KR102602561B1 - 2019 신종 코로나바이러스 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서 - Google Patents
2019 신종 코로나바이러스 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 COVID-19 백신 접종자 및 감염환자에서 중화항체 생성 여부를 확인하기 위하여 COVID-19의 S1-RBD 재조합 단백질을 제작하여 멤브레인에 고정시킨 LFA 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 제공으로 검체에서 COVID-19 중화항체 생성 여부 확인을 위하여 COVID-19 바이러스를 필요로 하지 아니하여 안전하고 10분 안에 검사 결과를 확보할 수 있는바 기존의 cVNT 및 pVNT 방법보다 저렴하고 검사에 접근성이 높으며 빠른 결과 확보가 가능한바, 감염자 혹은 백신 접종자에 대한 효율적인 사후 관리와 백신 완전 접종 이후 사후 역학조사에 적극적으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서 등에 관한 것이다.
기존의 코로나 바이러스는 외막을 갖는 양성 센스(positive-sense), 단일 가닥, RNA 바이러스로서 사람에게 감염 시 가벼운 호흡기성 질환을 일으킨다고 알려져 있었으나, 2019년 말 중국의 한 병원에서 처음 학계에 보고된 호흡기 질환을 유발하는 코로나 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2: SARS-CoV-2) 또는 2019 신종 코로나 바이러스(2019-novel coronavirus: 2019-nCoV) 라는 이름으로도 불린다. 2021년 3월 17일까지 보고된 확진 수는 약 1.21억명, 사망자는 약 268만명에 육박한다. 확진 환자가 가장 많이 발생한 대륙은 미대륙, 유럽, 동남아시아 순이며 각 대륙에서의 확인된 누계 확진 환자 수는 각 53,160,109명, 41,563,117명, 그리고 13,986,486명으로 집계된다. 또한 국가 기준으로 해당 바이러스 감염 확진 환자 수는 미국, 브라질, 인도가 상위 세 곳으로 각 국가에서 29,605,933명, 11,693,838명, 그리고 11,474,605명의 2019-nCoV 감염에 의한 COVID-19 확진 환자가 발생했다는 것이 확인되었다.
공기중의 비말 내 포함된 바이러스에 의한 감염 전파가 2019-nCoV의 주된 전파 경로로 밝혀 짐에 따라, 2019-nCoV가 어떻게 급성 호흡기 감염 및 질환을 유발하는지'에 대한 연구 또한 집중적으로 이루어졌다. 이를 통해 연구자들은 2019-nCoV가 2002년부터 2003년까지 유행한 SARS-CoV와 같은 β-genus에 속한다는 것과, 신종 코로나 바이러스 또한 envelope-anchored spike 단백질을 매개한 숙주 수용체와의 결합 및 '세포내 이입(endocytosis)'이 주된 감염의 시작 경로임을 밝혀냈다. 또한 SARS-CoV와 마찬가지로 2019-nCoV는 안지오텐신 전환효소2 (angiotensin-converting enzyme 2: ACE2)를 주요 수용체 매개하여 숙주와 융합하고, 해당 수용체가 가장 많이 분포하고 있는 호흡기 내 폐포의 '폐 상피세포'를 통한 감염이 주된 전파 경로임을 확인하였다. 또한 2019-nCoV의 수용체로 작용하는 ACE2에 매개되는 바이러스의 항원성 단백질은 바이러스의 여러 단백질 중 spike (S)단백질로서 이 단백질은 subunit 1 (S1)과 subunit 2 (S2)로 이루어졌으며 두 종류의 소단위 단백질은 각각, S1은 숙주 세포로의 결합과 S2는 세포막과 바이러스의 융합에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이러한 정보에 따라 현재 한국을 포함하는 여러 국가에서 허가를 받아 국민들에게 접종 중에 있는 백신들은 주요 감염경로에 작용하는 2019-nCoV의 S1-RBD 단백질에 결합하는 중화 항체를 생성시켜 바이러스의 S1-RBD 단백질과 숙주세포의 ACE2의 결합을 방해함으로써 숙주세포로의 침입을 막는 역할을 한다. 특히 한국에서 현재 접종 중에 있는 아스트라제네카, 화이자, 모더나, 얀센 백신은 바이러스 항원 유전자를 체내에 투여하여 접종자가 2019-nCoV에 대하여 면역활성을 갖도록 유도하는 백신으로서, 접종자는 2019-nCoV의 감염 없이도 바이러스가 세포로 침투하는 기전을 막는 항체를 생성할 수 있게 된다.
현재까지 상기의 2019-nCoV 백신 접종자 및 감염환자에게서 중화항체가 생성되었는지 확인하는 방법으로 가장 널리 쓰이는 방식은 conventional virus neutralization test (cVNT) 방법 혹은 pseudovirus-based virus neutralization test (pVNT) 방법으로 시험한 검체 내의 COVID-19 바이러스에 대한 중화항체 양에 대하여 정확하게 확인할 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 고위험군의 바이러스를 직접적으로 사용하기 위한 시설을 갖추어야 하고, 시설을 이미 갖추었다 하더라도, 최종 결과를 얻기까지 최소 48시간에서 최대 96시간이 필요한 방법이기에 감염자 혹은 백신 접종자에 대한 효율적인 사후 관리와 백신 완전 접종 이후 사후 역학조사에 대하여 해당 방법을 적용하기 적절치 않다.
따라서 본 발명을 통하여 우리가 연구하고자 하는 것은 중화항체에 특이적인 항원 및 이를 활용한 측방유동 면역크로마토그래피법(lateral flow immunoassay: LFA) 대한 것으로, 2019 신종 코로나 바이러스가 사람의 ACE2에 결합하는데 있어 중요한 역할을 하는 2019-nCoV S1-RBD 단백질에 대한 재조합 항원을 제작하는 것이 첫째 목표다. 또한 이렇게 개발한 재조합 항원을 사용하여 개발한 신속진단키트의 감염자 또는 백신 접종자의 혈액에 존재하는 중화항체에 대한 성능학적 지표인 특이도와 민감도를 확인하고자 한다.
2019 신종 코로나바이러스 감염증(coronavirus disease-19: COVID-19)은 2019-nCoV 감염 질환으로, 2019-nCoV는 사람의 호흡기관, 특히 폐 상피세포에 다수로 분포하는 안지오텐신 전환효소 2 (angiotensin converting enzyme 2: ACE2)를 매개하여 감염을 일으키는 β-genus 바이러스이고, COVID-19는 완치환자 및 백신 접종자의 항체생성에 대한 효율적인 사후관리가 필요한 질병이다.
본 발명자들은 현장에서 간편하고 신속하게 COVID-19 완치환자 또는 백신 접종자에 항체 생성 여부를 확인할 수 있는 Point of Care (POC) 시스템을 구축하고자 하였으며, 이를 위하여 2019-nCoV의 Spike1-RBD(receptor binding domain)을 표적물질로 선정하고, 재조합 S1-RBD 항원을 제작하여 이를 이용한 측면 유동 분석(lateral flow assay: LFA) 기반의 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출용 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LFA 기반의 2019-nCoV 중화항체 검출용 바이오센서의 제조방법과, 상기 바이오센서를 이용한 2019-nCoV 중화항체 검출방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일단에서 타단 방향으로 (1) 금나노입자에 단일클론항체가 부착된 제1접합체와 금나노입자에 항-인간 IgG 항체가 부착된 제2접합체가 고정된 컨쥬게이트 패드; (2) 2019-nCoV의 재조합 Spike1-RBD (receptor-binding domain) 항원이 고정된 테스트 영역; 및 (3) 제1접합체의 단일클론항체와 결합하는 바인더가 고정된 컨트롤 영역;을 순차적으로 포함하는, 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 바이오센서에서 제1접합체의 단일클론항체는 제2접합체의 항-인간 IgG 항체와 구별되는 것으로서 구체적으로 상기 단일클론항체는 조류의 IgY 일 수 있으며, 보다 구체적으로 chicken-IgY일 수 있으나, 인간의 IgG와 결합하지 않는 단일클론항체라면 제한되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 재조합 Spike1-RBD 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있으며, 3차원 구조에 영향이 없는 범위에서 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 바인더는 제1접합체와 결합하여 컨트롤 영역의 발색을 유도할 수 있는 것이라면 제한되지 아니하며, 제1접합체의 단일클론항체의 종류에 따라 달라질 수 있다. 구체적으로 제1접합체의 단일클론항체가 IgY인 경우 항-IgY 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 바이오센서는 일 말단에 분석 샘플을 투입할 수 있는 샘플 패드를 추가로 포함하고, 타 말단에 흡수 패드를 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우 바이오센서는 일단에서 타단방향으로 [샘플 패드]-[컨쥬게이션 패드]-[테스트 영역]-[컨트롤 영역]-[흡수 패드]이 순차로 위치하게 된다.
상기 컨쥬게이션 패드는 샘플패드의 하단부위 위치할 수 있으며, 이 경우에도 일단에서 타단방향으로 각 패드 또는 영역이 시작되는 순서는 상술한 순서와 동일하다.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 2019-nCoV 중화항체 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 검출방법은 (가) 액상의 분석용 샘플을 준비하는 단계; (나) 상기 샘플을 상기 바이오센서의 컨쥬게이션 패드 또는 샘플 패드에 로딩하는 단계; (다) 상기 샘플의 측면 유동을 유도하고 상기 바이오센서의 컨트롤 영역과 테스트 영역의 발색을 확인하는 단계; 및 (라) 컨트롤 영역의 발색이 확인되지 않는 경우 재검이 필요하고, 컨트롤 영역 및 테스트 영역의 발색이 확인되는 경우 2019-nCoV 중화항체가 샘플내에 존재하고, 컨트롤 영역의 발색은 확인되지만 테스트 영역의 발색이 확인되지 않는 경우 2019-nCoV 중화항체가 샘플내에 존재하지 않는 것으로 판정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 분석용 샘플은 생물학적 시료, 특히 혈액일 수 있으며, 이 경우 상기 2019-nCoV 중화항체 검출방법은 2019-nCoV 면역 형성 여부를 판별하기 위한 정보제공방법으로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 바이오센서의 제조방법을 제공한다:
(A) 2019-nCoV 의 재조합 Spike1-RBD 항원 제조단계;
(B) 금나노입자에 단일클론항체가 부착된 제1접합체와 금나노입자에 항-인간 IgG 항체가 부착된 제2접합체 제조단계; 및
(C) 스트립 형태의 다공성 멤브레인에 일단에서 타단 방향으로 제1접합체 및 제2접합체를 고정하여 컨쥬게이션 패드 영역을 설정하고, 상기 재조합 Spike1-RBD 항원을 고정하여 테스트 영역을 설정하고, 상기 제1접합체와 결합할 수 있는 바인더를 고정하여 컨트롤 영역을 설정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (A) 단계는 하기 (a) 내지 (e) 단계를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 Spike1-RBD 유전자를 플라스미드(plasmid) 벡터에 삽입하여 재조합 Spike1-RBD 발현용 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 벡터를 세포에 주입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질전환체를 배양하고 배양액을 회수하여 필터로 여과하는 단계;
(d) 상기 여과액에 황산암모늄을 첨가하고 그 상층액을 회수 후 원심분리하여 펠렛을 회수하는 단계; 및
(e) 상기 펠렛을 인산염완충액에 현탁한 후 원심분리하여 그 상층액을 취하고, 상기 상층액을 필터로 여과한 후 Ni Sepharose 레진을 이용하여 재조합 Spike1-RBD 항원을 정제하는 단계.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계의 플라스미드 벡터는 삽입되는 재조합 Spike1-RBD 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있으며, 상기 프로모터의 종류는 상기 (b) 단계의 세포 종류에 따라 상이할 수 있고, 상기 세포에는 제한이 없으나, 바람직하게는 동물세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 포유동물 유래의 세포일 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 형질전환의 대상이 되는 (b) 단계의 세포 내에서 활발하게 작동하는 프로모터인 것이 바람직하다. 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 인간 배아 신장세포(human embryonic kidney)에서 재조합 Spike1-RBD 단백질을 발현시키기 위하여 CMV 프로모터로 구동되는 pCMV 플라스미드 벡터를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, (c) 단계의 형질전환체 배양은 무혈청 배지에서 수행되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 FBS가 포함된 무혈청 배지에서 배양하고 점차 FBS 함량이 낮은 무혈청 배지로 교환하여 배양하여 최종적으로 100% 무혈청 배지에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계의 원심분리는 8,000G 내지 10,000G, 바람직하게는 9,000G에서 수행될 수 있으며, 상기 (e) 단계의 원심분리는 4
에서 30분 동안 1,000G로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (C) 단계의 다공성 멤브레인은 기본적으로 친수성의 다공성(porous) 구조를 갖는 것이라면 제한되지 아니하나, 단가, 모세관 유동 특성, 높은 단백질 결합능, 조작의 용이성 등을 고려하여 니트로셀룰로오스(nitrocellulose)를 이용할 수 있다.
본 발명의 제공으로 검체에서 2019 신종 코로나 바이러스(2019-nCoV)에 대한 중화항체 생성 여부 확인을 위하여 2019-nCoV 바이러스를 필요로 하지 아니하여 안전하고 10분 안에 검사 결과를 확보할 수 있는바 기존의 cVNT 및 pVNT 방법보다 저렴하고 검사에 접근성이 높으며 빠른 결과 확보가 가능한다. 또한, 본 발명의 LFA 키트는 높은 민감도와 COVID-19에 대한 특이도가 높은바, COVID-19 감염자 혹은 백신 접종자에 대한 효율적인 사후 관리와 백신 완전 접종 이후 사후 역학조사에 적극적으로 이용될 수 있다.
도 1은 RBD 증폭산물의 아가로즈 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis) 결과(A)와, 상기 RBD 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드 벡터를 제한효소로 절단 후 전기영동을 수행한 결과(B)이다.
도 2는 상기 RBD 유전자 삽입한 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 HEK293 세포 배양상층액에서 분리 정제된 재조합 RBD 단백질의 SDS-PAGE 수행 결과이다.
도 3은 본 발명에서 제작한 재조합 RBD 단백질(Lane 1)과 시중에서 판매중인 RBD 단백질(Lane 2)의 SDS-PAGE 수행 결과(A), 웨스턴 블롯 결과(B), 및 점 블롯(dot blot) 결과(C)이다.
도 4는 본 발명의 2019-nCoV 중화항체 검출용 LFA 기반 바이오센서의 모식도로서, 중화항체 양성 검체를 샘플로 이용하였을 때 발색을 나타내는 원리를 나타낸다.
도 5는 8종 바이러스를 이용하여 본 발명의 바이오센서의 2019-nCoV 중화항체에 대한 특이도를 확인한 것이다.
도 2는 상기 RBD 유전자 삽입한 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 HEK293 세포 배양상층액에서 분리 정제된 재조합 RBD 단백질의 SDS-PAGE 수행 결과이다.
도 3은 본 발명에서 제작한 재조합 RBD 단백질(Lane 1)과 시중에서 판매중인 RBD 단백질(Lane 2)의 SDS-PAGE 수행 결과(A), 웨스턴 블롯 결과(B), 및 점 블롯(dot blot) 결과(C)이다.
도 4는 본 발명의 2019-nCoV 중화항체 검출용 LFA 기반 바이오센서의 모식도로서, 중화항체 양성 검체를 샘플로 이용하였을 때 발색을 나타내는 원리를 나타낸다.
도 5는 8종 바이러스를 이용하여 본 발명의 바이오센서의 2019-nCoV 중화항체에 대한 특이도를 확인한 것이다.
본 발명자들은 현장에서 숙련된 기술자와 고가의 장비 없이도 빠르고 정확하게 2019 신종 코로나바이러스(2019 novel coronavirus: 2019-nCoV) 중화항체 검출할 수 있는 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 2019-nCoV S1-RBD 재조합 단백질을 사용한 진단 키트의 양성 퍼센트 일치(PPA) 및 음성 퍼센트 일치(NPA)는 미국 FDA EUA에서 승인한 ELISA 키트와 비교했을 때 각각 100% 및 98.3%인 점에서 신속 진단 키트에 적용될 수 있으며, 향후 신속 진단 키트의 성능을 개선하고 정량 분석 장비를 통해 중화항체의 정량분석이 가능하면 제품화 통해 검체내의 중화항체 유무와 양을 확인함으로써 2019-nCoV에 대한 면역성을 예측하고 추가 예방접종 여부를 판단하는 데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"바이오센서"는 생물학적 요소와 분석 대상 물질과의 반응에서 나타나는 전기화학적 변화, 열 에너지 변화, 형광 또는 색의 변화 등을 인식가능한 신호로 변환시켜주는 디바이스와 결합하여 제작된 디바이스를 의미하며, 본 발명에서 바이오센서는 특히 다공성 멤브레인에 고정된 재조합 S1-RBD 항원과 샘플에 포함된 2019-nCoV 중화항체의 특이적 결합을 색의 변화로 나타내는 디바이스일 수 있다.
"바인더"는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체를 의미하며, 특히 본 발명에서 바인더는 제1접합체에 단일클론항체와 특이적으로 결합하는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.
"항원"은 특이한 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 물질(substance)로서, 구체적으로 적어도 하나의 항체에 의하여 인식 가능한 적어도 하나의 에피토프(epitope; 항체의 의하여 인식될 수 있는 특정 생화학적 유닛)을 함유하는 분자 또는 분자 그룹을 의미하며, 본 발명에서 항원은 2019 신종 코로나바이러스의 Spike 1 단백질에서 receptor binding domain (S1-RBD)를 의미하고, 상기 항원은 실험실 수준에서 제작된 재조합 S1-RBD일 수 있으며, 본 발명에서 재조합 S1-RBD 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있으나, 상기 아미노산 서열은 숙주 세포의 수용체와 결합하는 기능을 유지하는 범위 내에서 하나 또는 둘 이상의 아미노산 서열이 삽입, 결실, 및/또는 치환될 수 있다.
본 발명에서 특별히 언급하지 않는한, 본 명세서에서 "항체"는 완전한 다중클론(또는 폴리클론) 또는 단일클론(모노클론) 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬 (ScFv), 다이아바디, 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체, 그의 돌연변이, 항 체 부분을 포함하는 융합 단백질, 요망되는 특이성의 항체 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 기타 변형 배열을 의미할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 표현은 결합 시약(reagent), 예를 들면 항체의 특이성을 의미하는 것으로, 정의된 검체 또는 타겟 물질에 우선적으로 결합하는 것을 의미할 수 있다. 다른 잠재적인 타겟의 존재 하에서 특정 검체 또는 타겟 물질의 결합 시약 또는 항체에 의하여 인식되는 것은 이러한 결합의 일 특징일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 검체에 특이적으로 결합하는 결합 시약은 검사하고자 하는 샘플 내의 다른 간섭 부분 또는 부분들과의 결합을 회피할 수 있다.
"샘플"은 검출하고자 하는 검체, 즉 2019-nCoV 중화항체를 함유할 수 있다면 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를들어, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액(전혈), 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등이 있으나, 본 발명에서 생물학적 유체는 바람직하게는 혈액, 혈장, 및/또는 혈청일 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집괴로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다.
"접합체(conjugate)"는 광의로는 특정 물질 및 이에 접합된 검출 가능한 표지(label)를 의미할 수 있는 바, 본 발명에서는 표지로서 금 나노입자를 사용하고, 이에 단일클론항체가 접합된 것을 의미할 수 있다.
“프로모터”는 형질주입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.
"발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하 게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
"형질전환" 또는 “형질주입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1.
2019 nCoV spike1-RBD 발현용 벡터 제작
2019 신종 코로나바이러스 Spike 1 단백질의 RBD 영역 염기서열 정보는 NCBI (MD, USA)에서 검색하였으며, 유전자 합성을 통해 2019 nCoV S1-RBD 유전자를 합성하고 이를 pCMV vector plasmid (Sino Biological, Beijing, China)에 삽입하였다. 상기 합성된 S1-RBD 유전자는 PCR을 수행하여 증폭하였으며, PCR 증폭산물의 길이는 669bp이고 증폭산물의 아가로즈 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis) 결과는 도 1(A)에 나타내었다.
하기 표 1은 NCBI에서 검색한 상기 RBD 영역의 염기서열과 아미노산 서열이다.
| DNA Sequence of RBD (서열번호 1) |
AGGGTCCAACCAACAGAGAGCATTGTGAGGTTTCCAAACATCACCAACCTGTGTCCATTTGGAGAGGTGTTCAATGCCACCAGGTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATTAGCAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTCTACAACTCTGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGTTATGGAGTGAGCCCAACCAAACTGAATGACCTGTGTTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATTAGGGGAGATGAGGTGAGACAGATTGCCCCTGGACAAACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAACTGCCTGATGACTTCACAGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGAGGCAACTACAACTACCTCTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCATTTGAGAGGGACATCAGCACAGAGATTTACCAGGCTGGCAGCACACCATGTAATGGAGTGGAGGGCTTCAACTGTTACTTTCCACTCCAATCCTATGGCTTCCAACCAACCAATGGAGTGGGCTACCAACCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTCCATGCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTC |
| Amino Acid Sequence of RBD(서열번호 2) | RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF |
S1-RBP 유전자를 pCMV Vector Plasmid에 삽입 시, 5' 말단에는 Hind III (AAGCTT) 제한효소 절단분위를, 3'말단에는 Kpn I (GGTACC) 제한효소 절단부위를 포함하도록 설계하였다. 열충격방법을 이용하여 Escherichia coli DH5α competent cell을 상기 재조합 plasmid로 형질전환 하고, 형질전환된 E. coli DH5α competent cell은 Kanamycin (40 μg/mL)이 포함된 LB 평판배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 16시간 이상 배양하였다. 평판배지에 완전히 자란 단일 콜로니를 취하여 Kanamycin (40 μg/mL)이 포함된 LB 액체배지에 넣고 180 rpm의 속도로 Innova 4230 배양기(New Brunswick, Arlington, UK)에서 16시간 배양하였다. Plasmid prep kit (뉴클레오젠, 경기도, 한국)를 사용하여 plasmid purification을 수행하고, 제한효소(Hind III와 Kpn I) 처리 후 전기영동을 실시하였고, 유전자분석을 통하여 서열을 확인하였다. 제한효소를 처리한 purified plasmid vector의 전기영동 결과는 도 1(B)에 나타내었으며, 도 1(B)는 pCMV plasmid vector에 RBD 영역 유전자가 삽입되었음을 보여준다.
실시예 2. 세포 배양 및 형질전환
HEK293 (human embryonic kidney) 세포는 70-90 % 밀집도에서 트립신-EDTA (0.05%) 용액(ThermoFisher, MA, USA)을 사용하여 계대배양을 하였으며, 10% fetal bovine serum; FBS (Sigma-Aldrich, MO, USA)가 포함된 Dulbecco modified eagle medium F12; DMEM/F12 (Pan Biotech, Aidenbach, Germany)을 사용하여 1.0 × 105 cells/mL이 되도록 세포를 조절하였다. 이를 5% CO2 및 높은 습도로 유지되는 37°C 인큐베이터에서, 100unit/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 배지로 주기적으로 교체하며 배양하였다. 형질전환을 위해 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, MA, USA)을 사용하였으며, 형질전환 이후 10% FBS 와 100μg/mL hygromycin이 포함된 DMEM/F12를 사용하여 배양하였고 형질전환된 세포 중 RBD 단백질을 발현하는 well의 세포를 선택하여 계대배양하면서 FBS가 포함된 배지에 무혈청 배지의 양을 점차 증가시켜 세포를 무혈청배지에 적응시켜서 최종 100% 무혈청 배지에서 계대배양하였다.
실시예 3. 단백질 회수 및 확인
형질전환된 세포의 배양액을 회수하여 필터 처리한 후 회수한 배지 부피의 15% 농도가 되도록 황산암모늄(Samchun, Gyeonggi-do, Korea)을 첨가한 후 상층액을 회수하였다. 이를 4℃에서 하루동안 정지한 후에 다시 9,000 ×g로 원심분리를 수행하였다. 펠렛에 10 mM 인산염완충액(phosphate buffered saline: PBS)을 넣은 후 재현탁하고, 마지막으로 4℃에서 10,000 ×g로 30분간 원심분리하여 회수한 상층액을 0.45 μm 필터(Merck Millipore, MA, USA)로 걸러주었다. 재조합 RBD 항원의 정제는 친화 크로마토그래피법을 통해 수행하였으며, 정제는 Ni sepharose 레진(GE Healthcare, IL, USA)을 이용하였다. 또한 세척액을 레진에 투과시켜 S1-RBD 단백질 이외의 단백질을 제거하였고, 이후 용출완충액을 처리하여 레진에 흡착되어 있는 RBD 단백질을 용출하였다. 용출된 RBD 단백질을 10 mM 인산염완충액을 사용하여 4℃에서 3시간씩 2회 투석한 후 마지막 투석은 4℃에서 하룻밤동안 투석한 후에 회수하였다. 단백질의 크기는 SDS-PAGE를 실행하여 확인하였으며, Mini Protean 3 system (Bio-Rad, CA, USA)에서 12% separating gel을 사용하였다. 겔은 150 V에서 1 시간 동안 전기영동하였으며, 전기영동이 끝난 후에는 coomassie brilliant blue R-250 (Merck Millipore, MA, USA) 염색하여 확인하였다. 또한 이를 통해 회수한 단백질의 순도를 검사하기 위하여 GenAnalyzer 19.1; gel 분석 소프트웨어를 사용하여 확인하였다.
원심분리한 배양 상층액을 농축하여 니켈 레진으로 정제하여 단백질을 회수한 결과 수확한 재조합 단백질의 양은 배지 1 L당 평균 0.1 mg였다. 또한, 재조합 S1-RBD 단백질과 시중에 판매 중에 있는 2019-nCoV의 S1 단백질의 일부 아미노산이 포함된 RBD 단백질을 SDS-PAGE로 비교하여 단백질 마커와 대조하였을 때 이 연구를 통해 개발된 재조합 RBD 단백질은 35 kDa이였음을 확인하였고 추정 순도는 97%이였다(도 2).
실시예 4. Membrane Blotting을 통한 항원의 특이도 검사
실시예 3에서 서술한 방법을 통해 회수한 단백질과 구입한 RBD 단백질(바이오앱, 경상북도, 한국)의 RBD 특이 항체에 대한 반응성을 검증하기 위하여, 2019-nCoV의 S1-RBD 단백질에 대한 항체 clone#B3D4 (보레다바이오텍, 경기도, 한국)를 사용한 dot blot 과 western blot을 모두 실험 진행하여, 입체 구조의 단백질 및 denature 형태의 재조합 단백질이 2019-nCoV의 S1-RBD 단백질에 대한 항체에 대하여 반응하는지 확인하였다. Western blotting 및 dot blotting 결과는 도 3에 나타내었으며, Lane 1은 실시예 3에서 회수한 재조합 RBD 단백질 결과이고, Lane 2는 바이오앱에서 구입한 RBD 단백질 결과이다.
구입한 RBD 단백질은 54 kDa이고도 3(A), Lane2), RBD에 특이적인 항체를 사용하여 western blotting 및 dot blotting을 수행한 결과, 두 재조합 단백질 모두 변성(도 3(B)) 및 3차 아미노산 구조(도 3(C))에서 RBD 항체에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다. 개발된 재조합 단백질은 발현한 단백질의 크기가 예상한 것과 같고 western blotting 및 dot blotting의 결과 분석을 통해 RBD 단백질의 3차 구조와 생물학적 활성을 갖고 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. LFA를 통한 재조합 항원의 민감도와 특이도 검사
개발한 재조합 항원의 2019-nCoV 중화항체에 대한 특이도를 시험하기 위하여 LFA 형태로 제작하였으며, 키트의 membrane에는 control line(C)에 goat anti-chicken IgY과 test line(T)에 재조합 S1-RBD 단백질을 1 mg/mL 농도로 분주하여 고정하였다. 금나노입자-chicken IgY 접합체 및 금나노입자-anti-human IgG 접합체는 pH 6.5, 항체 농도 1.5 mg/mL에서 최적의 수율로 제작할 수 있었으며, 상기 조건에서 제작한 두 종류의 접합체를 컨쥬게이트 패드(conjugate pad)에 처리하여 건조기에서 건조하여 LFA 키트를 제작하였다.
임상검체는 LFA 키트의 sample pad에 적가하며, pad에 적가된 임상검체는 conjugate pad에 위치한 상기 양 접합체와 함께 LFA 키트의 test line을 거쳐 control line으로 이동하며, 임상 검체 내에 2019-nCoV의 S1-RBD 단백질에 대한 중화항체(neutralizing Ab)가 존재하는 경우 LFA의 검사선(test line)에 고정된 재조합 RBD 항원과 결합하여 발색이 일어난다(도 4 참조).
상기 제작된 LFA 키트에 NIBSC (Herts, UK)와 Precision for Medicine (MA, USA)에서 구입한 2019-nCoV 중화항체 양성 및 음성 검체를 사용하여 재조합 항원의 성능을 확인하였다. 구체적으로 2019-nCoV 중화항체 음성 검체(normal human serum, Precision Medicine, USA) 100개는 COVID-19 팬더믹 이전에 확보된 것으로서 Precision Medicine으로부터 구입하였으며, 2019-nCoV 중화항체 양성 검체는 NIBSC (Herts, UK)에서 분양받았으며 Genscript (USA)사의 cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit를 사용하여 양성 검체임을 재검증하여 이용하였다. 시험에 사용한 모든 검체들은 90 μL의 완충액과 혼합하여 100 μL로 만들었으며 test kit에 점적하고 10분 후 결과를 측정하였다.
5-1. 키트의 민감도 검사 결과
상기 임상 검체를 LFA 키트에 적가하여 3.8 AU/mL 미만을 음성 control (13 samples)로 판정하고 3.8 AU/mL 이상을 양성 control (24 samples)로 설정하여 재조합 RBD 항원의 2019-nCoV S1-RBD 특이적 중화항체에 대한 민감도를 확인한 결과, 양성 일치율, positive percent agreement (PPA) 100%, 음성 일치율, negative percent agreement (NPA) 98.3%, limit of detection (LOD)은 29.1 AU/mL의 결과를 얻을 수 있었다(표 3). 통계 분석은 Cohen's kappa 분석을 따랐다.
| Result | Control | |||
| Positive | Negative | Sum | ||
| Study | Positive | 22 (a) | 2 (b) | 24 (a+b) |
| Negative | 0(c) | 100(PM) (d) | 113 (c+d) | |
| 13(<3.8, NIBSC) (d) | ||||
| Sum | 22 (a+c) | 115 (b+d) | 137 (a+b+c+d) | |
PPA (%) = 100 x a/(a+c) : 100 %
NPA (%) = 100 x d/(b+d) : 98.3%
Overall rate of Agreement (%) = 100 x (a+d)/(a+b+c+d) : 98.5%
5-2. 키트의 특이도 검사 결과
이어서, 제작된 LFA 키트의 특이도를 확인하기 위하여 8종 바이러스((influenza A, influenza B, respiratory syncytial virus A (RSV A), respiratory syncytial virus B (RSV B), dengue virus, severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV), bovine coronavirus, canine coronavirus)에 대한 단일클론 항체를 구입하여 상기 키트를 이용하여 LFA를 수행하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, 재조합 S1-RBD 항원이 고정된 LFA 키트는 2019-nCoV S1-RBD에 특이적인 중화항체에만 반응하고, 다른 항체와 비특이적 결합하지 않음을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> ORE DA BIOTECH CO.,LTD.
<120> Biosensor based on lateral flow analysis for 2019 novel
coronavirus neutralizing antibody detection
<130> APC-2021-0737
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 2019 novel coronavirus_RBD
<400> 1
agggtccaac caacagagag cattgtgagg tttccaaaca tcaccaacct gtgtccattt 60
ggagaggtgt tcaatgccac caggtttgcc tctgtctatg cctggaacag gaagaggatt 120
agcaactgtg tggctgacta ctctgtgctc tacaactctg cctccttcag caccttcaag 180
tgttatggag tgagcccaac caaactgaat gacctgtgtt tcaccaatgt ctatgctgac 240
tcctttgtga ttaggggaga tgaggtgaga cagattgccc ctggacaaac aggcaagatt 300
gctgactaca actacaaact gcctgatgac ttcacaggct gtgtgattgc ctggaacagc 360
aacaacctgg acagcaaggt gggaggcaac tacaactacc tctacagact gttcaggaag 420
agcaacctga aaccatttga gagggacatc agcacagaga tttaccaggc tggcagcaca 480
ccatgtaatg gagtggaggg cttcaactgt tactttccac tccaatccta tggcttccaa 540
ccaaccaatg gagtgggcta ccaaccatac agggtggtgg tgctgtcctt tgaactgctc 600
catgcccctg ccacagtgtg tggaccaaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgt 660
gtgaacttc 669
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
<213> 2019 novel coronavirus_RBD
<400> 2
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
180 185 190
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
195 200 205
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
Claims (15)
- 일단에서 타단 방향으로 (1) 금나노입자에 단일클론항체가 부착된 제1접합체와 금나노입자에 항-인간 IgG 항체가 부착된 제2접합체가 고정된 컨쥬게이트 패드;
(2) 2019-nCoV의 재조합 Spike1-RBD (receptor-binding domain) 항원이 고정된 테스트 영역; 및
(3) 제1접합체의 단일클론항체와 결합하는 바인더가 고정된 컨트롤 영역;을 순차적으로 포함하는, 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서로서,
상기 제1접합체의 항체는 제2접합체와 구별되고,
상기 재조합 Spike1-RBD 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며,
상기 재조합 Spike1-RBD 항원은 형질전환된 인간배아세포로부터 분리된 것인, 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 재조합 Spike1-RBD 항원은 HEK293 (human embryonic kidney) 세포를 형질전환하여 획득한 것을 특징으로 하는, 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 제1접합체의 단일클론항체는 IgY이고,
상기 바인더는 포유류의 항-IgY 항체인 것을 특징으로 하는, 바이오센서. - 제3항에 있어서,
상기 제1접합체의 단일클론항체는 Chicken IgY이고,
상기 바인더는 Goat anti-chicken IgY 인 것을 특징으로 하는, 바이오센서. - 제1항에 있어서,
상기 바이오센서는 일 말단에 분석 샘플을 투입할 수 있는 샘플패드를 추가로 포함하고,
타 말단에 흡수 패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오센서. - 하기 단계를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출용 측면유동분석 기반의 바이오센서 제조방법:
(A) 하기 (a) 내지 (e) 단계를 포함하는 2019-nCoV 의 재조합 Spike1-RBD 항원 제조단계;
(a) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 Spike1-RBD 유전자를 플라스미드(plasmid) 벡터에 삽입하여 재조합 Spike1-RBD 발현용 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 벡터를 인간배아세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질전환체를 배양하고 배양액을 회수하여 필터로 여과하는 단계;
(d) 상기 여과액에 황산암모늄을 첨가하고 그 상층액을 회수 후 원심분리하여 펠렛을 회수하는 단계; 및
(e) 상기 펠렛을 인산염완충액에 현탁한 후 완심분리하여 그 상층액을 취하고, 상기 상층액을 필터로 여과한 후 Ni Sepharose 레진을 이용하여 재조합 Spike1-RBD 항원을 정제하는 단계.
(B) 금나노입자에 단일클론항체가 부착된 제1접합체와 금나노입자에 항-인간 IgG 항체가 부착된 제2접합체 제조단계; 및
(C) 스트립 형태의 다공성 멤브레인에 일단에서 타단 방향으로 제1접합체 및 제2접합체를 고정하여 컨쥬게이션 패드 영역을 설정하고, 상기 재조합 Spike1-RBD 항원을 고정하여 테스트 영역을 설정하고, 상기 제1접합체와 결합할 수 있는 바인더를 고정하여 컨트롤 영역을 설정하는 단계. - 제6항에 있어서,
상기 (a) 단계의 플라스미드 벡터는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 pCMV 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (b) 단계의 인간배아세포는 HEK293 (human embryonic kidney) 세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (c) 단계의 형질전환체의 배양은 무혈청 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (d) 단계의 원심분리는 8,000G 내지 10,000G에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (e) 단계의 원심분리는 4℃에서 30분 동안 1,000G로 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (B) 단계는 금나노입자와 각 단일클론항체를 pH 6.5 조건 하에서 반응시켜 제1접합체 및 제2접합체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - (가) 액상의 분석용 샘플을 준비하는 단계;
(나) 상기 샘플을 제1항의 바이오센서의 컨쥬게이션 패드 또는 이와 근접한 일 측면에 로딩하는 단계;
(다) 상기 샘플의 측면 유동을 유도하고 상기 제1항 바이오센서의 컨트롤 영역과 테스트 영역의 발색을 확인하는 단계; 및
(라) 컨트롤 영역의 발색이 확인되지 않는 경우 재검이 필요하고,
컨트롤 영역 및 테스트 영역의 발색이 확인되는 경우 2019-nCoV 중화항체가 샘플내에 존재하고,
컨트롤 영역의 발색은 확인되지만 테스트 영역의 발색이 확인되지 않는 경우 2019-nCoV 중화항체가 샘플내에 존재하지 않는 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 중화항체 검출방법. - 제13항에 있어서,
상기 (가) 단계의 분석용 샘플은 생물학적 시료를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출방법. - 제14항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는, 검출방법.
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