位基因HEK293T細胞經受共培養且藉由利用ELISA量測干擾素γ釋放來測試對構築體之反應性。 圖 11顯示識別SARS-CoV-2之特異性抗原決定基的TCR與用含有圖6A之27多抗原決定基構築體之LNP處理的樹突狀細胞反應。在SARS-CoV2廣泛感染之前，自2019年在美國收集之血液中分離單核細胞源性樹突狀細胞(moDC)。用含有圖6A中之構築體之mRNA的LNP處理moDC。使對來自表1A或1F之每一個所指示抗原決定基具特異性的T細胞與LNP處理之moDC經受共培養且藉由活化誘導之標記物(AIM) CD69及CD137之流式細胞術染色來量測T細胞反應性。因此，充分地加工且呈遞含於此等構築體內之抗原決定基以引出抗原決定基特異性T細胞之反應。 圖 12顯示識別SARS-CoV-2之抗原決定基的TCR使用共同TRAV基因。顯示識別表1A及F之YLQ、KLW及SPR抗原決定基的特異性純系之頻率。突出顯示共享之顯性TRAV基因。亦參見Ferretti等人 (2020) Immunity53: 1095-1107，尤其圖4以及用於證明TCR使用共同TRAV基因之額外支持的材料及方法。 圖 13顯示活體外疫苗模型之代表性、非限制性實例。 圖 14顯示在圖13之活體外疫苗模型中，脈衝SARS-CoV-2免疫顯性肽誘導來自原生T細胞群體之肽特異性T細胞的擴增。如所指示，使用MHC-肽四聚體染色來偵測肽特異性TCR。 圖 15顯示在圖13之活體外疫苗模型中，疫苗構築體誘導來自原生T細胞群體之肽特異性T細胞的擴增。 圖 16A- 圖 16C顯示對應於已知由所測試之MHC呈遞的抗原決定基(圖12)之已知V區在來自用圖9C之構築體處理的活體外疫苗模型而非來自未處理對照之頂部擴增TCR純系中佔優勢。圖16A說明經擴增純系之TRAV基因，突出顯示了對應於已知結合YLQ肽之TCR的已知TRAV基因，其中背景減去高於對照樣品之最大值的頻率。圖16B及16C說明當用表1A及F中描述之已知肽再刺激時，對應於圖9C之疫苗構築體的經擴增純系之TRAV基因。針對所測試之所指示MHC，突出顯示了對應於已知結合圖9C中之構築體內的肽之TCR之TRAV基因，其中背景減去高於對照樣品之最大值的頻率。因此，此等構築體在活體外疫苗模型中誘導原生T細胞之反應，該模型再現了對SARS-CoV-2天然感染之免疫反應。 
<![CDATA[<110> TScan治療公司(TSCAN THERAPEUTICS, INC.)]]>
                AHS醫院集團(AHS HOSPITAL CORP.)
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          <![CDATA[<141> 2021-11-12]]>
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          Pro Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr 
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          Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys 
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          Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys 
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          <![CDATA[<211> 9]]>
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          <![CDATA[<400> 24]]>
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          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
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          <![CDATA[<400> 25]]>
          Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu 
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          Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu 
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          Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu 
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          <![CDATA[<211> 9]]>
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          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu 
          1               5                   
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          <![CDATA[<211> 288]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Tyr Ala Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp His 
          1               5                   10                  15      
          Ser Tyr Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Lys His 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu Pro Ala Pro Asp Ala Tyr 
                  35                  40                  45              
          Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Ile Trp Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Ile Thr Val Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr Ala Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ser Leu Glu Ile Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln Ala Glu Pro Asn Met Met Val Thr 
                  115                 120                 125             
          Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala Lys Asn Pro Leu Leu Tyr 
              130                 135                 140                 
          Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Cys Trp His Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Tyr Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser Ala Glu Ser Leu Arg Pro Asp Thr Arg 
                      180                 185                 190         
          Tyr Val Leu Met Asp Gly Arg Lys Val Pro Thr Asp Asn Tyr Ile Thr 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Pro Gly Gln Cys Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro 
              210                 215                 220                 
          Lys Val Lys Tyr Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Asn Asp Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp 
                          245                 250                 255     
          Leu Gly Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val Gln Leu His Asn 
                      260                 265                 270         
          Asp Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn 
                  275                 280                 285             
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 228]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 30]]>
          Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Lys Ala Ala Phe Thr Ser Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Tyr Gln Leu Tyr Lys Ala Ala Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln 
                      20                  25                  30          
          Leu Lys Ala Ala Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Ala Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Lys Ala Ala Ala Thr Ser 
              50                  55                  60                  
          Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Lys Ala Ala Val Tyr Phe Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asn Phe Lys Ala Ala Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Lys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Lys Ala Ala Leu 
                      100                 105                 110         
          Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Lys Ala Ala Ser Pro Arg Trp Tyr 
                  115                 120                 125             
          Phe Tyr Tyr Leu Lys Ala Ala Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Ala Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ala Ala Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Val Thr Asp Thr Pro 
                          165                 170                 175     
          Lys Gly Pro Lys Lys Ala Ala Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Ala Ala Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Lys Ala Ala Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Trp Ala Gln Cys Val Gln Leu Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Thr Phe Leu Leu 
          225             
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                多肽
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Leu Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu Lys Thr Phe Pro Pro 
                      20                  25                  30          
          Thr Glu Pro Lys Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Ala Thr 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn 
              50                  55                  60                  
          Phe Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Met Val Thr Asn Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Thr Leu Lys Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu Pro Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr 
                  115                 120                 125             
          Tyr Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro Lys Lys Cys Tyr Gly Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Thr Lys Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Lys Leu Trp Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Cys Val Gln Leu Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu 
                          165                 170                 
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 412]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 32]]>
          His Ser Tyr Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Lys 
          1               5                   10                  15      
          His Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu Pro Ala Pro Tyr Ala 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ala Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Tyr Leu Phe Asp Glu Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ala Ser His Lys Asn 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Cys Trp His Arg Lys Val 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Val Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Pro Asn Met Met 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala Ser Ile Ile Lys 
                  115                 120                 125             
          Thr Ile Gln Pro Arg Val Glu Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Glu Gln Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Lys Asp Leu Ser Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Thr Tyr Lys Asn Thr Cys Asp 
                          165                 170                 175     
          Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Val His Ala Gly Thr Asp Leu 
                      180                 185                 190         
          Glu Gly Asn Phe Tyr Gly Pro Phe Glu Ser Leu Arg Pro Asp Thr Arg 
                  195                 200                 205             
          Tyr Val Leu Met Asp Gly Gln Thr Ala Cys Thr Asp Asp Asn Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Ala Tyr Tyr Asn Thr Thr Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Leu His Asn Asp Tyr Ala Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Ala Asp Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys 
                      260                 265                 270         
          Lys Asp Lys Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 
                  275                 280                 285             
          Asn Asp Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly 
              290                 295                 300                 
          Met Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Glu Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln Ala Glu Tyr 
                          325                 330                 335     
          Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser Ala Arg 
                      340                 345                 350         
          Asp Val Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Cys Arg 
                  355                 360                 365             
          Phe Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro Lys Val Lys Tyr Ile Trp Val 
              370                 375                 380                 
          Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Tyr Val Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn 
                          405                 410         
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 328]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 33]]>
          Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Lys Ala Ala Val Tyr Ile Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Pro Ala Gln Leu Lys Ala Ala Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn 
                      20                  25                  30          
          Phe Lys Ala Ala Tyr Leu Phe Asp Glu Ser Gly Glu Phe Lys Leu Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Lys Ala Ala Pro Thr 
              50                  55                  60                  
          Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Ala Thr Ser Arg Thr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Tyr Lys Lys Ala Ala Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Ala Ala Lys Thr Ile Gln Pro Arg Val Glu Lys Lys Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Lys Ala Ala Ser Pro Arg Trp 
                  115                 120                 125             
          Tyr Phe Tyr Tyr Leu Lys Ala Ala Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe 
              130                 135                 140                 
          Thr Tyr Lys Ala Ala Gly Thr Asp Leu Glu Gly Asn Phe Tyr Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ala Ala Cys Thr Asp Asp 
                          165                 170                 175     
          Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Lys Ala Ala Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Leu Lys Ala Ala Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Lys Ala 
                  195                 200                 205             
          Ala Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Ala Ala Lys Cys Tyr 
              210                 215                 220                 
          Gly Val Ser Pro Thr Lys Lys Ala Ala Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Arg Lys Ala Ala Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Lys Ala 
                          245                 250                 255     
          Ala Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Lys Ala Ala Thr Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Lys Ala Ala Asp Thr Asp Phe Val Asn 
                  275                 280                 285             
          Glu Phe Tyr Lys Ala Ala Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro Lys Lys 
              290                 295                 300                 
          Ala Ala Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Lys Ala Ala Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu 
                          325             
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 250]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 34]]>
          Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Tyr Leu Phe Asp Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Glu Phe Lys Leu Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr 
              50                  55                  60                  
          Tyr Lys Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Lys Thr Ile Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Val Glu Lys Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Gly Thr Asp Leu Glu Gly Asn Phe Tyr Arg Pro Asp Thr Arg Tyr 
                  115                 120                 125             
          Val Leu Cys Thr Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Lys Leu Trp Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Cys Val Gln Leu Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Lys Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn 
                      180                 185                 190         
          Gln Leu Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Thr Thr Asp Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Leu Gly Arg Tyr Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Asp Thr Pro Lys Gly Pro Lys Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu 
                          245                 250 
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 500]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Tyr Ala Leu Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ile 
          1               5                   10                  15      
          Met Arg Leu Trp Leu Cys Trp Lys Cys Arg Ser Lys Asn Pro Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Cys Trp His Gly Asp Gly Lys Met Lys 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn 
                          85                  90                  95      
          Pro Glu Lys Tyr Cys Ala Leu Ala Pro Asn Met Met Val Thr Asn Asn 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala Pro Thr Lys Val Thr Phe Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Leu Asn Glu Ser Leu Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Thr Ala Cys Thr Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Asn Thr Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Gly Gly Arg Phe Val Leu Ala Leu Leu Ser Asp Leu Gln Asp Leu 
              210                 215                 220                 
          Lys Trp Ala Arg Phe Pro Lys Ser Asp Gly Thr Gly Thr Ile Tyr Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Leu Glu Pro Pro Cys Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro 
                          245                 250                 255     
          Lys Val Lys Tyr Leu Arg Val Glu Ala Phe Glu Tyr Tyr His Thr Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser Ala Leu Asn His Thr Lys 
                  275                 280                 285             
          Lys Trp Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser Ser 
                          325                 330                 335     
          Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln Val Leu Gln Gln Leu Arg Val 
                      340                 345                 350         
          Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val Gln Leu His Asn Asp 
                  355                 360                 365             
          Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly 
              370                 375                 380                 
          Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Ser Lys Leu Ile Glu Tyr Thr Asp 
                  435                 440                 445             
          Phe Ala Thr Ser Ala Cys Val Leu Ala Ala Glu Cys Thr Ile Phe Lys 
              450                 455                 460                 
          Asp Ala Ser Gly Lys Pro Val Pro Tyr Cys Tyr Asp Thr Asn Val Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Gly Ser Val Ala Tyr Glu Ser Leu Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val 
                          485                 490                 495     
          Leu Met Asp Gly 
                      500 
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 1588]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 36]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr Arg Ala  Lys Arg Ser 
              1265                 1270                 1275             
          Gly Ser  Gly Ala Thr Asn Phe  Ser Leu Leu Lys Gln  Ala Gly Asp 
              1280                 1285                 1290             
          Val Glu  Glu Asn Pro Gly Pro  Tyr Ala Ser Ala Leu  Trp Glu Ile 
              1295                 1300                 1305             
          Gln Gln  Val Val Asp Ala Asp  His Ser Tyr Phe Thr  Ser Asp Tyr 
              1310                 1315                 1320             
          Tyr Gln  Leu Tyr Ser Thr Gln  Lys His Tyr Val Tyr  Ile Gly Asp 
              1325                 1330                 1335             
          Pro Ala  Gln Leu Pro Ala Pro  Asp Ala Tyr Lys Thr  Phe Pro Pro 
              1340                 1345                 1350             
          Thr Glu  Pro Lys Lys Asp Lys  Ile Trp Val Ala Thr  Glu Gly Ala 
              1355                 1360                 1365             
          Leu Asn  Thr Pro Lys Asp His  Ile Ile Thr Val Ala  Thr Ser Arg 
              1370                 1375                 1380             
          Thr Leu  Ser Tyr Tyr Lys Leu  Gly Ala Tyr Ala Leu  Val Tyr Phe 
              1385                 1390                 1395             
          Leu Gln  Ser Ile Asn Phe Val  Arg Ile Ser Leu Glu  Ile Pro Arg 
              1400                 1405                 1410             
          Arg Asn  Val Ala Thr Leu Gln  Ala Glu Pro Asn Met  Met Val Thr 
              1415                 1420                 1425             
          Asn Asn  Thr Phe Thr Leu Lys  Gly Gly Ala Lys Asn  Pro Leu Leu 
              1430                 1435                 1440             
          Tyr Asp  Ala Asn Tyr Phe Leu  Cys Trp His Lys Asp  Leu Ser Pro 
              1445                 1450                 1455             
          Arg Trp  Tyr Phe Tyr Tyr Leu  Gly Thr Gly Tyr Tyr  His Thr Thr 
              1460                 1465                 1470             
          Asp Pro  Ser Phe Leu Gly Arg  Tyr Met Ser Ala Glu  Ser Leu Arg 
              1475                 1480                 1485             
          Pro Asp  Thr Arg Tyr Val Leu  Met Asp Gly Arg Lys  Val Pro Thr 
              1490                 1495                 1500             
          Asp Asn  Tyr Ile Thr Thr Tyr  Pro Gly Gln Cys Arg  Phe Val Thr 
              1505                 1510                 1515             
          Asp Thr  Pro Lys Gly Pro Lys  Val Lys Tyr Ser Thr  Phe Lys Cys 
              1520                 1525                 1530             
          Tyr Gly  Val Ser Pro Thr Lys  Leu Asn Asp Lys Tyr  Glu Gln Tyr 
              1535                 1540                 1545             
          Ile Lys  Trp Pro Trp Tyr Ile  Trp Leu Gly Ser Ser  Ser Lys Leu 
              1550                 1555                 1560             
          Trp Ala  Gln Cys Val Gln Leu  His Asn Asp Tyr Val  Gly Tyr Leu 
              1565                 1570                 1575             
          Gln Pro  Arg Thr Phe Leu Leu  Lys Tyr Asn 
              1580                 1585             
          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<211> 1712]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 37]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr Arg Ala  Lys Arg Ser 
              1265                 1270                 1275             
          Gly Ser  Gly Ala Thr Asn Phe  Ser Leu Leu Lys Gln  Ala Gly Asp 
              1280                 1285                 1290             
          Val Glu  Glu Asn Pro Gly Pro  His Ser Tyr Phe Thr  Ser Asp Tyr 
              1295                 1300                 1305             
          Tyr Gln  Leu Tyr Ser Thr Gln  Lys His Tyr Val Tyr  Ile Gly Asp 
              1310                 1315                 1320             
          Pro Ala  Gln Leu Pro Ala Pro  Tyr Ala Leu Val Tyr  Phe Leu Gln 
              1325                 1330                 1335             
          Ser Ile  Asn Phe Val Arg Ile  Ala Thr Tyr Tyr Leu  Phe Asp Glu 
              1340                 1345                 1350             
          Ser Gly  Glu Phe Lys Leu Ala  Ser His Lys Asn Pro  Leu Leu Tyr 
              1355                 1360                 1365             
          Asp Ala  Asn Tyr Phe Leu Cys  Trp His Arg Lys Val  Pro Thr Asp 
              1370                 1375                 1380             
          Asn Tyr  Ile Thr Thr Tyr Pro  Gly Gln Ile Thr Val  Ala Thr Ser 
              1385                 1390                 1395             
          Arg Thr  Leu Ser Tyr Tyr Lys  Leu Gly Ala Pro Asn  Met Met Val 
              1400                 1405                 1410             
          Thr Asn  Asn Thr Phe Thr Leu  Lys Gly Gly Ala Ser  Ile Ile Lys 
              1415                 1420                 1425             
          Thr Ile  Gln Pro Arg Val Glu  Lys Lys Lys Leu Lys  Tyr Glu Gln 
              1430                 1435                 1440             
          Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu Gly Lys  Asp Leu Ser 
              1445                 1450                 1455             
          Pro Arg  Trp Tyr Phe Tyr Tyr  Leu Gly Thr Gly Thr  Tyr Lys Asn 
              1460                 1465                 1470             
          Thr Cys  Asp Gly Thr Thr Phe  Thr Tyr Ala Ser Ala  Val His Ala 
              1475                 1480                 1485             
          Gly Thr  Asp Leu Glu Gly Asn  Phe Tyr Gly Pro Phe  Glu Ser Leu 
              1490                 1495                 1500             
          Arg Pro  Asp Thr Arg Tyr Val  Leu Met Asp Gly Gln  Thr Ala Cys 
              1505                 1510                 1515             
          Thr Asp  Asp Asn Ala Leu Ala  Tyr Tyr Asn Thr Thr  Ser Ser Ser 
              1520                 1525                 1530             
          Lys Leu  Trp Ala Gln Cys Val  Gln Leu His Asn Asp  Tyr Ala Ser 
              1535                 1540                 1545             
          Ala Leu  Trp Glu Ile Gln Gln  Val Val Asp Ala Asp  Asp Ala Tyr 
              1550                 1555                 1560             
          Lys Thr  Phe Pro Pro Thr Glu  Pro Lys Lys Asp Lys  Ser Thr Phe 
              1565                 1570                 1575             
          Lys Cys  Tyr Gly Val Ser Pro  Thr Lys Leu Asn Asp  Ala Pro Ser 
              1580                 1585                 1590             
          Ala Ser  Ala Phe Phe Gly Met  Ser Arg Ile Gly Met  Leu Ala Leu 
              1595                 1600                 1605             
          Leu Leu  Leu Asp Arg Leu Asn  Gln Leu Glu Ser Lys  Ser Leu Glu 
              1610                 1615                 1620             
          Ile Pro  Arg Arg Asn Val Ala  Thr Leu Gln Ala Glu  Tyr Tyr His 
              1625                 1630                 1635             
          Thr Thr  Asp Pro Ser Phe Leu  Gly Arg Tyr Met Ser  Ala Arg Asp 
              1640                 1645                 1650             
          Val Asp  Thr Asp Phe Val Asn  Glu Phe Tyr Ala Tyr  Leu Cys Arg 
              1655                 1660                 1665             
          Phe Val  Thr Asp Thr Pro Lys  Gly Pro Lys Val Lys  Tyr Ile Trp 
              1670                 1675                 1680             
          Val Ala  Thr Glu Gly Ala Leu  Asn Thr Pro Lys Asp  His Ile Tyr 
              1685                 1690                 1695             
          Val Gly  Tyr Leu Gln Pro Arg  Thr Phe Leu Leu Lys  Tyr Asn 
              1700                 1705                 1710         
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 546]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 38]]>
          Met Leu Arg Val Glu Ala Phe Glu Tyr Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser 
          1               5                   10                  15      
          Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser Ala Leu Asn His Thr Lys Lys Trp Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys 
                  35                  40                  45              
          Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Ala Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln Ala Glu Leu Asn Glu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile 
                          165                 170                 175     
          Val Met Val Gln Thr Ala Cys Thr Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asn Thr Thr Lys Gly Gly Arg Phe Val Leu Ala Leu Leu Ser Asp Leu 
                  195                 200                 205             
          Gln Asp Leu Lys Trp Ala Arg Phe Pro Lys Ser Asp Gly Thr Gly Thr 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Thr Glu Leu Glu Pro Pro Cys Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Gly Pro Lys Val Lys Tyr Ser Ile Ile Lys Thr Ile Gln Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Val Glu Lys Lys Lys Leu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly Phe 
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp 
              290                 295                 300                 
          His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln Ser Lys Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Glu Tyr Thr Asp Phe Ala Thr Ser Ala Cys Val Leu Ala Ala Glu 
                          325                 330                 335     
          Cys Thr Ile Phe Lys Asp Ala Ser Gly Lys Pro Val Pro Tyr Cys Tyr 
                      340                 345                 350         
          Asp Thr Asn Val Leu Glu Gly Ser Val Ala Tyr Glu Ser Leu Arg Pro 
                  355                 360                 365             
          Asp Thr Arg Tyr Val Leu Met Asp Gly Glu Lys Tyr Cys Ala Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Pro Asn Met Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Thr Lys Val Thr Phe Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser 
                          405                 410                 415     
          Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu 
                      420                 425                 430         
          Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly 
                  435                 440                 445             
          Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Tyr Ala 
              450                 455                 460                 
          Leu Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ile Met Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Trp Leu Cys Trp Lys Cys Arg Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp 
                          485                 490                 495     
          Ala Asn Tyr Phe Leu Cys Trp His Thr Tyr Lys Asn Thr Cys Asp Gly 
                      500                 505                 510         
          Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val 
                  515                 520                 525             
          Asp Ala Asp Lys His Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu Pro 
              530                 535                 540                 
          Ala Pro 
          545     
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 1099]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 39]]>
          Met Tyr Ala Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val Gln Leu His Asn Asp Lys 
                      20                  25                  30          
          His Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu Pro Ala Pro Ser Leu 
                  35                  40                  45              
          Glu Ile Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr Leu Gln Ala Glu Arg Asp Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Thr Tyr Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Pro Asn Met Met 
                          85                  90                  95      
          Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Leu Phe Asp Glu Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ala Ser His Tyr Tyr His 
                  115                 120                 125             
          Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser Ala Glu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu Met Asp Gly Gln Thr Ala Cys Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Asn Thr Thr Ser Ile Ile Lys Thr 
                          165                 170                 175     
          Ile Gln Pro Arg Val Glu Lys Lys Lys Leu Cys Arg Phe Val Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Thr Pro Lys Gly Pro Lys Val Lys Tyr Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 
                  195                 200                 205             
          Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Arg Lys Val Pro Thr Asp Asn Tyr 
              210                 215                 220                 
          Ile Thr Thr Tyr Pro Gly Gln Val His Ala Gly Thr Asp Leu Glu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Phe Tyr Gly Pro Phe Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Lys Tyr Asn Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg 
                      260                 265                 270         
          Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr 
                  275                 280                 285             
          Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser 
                      340                 345                 350         
          Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Glu Lys Trp 
                  355                 360                 365             
          Glu Ser Gly Val Lys Asp Cys Val Val Leu His Ser Tyr Phe Thr Ser 
              370                 375                 380                 
          Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Leu Ser Thr Asp Thr Gly Val 
          385                 390                 395                 400 
          Glu His Val Thr Phe Phe Ile Tyr Asn Lys Ile Val Asp Glu Pro Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu His Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Val Asn 
                      420                 425                 430         
          Pro Val Met Glu Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val 
                  435                 440                 445             
          Pro Leu Ser Ser Met Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly 
              450                 455                 460                 
          Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val 
                          485                 490                 495     
          Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg 
                      500                 505                 510         
          Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly 
                  515                 520                 525             
          Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln 
              530                 535                 540                 
          Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Lys Gln Gly 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Ile Lys Asp Ala Thr Pro Leu Asp Phe Val Arg Ala Thr Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Ile Pro Ile Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Ile Val Gly Val 
                      580                 585                 590         
          Ala Leu Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Ser Lys Ile Ile Thr Leu Lys 
                  595                 600                 605             
          Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ser Lys Gly Val His Phe Val Cys Asn 
              610                 615                 620                 
          Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Val Tyr Ser His Leu Leu Leu Val Ala 
          625                 630                 635                 640 
          Ala Gly Leu Glu Ala Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn 
                          645                 650                 655     
          Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn 
                      660                 665                 670         
          Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln 
                  675                 680                 685             
          Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His 
              690                 695                 700                 
          Gly Lys Glu Gly Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn 
          705                 710                 715                 720 
          Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr 
                          725                 730                 735     
          Arg Arg Ile Arg Gly Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe 
                      740                 745                 750         
          Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile 
                  755                 760                 765             
          Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile 
              770                 775                 780                 
          Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp 
          785                 790                 795                 800 
          Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Pro Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Val 
                          805                 810                 815     
          Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ile Met Arg Leu Trp 
                      820                 825                 830         
          Leu Cys Trp Lys Cys Arg Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn 
                  835                 840                 845             
          Tyr Phe Leu Cys Trp His Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr 
              850                 855                 860                 
          Asn Ser Val Thr Ser Ser Ile Val Ile Thr Ser Gly Asp Gly Thr Thr 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Pro Ile Ser Glu His Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Thr Ala Pro 
                          885                 890                 895     
          Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp 
                  915                 920                 925             
          Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile 
              930                 935                 940                 
          Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Lys Lys Ala Tyr Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln 
                          965                 970                 975     
          Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys 
                      980                 985                 990         
          Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser  Ala Asp Ser Thr Gln  Ala Ile Thr 
                  995                 1000                 1005             
          Val Ala  Thr Ser Arg Thr Leu  Ser Tyr Tyr Lys Leu  Gly Ala Ser 
              1010                 1015                 1020             
          Gln Arg  Val Ala Gly Asp Ser  Gly Phe Ala Ala Tyr  Ser Arg Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Ile  Gly Asn Tyr Lys Leu  Asn Thr Asp His Ser  Ser Ser Ser 
              1040                 1045                 1050             
          Asp Asn  Ile Ala Leu Leu Val  Gln Leu Asn Glu Ser  Leu Ile Asp 
              1055                 1060                 1065             
          Leu Gln  Glu Leu Gly Lys Tyr  Glu Gln Tyr Ile Lys  Trp Pro Trp 
              1070                 1075                 1080             
          Tyr Ile  Trp Leu Gly Phe Ile  Ala Gly Leu Ile Ala  Ile Val Met 
              1085                 1090                 1095             
          Val 
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 1221]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 40]]>
          Met Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Asp Glu Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser His Ser Lys Leu Ile Glu Tyr Thr Asp Phe Ala Thr Ser Ala Cys 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Ala Ala Glu Cys Thr Ile Phe Lys Asp Ala Ser Gly Lys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Pro Tyr Cys Tyr Asp Thr Asn Val Leu Glu Gly Ser Val Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Leu Arg Pro Asp Thr Arg Tyr Val Leu Met Asp Gly Arg Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Val Pro Thr Asp Asn Tyr Ile Thr Thr Tyr Pro Gly Gln Gln Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Cys Thr Asp Asp Asn Ala Leu Ala Tyr Tyr Asn Thr Thr Lys Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Phe Val Leu Ala Leu Leu Ser Asp Leu Gln Asp Leu Lys Trp Ala 
                  115                 120                 125             
          Arg Phe Pro Lys Ser Asp Gly Thr Gly Thr Ile Tyr Thr Glu Leu Glu 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Cys Arg Phe Val Thr Asp Thr Pro Lys Gly Pro Lys Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp 
                          165                 170                 175     
          Arg Asp Val Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Thr 
                      180                 185                 190         
          Tyr Lys Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Ser Ala Leu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Leu Arg Val Glu Ala Phe 
              210                 215                 220                 
          Glu Tyr Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Met Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Leu Asn His Thr Lys Lys Trp Lys His Tyr Val Tyr Ile Gly Asp 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Gln Leu Pro Ala Pro Ser Leu Glu Ile Pro Arg Arg Asn Val 
                      260                 265                 270         
          Ala Thr Leu Gln Ala Glu Val Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Asp Thr Val His Ala Gly Thr Asp Leu Glu Gly Asn Phe Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Pro Phe Ser Ile Ile Lys Thr Ile Gln Pro Arg Val Glu Lys Lys 
                          325                 330                 335     
          Lys Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Leu Ala Pro Asn Met Met Val Thr Asn 
                      340                 345                 350         
          Asn Thr Phe Thr Leu Lys Gly Gly Ala Pro Thr Lys Val Thr Phe Gly 
                  355                 360                 365             
          Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Gly 
              370                 375                 380                 
          Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly 
                          405                 410                 415     
          Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His 
                      420                 425                 430         
          Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu 
                  435                 440                 445             
          Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg 
              450                 455                 460                 
          Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Glu Lys Trp Glu Ser Gly Val Lys Asp 
                          485                 490                 495     
          Cys Val Val Leu His Ser Tyr Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ser Thr Gln Leu Ser Thr Asp Thr Gly Val Glu His Val Thr Phe Phe 
                  515                 520                 525             
          Ile Tyr Asn Lys Ile Val Asp Glu Pro Glu Glu His Val Gln Ile His 
              530                 535                 540                 
          Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Val Asn Pro Val Met Glu Pro Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val Pro Leu Ser Ser Met Gly 
                          565                 570                 575     
          Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala 
                      580                 585                 590         
          Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly 
                  595                 600                 605             
          Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala 
              610                 615                 620                 
          Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly 
                          645                 650                 655     
          Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His 
                      660                 665                 670         
          Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Lys Gln Gly Glu Ile Lys Asp Ala Thr 
                  675                 680                 685             
          Pro Leu Asp Phe Val Arg Ala Thr Ala Thr Ile Pro Ile Gln Ala Ser 
              690                 695                 700                 
          Leu Pro Phe Gly Trp Leu Ile Val Gly Val Ala Leu Leu Ala Val Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Gln Ser Ala Ser Lys Ile Ile Thr Leu Lys Lys Arg Trp Gln Leu Ala 
                          725                 730                 735     
          Leu Ser Lys Gly Val His Phe Val Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val 
                      740                 745                 750         
          Thr Val Tyr Ser His Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Glu Ala Met 
                  755                 760                 765             
          Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe 
              770                 775                 780                 
          Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Gly Leu Lys 
                      820                 825                 830         
          Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp 
                  835                 840                 845             
          Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Leu 
              850                 855                 860                 
          Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile 
          865                 870                 875                 880 
          Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu 
                          885                 890                 895     
          Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg 
                      900                 905                 910         
          Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys 
                  915                 920                 925             
          Glu Pro Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile 
              930                 935                 940                 
          Asn Phe Val Arg Ile Ile Met Arg Leu Trp Leu Cys Trp Lys Cys Arg 
          945                 950                 955                 960 
          Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe Leu Cys Trp His 
                          965                 970                 975     
          Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr Asn Ser Val Thr Ser Ser 
                      980                 985                 990         
          Ile Val Ile Thr Ser Gly Asp Gly  Thr Thr Ser Pro Ile  Ser Glu His 
                  995                 1000                 1005             
          Asp Tyr  Gln Ile Gly Gly Tyr  Thr Ala Pro Ser Ala  Ser Ala Phe 
              1010                 1015                 1020             
          Phe Gly  Met Ser Arg Ile Gly  Met Glu Val Thr Pro  Ser Gly Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Trp Leu  Thr Tyr Thr Gly Ala  Ile Lys Leu Asp Asp  Lys Asp Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Phe  Lys Asp Gln Val Ile  Leu Leu Asn Lys His  Ile Asp Ala 
              1055                 1060                 1065             
          Tyr Lys  Thr Phe Pro Pro Thr  Glu Pro Lys Lys Asp  Lys Lys Lys 
              1070                 1075                 1080             
          Lys Ala  Tyr Glu Thr Gln Ala  Leu Pro Gln Arg Gln  Lys Lys Gln 
              1085                 1090                 1095             
          Gln Thr  Val Thr Leu Leu Pro  Ala Ala Asp Leu Asp  Asp Phe Ser 
              1100                 1105                 1110             
          Lys Gln  Leu Gln Gln Ser Met  Ser Ser Ala Asp Ser  Thr Gln Ala 
              1115                 1120                 1125             
          Ile Thr  Val Ala Thr Ser Arg  Thr Leu Ser Tyr Tyr  Lys Leu Gly 
              1130                 1135                 1140             
          Ala Ser  Gln Arg Val Ala Gly  Asp Ser Gly Phe Ala  Ala Tyr Ser 
              1145                 1150                 1155             
          Arg Tyr  Arg Ile Gly Asn Tyr  Lys Leu Asn Thr Asp  His Ser Ser 
              1160                 1165                 1170             
          Ser Ser  Asp Asn Ile Ala Leu  Leu Val Gln Leu Asn  Glu Ser Leu 
              1175                 1180                 1185             
          Ile Asp  Leu Gln Glu Leu Gly  Lys Tyr Glu Gln Tyr  Ile Lys Trp 
              1190                 1195                 1200             
          Pro Trp  Tyr Ile Trp Leu Gly  Phe Ile Ala Gly Leu  Ile Ala Ile 
              1205                 1210                 1215             
          Val Met  Val 
              1220     
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 1800]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                多肽
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr Arg Ala  Lys Arg Ser 
              1265                 1270                 1275             
          Gly Ser  Gly Ala Thr Asn Phe  Ser Leu Leu Lys Gln  Ala Gly Asp 
              1280                 1285                 1290             
          Val Glu  Glu Asn Pro Gly Pro  Tyr Ala Leu Val Tyr  Phe Leu Gln 
              1295                 1300                 1305             
          Ser Ile  Asn Phe Val Arg Ile  Ile Met Arg Leu Trp  Leu Cys Trp 
              1310                 1315                 1320             
          Lys Cys  Arg Ser Lys Asn Pro  Leu Leu Tyr Asp Ala  Asn Tyr Phe 
              1325                 1330                 1335             
          Leu Cys  Trp His Gly Asp Gly  Lys Met Lys Asp Leu  Ser Pro Arg 
              1340                 1345                 1350             
          Trp Tyr  Phe Tyr Tyr Leu Gly  Thr Gly Pro Glu Ala  Gly Leu Pro 
              1355                 1360                 1365             
          Tyr Gly  Ala Asn Lys Asp Gly  Ile Ile Trp Val Ala  Thr Glu Gly 
              1370                 1375                 1380             
          Ala Leu  Asn Thr Pro Lys Asp  His Ile Gly Thr Arg  Asn Pro Glu 
              1385                 1390                 1395             
          Lys Tyr  Cys Ala Leu Ala Pro  Asn Met Met Val Thr  Asn Asn Thr 
              1400                 1405                 1410             
          Phe Thr  Leu Lys Gly Gly Ala  Pro Thr Lys Val Thr  Phe Gly Thr 
              1415                 1420                 1425             
          Tyr Lys  Asn Thr Cys Asp Gly  Thr Thr Phe Thr Tyr  Ala Ser Ala 
              1430                 1435                 1440             
          Leu Trp  Glu Ile Gln Gln Val  Val Asp Ala Asp Leu  Asn Glu Ser 
              1445                 1450                 1455             
          Leu Ile  Asp Leu Gln Glu Leu  Gly Lys Tyr Glu Gln  Tyr Ile Lys 
              1460                 1465                 1470             
          Trp Pro  Trp Tyr Ile Trp Leu  Gly Phe Ile Ala Gly  Leu Ile Ala 
              1475                 1480                 1485             
          Ile Val  Met Val Gln Thr Ala  Cys Thr Asp Asp Asn  Ala Leu Ala 
              1490                 1495                 1500             
          Tyr Tyr  Asn Thr Thr Lys Gly  Gly Arg Phe Val Leu  Ala Leu Leu 
              1505                 1510                 1515             
          Ser Asp  Leu Gln Asp Leu Lys  Trp Ala Arg Phe Pro  Lys Ser Asp 
              1520                 1525                 1530             
          Gly Thr  Gly Thr Ile Tyr Thr  Glu Leu Glu Pro Pro  Cys Arg Phe 
              1535                 1540                 1545             
          Val Thr  Asp Thr Pro Lys Gly  Pro Lys Val Lys Tyr  Leu Arg Val 
              1550                 1555                 1560             
          Glu Ala  Phe Glu Tyr Tyr His  Thr Thr Asp Pro Ser  Phe Leu Gly 
              1565                 1570                 1575             
          Arg Tyr  Met Ser Ala Leu Asn  His Thr Lys Lys Trp  Ile Thr Val 
              1580                 1585                 1590             
          Ala Thr  Ser Arg Thr Leu Ser  Tyr Tyr Lys Leu Gly  Ala Ser Gln 
              1595                 1600                 1605             
          Arg Val  Ala Gly Asp Ser Gly  Phe Ala Ala Tyr Ser  Arg Tyr Arg 
              1610                 1615                 1620             
          Ile Gly  Asn Tyr Lys Leu Asn  Thr Asp His Ser Ser  Ser Ser Asp 
              1625                 1630                 1635             
          Asn Ile  Ala Leu Leu Val Gln  Val Leu Gln Gln Leu  Arg Val Glu 
              1640                 1645                 1650             
          Ser Ser  Ser Lys Leu Trp Ala  Gln Cys Val Gln Leu  His Asn Asp 
              1655                 1660                 1665             
          Ile Leu  Leu Ala Lys Asp Thr  Ala Pro Ser Ala Ser  Ala Phe Phe 
              1670                 1675                 1680             
          Gly Met  Ser Arg Ile Gly Met  Glu Val Thr Pro Ser  Gly Thr Trp 
              1685                 1690                 1695             
          Leu Thr  Tyr Thr Gly Ala Ile  Lys Leu Asp Asp Lys  Asp Pro Asn 
              1700                 1705                 1710             
          Phe Lys  Asp Gln Val Ile Leu  Leu Asn Lys His Ile  Asp Ala Tyr 
              1715                 1720                 1725             
          Lys Thr  Phe Pro Pro Thr Glu  Pro Lys Lys Asp Lys  Ser Lys Leu 
              1730                 1735                 1740             
          Ile Glu  Tyr Thr Asp Phe Ala  Thr Ser Ala Cys Val  Leu Ala Ala 
              1745                 1750                 1755             
          Glu Cys  Thr Ile Phe Lys Asp  Ala Ser Gly Lys Pro  Val Pro Tyr 
              1760                 1765                 1770             
          Cys Tyr  Asp Thr Asn Val Leu  Glu Gly Ser Val Ala  Tyr Glu Ser 
              1775                 1780                 1785             
          Leu Arg  Pro Asp Thr Arg Tyr  Val Leu Met Asp Gly  
              1790                 1795                 1800 
          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<211> 7096]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          Met Glu Ser Leu Val Pro Gly Phe Asn Glu Lys Thr His Val Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Pro Val Leu Gln Val Arg Asp Val Leu Val Arg Gly Phe Gly 
                      20                  25                  30          
          Asp Ser Val Glu Glu Val Leu Ser Glu Ala Arg Gln His Leu Lys Asp 
                  35                  40                  45              
          Gly Thr Cys Gly Leu Val Glu Val Glu Lys Gly Val Leu Pro Gln Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Pro Tyr Val Phe Ile Lys Arg Ser Asp Ala Arg Thr Ala Pro 
          65                  70                  75                  80  
          His Gly His Val Met Val Glu Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Ile Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Gly Arg Ser Gly Glu Thr Leu Gly Val Leu Val Pro His Val Gly 
                      100                 105                 110         
          Glu Ile Pro Val Ala Tyr Arg Lys Val Leu Leu Arg Lys Asn Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Ala Gly Gly His Ser Tyr Gly Ala Asp Leu Lys Ser Phe Asp 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Asp Glu Leu Gly Thr Asp Pro Tyr Glu Asp Phe Gln Glu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Thr Lys His Ser Ser Gly Val Thr Arg Glu Leu Met Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Leu Asn Gly Gly Ala Tyr Thr Arg Tyr Val Asp Asn Asn Phe Cys Gly 
                      180                 185                 190         
          Pro Asp Gly Tyr Pro Leu Glu Cys Ile Lys Asp Leu Leu Ala Arg Ala 
                  195                 200                 205             
          Gly Lys Ala Ser Cys Thr Leu Ser Glu Gln Leu Asp Phe Ile Asp Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Arg Gly Val Tyr Cys Cys Arg Glu His Glu His Glu Ile Ala Trp 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Thr Glu Arg Ser Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Gln Thr Pro Phe Glu 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Leu Ala Lys Lys Phe Asp Thr Phe Asn Gly Glu Cys Pro Asn 
                      260                 265                 270         
          Phe Val Phe Pro Leu Asn Ser Ile Ile Lys Thr Ile Gln Pro Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Lys Lys Lys Leu Asp Gly Phe Met Gly Arg Ile Arg Ser Val Tyr 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Ala Ser Pro Asn Glu Cys Asn Gln Met Cys Leu Ser Thr Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Lys Cys Asp His Cys Gly Glu Thr Ser Trp Gln Thr Gly Asp Phe 
                          325                 330                 335     
          Val Lys Ala Thr Cys Glu Phe Cys Gly Thr Glu Asn Leu Thr Lys Glu 
                      340                 345                 350         
          Gly Ala Thr Thr Cys Gly Tyr Leu Pro Gln Asn Ala Val Val Lys Ile 
                  355                 360                 365             
          Tyr Cys Pro Ala Cys His Asn Ser Glu Val Gly Pro Glu His Ser Leu 
              370                 375                 380                 
          Ala Glu Tyr His Asn Glu Ser Gly Leu Lys Thr Ile Leu Arg Lys Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Arg Thr Ile Ala Phe Gly Gly Cys Val Phe Ser Tyr Val Gly Cys 
                          405                 410                 415     
          His Asn Lys Cys Ala Tyr Trp Val Pro Arg Ala Ser Ala Asn Ile Gly 
                      420                 425                 430         
          Cys Asn His Thr Gly Val Val Gly Glu Gly Ser Glu Gly Leu Asn Asp 
                  435                 440                 445             
          Asn Leu Leu Glu Ile Leu Gln Lys Glu Lys Val Asn Ile Asn Ile Val 
              450                 455                 460                 
          Gly Asp Phe Lys Leu Asn Glu Glu Ile Ala Ile Ile Leu Ala Ser Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Ala Ser Thr Ser Ala Phe Val Glu Thr Val Lys Gly Leu Asp Tyr 
                          485                 490                 495     
          Lys Ala Phe Lys Gln Ile Val Glu Ser Cys Gly Asn Phe Lys Val Thr 
                      500                 505                 510         
          Lys Gly Lys Ala Lys Lys Gly Ala Trp Asn Ile Gly Glu Gln Lys Ser 
                  515                 520                 525             
          Ile Leu Ser Pro Leu Tyr Ala Phe Ala Ser Glu Ala Ala Arg Val Val 
              530                 535                 540                 
          Arg Ser Ile Phe Ser Arg Thr Leu Glu Thr Ala Gln Asn Ser Val Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Val Leu Gln Lys Ala Ala Ile Thr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Gln Tyr 
                          565                 570                 575     
          Ser Leu Arg Leu Ile Asp Ala Met Met Phe Thr Ser Asp Leu Ala Thr 
                      580                 585                 590         
          Asn Asn Leu Val Val Met Ala Tyr Ile Thr Gly Gly Val Val Gln Leu 
                  595                 600                 605             
          Thr Ser Gln Trp Leu Thr Asn Ile Phe Gly Thr Val Tyr Glu Lys Leu 
              610                 615                 620                 
          Lys Pro Val Leu Asp Trp Leu Glu Glu Lys Phe Lys Glu Gly Val Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Phe Leu Arg Asp Gly Trp Glu Ile Val Lys Phe Ile Ser Thr Cys Ala 
                          645                 650                 655     
          Cys Glu Ile Val Gly Gly Gln Ile Val Thr Cys Ala Lys Glu Ile Lys 
                      660                 665                 670         
          Glu Ser Val Gln Thr Phe Phe Lys Leu Val Asn Lys Phe Leu Ala Leu 
                  675                 680                 685             
          Cys Ala Asp Ser Ile Ile Ile Gly Gly Ala Lys Leu Lys Ala Leu Asn 
              690                 695                 700                 
          Leu Gly Glu Thr Phe Val Thr His Ser Lys Gly Leu Tyr Arg Lys Cys 
          705                 710                 715                 720 
          Val Lys Ser Arg Glu Glu Thr Gly Leu Leu Met Pro Leu Lys Ala Pro 
                          725                 730                 735     
          Lys Glu Ile Ile Phe Leu Glu Gly Glu Thr Leu Pro Thr Glu Val Leu 
                      740                 745                 750         
          Thr Glu Glu Val Val Leu Lys Thr Gly Asp Leu Gln Pro Leu Glu Gln 
                  755                 760                 765             
          Pro Thr Ser Glu Ala Val Glu Ala Pro Leu Val Gly Thr Pro Val Cys 
              770                 775                 780                 
          Ile Asn Gly Leu Met Leu Leu Glu Ile Lys Asp Thr Glu Lys Tyr Cys 
          785                 790                 795                 800 
          Ala Leu Ala Pro Asn Met Met Val Thr Asn Asn Thr Phe Thr Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Gly Gly Ala Pro Thr Lys Val Thr Phe Gly Asp Asp Thr Val Ile Glu 
                      820                 825                 830         
          Val Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asn Ile Thr Phe Glu Leu Asp Glu Arg 
                  835                 840                 845             
          Ile Asp Lys Val Leu Asn Glu Lys Cys Ser Ala Tyr Thr Val Glu Leu 
              850                 855                 860                 
          Gly Thr Glu Val Asn Glu Phe Ala Cys Val Val Ala Asp Ala Val Ile 
          865                 870                 875                 880 
          Lys Thr Leu Gln Pro Val Ser Glu Leu Leu Thr Pro Leu Gly Ile Asp 
                          885                 890                 895     
          Leu Asp Glu Trp Ser Met Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Asp Glu Ser Gly 
                      900                 905                 910         
          Glu Phe Lys Leu Ala Ser His Met Tyr Cys Ser Phe Tyr Pro Pro Asp 
                  915                 920                 925             
          Glu Asp Glu Glu Glu Gly Asp Cys Glu Glu Glu Glu Phe Glu Pro Ser 
              930                 935                 940                 
          Thr Gln Tyr Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Asp Tyr Gln Gly Lys Pro Leu 
          945                 950                 955                 960 
          Glu Phe Gly Ala Thr Ser Ala Ala Leu Gln Pro Glu Glu Glu Gln Glu 
                          965                 970                 975     
          Glu Asp Trp Leu Asp Asp Asp Ser Gln Gln Thr Val Gly Gln Gln Asp 
                      980                 985                 990         
          Gly Ser Glu Asp Asn Gln Thr Thr  Thr Ile Gln Thr Ile  Val Glu Val 
                  995                 1000                 1005             
          Gln Pro  Gln Leu Glu Met Glu  Leu Thr Pro Val Val  Gln Thr Ile 
              1010                 1015                 1020             
          Glu Val  Asn Ser Phe Ser Gly  Tyr Leu Lys Leu Thr  Asp Asn Val 
              1025                 1030                 1035             
          Tyr Ile  Lys Asn Ala Asp Ile  Val Glu Glu Ala Lys  Lys Val Lys 
              1040                 1045                 1050             
          Pro Thr  Val Val Val Asn Ala  Ala Asn Val Tyr Leu  Lys His Gly 
              1055                 1060                 1065             
          Gly Gly  Val Ala Gly Ala Leu  Asn Lys Ala Thr Asn  Asn Ala Met 
              1070                 1075                 1080             
          Gln Val  Glu Ser Asp Asp Tyr  Ile Ala Thr Asn Gly  Pro Leu Lys 
              1085                 1090                 1095             
          Val Gly  Gly Ser Cys Val Leu  Ser Gly His Asn Leu  Ala Lys His 
              1100                 1105                 1110             
          Cys Leu  His Val Val Gly Pro  Asn Val Asn Lys Gly  Glu Asp Ile 
              1115                 1120                 1125             
          Gln Leu  Leu Lys Ser Ala Tyr  Glu Asn Phe Asn Gln  His Glu Val 
              1130                 1135                 1140             
          Leu Leu  Ala Pro Leu Leu Ser  Ala Gly Ile Phe Gly  Ala Asp Pro 
              1145                 1150                 1155             
          Ile His  Ser Leu Arg Val Cys  Val Asp Thr Val Arg  Thr Asn Val 
              1160                 1165                 1170             
          Tyr Leu  Ala Val Phe Asp Lys  Asn Leu Tyr Asp Lys  Leu Val Ser 
              1175                 1180                 1185             
          Ser Phe  Leu Glu Met Lys Ser  Glu Lys Gln Val Glu  Gln Lys Ile 
              1190                 1195                 1200             
          Ala Glu  Ile Pro Lys Glu Glu  Val Lys Pro Phe Ile  Thr Glu Ser 
              1205                 1210                 1215             
          Lys Pro  Ser Val Glu Gln Arg  Lys Gln Asp Asp Lys  Lys Ile Lys 
              1220                 1225                 1230             
          Ala Cys  Val Glu Glu Val Thr  Thr Thr Leu Glu Glu  Thr Lys Phe 
              1235                 1240                 1245             
          Leu Thr  Glu Asn Leu Leu Leu  Tyr Ile Asp Ile Asn  Gly Asn Leu 
              1250                 1255                 1260             
          His Pro  Asp Ser Ala Thr Leu  Val Ser Asp Ile Asp  Ile Thr Phe 
              1265                 1270                 1275             
          Leu Lys  Lys Asp Ala Pro Tyr  Ile Val Gly Asp Val  Val Gln Glu 
              1280                 1285                 1290             
          Gly Val  Leu Thr Ala Val Val  Ile Pro Thr Lys Lys  Ala Gly Gly 
              1295                 1300                 1305             
          Thr Thr  Glu Met Leu Ala Lys  Ala Leu Arg Lys Val  Pro Thr Asp 
              1310                 1315                 1320             
          Asn Tyr  Ile Thr Thr Tyr Pro  Gly Gln Gly Leu Asn  Gly Tyr Thr 
              1325                 1330                 1335             
          Val Glu  Glu Ala Lys Thr Val  Leu Lys Lys Cys Lys  Ser Ala Phe 
              1340                 1345                 1350             
          Tyr Ile  Leu Pro Ser Ile Ile  Ser Asn Glu Lys Gln  Glu Ile Leu 
              1355                 1360                 1365             
          Gly Thr  Val Ser Trp Asn Leu  Arg Glu Met Leu Ala  His Ala Glu 
              1370                 1375                 1380             
          Glu Thr  Arg Lys Leu Met Pro  Val Cys Val Glu Thr  Lys Ala Ile 
              1385                 1390                 1395             
          Val Ser  Thr Ile Gln Arg Lys  Tyr Lys Gly Ile Lys  Ile Gln Glu 
              1400                 1405                 1410             
          Gly Val  Val Asp Tyr Gly Ala  Arg Phe Tyr Phe Tyr  Thr Ser Lys 
              1415                 1420                 1425             
          Thr Thr  Val Ala Ser Leu Ile  Asn Thr Leu Asn Asp  Leu Asn Glu 
              1430                 1435                 1440             
          Thr Leu  Val Thr Met Pro Leu  Gly Tyr Val Thr His  Gly Leu Asn 
              1445                 1450                 1455             
          Leu Glu  Glu Ala Ala Arg Tyr  Met Arg Ser Leu Lys  Val Pro Ala 
              1460                 1465                 1470             
          Thr Val  Ser Val Ser Ser Pro  Asp Ala Val Thr Ala  Tyr Asn Gly 
              1475                 1480                 1485             
          Tyr Leu  Thr Ser Ser Ser Lys  Thr Pro Glu Glu His  Phe Ile Glu 
              1490                 1495                 1500             
          Thr Ile  Ser Leu Ala Gly Ser  Tyr Lys Asp Trp Ser  Tyr Ser Gly 
              1505                 1510                 1515             
          Gln Ser  Thr Gln Leu Gly Ile  Glu Phe Leu Lys Arg  Gly Asp Lys 
              1520                 1525                 1530             
          Ser Val  Tyr Tyr Thr Ser Asn  Pro Thr Thr Phe His  Leu Asp Gly 
              1535                 1540                 1545             
          Glu Val  Ile Thr Phe Asp Asn  Leu Lys Thr Leu Leu  Ser Leu Arg 
              1550                 1555                 1560             
          Glu Val  Arg Thr Ile Lys Val  Phe Thr Thr Val Asp  Asn Ile Asn 
              1565                 1570                 1575             
          Leu His  Thr Gln Val Val Asp  Met Ser Met Thr Tyr  Gly Gln Gln 
              1580                 1585                 1590             
          Phe Gly  Pro Thr Tyr Leu Asp  Gly Ala Asp Val Thr  Lys Ile Lys 
              1595                 1600                 1605             
          Pro His  Asn Ser His Glu Gly  Lys Thr Phe Tyr Val  Leu Pro Asn 
              1610                 1615                 1620             
          Asp Asp  Thr Leu Arg Val Glu  Ala Phe Glu Tyr Tyr  His Thr Thr 
              1625                 1630                 1635             
          Asp Pro  Ser Phe Leu Gly Arg  Tyr Met Ser Ala Leu  Asn His Thr 
              1640                 1645                 1650             
          Lys Lys  Trp Lys Tyr Pro Gln  Val Asn Gly Leu Thr  Ser Ile Lys 
              1655                 1660                 1665             
          Trp Ala  Asp Asn Asn Cys Tyr  Leu Ala Thr Ala Leu  Leu Thr Leu 
              1670                 1675                 1680             
          Gln Gln  Ile Glu Leu Lys Phe  Asn Pro Pro Ala Leu  Gln Asp Ala 
              1685                 1690                 1695             
          Tyr Tyr  Arg Ala Arg Ala Gly  Glu Ala Ala Asn Phe  Cys Ala Leu 
              1700                 1705                 1710             
          Ile Leu  Ala Tyr Cys Asn Lys  Thr Val Gly Glu Leu  Gly Asp Val 
              1715                 1720                 1725             
          Arg Glu  Thr Met Ser Tyr Leu  Phe Gln His Ala Asn  Leu Asp Ser 
              1730                 1735                 1740             
          Cys Lys  Arg Val Leu Asn Val  Val Cys Lys Thr Cys  Gly Gln Gln 
              1745                 1750                 1755             
          Gln Thr  Thr Leu Lys Gly Val  Glu Ala Val Met Tyr  Met Gly Thr 
              1760                 1765                 1770             
          Leu Ser  Tyr Glu Gln Phe Lys  Lys Gly Val Gln Ile  Pro Cys Thr 
              1775                 1780                 1785             
          Cys Gly  Lys Gln Ala Thr Lys  Tyr Leu Val Gln Gln  Glu Ser Pro 
              1790                 1795                 1800             
          Phe Val  Met Met Ser Ala Pro  Pro Ala Gln Tyr Glu  Leu Lys His 
              1805                 1810                 1815             
          Gly Thr  Phe Thr Cys Ala Ser  Glu Tyr Thr Gly Asn  Tyr Gln Cys 
              1820                 1825                 1830             
          Gly His  Tyr Lys His Ile Thr  Ser Lys Glu Thr Leu  Tyr Cys Ile 
              1835                 1840                 1845             
          Asp Gly  Ala Leu Leu Thr Lys  Ser Ser Glu Tyr Lys  Gly Pro Ile 
              1850                 1855                 1860             
          Thr Asp  Val Phe Tyr Lys Glu  Asn Ser Tyr Thr Thr  Thr Ile Lys 
              1865                 1870                 1875             
          Pro Val  Thr Tyr Lys Leu Asp  Gly Val Val Cys Thr  Glu Ile Asp 
              1880                 1885                 1890             
          Pro Lys  Leu Asp Asn Tyr Tyr  Lys Lys Asp Asn Ser  Tyr Phe Thr 
              1895                 1900                 1905             
          Glu Gln  Pro Ile Asp Leu Val  Pro Asn Gln Pro Tyr  Pro Asn Ala 
              1910                 1915                 1920             
          Ser Phe  Asp Asn Phe Lys Phe  Val Cys Asp Asn Ile  Lys Phe Ala 
              1925                 1930                 1935             
          Asp Asp  Leu Asn Gln Leu Thr  Gly Tyr Lys Lys Pro  Ala Ser Arg 
              1940                 1945                 1950             
          Glu Leu  Lys Val Thr Phe Phe  Pro Asp Leu Asn Gly  Asp Val Val 
              1955                 1960                 1965             
          Ala Ile  Asp Tyr Lys His Tyr  Thr Pro Ser Phe Lys  Lys Gly Ala 
              1970                 1975                 1980             
          Lys Leu  Leu His Lys Pro Ile  Val Trp His Val Asn  Asn Ala Thr 
              1985                 1990                 1995             
          Asn Lys  Ala Thr Tyr Lys Pro  Asn Thr Trp Cys Ile  Arg Cys Leu 
              2000                 2005                 2010             
          Trp Ser  Thr Lys Pro Val Glu  Thr Ser Asn Ser Phe  Asp Val Leu 
              2015                 2020                 2025             
          Lys Ser  Glu Asp Ala Gln Gly  Met Asp Asn Leu Ala  Cys Glu Asp 
              2030                 2035                 2040             
          Leu Lys  Pro Val Ser Glu Glu  Val Val Glu Asn Pro  Thr Ile Gln 
              2045                 2050                 2055             
          Lys Asp  Val Leu Glu Cys Asn  Val Lys Thr Thr Glu  Val Val Gly 
              2060                 2065                 2070             
          Asp Ile  Ile Leu Lys Pro Ala  Asn Asn Ser Leu Lys  Ile Thr Glu 
              2075                 2080                 2085             
          Glu Val  Gly His Thr Asp Leu  Met Ala Ala Tyr Val  Asp Asn Ser 
              2090                 2095                 2100             
          Ser Leu  Thr Ile Lys Lys Pro  Asn Glu Leu Ser Arg  Val Leu Gly 
              2105                 2110                 2115             
          Leu Lys  Thr Leu Ala Thr His  Gly Leu Ala Ala Val  Asn Ser Val 
              2120                 2125                 2130             
          Pro Trp  Asp Thr Ile Ala Asn  Tyr Ala Lys Pro Phe  Leu Asn Lys 
              2135                 2140                 2145             
          Val Val  Ser Thr Thr Thr Asn  Ile Val Thr Arg Cys  Leu Asn Arg 
              2150                 2155                 2160             
          Val Cys  Thr Asn Tyr Met Pro  Tyr Phe Phe Thr Leu  Leu Leu Gln 
              2165                 2170                 2175             
          Leu Cys  Thr Phe Thr Arg Ser  Thr Asn Ser Arg Ile  Lys Ala Ser 
              2180                 2185                 2190             
          Met Pro  Thr Thr Ile Ala Lys  Asn Thr Val Lys Ser  Val Gly Lys 
              2195                 2200                 2205             
          Phe Cys  Leu Glu Ala Ser Phe  Asn Tyr Leu Lys Ser  Pro Asn Phe 
              2210                 2215                 2220             
          Ser Lys  Leu Ile Asn Ile Ile  Ile Trp Phe Leu Leu  Leu Ser Val 
              2225                 2230                 2235             
          Cys Leu  Gly Ser Leu Ile Tyr  Ser Thr Ala Ala Leu  Gly Val Leu 
              2240                 2245                 2250             
          Met Ser  Asn Leu Gly Met Pro  Ser Tyr Cys Thr Gly  Tyr Arg Glu 
              2255                 2260                 2265             
          Gly Tyr  Leu Asn Ser Thr Asn  Val Thr Ile Ala Thr  Tyr Cys Thr 
              2270                 2275                 2280             
          Gly Ser  Ile Pro Cys Ser Val  Cys Leu Ser Gly Leu  Asp Ser Leu 
              2285                 2290                 2295             
          Asp Thr  Tyr Pro Ser Leu Glu  Thr Ile Gln Ile Thr  Ile Ser Ser 
              2300                 2305                 2310             
          Phe Lys  Trp Asp Leu Thr Ala  Phe Gly Leu Val Ala  Glu Trp Phe 
              2315                 2320                 2325             
          Leu Ala  Tyr Ile Leu Phe Thr  Arg Phe Phe Tyr Val  Leu Gly Leu 
              2330                 2335                 2340             
          Ala Ala  Ile Met Gln Leu Phe  Phe Ser Tyr Phe Ala  Val His Phe 
              2345                 2350                 2355             
          Ile Ser  Asn Ser Trp Leu Met  Trp Leu Ile Ile Asn  Leu Val Gln 
              2360                 2365                 2370             
          Met Ala  Pro Ile Ser Ala Met  Val Arg Met Tyr Ile  Phe Phe Ala 
              2375                 2380                 2385             
          Ser Phe  Tyr Tyr Val Trp Lys  Ser Tyr Val His Val  Val Asp Gly 
              2390                 2395                 2400             
          Cys Asn  Ser Ser Thr Cys Met  Met Cys Tyr Lys Arg  Asn Arg Ala 
              2405                 2410                 2415             
          Thr Arg  Val Glu Cys Thr Thr  Ile Val Asn Gly Val  Arg Arg Ser 
              2420                 2425                 2430             
          Phe Tyr  Val Tyr Ala Asn Gly  Gly Lys Gly Phe Cys  Lys Leu His 
              2435                 2440                 2445             
          Asn Trp  Asn Cys Val Asn Cys  Asp Thr Phe Cys Ala  Gly Ser Thr 
              2450                 2455                 2460             
          Phe Ile  Ser Asp Glu Val Ala  Arg Asp Leu Ser Leu  Gln Phe Lys 
              2465                 2470                 2475             
          Arg Pro  Ile Asn Pro Thr Asp  Gln Ser Ser Tyr Ile  Val Asp Ser 
              2480                 2485                 2490             
          Val Thr  Val Lys Asn Gly Ser  Ile His Leu Tyr Phe  Asp Lys Ala 
              2495                 2500                 2505             
          Gly Gln  Lys Thr Tyr Glu Arg  His Ser Leu Ser His  Phe Val Asn 
              2510                 2515                 2520             
          Leu Asp  Asn Leu Arg Ala Asn  Asn Thr Lys Gly Ser  Leu Pro Ile 
              2525                 2530                 2535             
          Asn Val  Ile Val Phe Asp Gly  Lys Ser Lys Cys Glu  Glu Ser Ser 
              2540                 2545                 2550             
          Ala Lys  Ser Ala Ser Val Tyr  Tyr Ser Gln Leu Met  Cys Gln Pro 
              2555                 2560                 2565             
          Ile Leu  Leu Leu Asp Gln Ala  Leu Val Ser Asp Val  Gly Asp Ser 
              2570                 2575                 2580             
          Ala Glu  Val Ala Val Lys Met  Phe Asp Ala Tyr Val  Asn Thr Phe 
              2585                 2590                 2595             
          Ser Ser  Thr Phe Asn Val Pro  Met Glu Lys Leu Lys  Thr Leu Val 
              2600                 2605                 2610             
          Ala Thr  Ala Glu Ala Glu Leu  Ala Lys Asn Val Ser  Leu Asp Asn 
              2615                 2620                 2625             
          Val Leu  Ser Thr Phe Ile Ser  Ala Ala Arg Gln Gly  Phe Val Asp 
              2630                 2635                 2640             
          Ser Asp  Val Glu Thr Lys Asp  Val Val Glu Cys Leu  Lys Leu Ser 
              2645                 2650                 2655             
          His Gln  Ser Asp Ile Glu Val  Thr Gly Asp Ser Cys  Asn Asn Tyr 
              2660                 2665                 2670             
          Met Leu  Thr Tyr Asn Lys Val  Glu Asn Met Thr Pro  Arg Asp Leu 
              2675                 2680                 2685             
          Gly Ala  Cys Ile Asp Cys Ser  Ala Arg His Ile Asn  Ala Gln Val 
              2690                 2695                 2700             
          Ala Lys  Ser His Asn Ile Ala  Leu Ile Trp Asn Val  Lys Asp Phe 
              2705                 2710                 2715             
          Met Ser  Leu Ser Glu Gln Leu  Arg Lys Gln Ile Arg  Ser Ala Ala 
              2720                 2725                 2730             
          Lys Lys  Asn Asn Leu Pro Phe  Lys Leu Thr Cys Ala  Thr Thr Arg 
              2735                 2740                 2745             
          Gln Val  Val Asn Val Val Thr  Thr Lys Ile Ala Leu  Lys Gly Gly 
              2750                 2755                 2760             
          Lys Ile  Val Asn Asn Trp Leu  Lys Gln Leu Ile Lys  Val Thr Leu 
              2765                 2770                 2775             
          Val Phe  Leu Phe Val Ala Ala  Ile Phe Tyr Leu Ile  Thr Pro Val 
              2780                 2785                 2790             
          His Val  Met Ser Lys His Thr  Asp Phe Ser Ser Glu  Ile Ile Gly 
              2795                 2800                 2805             
          Tyr Lys  Ala Ile Asp Gly Gly  Val Thr Arg Asp Ile  Ala Ser Thr 
              2810                 2815                 2820             
          Asp Thr  Cys Phe Ala Asn Lys  His Ala Asp Phe Asp  Thr Trp Phe 
              2825                 2830                 2835             
          Ser Gln  Arg Gly Gly Ser Tyr  Thr Asn Asp Lys Ala  Cys Pro Leu 
              2840                 2845                 2850             
          Ile Ala  Ala Val Ile Thr Arg  Glu Val Gly Phe Val  Val Pro Gly 
              2855                 2860                 2865             
          Leu Pro  Gly Thr Ile Leu Arg  Thr Thr Asn Gly Asp  Phe Leu His 
              2870                 2875                 2880             
          Phe Leu  Pro Arg Val Phe Ser  Ala Val Gly Asn Ile  Cys Tyr Thr 
              2885                 2890                 2895             
          Pro Ser  Lys Leu Ile Glu Tyr  Thr Asp Phe Ala Thr  Ser Ala Cys 
              2900                 2905                 2910             
          Val Leu  Ala Ala Glu Cys Thr  Ile Phe Lys Asp Ala  Ser Gly Lys 
              2915                 2920                 2925             
          Pro Val  Pro Tyr Cys Tyr Asp  Thr Asn Val Leu Glu  Gly Ser Val 
              2930                 2935                 2940             
          Ala Tyr  Glu Ser Leu Arg Pro  Asp Thr Arg Tyr Val  Leu Met Asp 
              2945                 2950                 2955             
          Gly Ser  Ile Ile Gln Phe Pro  Asn Thr Tyr Leu Glu  Gly Ser Val 
              2960                 2965                 2970             
          Arg Val  Val Thr Thr Phe Asp  Ser Glu Tyr Cys Arg  His Gly Thr 
              2975                 2980                 2985             
          Cys Glu  Arg Ser Glu Ala Gly  Val Cys Val Ser Thr  Ser Gly Arg 
              2990                 2995                 3000             
          Trp Val  Leu Asn Asn Asp Tyr  Tyr Arg Ser Leu Pro  Gly Val Phe 
              3005                 3010                 3015             
          Cys Gly  Val Asp Ala Val Asn  Leu Leu Thr Asn Met  Phe Thr Pro 
              3020                 3025                 3030             
          Leu Ile  Gln Pro Ile Gly Ala  Leu Asp Ile Ser Ala  Ser Ile Val 
              3035                 3040                 3045             
          Ala Gly  Gly Ile Val Ala Ile  Val Val Thr Cys Leu  Ala Tyr Tyr 
              3050                 3055                 3060             
          Phe Met  Arg Phe Arg Arg Ala  Phe Gly Glu Tyr Ser  His Val Val 
              3065                 3070                 3075             
          Ala Phe  Asn Thr Leu Leu Phe  Leu Met Ser Phe Thr  Val Leu Cys 
              3080                 3085                 3090             
          Leu Thr  Pro Val Tyr Ser Phe  Leu Pro Gly Val Tyr  Ser Val Ile 
              3095                 3100                 3105             
          Tyr Leu  Tyr Leu Thr Phe Tyr  Leu Thr Asn Asp Val  Ser Phe Leu 
              3110                 3115                 3120             
          Ala His  Ile Gln Trp Met Val  Met Phe Thr Pro Leu  Val Pro Phe 
              3125                 3130                 3135             
          Trp Ile  Thr Ile Ala Tyr Ile  Ile Cys Ile Ser Thr  Lys His Phe 
              3140                 3145                 3150             
          Tyr Trp  Phe Phe Ser Asn Tyr  Leu Lys Arg Arg Val  Val Phe Asn 
              3155                 3160                 3165             
          Gly Val  Ser Phe Ser Thr Phe  Glu Glu Ala Ala Leu  Cys Thr Phe 
              3170                 3175                 3180             
          Leu Leu  Asn Lys Glu Met Tyr  Leu Lys Leu Arg Ser  Asp Val Leu 
              3185                 3190                 3195             
          Leu Pro  Leu Thr Gln Tyr Asn  Arg Tyr Leu Ala Leu  Tyr Asn Lys 
              3200                 3205                 3210             
          Tyr Lys  Tyr Phe Ser Gly Ala  Met Asp Thr Thr Ser  Tyr Arg Glu 
              3215                 3220                 3225             
          Ala Ala  Cys Cys His Leu Ala  Lys Ala Leu Asn Asp  Phe Ser Asn 
              3230                 3235                 3240             
          Ser Gly  Ser Asp Val Leu Tyr  Gln Pro Pro Gln Thr  Ser Ile Thr 
              3245                 3250                 3255             
          Ser Ala  Val Leu Gln Ser Gly  Phe Arg Lys Met Ala  Phe Pro Ser 
              3260                 3265                 3270             
          Gly Lys  Val Glu Gly Cys Met  Val Gln Val Thr Cys  Gly Thr Thr 
              3275                 3280                 3285             
          Thr Leu  Asn Gly Leu Trp Leu  Asp Asp Val Val Tyr  Cys Pro Arg 
              3290                 3295                 3300             
          His Val  Ile Cys Thr Ser Glu  Asp Met Leu Asn Pro  Asn Tyr Glu 
              3305                 3310                 3315             
          Asp Leu  Leu Ile Arg Lys Ser  Asn His Asn Phe Leu  Val Gln Ala 
              3320                 3325                 3330             
          Gly Asn  Val Gln Leu Arg Val  Ile Gly His Ser Met  Gln Asn Cys 
              3335                 3340                 3345             
          Val Leu  Lys Leu Lys Val Asp  Thr Ala Asn Pro Lys  Thr Pro Lys 
              3350                 3355                 3360             
          Tyr Lys  Phe Val Arg Ile Gln  Pro Gly Gln Thr Phe  Ser Val Leu 
              3365                 3370                 3375             
          Ala Cys  Tyr Asn Gly Ser Pro  Ser Gly Val Tyr Gln  Cys Ala Met 
              3380                 3385                 3390             
          Arg Pro  Asn Phe Thr Ile Lys  Gly Ser Phe Leu Asn  Gly Ser Cys 
              3395                 3400                 3405             
          Gly Ser  Val Gly Phe Asn Ile  Asp Tyr Asp Cys Val  Ser Phe Cys 
              3410                 3415                 3420             
          Tyr Met  His His Met Glu Leu  Pro Thr Gly Val His  Ala Gly Thr 
              3425                 3430                 3435             
          Asp Leu  Glu Gly Asn Phe Tyr  Gly Pro Phe Val Asp  Arg Gln Thr 
              3440                 3445                 3450             
          Ala Gln  Ala Ala Gly Thr Asp  Thr Thr Ile Thr Val  Asn Val Leu 
              3455                 3460                 3465             
          Ala Trp  Leu Tyr Ala Ala Val  Ile Asn Gly Asp Arg  Trp Phe Leu 
              3470                 3475                 3480             
          Asn Arg  Phe Thr Thr Thr Leu  Asn Asp Phe Asn Leu  Val Ala Met 
              3485                 3490                 3495             
          Lys Tyr  Asn Tyr Glu Pro Leu  Thr Gln Asp His Val  Asp Ile Leu 
              3500                 3505                 3510             
          Gly Pro  Leu Ser Ala Gln Thr  Gly Ile Ala Val Leu  Asp Met Cys 
              3515                 3520                 3525             
          Ala Ser  Leu Lys Glu Leu Leu  Gln Asn Gly Met Asn  Gly Arg Thr 
              3530                 3535                 3540             
          Ile Leu  Gly Ser Ala Leu Leu  Glu Asp Glu Phe Thr  Pro Phe Asp 
              3545                 3550                 3555             
          Val Val  Arg Gln Cys Ser Gly  Val Thr Phe Gln Ser  Ala Val Lys 
              3560                 3565                 3570             
          Arg Thr  Ile Lys Gly Thr His  His Trp Leu Leu Leu  Thr Ile Leu 
              3575                 3580                 3585             
          Thr Ser  Leu Leu Val Leu Val  Gln Ser Thr Gln Trp  Ser Leu Phe 
              3590                 3595                 3600             
          Phe Phe  Leu Tyr Glu Asn Ala  Phe Leu Pro Phe Ala  Met Gly Ile 
              3605                 3610                 3615             
          Ile Ala  Met Ser Ala Phe Ala  Met Met Phe Val Lys  His Lys His 
              3620                 3625                 3630             
          Ala Phe  Leu Cys Leu Phe Leu  Leu Pro Ser Leu Ala  Thr Val Ala 
              3635                 3640                 3645             
          Tyr Phe  Asn Met Val Tyr Met  Pro Ala Ser Trp Val  Met Arg Ile 
              3650                 3655                 3660             
          Met Thr  Trp Leu Asp Met Val  Asp Thr Ser Leu Ser  Gly Phe Lys 
              3665                 3670                 3675             
          Leu Lys  Asp Cys Val Met Tyr  Ala Ser Ala Val Val  Leu Leu Ile 
              3680                 3685                 3690             
          Leu Met  Thr Ala Arg Thr Val  Tyr Asp Asp Gly Ala  Arg Arg Val 
              3695                 3700                 3705             
          Trp Thr  Leu Met Asn Val Leu  Thr Leu Val Tyr Lys  Val Tyr Tyr 
              3710                 3715                 3720             
          Gly Asn  Ala Leu Asp Gln Ala  Ile Ser Met Trp Ala  Leu Ile Ile 
              3725                 3730                 3735             
          Ser Val  Thr Ser Asn Tyr Ser  Gly Val Val Thr Thr  Val Met Phe 
              3740                 3745                 3750             
          Leu Ala  Arg Gly Ile Val Phe  Met Cys Val Glu Tyr  Cys Pro Ile 
              3755                 3760                 3765             
          Phe Phe  Ile Thr Gly Asn Thr  Leu Gln Cys Ile Met  Leu Val Tyr 
              3770                 3775                 3780             
          Cys Phe  Leu Gly Tyr Phe Cys  Thr Cys Tyr Phe Gly  Leu Phe Cys 
              3785                 3790                 3795             
          Leu Leu  Asn Arg Tyr Phe Arg  Leu Thr Leu Gly Val  Tyr Asp Tyr 
              3800                 3805                 3810             
          Leu Val  Ser Thr Gln Glu Phe  Arg Tyr Met Asn Ser  Gln Gly Leu 
              3815                 3820                 3825             
          Leu Pro  Pro Lys Asn Ser Ile  Asp Ala Phe Lys Leu  Asn Ile Lys 
              3830                 3835                 3840             
          Leu Leu  Gly Val Gly Gly Lys  Pro Cys Ile Lys Val  Ala Thr Val 
              3845                 3850                 3855             
          Gln Ser  Lys Met Ser Asp Val  Lys Cys Thr Ser Val  Val Leu Leu 
              3860                 3865                 3870             
          Ser Val  Leu Gln Gln Leu Arg  Val Glu Ser Ser Ser  Lys Leu Trp 
              3875                 3880                 3885             
          Ala Gln  Cys Val Gln Leu His  Asn Asp Ile Leu Leu  Ala Lys Asp 
              3890                 3895                 3900             
          Thr Thr  Glu Ala Phe Glu Lys  Met Val Ser Leu Leu  Ser Val Leu 
              3905                 3910                 3915             
          Leu Ser  Met Gln Gly Ala Val  Asp Ile Asn Lys Leu  Cys Glu Glu 
              3920                 3925                 3930             
          Met Leu  Asp Asn Arg Ala Thr  Leu Gln Ala Ile Ala  Ser Glu Phe 
              3935                 3940                 3945             
          Ser Ser  Leu Pro Ser Tyr Ala  Ala Phe Ala Thr Ala  Gln Glu Ala 
              3950                 3955                 3960             
          Tyr Glu  Gln Ala Val Ala Asn  Gly Asp Ser Glu Val  Val Leu Lys 
              3965                 3970                 3975             
          Lys Leu  Lys Lys Ser Leu Asn  Val Ala Lys Ser Glu  Phe Asp Arg 
              3980                 3985                 3990             
          Asp Ala  Ala Met Gln Arg Lys  Leu Glu Lys Met Ala  Asp Gln Ala 
              3995                 4000                 4005             
          Met Thr  Gln Met Tyr Lys Gln  Ala Arg Ser Glu Asp  Lys Arg Ala 
              4010                 4015                 4020             
          Lys Val  Thr Ser Ala Met Gln  Thr Met Leu Phe Thr  Met Leu Arg 
              4025                 4030                 4035             
          Lys Leu  Asp Asn Asp Ala Leu  Asn Asn Ile Ile Asn  Asn Ala Arg 
              4040                 4045                 4050             
          Asp Gly  Cys Val Pro Leu Asn  Ile Ile Pro Leu Thr  Thr Ala Ala 
              4055                 4060                 4065             
          Lys Leu  Met Val Val Ile Pro  Asp Tyr Asn Thr Tyr  Lys Asn Thr 
              4070                 4075                 4080             
          Cys Asp  Gly Thr Thr Phe Thr  Tyr Ala Ser Ala Leu  Trp Glu Ile 
              4085                 4090                 4095             
          Gln Gln  Val Val Asp Ala Asp  Ser Lys Ile Val Gln  Leu Ser Glu 
              4100                 4105                 4110             
          Ile Ser  Met Asp Asn Ser Pro  Asn Leu Ala Trp Pro  Leu Ile Val 
              4115                 4120                 4125             
          Thr Ala  Leu Arg Ala Asn Ser  Ala Val Lys Leu Gln  Asn Asn Glu 
              4130                 4135                 4140             
          Leu Ser  Pro Val Ala Leu Arg  Gln Met Ser Cys Ala  Ala Gly Thr 
              4145                 4150                 4155             
          Thr Gln  Thr Ala Cys Thr Asp  Asp Asn Ala Leu Ala  Tyr Tyr Asn 
              4160                 4165                 4170             
          Thr Thr  Lys Gly Gly Arg Phe  Val Leu Ala Leu Leu  Ser Asp Leu 
              4175                 4180                 4185             
          Gln Asp  Leu Lys Trp Ala Arg  Phe Pro Lys Ser Asp  Gly Thr Gly 
              4190                 4195                 4200             
          Thr Ile  Tyr Thr Glu Leu Glu  Pro Pro Cys Arg Phe  Val Thr Asp 
              4205                 4210                 4215             
          Thr Pro  Lys Gly Pro Lys Val  Lys Tyr Leu Tyr Phe  Ile Lys Gly 
              4220                 4225                 4230             
          Leu Asn  Asn Leu Asn Arg Gly  Met Val Leu Gly Ser  Leu Ala Ala 
              4235                 4240                 4245             
          Thr Val  Arg Leu Gln Ala Gly  Asn Ala Thr Glu Val  Pro Ala Asn 
              4250                 4255                 4260             
          Ser Thr  Val Leu Ser Phe Cys  Ala Phe Ala Val Asp  Ala Ala Lys 
              4265                 4270                 4275             
          Ala Tyr  Lys Asp Tyr Leu Ala  Ser Gly Gly Gln Pro  Ile Thr Asn 
              4280                 4285                 4290             
          Cys Val  Lys Met Leu Cys Thr  His Thr Gly Thr Gly  Gln Ala Ile 
              4295                 4300                 4305             
          Thr Val  Thr Pro Glu Ala Asn  Met Asp Gln Glu Ser  Phe Gly Gly 
              4310                 4315                 4320             
          Ala Ser  Cys Cys Leu Tyr Cys  Arg Cys His Ile Asp  His Pro Asn 
              4325                 4330                 4335             
          Pro Lys  Gly Phe Cys Asp Leu  Lys Gly Lys Tyr Val  Gln Ile Pro 
              4340                 4345                 4350             
          Thr Thr  Cys Ala Asn Asp Pro  Val Gly Phe Thr Leu  Lys Asn Thr 
              4355                 4360                 4365             
          Val Cys  Thr Val Cys Gly Met  Trp Lys Gly Tyr Gly  Cys Ser Cys 
              4370                 4375                 4380             
          Asp Gln  Leu Arg Glu Pro Met  Leu Gln Ser Ala Asp  Ala Gln Ser 
              4385                 4390                 4395             
          Phe Leu  Asn Arg Val Cys Gly  Val Ser Ala Ala Arg  Leu Thr Pro 
              4400                 4405                 4410             
          Cys Gly  Thr Gly Thr Ser Thr  Asp Val Val Tyr Arg  Ala Phe Asp 
              4415                 4420                 4425             
          Ile Tyr  Asn Asp Lys Val Ala  Gly Phe Ala Lys Phe  Leu Lys Thr 
              4430                 4435                 4440             
          Asn Cys  Cys Arg Phe Gln Glu  Lys Asp Glu Asp Asp  Asn Leu Ile 
              4445                 4450                 4455             
          Asp Ser  Tyr Phe Val Val Lys  Arg His Thr Phe Ser  Asn Tyr Gln 
              4460                 4465                 4470             
          His Glu  Glu Thr Ile Tyr Asn  Leu Leu Lys Asp Cys  Pro Ala Val 
              4475                 4480                 4485             
          Ala Lys  His Asp Phe Phe Lys  Phe Arg Ile Asp Gly  Asp Met Val 
              4490                 4495                 4500             
          Pro His  Ile Ser Arg Gln Arg  Leu Thr Lys Tyr Thr  Met Ala Asp 
              4505                 4510                 4515             
          Leu Val  Tyr Ala Leu Arg His  Phe Asp Glu Gly Asn  Cys Asp Thr 
              4520                 4525                 4530             
          Leu Lys  Glu Ile Leu Val Thr  Tyr Asn Cys Cys Asp  Asp Asp Tyr 
              4535                 4540                 4545             
          Phe Asn  Lys Lys Asp Trp Tyr  Asp Phe Val Glu Asn  Pro Asp Ile 
              4550                 4555                 4560             
          Leu Arg  Val Tyr Ala Asn Leu  Gly Glu Arg Val Arg  Gln Ala Leu 
              4565                 4570                 4575             
          Leu Lys  Thr Val Gln Phe Cys  Asp Ala Met Arg Asn  Ala Gly Ile 
              4580                 4585                 4590             
          Val Gly  Val Leu Thr Leu Asp  Asn Gln Asp Leu Asn  Gly Asn Trp 
              4595                 4600                 4605             
          Tyr Asp  Phe Gly Asp Phe Ile  Gln Thr Thr Pro Gly  Ser Gly Val 
              4610                 4615                 4620             
          Pro Val  Val Asp Ser Tyr Tyr  Ser Leu Leu Met Pro  Ile Leu Thr 
              4625                 4630                 4635             
          Leu Thr  Arg Ala Leu Thr Ala  Glu Ser His Val Asp  Thr Asp Leu 
              4640                 4645                 4650             
          Thr Lys  Pro Tyr Ile Lys Trp  Asp Leu Leu Lys Tyr  Asp Phe Thr 
              4655                 4660                 4665             
          Glu Glu  Arg Leu Lys Leu Phe  Asp Arg Tyr Phe Lys  Tyr Trp Asp 
              4670                 4675                 4680             
          Gln Thr  Tyr His Pro Asn Cys  Val Asn Cys Leu Asp  Asp Arg Cys 
              4685                 4690                 4695             
          Ile Leu  His Cys Ala Asn Phe  Asn Val Leu Phe Ser  Thr Val Phe 
              4700                 4705                 4710             
          Pro Pro  Thr Ser Phe Gly Pro  Leu Val Arg Lys Ile  Phe Val Asp 
              4715                 4720                 4725             
          Gly Val  Pro Phe Val Val Ser  Thr Gly Tyr His Phe  Arg Glu Leu 
              4730                 4735                 4740             
          Gly Val  Val His Asn Gln Asp  Val Asn Leu His Ser  Ser Arg Leu 
              4745                 4750                 4755             
          Ser Phe  Lys Glu Leu Leu Val  Tyr Ala Ala Asp Pro  Ala Met His 
              4760                 4765                 4770             
          Ala Ala  Ser Gly Asn Leu Leu  Leu Asp Lys Arg Thr  Thr Cys Phe 
              4775                 4780                 4785             
          Ser Val  Ala Ala Leu Thr Asn  Asn Val Ala Phe Gln  Thr Val Lys 
              4790                 4795                 4800             
          Pro Gly  Asn Phe Asn Lys Asp  Phe Tyr Asp Phe Ala  Val Ser Lys 
              4805                 4810                 4815             
          Gly Phe  Phe Lys Glu Gly Ser  Ser Val Glu Leu Lys  His Phe Phe 
              4820                 4825                 4830             
          Phe Ala  Gln Asp Gly Asn Ala  Ala Ile Ser Asp Tyr  Asp Tyr Tyr 
              4835                 4840                 4845             
          Arg Tyr  Asn Leu Pro Thr Met  Cys Asp Ile Arg Gln  Leu Leu Phe 
              4850                 4855                 4860             
          Val Val  Glu Val Val Asp Lys  Tyr Phe Asp Cys Tyr  Asp Gly Gly 
              4865                 4870                 4875             
          Cys Ile  Asn Ala Asn Gln Val  Ile Val Asn Asn Leu  Asp Lys Ser 
              4880                 4885                 4890             
          Ala Gly  Phe Pro Phe Asn Lys  Trp Gly Lys Ala Arg  Leu Tyr Tyr 
              4895                 4900                 4905             
          Asp Ser  Met Ser Tyr Glu Asp  Gln Asp Ala Leu Phe  Ala Tyr Thr 
              4910                 4915                 4920             
          Lys Arg  Asn Val Ile Pro Thr  Ile Thr Gln Met Asn  Leu Lys Tyr 
              4925                 4930                 4935             
          Ala Ile  Ser Ala Lys Asn Arg  Ala Arg Thr Val Ala  Gly Val Ser 
              4940                 4945                 4950             
          Ile Cys  Ser Thr Met Thr Asn  Arg Gln Phe His Gln  Lys Leu Leu 
              4955                 4960                 4965             
          Lys Ser  Ile Ala Ala Thr Arg  Gly Ala Thr Val Val  Ile Gly Thr 
              4970                 4975                 4980             
          Ser Lys  Phe Tyr Gly Gly Trp  His Asn Met Leu Lys  Thr Val Tyr 
              4985                 4990                 4995             
          Ser Asp  Val Glu Asn Pro His  Leu Met Gly Trp Asp  Tyr Pro Lys 
              5000                 5005                 5010             
          Cys Asp  Arg Ala Met Pro Asn  Met Leu Arg Ile Met  Ala Ser Leu 
              5015                 5020                 5025             
          Val Leu  Ala Arg Lys His Thr  Thr Cys Cys Ser Leu  Ser His Arg 
              5030                 5035                 5040             
          Phe Tyr  Arg Leu Ala Asn Glu  Cys Ala Gln Val Leu  Ser Glu Met 
              5045                 5050                 5055             
          Val Met  Cys Gly Gly Ser Leu  Tyr Val Lys Pro Gly  Gly Thr Ser 
              5060                 5065                 5070             
          Ser Gly  Asp Ala Thr Thr Ala  Tyr Ala Asn Ser Val  Phe Asn Ile 
              5075                 5080                 5085             
          Cys Gln  Ala Val Thr Ala Asn  Val Asn Ala Leu Leu  Ser Thr Asp 
              5090                 5095                 5100             
          Gly Asn  Lys Ile Ala Asp Lys  Tyr Val Arg Asn Leu  Gln His Arg 
              5105                 5110                 5115             
          Leu Tyr  Glu Cys Leu Tyr Arg  Asn Arg Asp Val Asp  Thr Asp Phe 
              5120                 5125                 5130             
          Val Asn  Glu Phe Tyr Ala Tyr  Leu Arg Lys His Phe  Ser Met Met 
              5135                 5140                 5145             
          Ile Leu  Ser Asp Asp Ala Val  Val Cys Phe Asn Ser  Thr Tyr Ala 
              5150                 5155                 5160             
          Ser Gln  Gly Leu Val Ala Ser  Ile Lys Asn Phe Lys  Ser Val Leu 
              5165                 5170                 5175             
          Tyr Tyr  Gln Asn Asn Val Phe  Met Ser Glu Ala Lys  Cys Trp Thr 
              5180                 5185                 5190             
          Glu Thr  Asp Leu Thr Lys Gly  Pro His Glu Phe Cys  Ser Gln His 
              5195                 5200                 5205             
          Thr Met  Leu Val Lys Gln Gly  Asp Asp Tyr Val Tyr  Leu Pro Tyr 
              5210                 5215                 5220             
          Pro Asp  Pro Ser Arg Ile Leu  Gly Ala Gly Cys Phe  Val Asp Asp 
              5225                 5230                 5235             
          Ile Val  Lys Thr Asp Gly Thr  Leu Met Ile Glu Arg  Phe Val Ser 
              5240                 5245                 5250             
          Leu Ala  Ile Asp Ala Tyr Pro  Leu Thr Lys His Pro  Asn Gln Glu 
              5255                 5260                 5265             
          Tyr Ala  Asp Val Phe His Leu  Tyr Leu Gln Tyr Ile  Arg Lys Leu 
              5270                 5275                 5280             
          His Asp  Glu Leu Thr Gly His  Met Leu Asp Met Tyr  Ser Val Met 
              5285                 5290                 5295             
          Leu Thr  Asn Asp Asn Thr Ser  Arg Tyr Trp Glu Pro  Glu Phe Tyr 
              5300                 5305                 5310             
          Glu Ala  Met Tyr Thr Pro His  Thr Val Leu Gln Ala  Val Gly Ala 
              5315                 5320                 5325             
          Cys Val  Leu Cys Asn Ser Gln  Thr Ser Leu Arg Cys  Gly Ala Cys 
              5330                 5335                 5340             
          Ile Arg  Arg Pro Phe Leu Cys  Cys Lys Cys Cys Tyr  Asp His Val 
              5345                 5350                 5355             
          Ile Ser  Thr Ser His Lys Leu  Val Leu Ser Val Asn  Pro Tyr Val 
              5360                 5365                 5370             
          Cys Asn  Ala Pro Gly Cys Asp  Val Thr Asp Val Thr  Gln Leu Tyr 
              5375                 5380                 5385             
          Leu Gly  Gly Met Ser Tyr Tyr  Cys Lys Ser His Lys  Pro Pro Ile 
              5390                 5395                 5400             
          Ser Phe  Pro Leu Cys Ala Asn  Gly Gln Val Phe Gly  Leu Tyr Lys 
              5405                 5410                 5415             
          Asn Thr  Cys Val Gly Ser Asp  Asn Val Thr Asp Phe  Asn Ala Ile 
              5420                 5425                 5430             
          Ala Thr  Cys Asp Trp Thr Asn  Ala Gly Asp Tyr Ile  Leu Ala Asn 
              5435                 5440                 5445             
          Thr Cys  Thr Glu Arg Leu Lys  Leu Phe Ala Ala Glu  Thr Leu Lys 
              5450                 5455                 5460             
          Ala Thr  Glu Glu Thr Phe Lys  Leu Ser Tyr Gly Ile  Ala Thr Val 
              5465                 5470                 5475             
          Arg Glu  Val Leu Ser Asp Arg  Glu Leu His Leu Ser  Trp Glu Val 
              5480                 5485                 5490             
          Gly Lys  Pro Arg Pro Pro Leu  Asn Arg Asn Tyr Val  Phe Thr Gly 
              5495                 5500                 5505             
          Tyr Arg  Val Thr Lys Asn Ser  Lys Val Gln Ile Gly  Glu Tyr Thr 
              5510                 5515                 5520             
          Phe Glu  Lys Gly Asp Tyr Gly  Asp Ala Val Val Tyr  Arg Gly Thr 
              5525                 5530                 5535             
          Thr Thr  Tyr Lys Leu Asn Val  Gly Asp Tyr Phe Val  Leu Thr Ser 
              5540                 5545                 5550             
          His Thr  Val Met Pro Leu Ser  Ala Pro Thr Leu Val  Pro Gln Glu 
              5555                 5560                 5565             
          His Tyr  Val Arg Ile Thr Gly  Leu Tyr Pro Thr Leu  Asn Ile Ser 
              5570                 5575                 5580             
          Asp Glu  Phe Ser Ser Asn Val  Ala Asn Tyr Gln Lys  Val Gly Met 
              5585                 5590                 5595             
          Gln Lys  Tyr Ser Thr Leu Gln  Gly Pro Pro Gly Thr  Gly Lys Ser 
              5600                 5605                 5610             
          His Phe  Ala Ile Gly Leu Ala  Leu Tyr Tyr Pro Ser  Ala Arg Ile 
              5615                 5620                 5625             
          Val Tyr  Thr Ala Cys Ser His  Ala Ala Val Asp Ala  Leu Cys Glu 
              5630                 5635                 5640             
          Lys Ala  Leu Lys Tyr Leu Pro  Ile Asp Lys Cys Ser  Arg Ile Ile 
              5645                 5650                 5655             
          Pro Ala  Arg Ala Arg Val Glu  Cys Phe Asp Lys Phe  Lys Val Asn 
              5660                 5665                 5670             
          Ser Thr  Leu Glu Gln Tyr Val  Phe Cys Thr Val Asn  Ala Leu Pro 
              5675                 5680                 5685             
          Glu Thr  Thr Ala Asp Ile Val  Val Phe Asp Glu Ile  Ser Met Ala 
              5690                 5695                 5700             
          Thr Asn  Tyr Asp Leu Ser Val  Val Asn Ala Arg Leu  Arg Ala Lys 
              5705                 5710                 5715             
          His Tyr  Val Tyr Ile Gly Asp  Pro Ala Gln Leu Pro  Ala Pro Arg 
              5720                 5725                 5730             
          Thr Leu  Leu Thr Lys Gly Thr  Leu Glu Pro Glu Tyr  Phe Asn Ser 
              5735                 5740                 5745             
          Val Cys  Arg Leu Met Lys Thr  Ile Gly Pro Asp Met  Phe Leu Gly 
              5750                 5755                 5760             
          Thr Cys  Arg Arg Cys Pro Ala  Glu Ile Val Asp Thr  Val Ser Ala 
              5765                 5770                 5775             
          Leu Val  Tyr Asp Asn Lys Leu  Lys Ala His Lys Asp  Lys Ser Ala 
              5780                 5785                 5790             
          Gln Cys  Phe Lys Met Phe Tyr  Lys Gly Val Ile Thr  His Asp Val 
              5795                 5800                 5805             
          Ser Ser  Ala Ile Asn Arg Pro  Gln Ile Gly Val Val  Arg Glu Phe 
              5810                 5815                 5820             
          Leu Thr  Arg Asn Pro Ala Trp  Arg Lys Ala Val Phe  Ile Ser Pro 
              5825                 5830                 5835             
          Tyr Asn  Ser Gln Asn Ala Val  Ala Ser Lys Ile Leu  Gly Leu Pro 
              5840                 5845                 5850             
          Thr Gln  Thr Val Asp Ser Ser  Gln Gly Ser Glu Tyr  Asp Tyr Val 
              5855                 5860                 5865             
          Ile Phe  Thr Gln Thr Thr Glu  Thr Ala His Ser Cys  Asn Val Asn 
              5870                 5875                 5880             
          Arg Phe  Asn Val Ala Ile Thr  Arg Ala Lys Val Gly  Ile Leu Cys 
              5885                 5890                 5895             
          Ile Met  Ser Asp Arg Asp Leu  Tyr Asp Lys Leu Gln  Phe Thr Ser 
              5900                 5905                 5910             
          Leu Glu  Ile Pro Arg Arg Asn  Val Ala Thr Leu Gln  Ala Glu Asn 
              5915                 5920                 5925             
          Val Thr  Gly Leu Phe Lys Asp  Cys Ser Lys Val Ile  Thr Gly Leu 
              5930                 5935                 5940             
          His Pro  Thr Gln Ala Pro Thr  His Leu Ser Val Asp  Thr Lys Phe 
              5945                 5950                 5955             
          Lys Thr  Glu Gly Leu Cys Val  Asp Ile Pro Gly Ile  Pro Lys Asp 
              5960                 5965                 5970             
          Met Thr  Tyr Arg Arg Leu Ile  Ser Met Met Gly Phe  Lys Met Asn 
              5975                 5980                 5985             
          Tyr Gln  Val Asn Gly Tyr Pro  Asn Met Phe Ile Thr  Arg Glu Glu 
              5990                 5995                 6000             
          Ala Ile  Arg His Val Arg Ala  Trp Ile Gly Phe Asp  Val Glu Gly 
              6005                 6010                 6015             
          Cys His  Ala Thr Arg Glu Ala  Val Gly Thr Asn Leu  Pro Leu Gln 
              6020                 6025                 6030             
          Leu Gly  Phe Ser Thr Gly Val  Asn Leu Val Ala Val  Pro Thr Gly 
              6035                 6040                 6045             
          Tyr Val  Asp Thr Pro Asn Asn  Thr Asp Phe Ser Arg  Val Ser Ala 
              6050                 6055                 6060             
          Lys Pro  Pro Pro Gly Asp Gln  Phe Lys His Leu Ile  Pro Leu Met 
              6065                 6070                 6075             
          Tyr Lys  Gly Leu Pro Trp Asn  Val Val Arg Ile Lys  Ile Val Gln 
              6080                 6085                 6090             
          Met Leu  Ser Asp Thr Leu Lys  Asn Leu Ser Asp Arg  Val Val Phe 
              6095                 6100                 6105             
          Val Leu  Trp Ala His Gly Phe  Glu Leu Thr Ser Met  Lys Tyr Phe 
              6110                 6115                 6120             
          Val Lys  Ile Gly Pro Glu Arg  Thr Cys Cys Leu Cys  Asp Arg Arg 
              6125                 6130                 6135             
          Ala Thr  Cys Phe Ser Thr Ala  Ser Asp Thr Tyr Ala  Cys Trp His 
              6140                 6145                 6150             
          His Ser  Ile Gly Phe Asp Tyr  Val Tyr Asn Pro Phe  Met Ile Asp 
              6155                 6160                 6165             
          Val Gln  Gln Trp Gly Phe Thr  Gly Asn Leu Gln Ser  Asn His Asp 
              6170                 6175                 6180             
          Leu Tyr  Cys Gln Val His Gly  Asn Ala His Val Ala  Ser Cys Asp 
              6185                 6190                 6195             
          Ala Ile  Met Thr Arg Cys Leu  Ala Val His Glu Cys  Phe Val Lys 
              6200                 6205                 6210             
          Arg Val  Asp Trp Thr Ile Glu  Tyr Pro Ile Ile Gly  Asp Glu Leu 
              6215                 6220                 6225             
          Lys Ile  Asn Ala Ala Cys Arg  Lys Val Gln His Met  Val Val Lys 
              6230                 6235                 6240             
          Ala Ala  Leu Leu Ala Asp Lys  Phe Pro Val Leu His  Asp Ile Gly 
              6245                 6250                 6255             
          Asn Pro  Lys Ala Ile Lys Cys  Val Pro Gln Ala Asp  Val Glu Trp 
              6260                 6265                 6270             
          Lys Phe  Tyr Asp Ala Gln Pro  Cys Ser Asp Lys Ala  Tyr Lys Ile 
              6275                 6280                 6285             
          Glu Glu  Leu Phe Tyr Ser Tyr  Ala Thr His Ser Asp  Lys Phe Thr 
              6290                 6295                 6300             
          Asp Gly  Val Cys Leu Phe Trp  Asn Cys Asn Val Asp  Arg Tyr Pro 
              6305                 6310                 6315             
          Ala Asn  Ser Ile Val Cys Arg  Phe Asp Thr Arg Val  Leu Ser Asn 
              6320                 6325                 6330             
          Leu Asn  Leu Pro Gly Cys Asp  Gly Gly Ser Leu Tyr  Val Asn Lys 
              6335                 6340                 6345             
          His Ala  Phe His Thr Pro Ala  Phe Asp Lys Ser Ala  Phe Val Asn 
              6350                 6355                 6360             
          Leu Lys  Gln Leu Pro Phe Phe  Tyr Tyr Ser Asp Ser  Pro Cys Glu 
              6365                 6370                 6375             
          Ser His  Gly Lys Gln Val Val  Ser Asp Ile Asp Tyr  Val Pro Leu 
              6380                 6385                 6390             
          Lys Ser  Ala Thr Cys Ile Thr  Arg Cys Asn Leu Gly  Gly Ala Val 
              6395                 6400                 6405             
          Cys Arg  His His Ala Asn Glu  Tyr Arg Leu Tyr Leu  Asp Ala Tyr 
              6410                 6415                 6420             
          Asn Met  Met Ile Ser Ala Gly  Phe Ser Leu Trp Val  Tyr Lys Gln 
              6425                 6430                 6435             
          Phe Asp  Thr Tyr Asn Leu Trp  Asn Thr Phe Thr Arg  Leu Gln Ser 
              6440                 6445                 6450             
          Leu Glu  Asn Val Ala Phe Asn  Val Val Asn Lys Gly  His Phe Asp 
              6455                 6460                 6465             
          Gly Gln  Gln Gly Glu Val Pro  Val Ser Ile Ile Asn  Asn Thr Val 
              6470                 6475                 6480             
          Tyr Thr  Lys Val Asp Gly Val  Asp Val Glu Leu Phe  Glu Asn Lys 
              6485                 6490                 6495             
          Thr Thr  Leu Pro Val Asn Val  Ala Phe Glu Leu Trp  Ala Lys Arg 
              6500                 6505                 6510             
          Asn Ile  Lys Pro Val Pro Glu  Val Lys Ile Leu Asn  Asn Leu Gly 
              6515                 6520                 6525             
          Val Asp  Ile Ala Ala Asn Thr  Val Ile Trp Asp Tyr  Lys Arg Asp 
              6530                 6535                 6540             
          Ala Pro  Ala His Ile Ser Thr  Ile Gly Val Cys Ser  Met Thr Asp 
              6545                 6550                 6555             
          Ile Ala  Lys Lys Pro Thr Glu  Thr Ile Cys Ala Pro  Leu Thr Val 
              6560                 6565                 6570             
          Phe Phe  Asp Gly Arg Val Asp  Gly Gln Val Asp Leu  Phe Arg Asn 
              6575                 6580                 6585             
          Ala Arg  Asn Gly Val Leu Ile  Thr Glu Gly Ser Val  Lys Gly Leu 
              6590                 6595                 6600             
          Gln Pro  Ser Val Gly Pro Lys  Gln Ala Ser Leu Asn  Gly Val Thr 
              6605                 6610                 6615             
          Leu Ile  Gly Glu Ala Val Lys  Thr Gln Phe Asn Tyr  Tyr Lys Lys 
              6620                 6625                 6630             
          Val Asp  Gly Val Val Gln Gln  Leu Pro Glu Thr Tyr  Phe Thr Gln 
              6635                 6640                 6645             
          Ser Arg  Asn Leu Gln Glu Phe  Lys Pro Arg Ser Gln  Met Glu Ile 
              6650                 6655                 6660             
          Asp Phe  Leu Glu Leu Ala Met  Asp Glu Phe Ile Glu  Arg Tyr Lys 
              6665                 6670                 6675             
          Leu Glu  Gly Tyr Ala Phe Glu  His Ile Val Tyr Gly  Asp Phe Ser 
              6680                 6685                 6690             
          His Ser  Gln Leu Gly Gly Leu  His Leu Leu Ile Gly  Leu Ala Lys 
              6695                 6700                 6705             
          Arg Phe  Lys Glu Ser Pro Phe  Glu Leu Glu Asp Phe  Ile Pro Met 
              6710                 6715                 6720             
          Asp Ser  Thr Val Lys Asn Tyr  Phe Ile Thr Asp Ala  Gln Thr Gly 
              6725                 6730                 6735             
          Ser Ser  Lys Cys Val Cys Ser  Val Ile Asp Leu Leu  Leu Asp Asp 
              6740                 6745                 6750             
          Phe Val  Glu Ile Ile Lys Ser  Gln Asp Leu Ser Val  Val Ser Lys 
              6755                 6760                 6765             
          Val Val  Lys Val Thr Ile Asp  Tyr Thr Glu Ile Ser  Phe Met Leu 
              6770                 6775                 6780             
          Trp Cys  Lys Asp Gly His Val  Glu Thr Phe Tyr Pro  Lys Leu Gln 
              6785                 6790                 6795             
          Ser Ser  Gln Ala Trp Gln Pro  Gly Val Ala Met Pro  Asn Leu Tyr 
              6800                 6805                 6810             
          Lys Met  Gln Arg Met Leu Leu  Glu Lys Cys Asp Leu  Gln Asn Tyr 
              6815                 6820                 6825             
          Gly Asp  Ser Ala Thr Leu Pro  Lys Gly Ile Met Met  Asn Val Ala 
              6830                 6835                 6840             
          Lys Tyr  Thr Gln Leu Cys Gln  Tyr Leu Asn Thr Leu  Thr Leu Ala 
              6845                 6850                 6855             
          Val Pro  Tyr Asn Met Arg Val  Ile His Phe Gly Ala  Gly Ser Asp 
              6860                 6865                 6870             
          Lys Gly  Val Ala Pro Gly Thr  Ala Val Leu Arg Gln  Trp Leu Pro 
              6875                 6880                 6885             
          Thr Gly  Thr Leu Leu Val Asp  Ser Asp Leu Asn Asp  Phe Val Ser 
              6890                 6895                 6900             
          Asp Ala  Asp Ser Thr Leu Ile  Gly Asp Cys Ala Thr  Val His Thr 
              6905                 6910                 6915             
          Ala Asn  Lys Trp Asp Leu Ile  Ile Ser Asp Met Tyr  Asp Pro Lys 
              6920                 6925                 6930             
          Thr Lys  Asn Val Thr Lys Glu  Asn Asp Ser Lys Glu  Gly Phe Phe 
              6935                 6940                 6945             
          Thr Tyr  Ile Cys Gly Phe Ile  Gln Gln Lys Leu Ala  Leu Gly Gly 
              6950                 6955                 6960             
          Ser Val  Ala Ile Lys Ile Thr  Glu His Ser Trp Asn  Ala Asp Leu 
              6965                 6970                 6975             
          Tyr Lys  Leu Met Gly His Phe  Ala Trp Trp Thr Ala  Phe Val Thr 
              6980                 6985                 6990             
          Asn Val  Asn Ala Ser Ser Ser  Glu Ala Phe Leu Ile  Gly Cys Asn 
              6995                 7000                 7005             
          Tyr Leu  Gly Lys Pro Arg Glu  Gln Ile Asp Gly Tyr  Val Met His 
              7010                 7015                 7020             
          Ala Asn  Tyr Ile Phe Trp Arg  Asn Thr Asn Pro Ile  Gln Leu Ser 
              7025                 7030                 7035             
          Ser Tyr  Ser Leu Phe Asp Met  Ser Lys Phe Pro Leu  Lys Leu Arg 
              7040                 7045                 7050             
          Gly Thr  Ala Val Met Ser Leu  Lys Glu Gly Gln Ile  Asn Asp Met 
              7055                 7060                 7065             
          Ile Leu  Ser Leu Leu Ser Lys  Gly Arg Leu Ile Ile  Arg Glu Asn 
              7070                 7075                 7080             
          Asn Arg  Val Val Ile Ser Ser  Asp Val Leu Val Asn  Asn 
              7085                 7090                 7095     
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<211> 1273]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr 
              1265                 1270             
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 419]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr 
          1               5                   10                  15      
          Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly 
                          85                  90                  95      
          Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp 
              130                 135                 140                 
          His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala 
                  195                 200                 205             
          Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys 
                          245                 250                 255     
          Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln 
                      260                 265                 270         
          Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp 
                  275                 280                 285             
          Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro 
                  355                 360                 365             
          Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln 
              370                 375                 380                 
          Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 
                          405                 410                 415     
          Thr Gln Ala 
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<211> 275]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Met Asp Leu Phe Met Arg Ile Phe Thr Ile Gly Thr Val Thr Leu Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Gly Glu Ile Lys Asp Ala Thr Pro Ser Asp Phe Val Arg Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala Thr Ile Pro Ile Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Ile Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ala Leu Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Ser Lys Ile Ile Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ser Lys Gly Val His Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Val Tyr Ser His Leu Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Val Ala Ala Gly Leu Glu Ala Pro Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ile Met Arg Leu Trp 
                  115                 120                 125             
          Leu Cys Trp Lys Cys Arg Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Phe Leu Cys Trp His Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Val Thr Ser Ser Ile Val Ile Thr Ser Gly Asp Gly Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Ile Ser Glu His Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Thr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Trp Glu Ser Gly Val Lys Asp Cys Val Val Leu His Ser Tyr Phe Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Leu Ser Thr Asp Thr Gly 
              210                 215                 220                 
          Val Glu His Val Thr Phe Phe Ile Tyr Asn Lys Ile Val Asp Glu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Glu His Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Val 
                          245                 250                 255     
          Asn Pro Val Met Glu Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser 
                      260                 265                 270         
          Val Pro Leu 
                  275 
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 222]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile 
                  35                  40                  45              
          Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys 
              50                  55                  60                  
          Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe 
                          85                  90                  95      
          Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile 
              130                 135                 140                 
          Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln 
              210                 215                 220         
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Ala Leu Ile Thr Leu Ala Thr Cys Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys 
                      20                  25                  30          
          Glu Pro Cys Ser Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Phe Ser Thr Gln Phe Ala 
              50                  55                  60                  
          Phe Ala Cys Pro Asp Gly Val Lys His Val Tyr Gln Leu Arg Ala Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Pro Ile Phe Leu Ile Val Ala Ala Ile Val Phe Ile Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Cys Phe Thr Leu Lys Arg Lys Thr Glu 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 48]]>
          <![CDATA[<211> 870]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 48]]>
          atgtacgcca gcgccctgtg ggagatccag caggtggtgg acgctgatca cagctacttc       60
          acctctgatt actaccagct ttattctaca cagaagcact acgtgtatat cggcgacccc      120
          gcccaactgc ctgcccctga cgcctacaaa accttccccc ccacagaacc caaaaaggac      180
          aaaatctggg tcgccaccga gggcgccctg aacaccccta aagaccatat catcaccgtg      240
          gccacaagca gaaccctgag ctattacaag ctgggcgctt acgccctggt gtactttctg      300
          cagagcatca acttcgtgcg gatctccctg gaaatcccta ggcggaacgt tgctaccctg      360
          caggccgagc ctaatatgat ggtgaccaac aacaccttca ccctcaaggg cggagccaag      420
          aaccccctgc tgtacgacgc caattacttc ctgtgctggc acaaggacct gtctccaaga      480
          tggtatttct actacctggg caccggctac taccacacca cagatccaag cttcctggga      540
          agatacatga gcgctgaaag cctgagacct gataccagat acgtgctgat ggacggcaga      600
          aaggtgccta ccgacaacta cattaccaca taccccggcc agtgtagatt cgtgacagac      660
          acccctaagg gacctaaggt gaagtacagc acattcaagt gctacggcgt gtccccaaca      720
          aagctgaatg ataaatacga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcagc      780
          agctccaagc tgtgggccca gtgcgtgcag ctgcacaacg actacgtcgg ctacctgcaa      840
          cctcggacat ttctgctgaa gtacaactag                                       870
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<211> 690]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 49]]>
          atggccctgt gggagatcca gcaggttgtg aaggctgcat tcacctctga ttactaccag       60
          ctgtacaagg ccgccgtgta catcggcgac cccgcccagc tgaaggccgc taaaaccttc      120
          ccccccaccg agcctaagaa agctgctgca acagaaggcg ccctgaatac acctaagaaa      180
          gccgccgcca caagcagaac actgagctac tacaagaagg ccgctgtgta tttcctccag      240
          agcatcaact tcaaggccgc tatccccagg cggaacgtgg ccaccctgaa agctgccatg      300
          gtcaccaaca acacctttac cctgaagaag gccgccctgc tgtacgacgc caattacttt      360
          ctgaaggccg catctccacg gtggtacttc tactacctga aggccgccac caccgaccct      420
          agcttcctgg gcagatacaa ggccgccaga cctgacacca gatacgtgct gaaagccgcc      480
          cctaccgaca actacattac aacctacaag gccgccgtga cagatacccc taagggacct      540
          aaaaaggccg ccaagtgcta cggcgtgtcc ccaacaaaga aggccgctca gtacatcaag      600
          tggccttggt atatcaaggc cgccaagctg tgggcccaat gtgtgcagct gaaggccgcc      660
          tatctgcagc ctagaacctt cctgctgtag                                       690
          <![CDATA[<210> 50]]>
          <![CDATA[<211> 528]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 50]]>
          atggccctgt gggagatcca gcaggtggtg ttcaccagcg actactacca gctgtacgtg       60
          tacatcggcg accccgctca gctgaagacc ttcccaccta ccgaacccaa ggccaccgag      120
          ggagccctga acacccctaa ggctacatct agaaccctga gctactacaa ggtgtacttc      180
          ctgcagtcta tcaacttcat cccccggaga aacgtggcca ccctgatggt taccaacaac      240
          acctttaccc tgaagctgct gtacgacgcc aattacttcc tcagccctcg gtggtatttc      300
          tactacctta caaccgaccc tagcttcctg ggcagataca gacctgacac aagatatgtg      360
          ctgcctacag ataattacat caccacatac gtcaccgata cccccaaagg ccctaaaaag      420
          tgctacggcg tgtcccctac aaagcagtac attaagtggc cttggtacat caagctgtgg      480
          gcccagtgtg tgcagctgta tctgcaacca cggacatttc tgctgtag                   528
          <![CDATA[<210> 51]]>
          <![CDATA[<211> 1248]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 51]]>
          atgcacagct acttcaccag cgactactac cagctgtaca gcacccagaa gcactacgtg       60
          tacatcggcg accccgccca gctgcccgcc ccctacgccc tggtgtactt cctgcagagc      120
          atcaacttcg tgaggatcgc cacctactac ctgttcgacg agagcggcga gttcaagctg      180
          gccagccaca agaaccccct gctgtacgac gccaactact tcctgtgctg gcacaggaag      240
          gtgcccaccg acaactacat caccacctac cccggccaga tcaccgtggc caccagcagg      300
          accctgagct actacaagct gggcgccccc aacatgatgg tgaccaacaa caccttcacc      360
          ctgaagggcg gcgccagcat catcaagacc atccagccca gggtggagaa gaagaagctg      420
          aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggcaagga cctgagcccc      480
          aggtggtact tctactacct gggcaccggc acctacaaga acacctgcga cggcaccacc      540
          ttcacctacg ccagcgccgt gcacgccggc accgacctgg agggcaactt ctacggcccc      600
          ttcgagagcc tgaggcccga caccaggtac gtgctgatgg acggccagac cgcctgcacc      660
          gacgacaacg ccctggccta ctacaacacc accagcagca gcaagctgtg ggcccagtgc      720
          gtgcagctgc acaacgacta cgccagcgcc ctgtgggaga tccagcaggt ggtggacgcc      780
          gacgacgcct acaagacctt cccccccacc gagcccaaga aggacaagag caccttcaag      840
          tgctacggcg tgagccccac caagctgaac gacgccccca gcgccagcgc cttcttcggc      900
          atgagcagga tcggcatgct ggccctgctg ctgctggaca ggctgaacca gctggagagc      960
          aagagcctgg agatccccag gaggaacgtg gccaccctgc aggccgagta ctaccacacc     1020
          accgacccca gcttcctggg caggtacatg agcgccaggg acgtggacac cgacttcgtg     1080
          aacgagttct acgcctacct gtgcaggttc gtgaccgaca cccccaaggg ccccaaggtg     1140
          aagtacatct gggtggccac cgagggcgcc ctgaacaccc ccaaggacca catctacgtg     1200
          ggctacctgc agcccaggac cttcctgctg aagtacaact gataatag                  1248
          <![CDATA[<210> 52]]>
          <![CDATA[<211> 990]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 52]]>
          atgtttacgt cagactacta tcagctttac aaagcagccg tctatatcgg ggatcccgcc       60
          cagcttaaag ccgccgtgta tttcctgcag tccatcaact tcaaagcagc gtatttgttc      120
          gatgagtctg gggagtttaa attgaaagct gccctcctct acgacgccaa ttattttctt      180
          aaagcggccc caacggataa ctatataacg acctacaaag cagctgccac atcccgaaca      240
          ctcagttatt ataagaaagc agccatggtt acgaataaca cttttacgct gaaaaaagct      300
          gcaaaaacga ttcagccgcg ggttgaaaag aaagctgcgc agtacataaa gtggccatgg      360
          tatatcaaag ccgcctcccc cagatggtac ttctattatt tgaaagcggc caacacatgc      420
          gacggtacca cgtttacata taaagctgcg gggacagact tggaagggaa tttttacaag      480
          gcggctcgcc cagatacacg ctacgttttg aaagccgctt gtactgatga taacgcattg      540
          gcttactata aagcagcaaa gctttgggcc cagtgcgttc agctgaaggc cgcagcgctc      600
          tgggaaatcc aacaggttgt gaaagccgca aaaactttcc cgccgacaga accgaaaaag      660
          gcggcgaagt gctatggagt cagtcctact aaaaaggccg ccgcgtcagc cttctttggc      720
          atgagtcgca aggctgctct gcttttggat cggctcaatc aactcaaagc cgcaataccg      780
          agaaggaacg ttgcgacatt gaaggcggcc acaacagacc cgtcattcct gggcagatac      840
          aaggcagctg ataccgactt cgtcaatgag ttttacaagg cggcggtcac tgacacaccg      900
          aaaggcccca aaaaggccgc tgcgaccgag ggtgcgttga atacaccaaa aaaggcagca      960
          tatctccagc caaggacgtt cctgctgtag                                       990
          <![CDATA[<210> 53]]>
          <![CDATA[<211> 756]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 53]]>
          atgttcacct ctgattacta ccagctttat gtgtacattg gagatcctgc tcagctggtg       60
          tacttcctgc agagcatcaa cttctacctg ttcgacgaga gcggcgaatt caagctgctg      120
          ctgtacgacg ccaactactt cctgcctacc gataattaca tcaccacata cgccacatct      180
          cggaccctga gctactacaa gatggtcacc aacaacacct ttaccctgaa gaagaccatc      240
          cagcctcggg tggaaaagca gtacatcaag tggccttggt atatcagccc tagatggtac      300
          ttttactacc tgaacacctg cgacggcacc acctttacat acggcacaga tctggaaggc      360
          aacttctaca gacctgacac cagatacgtg ctgtgcaccg acgacaatgc cctggcctac      420
          tataagctgt gggcccaatg tgtgcagctg gctctgtggg agatccagca ggtggtgaag      480
          acattccccc ccaccgagcc caagaaatgc tacggcgtgt ccccaacaaa ggccagcgcc      540
          ttcttcggca tgagccggct gctgctggac agactgaacc agctgatccc ccgcaggaac      600
          gtggccaccc tgaccaccga cccctccttc ctgggaagat acgacacaga cttcgtgaac      660
          gagttctacg ttacagatac accaaaaggc cctaaagcta cagagggcgc cctgaatacc      720
          cctaagtacc tgcaacctag aacctttctg ctctag                                756
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 1506]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 54]]>
          atgtacgctc tggtttattt tcttcagtcc atcaacttcg taaggatcat tatgcgactc       60
          tggctgtgct ggaagtgtcg cagcaagaac cccctcttgt atgacgctaa ttacttcctg      120
          tgctggcacg gggacggcaa gatgaaagat ctgagcccca gatggtactt ctactatctt      180
          ggtaccggac ccgaagccgg gctgccatac ggggcaaata aagacggtat tatctgggtt      240
          gccactgagg gtgccctgaa tactcctaaa gaccacattg gcacacggaa tcccgagaag      300
          tactgcgcat tggctcccaa catgatggtg accaacaata cctttacatt aaagggggga      360
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          tacgcaagcg ctctgtggga aattcaacag gtcgtcgacg ccgatcttaa cgagtctctt      480
          atcgatttac aggaattggg taaatatgaa cagtatatca agtggccttg gtacatctgg      540
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                聚核苷酸
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                聚核苷酸
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
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                聚核苷酸
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                聚核苷酸
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          gactactgca tcccctacaa cagcgtgacc agcagcatcg tgatcaccag cggcgacggc     3000
          accaccagcc ccatcagcga gcacgactac cagatcggcg gctacaccgc ccccagcgcc     3060
          agcgccttct tcggcatgag cagaatcggc atggaggtga cccccagcgg cacctggctg     3120
          acctacaccg gcgccatcaa gctggacgac aaggacccca acttcaagga ccaggtgatc     3180
          ctgctgaaca agcacatcga cgcctacaag accttccccc ccaccgagcc caagaaggac     3240
          aagaagaaga aggcctacga gacccaggcc ctgccccaga gacagaagaa gcagcagacc     3300
          gtgaccctgc tgcccgccgc cgacctggac gacttcagca agcagctgca gcagagcatg     3360
          agcagcgccg acagcaccca ggccatcacc gtggccacca gcagaaccct gagctactac     3420
          aagctgggcg ccagccagag agtggccggc gacagcggct tcgccgccta cagcagatac     3480
          agaatcggca actacaagct gaacaccgac cacagcagca gcagcgacaa catcgccctg     3540
          ctggtgcagc tgaacgagag cctgatcgac ctgcaggagc tgggcaagta cgagcagtac     3600
          atcaagtggc cctggtacat ctggctgggc ttcatcgccg gcctgatcgc catcgtgatg     3660
          gtgtgataat ag                                                         3672
          <![CDATA[<210> 60]]>
          <![CDATA[<211> 5403]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                聚核苷酸
          <![CDATA[<400> 60]]>
          atgttcgttt ttctggttct gctgccactc gtgtcaagtc agtgcgtgaa ccttactaca       60
          aggactcagc tcccaccagc atacacgaat agttttacgc ggggcgtgta ctatccagac      120
          aaagtgtttc gcagctctgt tctacattca actcaagacc tgtttttgcc tttcttctcc      180
          aatgtgacct ggttccacgc catccacgtg agtggcacga acgggaccaa acggtttgat      240
          aacccagtgc tgccttttaa cgacggggta tatttcgcct ctactgaaaa atccaacatc      300
          atccgcggct ggattttcgg gaccactctt gactccaaga cccagtcact cctgatcgta      360
          aacaatgcga ccaacgtcgt gattaaggtg tgcgagtttc aattctgtaa cgaccctttc      420
          ctgggtgtat attaccacaa gaataataag tcctggatgg aatcagagtt tagagtatac      480
          tctagcgcta acaactgtac ttttgaatat gtgtcccaac ccttcttgat ggacttggag      540
          ggaaaacagg gaaattttaa gaatctccga gagttcgtgt ttaaaaacat tgacggctat      600
          ttcaagatat actctaagca tacacccatc aatctggtcc gcgatctgcc acaggggttt      660
          agcgcactgg aaccgttggt ggatctcccc attgggatta atatcacccg tttccagaca      720
          cttttagcct tgcatcggag ctacctaacc cccggggact caagtagcgg ctggactgcg      780
          ggagcggccg cctattatgt cggatatctg cagcctcgga cattcctcct gaagtacaat      840
          gagaatggca caattacaga cgcagtagac tgtgccctgg atccgctctc cgaaaccaaa      900
          tgcacgctga aatcatttac ggtggaaaaa ggtatatacc agaccagcaa tttcagggtg      960
          cagcctacgg agtccattgt ccgtttcccc aatatcacca atctgtgtcc tttcggcgaa     1020
          gtgtttaacg caactaggtt cgcgagtgtc tacgcctgga accgaaagag aatctcaaac     1080
          tgtgtggccg attacagcgt cctgtacaac tccgcatctt tcagtacctt caagtgctac     1140
          ggggtcagcc ccaccaaact taacgatctt tgcttcacta acgtttatgc cgatagtttt     1200
          gtcatcaggg gcgacgaagt gcgacagatt gcccctggac agacgggaaa gatcgccgac     1260
          tataactata agctgccaga cgatttcaca ggatgcgtga tcgcctggaa tagcaacaat     1320
          ctggactcta aggtgggggg gaattataat tatttgtata gactgtttcg aaagtcaaac     1380
          cttaagccat ttgagaggga tatcagcaca gagatttacc aggcaggaag caccccatgt     1440
          aacggggtag aaggcttcaa ctgctacttc cccctccagt catatgggtt ccagcctacc     1500
          aatggtgtgg gttaccagcc gtacagagta gtggttcttt catttgagct gctgcatgcc     1560
          cctgccaccg tctgcggacc taaaaaatct accaatttag tgaaaaataa gtgcgtgaat     1620
          tttaatttca acggccttac gggcaccggc gtgctgactg agagcaataa gaaattctta     1680
          ccatttcagc agttcggccg cgacatagct gataccaccg atgcagttcg cgacccccag     1740
          accctggaga tccttgacat cactccttgc agtttcggag gagtctcggt catcacacct     1800
          ggaacaaaca catccaacca ggtggcagtt ctttaccagg atgtgaactg taccgaagtg     1860
          ccagtggcaa tccacgccga tcagttaact cccacctgga gagtgtactc tacaggctct     1920
          aacgtcttcc agactcgggc cggttgcctt attggggctg agcacgtgaa caactcctac     1980
          gagtgcgaca tacctattgg tgccggcatc tgtgccagct accagaccca aaccaattcg     2040
          ccaaggcgag cgcgttctgt agcaagccag tcgattattg cctacactat gtccttaggt     2100
          gctgagaact ctgtggctta ctctaacaac tccatagcaa ttccaacaaa ctttacaatt     2160
          agtgttacta ctgaaatctt gcccgtcagc atgactaaaa cctctgtcga ttgtaccatg     2220
          tacatttgtg gggactctac agagtgcagc aatcttctgc tccagtacgg ctctttttgt     2280
          acgcagctga accgtgctct gactgggatt gccgtcgagc aagataagaa cacccaggag     2340
          gtgtttgccc aagttaagca gatttataag acaccaccca tcaaagactt cggcggattt     2400
          aacttttctc agattctgcc cgacccctcc aagcccagca agaggagctt tatcgaggac     2460
          ctgctgttca ataaggtcac actcgctgat gcaggattca tcaagcagta tggcgattgc     2520
          ctcggagaca tcgctgcgag agacctcata tgcgctcaga aattcaatgg cctgacggtg     2580
          ctacctccgc tactgactga cgaaatgata gctcagtaca cgtcggctct cttggccgga     2640
          acaatcacct ccggatggac ctttggcgcg ggagcagcac tacagatccc ttttgcaatg     2700
          caaatggctt accggttcaa tggcataggg gtaactcaaa atgtgctgta cgagaaccaa     2760
          aaattgatcg ctaaccagtt caacagcgcc attgggaaga tccaggattc tttgtcctca     2820
          accgccagtg cattgggcaa gctccaggac gtcgttaacc agaacgctca ggccttaaac     2880
          acgctggtca aacagttgtc ctccaatttt ggcgctatat ccagcgttct caatgatatc     2940
          ctttcccgct tagatccacc agaagctgag gtccaaattg ataggttaat aaccggcaga     3000
          ctccagagcc tgcaaactta cgtcacccag caactcatac gcgccgcgga gatccgcgct     3060
          agcgcaaacc tagctgccac taaaatgagt gagtgtgttc tcggacagtc taagcgggtg     3120
          gacttttgcg gcaaaggcta tcacctcatg agcttccccc aaagcgcacc acatggcgtt     3180
          gtgttcttgc acgtgactta cgttcccgca caggagaaaa atttcaccac agcccccgcc     3240
          atctgccatg atgggaaagc tcattttcca cgagaagggg tgttcgtgtc aaacggtaca     3300
          cactggtttg tcacacaaag aaatttttat gaacctcaaa ttatcacaac tgacaatacc     3360
          ttcgtgagcg gaaactgtga tgtcgtaatt gggatcgtaa acaacactgt gtatgacccc     3420
          cttcagcccg aactggacag tttcaaggaa gagcttgaca agtatttcaa gaaccatact     3480
          tcaccagacg tagaccttgg tgatatttca ggaatcaacg ctagtgtggt gaacatccag     3540
          aaagaaattg atcgcctcaa tgaggtcgcg aaaaatctga atgagtctct gatcgacctg     3600
          caagagttgg ggaagtacga acagtatatt aaatggccct ggtacatttg gctgggattt     3660
          atagctggac tcattgccat tgttatggtc acaataatgc tgtgttgcat gactagctgt     3720
          tgctcatgcc taaaagggtg ctgcagttgc ggctcctgtt gcaagtttga tgaagacgat     3780
          agcgagccgg tccttaaagg cgttaagcta cattatacta gggctaagag atccggcagt     3840
          ggggcgacca actttagctt gttgaagcaa gcaggggacg tggaagaaaa ccccggccct     3900
          tacgccctag tgtactttct gcagtccatt aacttcgttc ggattatcat gaggttgtgg     3960
          ctgtgttgga agtgtcggtc gaagaatcca ctcctgtacg atgcaaatta ctttctgtgc     4020
          tggcacggag acggcaaaat gaaagacctg tccccgagat ggtattttta ttatctgggt     4080
          accggtcccg aggcggggct gccctacggg gcaaacaaag acggaatcat ctgggtcgca     4140
          acagagggag ctcttaatac acctaaagat cacattggca cccgcaatcc cgagaagtac     4200
          tgtgccctgg cccccaatat gatggtgaca aataacacct ttacattaaa gggcggggcc     4260
          ccaaccaagg tgacattcgg tacatacaag aatacctgtg acggcacaac gttcacgtat     4320
          gcaagcgctc tgtgggagat ccaacaggtg gtggacgccg acctgaatga aagtctgatt     4380
          gatctccagg aactcggcaa atatgagcag tatatcaagt ggccttggta catctggctc     4440
          ggttttatcg ctggtcttat cgccatcgtg atggtgcaga ctgcttgcac cgatgataat     4500
          gcactcgcgt actacaacac cacaaaagga ggacgatttg tgctagccct gctcagtgat     4560
          ctgcaagatc tcaaatgggc ccgcttcccg aagtccgatg gaaccggcac aatctataca     4620
          gaattggaac ctccttgtag gttcgtgacc gatactccca agggtcccaa ggtaaaatac     4680
          ctgcgggtag aagcttttga atactaccac actactgacc catcttttct gggcagatat     4740
          atgtctgcat taaatcacac caaaaagtgg ataacagtgg ccacctcccg gacactgtca     4800
          tactataaac tgggtgcatc ccagcgggtt gctggtgatt ccggattcgc cgcctattcg     4860
          cggtatagaa tagggaatta caagttgaat accgaccact ccagttctag tgataacata     4920
          gccctgctgg ttcaggttct tcagcagctg agagtagaat cttccagcaa gctgtgggcc     4980
          cagtgtgttc aactccacaa tgatatttta ctcgccaagg acactgcacc gtcagcctct     5040
          gccttcttcg ggatgtctcg tattggtatg gaggttactc ctagcggcac atggctgacg     5100
          tacaccgggg ctataaagtt ggacgacaag gacccaaact tcaaggacca agtgatctta     5160
          ctgaacaaac atatcgatgc ttataagaca ttccctccta ctgagcctaa aaaagataaa     5220
          tcaaagctca ttgagtacac agattttgct acaagcgctt gtgtcctggc ggccgagtgc     5280
          accatcttca aagacgctag tggcaagccc gtgccgtatt gctatgacac caatgtgctc     5340
          gagggttcag tcgcctatga gtcattaagg ccagatacga ggtacgtcct aatggatggg     5400
          tag                                                                   5403
          <![CDATA[<210> 61]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                肽
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 位點]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(10)]]>
          <![CDATA[<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 位點]]>
          <![CDATA[<222> (11)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，參見所申請之說明書]]>
          <![CDATA[<400> 61]]>
          Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Ser Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210> 62]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                肽
          <![CDATA[<400> 62]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 63]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                肽
          <![CDATA[<400> 63]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 64]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                肽
          <![CDATA[<400> 64]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 65]]>
          <![CDATA[<211> 4]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>
                肽
          <![CDATA[<400> 65]]>
          Ser Gly Ser Gly 
          1
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Claims (93)

  1. 一種免疫原性多肽，其包含至少兩個選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。
  2. 如請求項1之免疫原性多肽，其包含呈串接次序之該至少兩個肽抗原決定基，視情況其中至少一或多個免疫顯性抗原決定基存在於超過一個複本中。
  3. 如請求項2之免疫原性多肽，其包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29個或更多個該等肽抗原決定基，視情況其中該免疫原性多肽包含HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及HLA-B*07中之每一者至少一個、兩個及/或三個免疫顯性抗原決定基。
  4. 如請求項2或3之免疫原性多肽，其包含3個來自表1A、1B、1C、1D、1E及1F中之每一者之肽抗原決定基。
  5. 如請求項2至4中任一項之免疫原性多肽，其進一步包含該等肽抗原決定基之間的連接子。
  6. 如請求項5之免疫原性多肽，其中該連接子包含用於該等肽抗原決定基中之每一者的至少三個胺基酸，其中該至少三個胺基酸係與其各別肽抗原決定基鄰接之彼等。
  7. 如請求項5之免疫原性多肽，其中該連接子為蛋白酶體裂解基序。
  8. 如請求項2至7中任一項之免疫原性多肽，其進一步包含一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多种全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白。
  9. 如請求項2至8中任一項之免疫原性多肽，其進一步包含核糖體停止/再啟動區段、IRES區段及/或轉譯後裂解區段，視情況其中該轉譯後裂解區段為P2A區段。
  10. 如請求項2至9中任一項之免疫原性多肽，其包含表1G或表1I中所提供之胺基酸序列中的任一者。
  11. 如請求項1之免疫原性多肽，其包含至少兩個肽片段，該至少兩個肽片段各自包含該等肽抗原決定基中之至少兩者，其中每一個肽片段中的該等肽抗原決定基中之該至少兩者係源自同一SARS-CoV-2蛋白。
  12. 如請求項11之免疫原性多肽，其中該至少兩個肽片段係源自SARS-CoV-2之N蛋白、M蛋白、ORF1a/b蛋白或ORF3a蛋白。
  13. 如請求項11或12之免疫原性多肽，其包含至多6個該等肽片段。
  14. 如請求項11至13中任一項之免疫原性多肽，其進一步包含一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多种全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白。
  15. 如請求項11至14中任一項之免疫原性多肽，其進一步包含核糖體停止/再啟動區段、IRES區段及/或轉譯後裂解區段，視情況其中該轉譯後裂解區段為P2A區段。
  16. 如請求項11、12、14及15中任一項之免疫原性多肽，其包含表1H或表1J中所提供之胺基酸序列中的任一者。
  17. 如請求項1至16中任一項之免疫原性多肽，其中該免疫原性多肽能夠活體外及/或活體內引出T細胞反應，視情況其中藉由四聚體染色分析、T細胞活化分析、CD137染色分析、細胞內IFNg染色分析、細胞介素釋放分析及/或T細胞增生分析來測定該T細胞反應。
  18. 一種免疫原性組合物，其包含至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽，視情況其中該免疫原性組合物進一步包含1)一或多種選自由Orf1ab、M、N、Orf3a及S組成之群的全長SARS-CoV-2蛋白，或其一或多個蛋白片段，視情況其中該一或多种全長SARS-CoV-2蛋白之片段涵蓋未編碼功能性SARS-CoV-2蛋白之SARS-CoV-2蛋白，及/或2)佐劑。
  19. 如請求項18之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物能夠活體外及/或活體內引出T細胞反應，視情況其中藉由四聚體染色分析、T細胞活化分析、CD137染色分析、細胞內IFNg染色分析、細胞介素釋放分析及/或T細胞增生分析來測定該T細胞反應。
  20. 如請求項18或19之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物能够引出個體之T細胞反應。
  21. 一種組合物，其包含至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽及MHC分子。
  22. 如請求項21之組合物，其中該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。
  23. 如請求項21或22之組合物，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  24. 如請求項21至23中任一項之組合物，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及/或HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中該HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。
  25. 一種穩定MHC-肽複合物，其在MHC分子之背景中包含該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽的肽抗原決定基。
  26. 如請求項25之穩定MHC-肽複合物，其中該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。
  27. 如請求項25或26之穩定MHC-肽複合物，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  28. 如請求項25至27中任一項之穩定MHC-肽複合物，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及/或HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中該HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。
  29. 如請求項25至28中任一項之穩定MHC-肽複合物，其中該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。
  30. 如請求項25至29中任一項之穩定MHC-肽複合物，其中該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。
  31. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物及佐劑。
  32. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽或其補體，視情況其中該經分離核酸為DNA、RNA、經化學修飾RNA、mRNA、cDNA、自複製的、環化的、多聯體化的，包含5’非轉譯區(5’UTR)及/或3’UTR，包含表現啟動子，包含內部核糖體進入位點(IRES)，及/或包含自裂解2A肽(諸如P2A或T2A)。
  33. 一種載體，其包含如請求項32之經分離核酸，視情況其中該載體為表現載體。
  34. 一種細胞，其a)包含如請求項32之經分離核酸，b)包含如請求項33之載體，及/或c)産生一或多種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽及/或將一或多種如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物呈遞於細胞表面，視情況其中該細胞係經遺傳工程改造。
  35. 一種結合部分，其特异性結合如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽及/或如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物，視情況其中該結合部分為抗體、抗體之抗原結合片段、TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應子域之融合蛋白。
  36. 一種器件或套組，其包含a)一或多種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽及/或b)一或多種如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物，該器件或套組視情況包含偵測a)及/或b)與T細胞受體之結合的試劑。
  37. 一種偵測結合穩定MHC-肽複合物之T細胞之方法，其包含： a) 使包含T細胞之樣品與如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物接觸；及 b) 偵測T細胞與該穩定MHC-肽複合物之結合，視情況進一步測定與該穩定MHC-肽複合物結合之穩定MHC-肽特异性T細胞的百分率，視情況其中該樣品包含外周血單核細胞(PBMC)。
  38. 如請求項37之方法，其中該等T細胞為CD8+ T細胞。
  39. 如請求項37或38之方法，其中使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點或細胞內流式分析來執行該偵測及/或測定。
  40. 如請求項37至39中任一項之方法，其中該樣品包含接觸或懷疑接觸過一或多種SARS-CoV-2蛋白或其片段之T細胞。
  41. 一種確定個體是否已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護的方法，其包含： a) 使包含自該個體獲得之T細胞之細胞群體與如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽或如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物一起培育；及 b) 偵測反應性之存在或水準， 其中存在反應性或與對照水準相比反應性水準較高指示該個體已暴露於SARS-CoV-2及/或具有抵抗SARS-CoV-2之保護。
  42. 一種用於預測罹患SARS-CoV-2感染之個體之臨床結果的方法，其包含： a) 測定自該個體獲得之T細胞與一或多種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽或一或多種如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準；及 b) 將該反應性之存在或水準與來自對照之反應性之存在或水準進行比較，其中該對照係獲自具有良好臨床結果之個體； 其中該個體樣品中存在反應性或如與該對照相比反應性水準較高指示該個體具有良好臨床結果。
  43. 一種評估SARS-CoV-2療法之功效之方法，其包含： a) 在向個體提供該SARS-CoV-2療法的至少一部分之前自該個體獲得之第一樣品中，測定自該個體獲得之T細胞與一或多種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽或一或多種如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物之間的反應性之存在或水準，及 b) 測定該一或多種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽或該一或多種如請求項25至30中任一項之穩定MHC-肽複合物與自該個體獲得之T細胞之間的反應性之存在或水準，該等T細胞存在於提供該SARS-CoV-2療法的該部分之后自該個體獲得之第二樣品中， 其中該第二樣品中存在反應性或相對於該第一樣品反應性水準較高指示該療法對治療該個體之SARS-CoV-2有效。
  44. 如請求項41至43中任一項之方法，其中該反應性水準由a)結合之存在及/或b) T細胞活化及/或效應子功能指示，視情況其中該T細胞活化或效應子功能為T細胞增生、殺死或細胞介素釋放。
  45. 如請求項41至44中任一項之方法，其進一步包含在後續時間點重複步驟a)及b)，視情況其中該個體在第一時間點與該後續時間點之間已經歷治療以改善SARS-CoV-2感染。
  46. 如請求項41至45中任一項之方法，其中使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點或細胞內流式分析來偵測該T細胞結合、活化及/或效應子功能。
  47. 如請求項41至46中任一項之方法，其中該對照水準為參考數字。
  48. 如請求項41至47中任一項之方法，其中該對照水準係未暴露於SARS-CoV-2之個體水準。
  49. 一種預防及/或治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量的包含及/或編碼至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之免疫原性組合物，或如請求項34之細胞。
  50. 如請求項49之方法，其中該免疫原性組合物包含編碼如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之核酸。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該核酸為DNA、RNA、mRNA、cDNA、自複製的、環化的及/或多聯體化的。
  52. 如請求項49至51中任一項之方法，其中該SARS-CoV-2蛋白係選自由orf1a/b、S蛋白、N蛋白、M蛋白、orf3a及orf7a組成之群。
  53. 如請求項49至51中任一項之方法，其中該免疫原性多肽能够引出個體之T細胞反應。
  54. 如請求項49至52中任一項之方法，其中該免疫原性組合物包含超過一種免疫原性多肽。
  55. 如請求項49至54中任一項之方法，其中該免疫原性組合物進一步包含佐劑。
  56. 如請求項49至55中任一項之方法，其中該免疫原性組合物能够引出個體之T細胞反應。
  57. 如請求項49至56中任一項之方法，其中該投與之免疫原性組合物誘導該個體針對該SARS-CoV-2之免疫反應。
  58. 如請求項49至57中任一項之方法，其中該投與之免疫原性組合物誘導該個體針對該SARS-CoV-2之T細胞免疫反應。
  59. 如請求項49至58中任一項之方法，其中該T細胞免疫反應為CD8+ T細胞免疫反應。
  60. 一種鑑別與該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的肽結合分子或其抗原結合片段之方法，其包含： a) 提供細胞，該細胞在MHC分子之背景中將該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基呈遞於該細胞之表面上，視情況其中該細胞包含編碼且表現該至少一種免疫原性多肽之核酸； b) 測定複數種候選肽結合分子或其抗原結合片段在該MHC分子之背景中與該細胞上之該肽抗原決定基的結合；及 c) 鑑別在該MHC分子之背景中與該肽抗原決定基結合的一或多種肽結合分子或其抗原結合片段。
  61. 如請求項60之方法，其中該步驟a)包含使該MHC分子在該細胞之表面上與選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基接觸。
  62. 如請求項60之方法，其中該步驟a)包含用鹼性核酸及/或包含該鹼性核酸之載體轉染該細胞。
  63. 一種鑑別與該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的肽結合分子或其抗原結合片段之方法，其包含： a) 提供穩定MHC-肽複合物，其在MHC分子之背景中包含該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽的肽抗原決定基； b) 測定複數種候選肽結合分子或其抗原結合片段與該穩定MHC-肽複合物的結合；及 c) 鑑別與該穩定MHC-肽複合物結合的一或多種肽結合分子或其抗原結合片段。
  64. 如請求項63之方法，其中該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。
  65. 如請求項63或64之方法，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  66. 如請求項63至65中任一項之方法，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及/或HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中該HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。
  67. 如請求項63至66中任一項之方法，其中該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。
  68. 如請求項63至67中任一項之方法，其中該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。
  69. 如請求項60至68中任一項之方法，其中該複數種候選肽結合分子包含一或多種T細胞受體(TCR)，或TCR之一或多個抗原結合片段。
  70. 如請求項60至69中任一項之方法，其中該複數種候選肽結合分子包含至少2、5、10、100、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9種或更多種不同的候選肽結合分子。
  71. 如請求項60至70中任一項之方法，其中該複數種候選肽結合分子包含自個體或個體群體之樣品獲得的一或多種候選肽結合分子；或該複數種候選肽結合分子包含包括自個體樣品獲得之親本支架肽結合分子之突變的一或多種候選肽結合分子。
  72. 如請求項71之方法，其中該個體或個體群體a)未感染SARS-CoV-2及/或已自COVID-19中恢復或b)感染SARS-CoV-2及/或具有COVID-19。
  73. 如請求項71或72之方法，其中該個體或個體群體已接種一或多種免疫原性多肽，其中該等免疫原性多肽包含選自表1A、1B、1C、1D、1E及/或1F之肽抗原決定基。
  74. 如請求項68至73中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒動物。
  75. 如請求項71至74中任一項之方法，其中該個體為HLA轉殖基因小鼠及/或為人類TCR轉殖基因小鼠。
  76. 如請求項71至75中任一項之方法，其中該樣品包含T細胞。
  77. 如請求項76之方法，其中該樣品包含外周血單核細胞(PBMC)或CD8+記憶T細胞。
  78. 一種根據請求項60至77中任一項所鑑別之肽結合分子或其抗原結合片段，視情況其中該結合部分為抗體、抗體之抗原結合片段、TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應子域之融合蛋白。
  79. 一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現藉由如請求項63至78中任一項之方法鑑別的TCR。
  80. 一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現與該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基結合的TCR。
  81. 一種治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量的經遺傳工程改造之T細胞，該等T細胞表現與在MHC分子之背景中包含該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基的穩定MHC-肽複合物結合之TCR。
  82. 如請求項81之方法，其中該MHC分子為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。
  83. 如請求項79至82中任一項之方法，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  84. 如請求項79至83中任一項之方法，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈係選自由HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24及/或HLA-B*07組成之群的HLA血清型，視情況其中該HLA等位基因係選自由HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0220、HLA-A*0222、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、HLA-A*0274等位基因、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*0116等位基因、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、HLA-A*1119等位基因、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458等位基因、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715及HLA-B*0721等位基因組成之群。
  85. 如請求項79至84中任一項之方法，其中該肽抗原決定基及該MHC分子係共價連接及/或其中該MHC分子之α及β鏈係共價連接。
  86. 如請求項79至85中任一項之方法，其中該穩定MHC-肽複合物包含可偵測標記，視情況其中該可偵測標記為螢光團。
  87. 如請求項79至86中任一項之方法，其中該等T細胞係自a)該個體、b)未感染SARS-CoV-2之供體或c)自COVID-19中恢復之供體分離。
  88. 一種預防或治療個體之SARS-CoV-2感染之方法，其包含向該個體輸注抗原特异性T細胞，其中該等抗原特异性T細胞係藉由以下産生： a) 用如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽、編碼如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽的核酸、在MHC分子之背景中包含該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基的穩定MHC-肽複合物或者在MHC分子之背景中編碼及/或在細胞表面上呈遞該至少一種如請求項1至17中任一項之免疫原性多肽之肽抗原決定基的細胞刺激個體之PBMC或T細胞；及 b) 活體外擴增抗原特异性T細胞，視情況在刺激PBMC或T細胞之前自該個體分離該等PBMC或T細胞。
  89. 如請求項88之方法，其中該T細胞為原生T細胞、中央記憶T細胞或效應子記憶T細胞。
  90. 如請求項89之方法，其中該T細胞為CD8+記憶T細胞。
  91. 如請求項36至90中任一項之方法，其中使該等劑在適合於在該肽抗原決定基、免疫原性多肽、穩定MHC-肽複合物、T細胞受體及/或T細胞之間形成至少一種免疫複合物的條件下及時間內接觸置放。
  92. 如請求項36至91中任一項之方法，其中該肽抗原決定基、免疫原性多肽、穩定MHC-肽複合物及/或T細胞受體由細胞表現，且該等細胞在一或多個步驟期間經擴增及/或分離。
  93. 如請求項36至92中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒動物。
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