PT2054443E - Anticorpos contra um epítopo de agr2, ensaios e hibridomas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS CONTRA UM EPÍTOPO DE AGR2, ENSAIOS E HIBRIDOMAS" A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais e a fragmentos de ligação a antigénio de tais anticorpos monoclonais. A invenção refere-se também a hibridomas capazes de produzir tais anticorpos. Outros aspectos da invenção referem-se também a utilizações dos anticorpos monoclonais divulgados em ensaios de diagnóstico e prognóstico de doença metastática. A proteína anterior de gradiente 2 (AGR2) é o homólogo humano do gene específico para a glândula de cemento de Xenopus (XAG-2). A sequência de aminoácidos de AGR2 é mostrada na Sequência ID N° 1. Foi demonstrado que a expressão aumentada de AGR2 correlaciona com positividade para o receptor de estrogénio (ER) em especímenes de carcinoma da mama. A expressão induzida de AGR2 parece dar origem a um fenótipo metastático naquelas que seriam, de outro modo, células benignas não metastáticas. 0 cancro é a segunda causa mais comum de morte no mundo Ocidental, e é a causa principal de morte entre aqueles com menos de 85 anos de idade. Um em quatro da população morrerá de cancro, e estas mortes ocorrem geralmente em consequência de doença metastática não tratável. A disseminação de metástases pelo corpo aumenta o número de tecidos danificados pelo cancro, enquanto torna o tratamento do cancro cada vez mais difícil. 0 número de metástases que se pode desenvolver a partir de um único tumor primário será geralmente demasiado grande para ser 2 tratado, e o número de sítios diferentes que requer tratamento demasiado abundantes e variados. A capacidade dos cancros metastáticos para "reaparecer" ou "aparecer", mesmo após excisão ou resolução de um tumor primário e tratamento sistémico, contribui muito para as dificuldades encontradas no tratamento de cancro e também para a angústia sentida pelos doentes com cancro face à incerteza se um tratamento foi eficaz para os tornar livres de cancro.

Entender-se-á, à luz da influência negativa do cancro na população como um todo, que existe uma necessidade bem reconhecida de métodos que possam ser utilizados para diagnosticar cancro metastático (doença metastática). Muitos métodos existentes carecem de sensibilidade e/ou fiabilidade e, deste modo, os resultados destes métodos não podem ser vistos como conclusivos. Uma sensibilidade reduzida dos ensaios de diagnóstico pode levar à realização de diagnósticos incorrectos com base nos resultados de ensaio incorrectos.

Existem também uma necessidade de ensaios que possam ser utilizados em prognóstico para avaliar a probabilidade de um doente para desenvolver cancro metastático. As limitações de sensibilidade e fiabilidade dos ensaios existentes para a doença metastática também significam que determinados doentes com um risco aumentado para desenvolver doença metastática não são necessariamente identificados utilizando os ensaios existentes. A incapacidade para identificar tais doentes pode significar que são perdidas oportunidades para intervenção terapêutica antes do aparecimento dos sintomas de doença metastática. 3

Também existe uma necessidade de ensaios de prognóstico que sejam capazes de indicar se um doente responderá favoravelmente, ou não, ao tratamento para cancro metastático. Em geral, os tratamentos para cancro metastático compreendem regimes relativamente "duros". Tais regimes de tratamento, e os efeitos de mal-estar que possam provocar, são geralmente justificados no caso de doentes para os quais não seja esperado que respondam a um tratamento menos rigoroso. No entanto será geralmente preferido evitar submeter doentes que provavelmente responderão de modo favorável a um tratamento mais "suave" a regimes duros desnecessários. Fletcher et al. (2003) divulgam um anticorpo policlonal contra uma associação de dois péptidos que representam dois fragmentos adjacentes de hAG-2 com homologia mínima com outros membros conhecidos da família. É um objectivo de determinadas formas de realização da invenção superar ou aliviar problemas associados à técnica antecedente. Por exemplo, é um objectivo de determinadas formas de realização da presente invenção proporcionar ensaios de diagnóstico para doença metastática que sejam mais sensíveis do que os proporcionados pela técnica antecedente. É um objectivo de determinadas formas de realização da presente invenção proporcionar ensaios de diagnóstico para doença metastática que sejam mais fiáveis do que os proporcionados pela técnica antecedente. É um objectivo de determinadas formas de realização da invenção proporcionar ensaios de prognóstico para doença metastática que sejam mais sensíveis do que os proporcionados pela técnica antecedente. É um objectivo de determinadas formas de realização da invenção proporcionar ensaios de prognóstico para doença metastática que sejam mais fiáveis do que os proporcionados pela técnica antecedente. É um objectivo de determinadas formas de realização da invenção 4 proporcionar agentes que possam ser utilizados em ensaios de diagnóstico e/ou prognóstico para doença metastática com maior sensibilidade e/ou fiabilidade do que os proporcionados pela técnica antecedente.

Num primeiro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especif icamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2. A Sequência ID N° 2 corresponde aos resíduos de aminoácido 26° a 40° da AGR2 humana. Os inventores constataram que um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, possuindo a especificidade definida acima proporciona vantagens assinaláveis em termos de utilização em comparação com os anticorpos contra a AGR2 da técnica antecedente. Em particular, os anticorpos da invenção podem ser utilizados em ensaios de prognóstico ou diagnóstico de cancro e, em particular, doença metastática, que têm maior sensibilidade do que ensaios semelhantes proporcionados pela técnica antecedente. Embora a expressão de AGR2 esteja fortemente associada aos cancros mamários, a expressão deste marcador também está presente numa grande gama de cancros incluindo carcinoma de células escamosas do esófago, carcinoma pancreático e carcinomas da próstata. Por conseguinte, os inventores acreditam que os anticorpos e métodos da invenção podem ser utilizados com respeito ao cancro e doença metastática, associados a qualquer forma de cancro primário. "Anticorpos da invenção," como referidos na presente descrição, pode ser qualquer anticorpo monoclonal possuindo especificidade para um epitopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2. O anticorpo produzido pelo hibridoma PZ7A10F10 representa um exemplo 5 particularmente preferido de um anticorpo da invenção. 0 PZ7A10F10 foi depositado nos termos do Tratado de Budapeste na Colecção Europeia de Culturas de Células (ECACC), em Porton Down, Salisbury, em 22 de Agosto de 2006, e foi-lhe dado o Número de Adesão 06082201. O anticorpo monoclonal produzido por este hibridoma pode ser referido, para efeitos da presente descrição, como "anti-AGR2/PZ7A10F10". O anti-AGR2/PZ7A10F10, ou os fragmentos de ligação a antigénio daquele, representa um anticorpo preferido, ou fragmentos de ligação a antigénio preferidos, para serem utilizados em todos os aspectos e formas de realização da invenção. AGR2/PZ7A10F10 é um anticorpo de IgG de cadeia leve K.

Como utilizado na presente descrição, o termo anticorpo da invenção deveria ser também entendido, a menos que o contexto exija de outro modo, como abrangendo fragmentos de ligação a antigénio de anticorpos da invenção, bem como derivados de ligação a antigénio de tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo.

Qualquer/quaisquer fragmento(s) de ligação a antigénio dos anticorpos da invenção pode(m) ser preparado(s) segundo técnicas conhecidas dos especialistas na técnica. Os fragmentos de ligação a antigénio funcionais mais pequenos de anticorpos da invenção podem compreender as regiões variáveis das cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de tais anticorpos. Estes fragmentos podem ter uma massa molecular de aproximadamente 13 kDa, ou menos de um décimo do tamanho típico de um anticorpo completo.

Os fragmentos de ligação a antigénio deste tipo podem ser bem expressados em sistemas de células de bactérias, leveduras e de mamíferos. Tais fragmentos também podem ser 6 resistentes a condições que, de outro modo, seriam prejudiciais, como liofilização ou desnaturação térmica.

Os anticorpos da invenção podem ter domínios Variáveis e Constantes. Entender-se-á que os fragmentos de ligação a antigénio (por exemplo, anticorpos scFV) que compreendem essencialmente a região Variável de um anticorpo sem qualquer região Constante também estão abrangidos pela presente invenção.

Os anticorpos da invenção podem ser "humanizados" utilizando técnicas que serão bem conhecidas dos especialistas na técnica. A humanização pode ser pelo menos parcialmente conseguida por anticorpos manipulados que utilizam sequências da região V de mAbs não humanos (por exemplo, roedores) e sequências da região C (e idealmente FRs da região V) de anticorpos humanos. Os mAbs 'manipulados' resultantes são menos imunogénicos em humanos do que os mAbs de roedores dos quais são derivados e são assim mais adequados para utilização clínica, e são deste modo mais susceptíveis para serem utilizados em ensaios in vi vo. A humanização adicional de anticorpos pode envolver enxerto de CDR ou a remodelação de anticorpos. Tais anticorpos são produzidos transplantando as CDRs da cadeia pesada e leve de um mAb de roedor (as quais formam o sítio de ligação ao antigénio do anticorpo) nas regiões estruturais correspondentes de um anticorpo humano.

Entender-se-á que, em pelo menos alguma extensão, a maior sensibilidade dos anticorpos monoclonais da invenção surge em consequência da especificidade da sua ligação a AGR2. Por conseguinte, pode preferir-se que os anticorpos monoclonais da invenção se liguem especificamente a AGR2, 7 mas não a proteínas semelhantes ou relacionadas. Pode particularmente preferir-se que anticorpo monoclonal da invenção seja um que não se ligue à proteína anterior de gradiente 3 (AGR3). De facto, esta característica é tão vantajosa, que a invenção também proporciona um anticorpo monoclonal com especificidade para AGR2, enquanto não tem qualquer especificidade para AGR3.

Os anticorpos da invenção são particularmente bem adequados para serem utilizados em aplicações de diagnóstico e/ou prognóstico. Por conseguinte, num terceiro aspecto, a invenção proporciona um método de diagnóstico de cancro, e em particular de doença metastática, utilizando um anticorpo da invenção. Num quarto aspecto, a invenção proporciona um método de avaliação da probabilidade do desenvolvimento de cancro, e em particular de doença metastática, utilizando um anticorpo da invenção. Para os efeitos da presente descrição um "método da invenção" deveria ser entendido como abrangendo qualquer utilização dos anticorpos da invenção em diagnóstico ou prognóstico. A menos que o contexto exija de outro modo qualquer método da invenção pode ser colocado em prática utilizando qualquer anticorpo da invenção. A utilização dos anticorpos da invenção em diagnóstico é particularmente vantajosa uma vez que a sensibilidade de diagnóstico dos ensaios utilizando os anticorpos da invenção está muito aumentada em relação à que pode ser conseguida utilizando técnicas da técnica antecedente. Embora não desejem ficar restringidos por qualquer hipótese, os inventores acreditam que esta sensibilidade aumentada dos ensaios de diagnóstico pode provir da maior sensibilidade dos anticorpos da invenção.

Os inventores constataram que os anticorpos da invenção podem ser utilizados em ensaios de prognóstico ou diagnóstico nos quais seja avaliada a aptidão dos anticorpos da invenção para se ligar a células tumorais presentes numa amostra do doente. Os inventores constataram que qualquer ligação dos anticorpos da invenção a células tumorais presentes numa amostra do doente pode ser considerada como indicativo, em termos de prognóstico ou diagnóstico, de doença metastática. Em particular, a ligação de anticorpos da invenção a aproximadamente 1% ou mais de células tumorais presentes numa amostra do doente é extremamente prognóstico e/ou diagnóstico de doença metastática.

Por conseguinte, um ensaio de acordo com o terceiro ou quarto aspectos da invenção pode compreender pôr em contacto uma amostra do doente com um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, de acordo com a invenção; e avaliar quanto à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente é diagnóstico e/ou prognóstico de cancro, e em particular de doença metastática, no doente. Preferencialmente, a amostra do doente pode ser uma amostra contendo células tumorais. Neste caso pode avaliar-se a ligação do anticorpo da invenção (ou fragmento de ligação a antigénio daquele) às células tumorais. No caso do anticorpo da invenção se ligar a células tumorais presentes na amostra do doente, isto é particularmente diagnóstico e/ou prognóstico de doença metastática no doente.

Pode fazer-se uma avaliação no que se refere à proporção de células tumorais numa amostra do doente que são ligadas por um anticorpo da invenção (ou um fragmento de ligação a antigénio daquele). Por exemplo, um resultado prognóstico e/ou diagnóstico indicativo de doença metastática no doente 9 pode ser indicado pela ligação do anticorpo (ou fragmento de ligação a antigénio daquele) a 1% ou mais das células tumorais presentes na amostra do doente.

Maiores incidências de ligação dos anticorpos da invenção a células tumorais numa amostra do doente estão associadas a uma redução na esperança de vida do doente de onde é proveniente a amostra. No caso de um anticorpo da invenção se ligar a aproximadamente 5% ou mais de células tumorais numa amostra do doente, isto pode indicar que o doente beneficiaria de intervenção rápida para tentar tratar o cancro e possíveis metástases. Também se pode utilizar ensaios deste tipo para determinar regimes terapêuticos adequados para o tratamento de cancro, representando aqueles com afinidade de ligação relativamente elevada dos anticorpos da invenção (até aproximadamente 5% ou mais de células tumorais presentes numa amostra do doente) candidatos adequados para tratamento com regimes que podem ser relativamente duros, se tais regimes proporcionassem benefícios administrados rapidamente.

Os ensaios de diagnóstico da invenção podem ser vantajosamente utilizados para identificar indivíduos que sofrem de cancro, e em particular de doença metastática. Os ensaios de diagnóstico de acordo com o terceiro aspecto da invenção podem compreender pôr em contacto uma amostra do doente com um anticorpo da invenção, e avaliar quanto à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente é diagnóstico de cancro, e em particular de doença metastática, no doente. A ligação do anticorpo à amostra do doente pode ser avaliada por qualquer técnica relevante conhecida dos especialistas na técnica, e uma técnica adequada pode ser seleccionada pelo especialista tendo em consideração a natureza de qualquer unidade repórter que possa estar ligada ao anticorpo 10 marcado. As unidades repórter adequadas que podem ser utilizadas como etiquetas ligadas aos anticorpos da invenção são consideradas noutra parte da especificação.

Entender-se-á que a maior sensibilidade dos ensaios de diagnóstico aqui divulgados tem um número de vantagens. A mais importante destas vantagens é que os ensaios de diagnóstico da invenção podem permitir ao utilizador um maior grau de confiança no resultado de diagnóstico do que em resultados proporcionados por ensaios da técnica antecedente. A maior sensibilidade dos ensaios da invenção permite a detecção de AGR2 em amostra do doente a níveis mais baixos do que tem sido anteriormente o caso. Isto permite diagnósticos mais precoces de cancro e em particular de doença metastática, do que tem sido possível utilizando os métodos da técnica antecedente, e permite por isso que o tratamento comece mais cedo após o aparecimento da doença. Iniciar o tratamento mais cedo é importante para se conseguir máxima eficácia terapêutica e para, desse modo, aumentar as hipóteses de sobrevivência de um doente. A detecção diagnóstico de AGR2 utilizando os ensaios da invenção também permite a selecção de regimes terapêuticos apropriados para o tratamento de cancro e, em particular de, de doença metastática, que afecta o doente. Em particular, as observações dos inventores sugerem que os doentes nos quais o cancro (em particular a doença metastática) provoca a expressão de AGR2 podem estar sujeitos a uma sobrevivência mais curta do que doentes equivalentes que não expressam AGR2. Este efeito parece particularmente assinalável no caso de doentes com receptor de estrogénio+ (ER+) tratados com tamoxifeno. Esta observação indica que a expressão de AGR2, a qual pode ser determinada com maior certeza e sensibilidade utilizando os ensaios da invenção, é indicativa de uma forma de doença 11 metastática que é aparentemente menos grave, e caracterizada por ER+ que não respondem bem a terapia hormonal. Por conseguinte, o diagnóstico utilizando os ensaios da invenção podem levar a que um clinico com responsabilidade pelo doente diagnosticado evite a terapia hormonal, e em vez disso escolha terapias alternativas que tenham provavelmente maiores resultados benéficos.

Finalmente, a maior sensibilidade conferida pelos ensaios da invenção significa que uma observação de que não está a ser expressada AGR2 pode ser aceite com maior confiança como prova da ausência de doença metastática. Assim, doentes que recebem um diagnóstico de que não está presente doença metastática (ou já não está presente após intervenção terapêutica bem sucedida) podem ter uma maior confiança de que esta observação é de facto correcta.

Além das utilizações de diagnóstico descritas acima, os anticorpos monoclonais da invenção também são susceptiveis à utilização em ensaios de prognóstico que podem ser utilizados para avaliar o risco do doente ter um resultado clinico adverso devido ao desenvolvimento de cancro, e em particular de cancro metastático. Um estudo por Innes et al. (2006) indica que os doentes ER+ que exibem expressão de AGR2 tendem a sofrer de sobrevivência reduzida em comparação com doentes semelhantes nos quais está ausente AGR2. O referido estudo divulga um anticorpo policlonal específico para AGR2 e não para AGR3.

Em particular, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados em ensaios de prognóstico que proporcionam uma indicação do grau de satisfação com que um doente com cancro, e em particular cancro metastático, responderá ao tratamento da doença. Os ensaios de prognóstico de acordo com o quarto aspecto da invenção podem compreender pôr em 12 contacto uma amostra do doente com um anticorpo da invenção, e analisar em relação à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente indica que é pouco provável que o doente responda favoravelmente ao tratamento de doença metastática. Tais doentes podem beneficiar de tratamento utilizando regimes terapêuticos rigorosos. Os detalhes dos regimes de tratamento rigorosos adequados que podem ser utilizados para tratar cancro metastático podem ser determinados relativamente aos tecidos ou órgãos específicos afectados pela doença metastática. Os critérios apropriados para selecção de regimes adequados serão evidentes para um especialista na técnica e podem ser, por exemplo, seleccionados por um clínico responsável pelo doente.

Os inventores julgam que os ensaios da invenção podem ser utilizados em prognóstico uma vez que pode ocorrer expressão detectável de AGR2 antes do desenvolvimento de cancro clinicamente detectável, e em particular de doença metastática. Além disso, os inventores julgam que a expressão de AGR2 por metástases poderia afectar o comportamento ou desenvolvimento das metástases. Além disso, a AGR2 pode ser detectável em amostras de doentes antes do desenvolvimento de cancro, e em particular de doença metastática, clinicamente reconhecível. Assim, os ensaios de prognóstico da invenção podem permitir a identificação da presença de AGR2 e, deste modo, um doente tem uma maior probabilidade de uma sobrevivência mais curta em consequência do cancro ou doença metastática. 0 reconhecimento da maior probabilidade de um doente para sobrevivência reduzida resultante de doença metastática pode permitir intervenção profiláctica (para prevenir o desenvolvimento adicional da doença) e/ou uma maior monitorização do desenvolvimento de doença metastática para 13 permitir que o tratamento seja iniciado mais cedo após o aparecimento de doença.

Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em ensaios de prognóstico ou ensaios de diagnóstico como descrito noutra parte da especificação. Os inventores julgam que os ensaios utilizando os anticorpos monoclonais da invenção podem ser, em particular, utilizados na avaliação diagnóstica ou prognóstica de cancros seleccionados do grupo consistindo de: cancro da próstata; cancro do ovário; e cancro pancreático. Pode preferir-se que as avaliações destes cancros seleccionados sejam realizadas utilizando ensaios da invenção, como descrito noutra parte da especificação.

Os inventores constataram surpreendentemente que os anticorpos monoclonais da invenção também podem ser utilizados no prognóstico ou diagnóstico de doenças que não o cancro. Em particular, os inventores acreditam que os anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados para a avaliação prognóstica ou diagnóstica de doenças inflamatórias. A artrite reumatóide representa um exemplo particularmente preferido de uma tal doença inflamatória que pode ser avaliada em termos de prognóstico ou diagnóstico utilizando anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção.

Um ensaio prognóstico ou diagnóstico para uma doença inflamatória pode compreender obter uma amostra do doente; pôr em contacto a amostra do doente com um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especif icamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2); e analisar em relação à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente é 14 prognóstico ou diagnóstico de uma doença inflamatória no doente.

Qualquer amostra de doente que possa conter proteína AGR2 pode ser utilizada nos ensaios de prognóstico ou diagnóstico da invenção (quer com respeito ao cancro e doença metastática ou doenças inflamatórias). Estas podem incluir amostras essencialmente acelulares, como urina, fluido cerebrospinal ou linfa, nas quais possa estar depositada AGR2. Preferencialmente, uma amostra adequada pode ser uma amostra compreendendo células capazes de expressar AGR2. Exemplos de tais amostras incluem amostras de sangue ou amostras (como amostras de biopsia) retiradas de outros tecidos. Os inventores constataram que amostras histológicas ou amostras de criotomia podem ser de utilidade particular nos ensaios de prognóstico ou diagnóstico da invenção.

Os anticorpos e ensaios da invenção podem ser utilizados em prognóstico ou diagnóstico em relação a muitas formas de cancro. Formas particulares de cancro que podem ser vantajosamente investigadas utilizando os anticorpos ou ensaios da invenção incluem cancro metastático; cancro da próstata; cancro do ovário; e cancro pancreático; cancro da mama; cancro do estômago; cancro do esófago; e cancro do cólon. Entender-se-á que a utilização dos anticorpos e ensaios da invenção em diagnóstico pode ser particularmente útil no caso de cancros que possam ser difíceis de diagnosticar de outro modo, incluindo cancros em sítios "interiores" do corpo (isto é, não palpáveis do exterior do corpo), como o cancro pancreático ou cancro do ovário; cancros que, de outro modo, podem permanecer "assintomáticos" por períodos prolongados, como o cancro do estômago; ou cancros nos quais a AGR2 parece estar extremamente expressada; como os cancros do cólon. 15

Será geralmente preferido que os ensaios da invenção, quer de prognóstico ou diagnóstico, sejam utilizados com respeito a amostras de doentes humanos.

Os ensaios da invenção podem utilizar qualquer meio adequado para detectar a ligação de um anticorpo ao seu antigénio que são conhecidos dos especialistas na técnica. Os métodos adequados podem ser seleccionados em relação à natureza de qualquer unidade repórter utilizada para marcar os anticorpos da invenção. As técnicas adequadas incluem, mas não se limitam de modo algum a, citometria de fluxo (como citometria de fluxo activada por fluorescência FACS) e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), e ensaios utilizando nanoparticulas. É particularmente preferido que um ensaio da invenção seja um que envolva imunocitoquimica no qual as células tumorais são expostas a um anticorpo da invenção, e o nível de marcação das células avaliado. Uma maior marcação de células será geralmente indicativa de um mau resultado clínico. Pode realizar-se uma análise estatística adequada dos resultados de tais ensaios segundo os testes delineados no Exemplo 2 da secção de Resultados Experimentais. A invenção também proporciona, num quinto aspecto, um hibridoma capaz de produzir um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2.

Um "hibridoma da invenção" pode ser qualquer hibridoma produzido segundo os métodos da invenção.

Preferencialmente, um hibridoma da invenção será um hibridoma capaz de produzir um anticorpo monoclonal da invenção. 0 hibridoma depositado como PZ7A10F10 sob o 16 Número de Adesão 06082201 representa um exemplo particularmente preferido de um hibridoma da invenção.

Um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal da invenção pode ser preparado por aplicação de um procedimento de imunização de rotina utilizando o fragmento peptídico KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2 como um antigénio de sensibilização, seguido de um procedimento de fusão de células utilizando uma técnica de fusão de células de rotina, e um procedimento de clonagem utilizando uma técnica de clonagem de rotina.

Num exemplo adequado, um animal não humano, tal como um rato, ratazana, coelho, porquinho-da-índia, porco, ovelha, cabra ou galinha pode ser o animal a ser imunizado. Preferencialmente, o animal a ser imunizado é um rato ou ratazana, e muito preferencialmente um rato. Pelo facto de as células de mieloma utilizadas como células homólogas para a fusão de células serem geralmente provenientes de ratos, pode ser particularmente preferido imunizar ratos quando se selecciona a fonte de células produtoras de anticorpo. 0 fragmento peptídico KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2), correspondente aos resíduos de aminoácidos 26 a 40 da AGR2 de comprimento total, é utilizado como o antigénio de sensibilização. Este antigénio pode ser administrado por qualquer via adequada (por exemplo, por via intraperitoneal, subcutânea ou na planta da pata) para gerar uma resposta imunológica no animal imunizado. Preferencialmente, o antigénio imunizante pode ser administrado por injecção subcutânea. O especialista compreenderá que os anticorpos da invenção podem ser gerados utilizando fragmentos de AGR2 compreendendo a Sequência ID N° 2 (incluindo a AGR2 de comprimento total) como um imunogénio, seguido de selecção 17 dos hibridomas que produzem um anticorpo que se liga a um epitopo dentro de KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2).

Os anticorpos da invenção podem ser gerados utilizando AGR2 de espécies que não a humana (ou sequências correspondentes de proteínas equivalentes de espécies não humanas) desde que sejam produzidos anticorpos possuindo a especificidade de ligação necessária. A imunização para produzir anticorpos da invenção pode ser realizada utilizando qualquer método adequado conhecido do especialista. Por exemplo, um método adequado pode compreender a administração de uma dose adequada de KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) diluída e suspensa num veículo como soro fisiológico tamponado com fosfato, soro fisiológico ou semelhantes, a animais receptores numa base semanal durante um a três meses.

Uma vez concluído um regime de imunização adequado, as células do baço, linfócitos, células de sangue periférico ou outras células produtoras de anticorpo podem ser colhidas dos animais imunizados. Em geral podem ser preferencialmente utilizadas células do baço, excisadas após a última administração do antigénio sensibilizador como as células produtoras de anticorpo. Em qualquer um dos casos, as células produtoras de anticorpo colhidas podem ser depois submetidas a fusão de células com estirpes particulares de células de mieloma, uma linha de células tumorais, para preparar células hibridomas.

Uma gama de linhas de células de mieloma adequadas que pode ser utilizada na produção de células hibridomas será conhecida do especialista. Por exemplo, as linhas de células, como as células P3-NSI/l-Ag4-l (abreviadamente, células NS-1) (Kõhler et al., Eur. J. Immunol., 6:511 18 (1976)), células SP2/0-Agl4 (abreviadamente, células SP2) (Schulman et al., Nature, 276 :269 (1978)) e células FO (deSaint Groth et al., J. Immunol. Meth., 35:1 (1980)) são todas adequadas para serem utilizadas para produzir hibridomas de acordo com a presente invenção. Pode ser preferido utilizar células SP2. A fim de facilitar a recuperação do anticorpo de interesse de um sobrenadante produzido pela cultura do hibridoma, pode ser preferível utilizar uma linha de células de mieloma que não segregue a imunoglobulina inerente às células de mieloma. Por exemplo, pode ser preferido utilizar células NS-1 como células de mieloma para a fusão de células.

Os métodos pelos quais uma célula produtora de anticorpo e uma célula de mieloma podem ser fundidas são agora uma questão de procedimento de rotina para os especialistas na técnica. Simplesmente a título de exemplo, a fusão de células pode ser conseguida segundo o protocolo utilizado por Kõhler e Milstein (Kõhler et al., 1975, Nature, 256;495). O procedimento de fusão de células pode ser realizado num meio nutriente corrente na presença de um promotor de fusão. O promotor de fusão adequado que pode ser utilizado para produzir hibridomas de acordo com a presente invenção inclui, polietileno glicol (PEG) ou vírus Sendai. O PEG adequado pode ter uma massa molecular média entre 1 000 e 6 000. A fusão de células é realizada utilizando células produtoras de anticorpo e células de mieloma misturadas numa proporção predeterminada. As proporções adequadas podem variar de cerca de 1:1 até cerca de 10:1. Pode utilizar-se RPMI 1640 como um meio de cultura no qual pode ocorrer a fusão de células, uma vez que este meio favorece o crescimento de células de mieloma. 19 A fim de efectuar a fusão de células, os dois tipos de células (células produtoras de anticorpo e mielomas) podem ser misturados em RPMI 1640 e mantidos em condições normais de cultura de células. Pode ser então adicionada uma solução de polietileno glicol numa concentração de 30 a 60% (m/v) para iniciar a fusão de células. Finalmente, uma vez ocorrida a fusão de células, pode adicionar-se um volume adicional de um meio adequado e o hibridoma produzido recuperado por centrifugação para remover o sobrenadante. O hibridoma recuperado pode ser seleccionado por cultura num meio de selecção corrente, como o meio HAT, que contém hipoxantina (H), aminopterina (A) e timidina (T). A cultura em meio HAT pode ser prosseguida durante um período entre vários dias e algumas semanas até terem sido mortas todas as células à excepção do hibridoma.

Quando é confirmada a presença de colónias do hibridoma, o sobrenadante cultivado pode ser rastreado para a presença do anticorpo monoclonal. O rastreio adequado para o anticorpo no sobrenadante da cultura pode ser, por exemplo, realizado analisando a actividade de anticorpo no sobrenadante da cultura por uma técnica de ELISA utilizando células imobilizadas como o antigénio (Ando Tamie et al., Introduction to Monoclonal Antibody Experiment Protocols, K dansha Scientific (1993), p. 126). Entender-se-á que as células adequadas para serem utilizadas numa tal técnica deveriam ser aquelas que expressam AGR2, como as células metastáticas de cancro. Uma vez confirmada a presença do hibridoma e do anticorpo monoclonal desejado, o hibridoma pode ser clonado para propagação subsequente utilizando técnicas bem conhecidas (por exemplo clonagem de anel ou clonagem por diluição limitante). 20

Seguindo os métodos descritos acima permite a produção, isolamento e clonagem de um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal da invenção. As técnicas adequadas para a manutenção de hibridomas são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Por exemplo, os hibridomas podem ser cultivados e subcultivados utilizando meios de cultura de células conhecidos, como o RPMI 1640 ou o meio essencial de Dulbecco modificado (DMEM). Amostras de hibridomas produzidos do modo descrito acima e que produzem o anticorpo monoclonal da invenção podem ser conservadas em azoto liquido antes de serem descongeladas para utilização futura.

Os hibridomas da invenção são adequados para serem cultivados em grande escala, para facilitar a produção de grandes quantidades dos anticorpos da invenção. Os hibridomas da invenção podem, por exemplo, ser cultivados em soro fetal de vitelo a 15% (FCS)-RPMI 1640 e os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados do sobrenadante da cultura.

Como uma alternativa, os hibridomas da invenção podem ser injectados por via intraperitoneal em ratos experimentais para formar tumores asciticos. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser depois preparados a partir do liquido ascitico.

Os anticorpos monoclonais da invenção, preparados seja de que forma for, podem ser purificados utilizando técnicas de purificação de anticorpo bem conhecidas. Os exemplos adequados de tecnologia de purificação de anticorpo que podem ser utilizados para purificar os anticorpos da invenção compreendem precipitação (separação por adição de sal) com sulfato de amónio ou semelhantes, cromatografia de troca iónica utilizando um derivado de éster de dietilamino 21 (DEAR), um derivado de carboximetilo (CM), ou semelhantes, cromatografia de hidroxiapatite, cromatografia de filtração de gel e cromatografia de afinidade utilizando Proteína A ou Proteína G, entre outras, incluindo ligação ao antigénio contra o qual o anticorpo foi criado. Entender-se-á que podem ser utilizadas combinações das técnicas sugeridas acima na purificação do anticorpo monoclonal. A invenção também proporciona um método para a preparação de um anticorpo monoclonal da invenção, compreendendo o método a imunização de um animal com o péptido KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) e em seguida o rastreio e isolamento do anticorpo. A invenção também proporciona um método para a preparação de um hibridoma que produz um anticorpo da invenção, compreendendo o método a imunização de um animal com o péptido KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2), obtendo-se uma célula produtora de anticorpo do animal imunizado; e a fusão da célula produtora de anticorpo com uma célula de mieloma. 0 especialista compreenderá prontamente que os anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados para gerar fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio. Estes podem ser gerados por manipulação dos anticorpos monoclonais existentes ou utilizando os anticorpos monoclonais como um molde para a produção de fragmentos adequados. Os mecanismos pelos quais tais fragmentos podem ser produzidos serão bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Meramente a título de exemplo, os Fab, F(ab')2 e outros fragmentos imunorreactivos, podem ser obtidos digerindo o anticorpo monoclonal da invenção com uma enzima proteolítica que não decomponha o sítio de ligação ao 22 antigénio (Fab), como a papaína, pepsina ou semelhantes. Os fragmentos de ligação a antigénio assim gerados podem ser depois isolados e purificados utilizando técnicas de rotina. Os fragmentos de ligação a antigénio com a especificidade dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados do mesmo modo que os próprios anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais, ou fragmentos de ligação a antigénio, de acordo com a invenção podem ser utilizados num número de ensaios (incluindo, mas não se limitando a ensaios de diagnóstico e prognóstico da invenção), nos quais pode ser benéfico ser-se capaz de obter informação sobre a localização ou ligação do anticorpo ou fragmento. Nesses casos pode preferir-se que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio, seja marcado utilizando uma unidade repórter. Tais unidades repórter podem estar directa ou indirectamente ligadas a um anticorpo da invenção.

As unidades repórter adequadas serão bem conhecidas dos especialistas na técnica, assim como o serão os métodos através dos quais elas podem ser ligadas aos anticorpos da invenção. Uma unidade repórter adequada pode ser seleccionada do grupo consistindo de uma unidade fluorescente; uma unidade luminescente; uma unidade bioluminescente; um material radioactivo; um grupo protético; um grupo colorimétrico; nanopartículas com propriedades detectáveis adequadas e uma unidade cromogénica.

Meramente a titulo de exemplo, e sem restrição, as unidades fluorescentes adequadas podem ser seleccionadas do grupo consistindo de: isotiocianato de fluoresceína (FITC); rodamina (TRITC); ficoeritrina; aloficocianina; cumarina (AMCA); vermelho do Texas; e cianina (Cy2, Cy3 ou Cy5). 23

Outras unidades fluorescentes adequadas que podem ser utilizadas na marcação de anticorpos da invenção serão prontamente evidentes para o especialista.

Uma marcação adequada de anticorpos da invenção com FITC pode ser conseguida utilizando o protocolo seguinte. 0 anticorpo da invenção é preparado como uma solução a 2 mg/mL em carbonato de sódio 0, 1M (pH 9,0) . 0 FITC é dissolvido em DMSO a 1 mg/mL e adicionado lentamente à solução de anticorpo (a uma concentração de cerca de 50pg de FITC por mL de anticorpo). A mistura de anticorpo e FITC é incubada no escuro durante 8 horas a 4 graus. Depois da conclusão desta primeira incubação, adiciona-se NH4C1 a 50 mM e a mistura resultante é incubada durante 2 horas a 4 graus. Finalmente, adiciona-se xileno cilanol e glicerol a 0,1 % e 5% respectivamente. O anticorpo da invenção marcado pode ser depois separado por filtração de gel.

Para os efeitos da presente descrição, unidades luminescente e bioluminescente podem ser consideradas como abrangendo unidades que têm elas próprias propriedades luminescentes e unidades capazes de dar origem a produtos luminescentes. Luminol representa um exemplo adequado de uma unidade luminescente que pode ser utilizada para marcar anticorpos da invenção. A luciferase proporciona um exemplo de uma unidade bioluminescente (neste caso uma unidade capaz de gerar um produto luminescente) que pode ser utilizada para marcar anticorpos da invenção.

Os materiais radioactivos adequados que podem ser utilizados para marcar anticorpos da invenção serão evidentes para o especialista. Meramente a título de exemplo ilustrativo, os materiais radioactivos adequados podem incluir radioisótopos seleccionados do grupo consistindo de: 125I; 131I; 35S; 3H; 14C; 32P; 99mTC e niIn. 24

Um anticorpo da invenção pode ser marcado utilizando grupos protéticos que se ligam um ao outro com especificidade elevada. Um exemplo de um tal grupo protético adequado que será bem conhecido dos especialistas na técnica é a biotina. Um anticorpo da invenção pode ser marcado com biotina e o anticorpo biotinilado exposto a um parceiro de ligação especifico para a biotina (por exemplo avidina ou estreptavidina). 0 parceiro de ligação pode ser portador de uma etiqueta separada, tal como uma etiqueta fluorescente.

As unidades colorimétricas que podem ser utilizadas para marcar anticorpos da invenção incluem, mas não se limitam a: ouro coloidal; e esferas de vidro ou plástico coloridas (por exemplo, polistireno, polipropileno, látex ou semelhantes).

Exemplos de unidades cromogénicas que podem ser utilizadas para marcar anticorpos da invenção incluem enzimas cromogénicas tais como: peroxidase de rábano-silvestre e fosfafatase alcalina. Vários substratos que podem ser utilizados para gerar produtos detectáveis representativos de actividade destas enzimas são bem conhecidos e estão, de facto, comercialmente disponíveis de muitos fornecedores de reagentes para laboratório.

Além da marcação directa de anticorpos da invenção, na qual as unidades repórter podem ser ligadas directamente ao anticorpo ou ao fragmento de ligação a antigénio, os anticorpos da invenção também podem ser marcados utilizando técnicas de marcação indirecta. Os métodos pelos quais os anticorpos, como os anticorpos da invenção, podem ser marcados indirectamente são bem conhecidos dos técnicos médios na matéria. 25

Uma maneira adequada através da qual os anticorpos da invenção podem ser marcados indirectamente é por meio de uma estratéqia de "anticorpo primário"/"anticorpo secundário". Resumidamente, numa tal estratégia o anticorpo da invenção não marcado é utilizado como um "anticorpo primário" capaz de se ligar a AGR2 numa amostra (por exemplo, uma amostra do doente). Um "anticorpo secundário" marcado (escolhido para reagir exclusivamente com o anticorpo da invenção e não com outros materiais na amostra) é então utilizado para se ligar ao anticorpo primário. Deste modo, o anticorpo da invenção não marcado é ligado eficazmente à etiqueta ligada ao anticorpo secundário. A marcação de anticorpos da invenção (quer directa ou indirectamente) permite a detecção destes anticorpos. Tipicamente as moléculas não ligadas portadoras da etiqueta escolhida (como os anticorpos directamente marcados ou anticorpos secundários não ligados) serão removidas da amostra pelo que permanece essencialmente apenas a etiqueta associada a anticorpos da invenção ligados. A detecção da etiqueta é então considerada como representando a detecção de anticorpos da invenção ligados. Os meios pelos quais a etiqueta será detectada dependerão da natureza da etiqueta seleccionada. Por exemplo, uma etiqueta fluorescente será detectada iluminando a amostra (contendo o anticorpo da invenção ligado) com luz ao comprimento de onda de excitação da etiqueta fluorescente e detectando a presença de luz ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo seleccionado.

Um anticorpo marcado com uma enzima cromogénica pode ser detectado incubando a amostra (contendo o anticorpo da invenção ligado) com um substrato cromogénico da enzima 26 seleccionada e detectando quanto à presença do produto corado como resultado da acção da enzima no substrato.

Os modos pelo quais os anticorpos da invenção que foram marcados utilizando unidades repórter alternativas podem ser detectados serão bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Noutras formas de realização, a invenção também proporciona estojos para serem utilizados em ensaios de diagnóstico ou prognóstico da invenção, compreendendo os estojos um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antigénio daquele, da invenção. Entender-se-á que tais estojos podem ser utilizados no prognóstico ou diagnóstico de uma ou mais doenças seleccionadas do grupo consistindo de: cancro; (e em particular cancro metastático; cancro da próstata; cancro do ovário; cancro pancreático; cancro da mama; cancro do estômago; cancro do esófago; ou cancro do cólon); uma doença inflamatória em geral; e artrite reumatóide em particular. Os estojos de acordo com a presente invenção também podem incluir componentes adicionais. Tais componentes podem incluir, por exemplo, pelo menos um item seleccionado do grupo consistindo de: materiais de instrução (em qualquer forma, incluindo impresso ou materiais legíveis por computador); reagentes para utilização na detecção da ligação do anticorpo (incluindo reagentes, como anticorpo secundários marcados, que podem ser utilizados na visualização dos anticorpos da invenção ligados); reagentes para serem utilizados na incubação do anticorpo (como soluções que podem ser utilizadas para a diluição de anticorpos primários ou secundários, ou reagentes para serem utilizados em protocolos de marcação cromogénica) ; e agentes para a visualização dos núcleos de células. Os anticorpos secundários marcados preferidos incluem anticorpos marcados fluorescentemente e anticorpos 27 marcados com um agente cromogénico. 0 anticorpo da invenção pode ser proporcionado como um de um painel de reagentes (tais como anticorpos adequados diferentes daqueles da invenção) que têm utilidade em prognóstico ou diagnóstico a serem incluídos num estojo de acordo com a invenção. A invenção também proporciona um substrato sólido ao qual está ligado um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio, da invenção. Por exemplo, o substrato pode compreender uma matriz compreendendo anticorpos da invenção. Os substratos adequados também podem incluir microesferas. Entender-se-á que os anticorpos da invenção podem ser proporcionados num substrato sólido como um de um painel de reagentes (incluindo anticorpos diferentes daqueles da invenção) que têm utilidade em prognóstico ou diagnóstico.

Os inventores julgam que os anticorpos da invenção podem ser capazes de bloquear a função de AGR2 expressada por células tumorais. Dada a especificidade excepcionalmente elevada dos anticorpos da invenção (como ilustrada pela sua maior utilidade em prognóstico e diagnóstico por comparação com os anticorpos anteriormente divulgados), estes anticorpos podem representar agentes terapêuticos extremamente promissores, uma vez que eles podem visar a AGR2 sem bloquear a função de componentes relacionados que não estejam envolvidos na progressão de cancro. Por conseguinte, a invenção proporciona um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2 para ser utilizado como um medicamento. 0 anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio, a ser utilizado neste aspecto da invenção pode ser preferencialmente um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma PZ7A10F10. 28

Os medicamentos fabricados utilizando os anticorpos da invenção podem ser úteis no tratamento de cancro e na prevenção e/ou tratamento de doença metastática (em que a capacidade dos anticorpos para bloquear a função AGR2 pode ajudar a prevenir a proqressão e disseminação de metástases). As modificações adequadas dos anticorpos da invenção que vão ser utilizados como agentes terapêuticos serão evidentes dos especialistas na técnica. Meramente a titulo de exemplo, pode ser preferido utilizar fragmentos de tais anticorpos no caso de se desejar atingir actividade intracelular que conduza a um efeito terapêutico. Adicional ou alternativamente, pode pretender-se "humanizar" os anticorpos (como considerado noutra parte da especificação) para reduzir a probabilidade de efeitos secundários indesejados provocados pela resposta imunológica do doente ao anticorpo exógeno.

Os anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação a antigénios de tais anticorpos, também podem ser utilizados na prevenção e/ou tratamento de doenças inflamatórias. A sequência de aminoácidos de AGR2 (Sequência ID N° 1) é ilustrada na secção de Informação de Sequências, juntamente com a sequência de aminoácidos do antigénio sensibilizador Sequência ID N° 2, um fragmento peptidico de AGR2. Os resíduos de aminoácido 1-20 da Sequência ID N° 1 constituem uma sequência de sinal secretor. O fragmento peptidico mostrado na Sequência ID N° 2 compreende os aminoácidos 26-40 da Sequência ID N° 1. A invenção será agora ainda descrita relativamente aos seguintes Resultados e Figuras Experimentais nos quais: 29

Figura 1 ilustra os resultados de transferência de western para determinar a especificidade do anticorpo monoclonal anti-AGR2 produzido segundo o Exemplo 1. A pista 1 mostrada na Figura 2 foi carregada com 0,5 pg de AGR2, enquanto a pista 2 foi carregada com 0,5 pg de AGR3. A ligação do anticorpo (detectada por quimioluminescência) indica que o anticorpo monoclonal se liga fortemente à AGR2 (mostrado pelo sinal forte na pista 1) mas não se liga à AGR3 (indicado pela falta de sinal na pista 3).

Figura 2 mostra a imunocitoquimica de amostras de tumor primário de doente utilizando um anticorpo monoclonal da invenção para marcar a AGR2. Painel 2A: mama normal; Painel 2B: uma secção de tumor que mostra revelação negativa para AGR2; Painel 2C: uma secção de tumor que mostra revelação positiva das células de carcinoma; Painel 2D: uma amplificação mais elevada de 2C que mostra uma revelação imunocitoquimica forte para AGR2. A seta indica as células tumorais que deram positivas quando reveladas em relação a AGR2 utilizando o anticorpo da invenção. Ampliação A-C 40x; D 12 5x.

Figura 3 mostra a frequência da categoria de revelação (de acordo com o Quadro 1) de diferentes amostras de carcinoma utilizando um anticorpo de acordo com a invenção. Carcinomas primários de 320 doentes foram revelados imunocitoquimicamente em relação a AGR2 com o anticorpo monoclonal da invenção.

Figura 4 mostra os tráficos de sobrevivência para cada categoria de revelação utilizando o anticorpo da invenção. A proporção cumulativa sobrevivente representa a percentagem de sobrevivência de doentes em cada categoria de revelação a cada 12 meses ao longo do período de estudo 30 de 240 meses. Foram avaliados 315 doentes. (a, ) doentes com revelação negativa em relação a AGR2 (-), 100% para 107 doentes; (b, -----) doentes com revelação na fronteira ( + /-), 100% para 93 doentes; (c, - - -) doentes com 5-25% de revelação (+), 100% para 61 doentes; (d, - - --) doentes com 25-50% de revelação (++) , 100% para 26 doentes e (e, - -) doentes com 50% ou mais de revelação (+++/++++), 100% para 28 doentes. Existiram 103 observações censuradas em a (19 mortes de outras causas); 39 observações censuradas em b (16 mortes de outras causas); 17 observações censuradas em c (10 mortes de outras causas); 4 observações censuradas em d (4 mortes de outras causas) e 10 observações censuradas em e (9 mortes de outras causas). Na globalidade os cinco gráficos são muito significativamente diferentes (estatística de Wilcoxon χ2 = 103,157, 4 graus de liberdade, P < 0,0001).

Figura 5 mostra gráficos de sobrevivência para os grupos de revelação negativa (-) , fronteira ( + /-) e todos os positivos (+,++,+++/++++) em relação a AGR2. A proporção acumulativa de doentes sobreviventes representa a percentagem de sobrevivência de doentes em cada categoria de revelação a cada 12 meses ao longo do período de estudo de 240 meses. Foram avaliados 315 doentes, (a, -), doentes com revelação negativa em relação a AGR2 (-) , 100% para 107 doentes; (b, - - -) , doentes com revelação na fronteira ( + /-) , 100% para 93 doentes; (c, ----), doentes com revelação positiva (+,++,++++/++++), 100% para 115 doentes. Existiram 103 observações censuradas em a (19 mortes de outras causas); 39 observações censuradas em b (16 mortes de outras causas) e 31 observações censuradas em c (23 mortes de outras causas). Os três gráficos foram muito significativamente diferentes (estatística de Wilcoxon χ2 =101,49. 2 graus de liberdade, P < 0,0001). 31

Figura 6 mostra gráficos de sobrevivência para os grupos de revelação negativa (-) e para todos os outros grupos de revelação positiva (+/-,+,++,+++/++++) utilizando 1% de nível limiar para a revelação de AGR2. A proporção acumulativa de doentes sobreviventes representa a percentagem de sobrevivência de doentes em qualquer uma das categorias de revelação a cada 12 meses ao longo do período de estudo de 240 meses. Foram avaliados 315 doentes, (a, -) , doentes com revelação negativa em relação a AGR2 (-) . 100% para 107 doentes, {b, -----), doentes com revelação na fronteira (+/-) agrupados com todos os outros grupos de revelação positiva (+,++,+++/++++). 100% para 208 doentes.

Existiram 103 observações censuradas em a (19 mortes de outras causas); e 70 observações censuradas em b (39 mortes de outras causas) . Os dois gráficos foram muito significativamente diferentes (estatística de Wilcoxon χ2 = 97,40, 1 grau de liberdade, P < 0,0001).

RESULTADOS EXPERIMENTAIS EXEMPLO 1: Preparação de um hibridoma produtor de anticorpo especifico para AGR2, e produção e isolamento do anticorpo contra AGR2 1.1 Antigénio Sensibilizador O fragmento peptídico KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2), que representa os resíduos de aminoácido 26 a 40 de AGR2 (como especificado na Sequência ID N° 1) foi sintetizado de novo utilizando procedimentos correntes de síntese. 1.2 Imunização

Quatro ratos, com idades entre as 6 e 8 semanas foram utilizados como animais hospedeiros a serem imunizados. O 32 fragmento peptídico KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) foi utilizado como o antigénio de sensibilização. Aos ratos foi administrado 50 yg/injecção do antigénio de sensibilização KPGAKKDTKDSRPKL por injecção subcutânea. As injecções foram administradas nos dias 0, 21 e 42 (com um reforço final antes da fusão) para estimular uma resposta imunológica contra o antigénio e para desencadear produção de anticorpo. Foi colhido soro pré-imune no dia 0. 1.3 Preparação de vim Hibridoma

Os linfócitos esplénicos do rato com melhor resposta foram fundidos com células de mieloma Sp2/0-Ag-14 utilizando PEG (polietileno glicol) e os hibridomas resultantes aplicados em placas de 96 poços para selecção em HAT. Os hibridomas produtores de IgG foram rastreados contra o antigénio. As colónias positivas foram expandidas, em ensaiadas em relação à produção de anticorpo e reactividade contra o antigénio (péptido) e contra a proteína AGR2 recombinante. Os hibridomas seleccionados foram clonados por diluição limitante e rastreados contra o antigénio (péptido) e contra a proteína AGR2 recombinante. O hibridoma seleccionado foi utilizado para definir o isotipo do anticorpo (Gl; kappa) e para produção e purificação da IgG. 1.4 Determinação da especificidade do anticorpo monoclonal

Figura 1. Transferência de Western do anticorpo seleccionado sobre AGR2 e AGR3. A capacidade do anticorpo monoclonal para se ligar especificamente a AGR2 foi determinada por transferência de western, como se segue. As proteínas AGR2 recombinante purificada (0,5 yg, Pista 1) e AGR3 recombinante (0,5 yg, Pista 2) foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida gel e a transferência em membranas de PVF. 33

Estas membranas foram então bloqueadas com uma solução contendo 5% de leite desnatado e incubadas com uma diluição de 1 para 2 000 do anticorpo monoclonal anti-AGR2 dum dia para o outro.

Após incubação dum dia para o outro, a membrana foi lavada e incubada durante uma hora com um anticorpo anti-rato conjugado com HRP. O anticorpo ligado foi detectado por quimioluminescência com um estojo de ECL e exposição do filtro a película fotográfica.

Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 1. Nesta Figura pode observar-se que a pista 1 mostra um sinal forte com a proteína AGR2 (seta) , mas nenhum sinal com a proteína AGR3. Este resultado indica claramente que o anticorpo monoclonal da invenção, produzido segundo o protocolo delineado acima, é específico para AGR2. EXEMPLO 2: Utilização em diagnóstico do anticorpo contra AGR2 A detecção imunocitoquímica de AGR2 com um anticorpo monoclonal da invenção (produzido como descrito no Exemplo 1), ao contrário de um anticorpo policlonal convencional de coelho conhecido da técnica precedente, possibilita que o limite discriminatório entre tumores com revelação positiva e negativa seja reduzido de 5% para 1% das células de carcinoma reveladas. Embora não pretendem ficar limitados por qualquer hipótese, os inventores acreditam que esta maior sensibilidade resulta em consequência da ausência de reactividade cruzada do anticorpo monoclonal com produtos não relacionados, por exemplo, AGR3. O método de revelação imuno-histoquímica de secções de tecido com anti-AGR2/PZ7A10F10, o anticorpo monoclonal da 34 invenção, é realizada do seguinte modo. Secções histológicas (cortes de 4 pm) em lamelas revestidas com APES (por uma modificação do método de Maddox, P.H. e Jenkins, D.) foram desengorduradas em xileno e re-hidratadas através de etanol para água como anteriormente descrito por Warburton et al. (1982). Foi efectuada a recuperação de antigénio por microondas (Cuevas et al., 1994). As secções foram imersas em tampão de citrato 10 mM, pH 6,0 e submetidas a microondas a 850 watt durante 15 minutos utilizando um forno de microondas doméstico. As lamelas foram deixadas arrefecer durante mais 15 minutos enquanto se mantinham imersas no tampão de citrato. Após recuperação do antigénio, a actividade peroxidase endógena nas secções de tecido foi bloqueada mergulhando as lamelas em metanol a 100% contendo 0,05% (v/v) de H202 durante 20 min à temperatura ambiente (Streefkerk, 1972). Aplicou-se anticorpo monoclonal anti-AGR2/PZ7A10F10 às lamelas a uma diluição de 1:100 em 0,5% de BSA/PBS dum dia para o outro à temperatura ambiente numa câmara de humidade. Foi efectuada revelação imunocitoquimica indirecta utilizando um sistema polimérico marcado com HRP melhorado, comercialmente disponível, o DAKO EnVision+System,peroxidase(DAB) (Dako Ltd, Ely, UK) (Heras, 1995), preparado segundo as instruções do fabricante. As secções foram então lavadas em água corrente antes de serem submetidas a revelação de contraste em Hemalum de Mayer. Aquelas foram em seguida desidratadas através de etanol graduado e xileno e foram montadas em fixador DPX (Merck, Poole, UK).

Utilizando este níveis discriminatórios (tornados disponíveis pelo anticorpo da invenção e ensaios da invenção), a associação da sobrevivência do doente com o tempo foi significativamente diferente entre os tumores revelados positivamente e revelados negativamente. O valor de significância χ2 (χ2) (estatística de Wilcoxon) e o 35 risco relativo (RR) (análise univariada de Cox) foram χ2 = 46,5, RR = 3,8 (95% Cl 2,7-5,3) utilizando o anticorpo policlonal e χ2 = 97,4, RR = 30,5 (95% Cl 11-86) utilizando o monoclonal.

Esta associação muito mais elevada de revelação imunocitoquimica positiva em relação a AGR2 com a morte precoce do doente obtida com o anticorpo monoclonal significa que, quando comparado com outros marcadores convencionais (tamanho do tumor, indice histológico, gânglios linfáticos envolvidos no tumor) e marcadores novos (por exemplo, revelação em relação a S100A4, S100P, osteopontina, c-met, ERa, PgR, p53, catepsina D, c-erbB-2), se tornou na variável de prognóstico independente mais significativa num teste de análise de regressão multivariada de Cox (χ2 = 14,3, P<0,001, RR = 10; 95% Cl 3-33) .

Anteriormente, a contribuição para prognóstico dos marcadores convencionais e novos combinados significava que a revelação em relação a AGR2 utilizando um anticorpo policlonal não estava independentemente associada à sobrevivência, sendo a sua contribuição equilibrada por estes outros marcadores. Assim, os anticorpos monoclonais da invenção, e ensaios da invenção, proporcionam vantagens notáveis em relação à técnica antecedente. EXEMPLO 3: Utilização em diagnóstico do anticorpo anti-AGR2 - segundo estudo

Numa expansão do estudo relatado acima, tecidos de cancro da mama de 320 doentes que sofriam de cancro da mama avançado e foram tratados por mastectomia e mastectomia radical foram investigados utilizando os anticorpos da invenção. Este estudo procurou investigar mais 36 profundamente a utilidade dos anticorpos da invenção em prognóstico e diagnóstico.

Os doentes dos quais as amostras eram provenientes apresentaram-se entre os anos de 1976 e 1982 em clinicas de cirurgia geral na Região de Merseyside do Noroeste de Inglaterra. Este grupo de doentes representava uma imagem razoável da população tal como o tratamento médico livre se encontra disponível no Reino Unido. A gama de idades dos doentes era de 29-92 com uma idade média de 57 anos. Estes doentes foram seguidos durante um período médio de 16 anos com uma gama de 14-20 anos. A sobrevivência dos doentes foi actualizada a 31 de Agosto de 1995. O estudo investigou ainda as relações entre marcação de amostras utilizando os anticorpos da invenção, e as taxas de sobrevivência dos doentes. A marcação imunológica utilizando o anticorpo monoclonal anti-AGR2/7A10 (produzido pelo hibridoma PZ7A10F10) foi efectuada utilizando os protocolos descritos no estudo precedente (resumidamente, marcação imunológica de secções histológicas desengorduradas, sendo o anticorpo primário ligado visualizado por meio do sistema Envision no qual a produção de uma cor castanha indica ligação de anticorpo).

Análise da revelação

Foram observadas manchas castanhas quando estava presente AGR2. A percentagem de células cancerosas reveladas foi determinada utilizando microscopia óptica e este valor utilizado para atribuir a amostra a um de seis grupos, como se mostra no Quadro 1 abaixo. Qualquer marcação imunológica menor de células normais (não tumorais) foi ignorada para os efeitos do estudo. 37

Análise Estatística A análise de sobrevivência foi realizada para determinar quaisquer associações entre os tempos de sobrevivência em cada categoria de revelação no período total de acompanhamento de 240 meses. Foram analisados apenas aqueles doentes que morreram de cancro. As curvas de sobrevivência foram construídas do quadro de vida utilizando gráficos de Kaplan-Meier e os dados de sobrevivência foram analisados utilizando Estatística de Wilcoxon (Gehan). Os doentes que morreram de outras causas que não o cancro e que estavam mortos no final do período de acompanhamento foram excluídos da análise. Foi realizada a análise de regressão univariada de Cox para se obter os valores do risco relativo com intervalos de confiança de 95% para cada uma das categorias que estavam a ser comparadas. Também foi efectuada a análise de regressão multivariada de Cox com todas as variáveis presentes para determinar a significância relativa entre os factores de prognóstico e para investigar se a sobrevivência do doente com AGR2 era independente destes factores de prognóstico. Foi utilizado um procedimento de selecção avançada por passos. Foi utilizada Classificação de Cross para comparar grupos de doentes separados nas categorias negativa (não revelado) e positiva (revelado) para dois marcadores de prognóstico diferentes. Foi efectuado o Teste Exacto de Fisher bilateral para qualquer diferença significativa entre os tumores revelados imunocitoquimicamente em relação a AGR2 e os positivos para marcadores patológicos ou para marcadores imuno-histoquímicos escolhidos (que também se julgava serem de relevância em prognóstico ou diagnóstico). Os marcadores patológicos utilizados incluíram o índice histológico, tamanho do tumor e estado dos gânglios enquanto o grupo do marcador imunocitoquímico incluiu a S100P, osteopontina, receptor de estrogénio a (ERa), c-erbB-2, c-erbB-3, S100A4, receptor de progesterona (PgR), 38 p53, catepsina D, pS2 e c-met no tumor primário. Os dados gerados da marcação da AGR2 utilizando um anticorpo monoclonal da invenção, e os dados gerados no estudo anterior utilizando anticorpo policlonal como uma comparação, foram avaliados em relação à correlação utilizando a função kappa na Classificação de Cross. Foi dado o índice kappa para mostrar se existiam concordâncias possíveis para além do acaso entre duas variáveis. Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o Statistical Package for the Social Sciences versão 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

RESULTADOS

Revelação imunocitoquimica em relação a AGR2 utilizando o anticorpo monoclonal A maioria das mamas normais não era revelada pelo anticorpo monoclonal contra a AGR2 (Figura 2A) embora existissem revelações fracas muito ocasionais de unidades lobulares ductais terminais (Figura 2B). Esta revelação distinguia-se facilmente da revelação observada em células cancerosas marcadas positivamente. A revelação de carcinomas (Figura 2C) estava principalmente localizada no citoplasma que apresentava uma aparência granular e na membrana (Figura 2D) .

As amostras dos carcinomas foram avaliadas quanto à revelação. Os doentes foram divididos em 6 categorias de acordo com a percentagem de células de carcinoma ligadas pelo anticorpo da invenção (em concordância com o Quadro D · O grupo + + + + (mais de 75% de revelação de células de carcinoma) foi agrupado com o grupo +++ (50-75% de 39 revelação) devido ao número relativamente pequeno de amostras nestas duas categorias. Das 320 amostras malignas avaliadas, 110 (34%) não contêm células que ligam o anticorpo da invenção (amostras "não reveladas", mostradas como -), 94 (30%) exibiram ligação do anticorpo da invenção em menos do que 5% das células tumorais presentes ("revelação de fronteira", mostradas como +/-), 62 (19%) exibiram ligação do anticorpo a 5-25% das células tumorais presentes (mostradas como +), 26 (8%) exibiram ligação do anticorpo da invenção a 25-50% das células tumorais presentes (mostradas como ++) e 28 (9%) exibiram ligação do anticorpo da invenção a 50-100% das células tumorais presentes (mostradas como +++) . A Figura 3 mostra as frequências de cada categoria de revelação.

Associação de AGR2 com outras variáveis patológicas e histológicas A revelação imunocitoquimica em relação a AGR2 utilizando anticorpo monoclonal foi avaliada utilizando Classificação de Cross para compará-la com outras variáveis patológicas e imunocitoquímicas. As variáveis patológicas incluíram o índice histológico, tamanho do tumor e estado dos gânglios enquanto as variáveis imunocitoquímicas incluíram a revelação em relação a AGR2 utilizando um anticorpo policlonal, em relação a S100P, osteopontina, receptor de estrogénio α (ERa), c-erbB-2, c-erbB-3, S100A4, receptor de progesterona (PgR), p53, catepsina D, pS2 e em relação a c-met. As comparações foram feitas utilizando quadros dois por dois e foram avaliadas utilizando o Teste Exacto de Fisher (bilateral). A revelação imunocitoquimica em relação a AGR2 foi ajustada a um limiar de 1%, isto é, o grupo fronteira (+/-) foi incorporado nos outros grupos de revelação positiva, deixando o grupo de revelação negativa 40 como aqueles tumores com menos do que 1% de células de carcinoma reveladas. O Quadro 2 mostra a associação da revelação em relação a AGR2 com outras variáveis patológicas. Apenas o estado dos gânglios (P = 0,036) mostrou uma associação significativa com a revelação positiva em relação a AGR2. A comparação também foi feita ao nível limiar de 5% de revelação da AGR2 (não mostrado), isto é, o grupo fronteira (+/-) foi incorporado no grupo de revelação negativa (-) , ficando o grupo de revelação positiva a consistir de todos os carcinomas definitivamente positivos (+,++,+++/++++). Os resultados foram semelhantes; no entanto, o estado dos gânglios mostraram agora apenas uma significância limite (P = 0,056) de associação com a revelação em relação a AGR2. A Classificação de Cross da revelação em relação a AGR2 foi inicialmente efectuada ao nível limiar de 1%. Pelo contrário, a revelação para outros marcadores tumorais que exibiram uma associação com o resultado do doente no cancro da mama foi fixado ao nível que atingiu a correlação mais significativa, geralmente 5%. De todas as variáveis moleculares, a revelação em relação a S100P (P < 0,0001), osteopontina (P < 0, 0001), ERa (P = 0, 002), c-erbB-3 (P = 0,001), S100A4 (P < 0,0001), PgR (P < 0,0001), pS2 (P = 0,004) e c-met (P < 0,0001) mostrou uma associação significativa com uma revelação positiva para AGR2.

Se o nível limiar para a revelação em relação a AGR2 fosse fixado em 5%, a significância dos resultados obtidos foi inferior à do nível limiar de 1% (não mostrada) . Isto indica a relevância prognóstica ou diagnóstica surpreendentemente forte de qualquer ligação do anticorpo da invenção a células tumorais numa amostra do doente. 41 A significância da revelação de AGR2 relacionada com a sobrevivência do doente

Este segundo estudo foi destinado a investigar se a ligação de um anticorpo da invenção a uma amostra do doente (como as células tumorais numa amostra de tumor primário) está associada com a duração da sobrevivência do doente no cancro da mama. Uma duração de sobrevivência reduzida está geralmente associada a doença metastática resultante de tumores primários. Para avaliar a associação foram representadas graficamente e comparadas as curvas de sobrevivência para doentes que apresentam niveis diferentes de ligação do anticorpo a células tumorais nas suas amostras (Figura 4).

Utilizando Estatística de Wilcoxon Gehan, houve uma diferença global significativa nos tempos de sobrevivência de doentes com as 5 categorias diferentes de carcinomas revelados (teste de Wilcoxon χ2 = 103,16, 4 graus de liberdade, P < 0,0001). 96% dos 107 doentes que foram classificados como revelados negativamente (-) estavam vivos no final do estudo com um tempo de sobrevivência mediano de > 216 meses. No grupo de revelação fronteira (+/-), a proporção acumulativa de doentes sobreviventes foi de 38% para 93 doentes e o tempo de sobrevivência mediano foi de 8 7 meses. Para aqueles doentes com tumores que apresentavam 5-25% (+) de revelação positiva utilizando o anticorpo da invenção, a proporção acumulativa sobrevivente foi de 21% e o tempo de sobrevivência mediano foi de 65 meses. Não existiram nenhuns sobreviventes (0%) entre os 26 doentes no grupo com tumores contendo 25-50% (++) de células de carcinoma que ligavam o anticorpo da invenção, e o tempo de sobrevivência mediano foi apenas de 45 meses. Para aqueles doentes cujos tumores continham mais do que 50% de células de carcinoma (+++/++++) que ligavam um 42 anticorpo da invenção, a proporção acumulativa sobrevivente para 28 doentes foi de 21% e o tempo de sobrevivência mediano foi de 52 meses (Figura 4). 0 risco relativo (R.R.) e o seu intervalo de confiança a 95% (95% C.I.) correspondentes a diferentes associações de categoria de revelação são detalhados no Quadro 4.

Na Figura 6, dos 107 doentes cujas células tumorais foram classificadas como não ligando um anticorpo da invenção, 96% dos mesmos sobreviveram até ao final do estudo com um tempo de sobrevivência mediano > 216 meses. A proporção acumulativa sobrevivente para aqueles que apresentaram revelação positiva em relação a AGR2 (+/-,+,++,+++/++++) foi de 26% no final do estudo com um tempo de sobrevivência mediano de 69 meses. O R.R. foi alto a 30,5 com 95% C.I., 11,3-82,5 (Figura 6). Isto ilustra que qualquer ligação de um anticorpo da invenção a células tumorais presentes numa amostra de doente é prognóstica e/ou diagnóstica de doença metastática. Que este é um marcador mais exacto e sensível do que a ligação utilizando outros anticorpos anti-AGR2 conhecidos da técnica precedente é claramente indicado pelos resultados do estudo precedente (no qual a utilidade dos anticorpos de acordo com a invenção em diagnóstico/prognóstico foi comparada com a de anticorpos policlonais conhecidos gerados contra AGR2).

Determinação de se a sobrevivência do doente com AGR2 foi independente de outros factores de prognóstico

Os dados de sobrevivência para amostras contendo células tumorais que se ligam aos anticorpos da invenção e os dados comparáveis de todas as variáveis patológicas e da maioria das variáveis tumorais que foram anteriormente avaliadas utilizando Classificação de Cross foram introduzidos numa análise de regressão múltipla de Cox (Materiais e Métodos). 43 A revelação em relação a AGR2 foi fixada no nivel limiar óptimo de 1% enquanto a revelação para a maioria dos outros parâmetros foi fixada no nivel limiar óptimo de 5% para sobrevivência do doente na análise univariada. As revelações em relação a c-erbB-3 e pS2 foram omitidas da análise, uma vez que elas não mostraram uma correlação significativa com a sobrevivência do doente na análise univariada, neste grupo particular de doentes. A catepsina D foi fixada a um nivel limiar de 1% já que apenas este limiar mostrou significância na análise univariada num estudo anterior com este grupo particular de doentes. De todos os factores investigados, apenas a ligação de um anticorpo da invenção, ou a revelação utilizando osteopontina, c-erbB-2, ERa, c-met e S100A4 foram independentes e relacionaram-se significativamente com os tempos de sobrevivência do doente. Constatou-se que a presença de células que se ligam a um anticorpo da invenção (mostrado como "AGR2") era a variável independente mais significativa em relação à sobrevivência do doente nesta análise (Quadro 5) .

Informação sobre as Sequências

Sequência ID N° 1 (Sequência de aminoácidos de AGR2 humana) mekipvsafl llvalsytla rdttvkpgak kdtkdsrpkl pqtlsrgwgd qliwtqtyee alyksktsnk plmiihhlde cphsqalkkv faenkeiqkl aeqfvllnlv yettdkhlsp dgqyvprimf vdpsltvrad itgrysnrly ayepadtall ldnmkkalkl lktel

Sequência ID N° 2 (Sequência de aminoácidos do antigénio de sensibilização) kpgakkdtkdsrpkl 44

Quadros

Percentagem de células tumorais reveladas (%) Classificação <1 - 1-5 + /- 5-25 + 25-50 + + 50-75 + + + 75-100 + + + +

Legenda do Quadro 1. Classificação de doentes com cancro da mama com base na marcação imunológica do tumor primário utilizando anticorpos da invenção. O sistema utilizado baseou-se na percentagem de células malignas que marcaram positivamente utilizando um anticorpo da invenção.

Quadro 2. Associação da revelação em relação a AGR2 ao nível limiar de 1% com variáveis patológicas.

Teste Exacto de Fisherb Número (%) de Número (%) de AGR2â AGR2a

Variáveis patológicas (n° de doentes) (-) ( + ) (bilateral) Categoria (total 285) Categoria 1,2 67 (75,3) 146 (74,5) 1,000 Categoria 3 22 (24,7) 50 (25,5) Tumor (total 304) Tl, 2 83 (80,6) 150 (74,6) T3,4 20 (19,4) 51 (25,4) 0,256 Gânglios (total 231) Gânglio (-) 48 (63,2) 75 (48,4) 0,036 Gânglio (+) 28 (36,8) 80 (51,6)

Legenda do Quadro 2 â Revelação imunocitoquimica em relação a AGR2 ao nivel limiar de 1%. (-) indica o grupo negativo enquanto (+) indica todos os outros grupos positivos incluindo o grupo de revelação fronteira (+/-). b Teste Exacto de Fisher (bilateral) foi utilizado para avaliar a significância de qualquer associação entre AGR2 e outras variáveis patológicas. Aquelas que foram significativas (P < 0,05) são mostradas a negrito. 45 Quadro 3. Associação da revelação em relação a AGR2 ao nível limiar de 1% com a revelação em relação a marcadores moleculares.

Revelação de variáveis3 moleculares (n° de doentes) S100P (total 280) S100P (-) S100P (+) Osteopontina (total 306) OPN (-) OPN (+) ERa (total 313) ERa (-) ERa (+) C-erbB-2 (total 314) c-erbB-2 (-) c-erbB-2 (+) C-erbB-3 (total 309) c-erbB-3 (-) c-erbB-3 (+) S100A4 (total 318) S100A4 (-) S100A4 (+) PgR (total 305) PgR (-) PgR (+) p53 (total 318) p53 (-) p53 (+) CatepsinaD (total 249) Cat D(-) Cat D (+) Número (%) Número (%) Teste Exacto de de AGR2b de AGR2b Fisherc (-) (+) (bilateral) 82 (82,0) 18 (18,0) 74 (68,5) 34 (31,5) 64 (58,7) 45 (41,3) 87 (80,6) 21 (19,4) 58 (53,7) 50 (46,3) 96 (87,3) 14 (12,7) 79 (75,2) 26 (24,8) 71 (65,1) 38 (34,9) 38(47,5) 42 (52,5) 51 (28,3) 129 (71,7) 29 (14,6) 169 (85,4) 81 (39,7) 123 (60,3) 155 (75,2) 51 (24,8) 67 (33,3) 134 (66,7) 96 (46,2) 112 (53,8) 109 (54,5) 91 (45,5) 122 (58,4) 87 (41,6) <0,0001 <0,0001 0,002 0, 324 0,001 <0,0001 <0,0001 0,277 66 (39,1) 0,218 103 (60,9) 46 46 Revelação de variáveis3 moleculares (n° de doentes) Número (%) Número (%) Teste Exacto de de AGR2b de AGR2b Fisherc (-) (+) (bilateral) pS2 (total 315) pS2 (-) 76 (69,7) 108 (52,4) 0, 004 pS2 (+) 33 (30,3) 98 (47,6) 56 (57,7) 41 (42,3) 28 (15,3) 155 (84,7) <0,0001 C-met (total 280) c-met (-) c-met (+)

Legenda do Quadro 3 3 Revelação imunocitoquímica de variáveis moleculares ao nivel limiar de 5%. - e + /- são agrupados como (-) e +,+ + ,+ + + / + + + + são agrupados como (+). b Revelação imunocitoquimica em relação a AGR2 ao nivel limiar de 1%. (-) indica o grupo negativo e (+) indica todos os outros grupos (+/-,+,+ + ,+ + + / + + + +) . c Teste Exacto de Fisher (bilateral) foi utilizado para avaliar qualquer associação significativa entre a revelação em relação a AGR2 e a revelação em relação a outras variáveis moleculares. Aquelas que foram significativas (P < 0,005) são mostradas a negrito.

Quadro 4. Comparação emparelhada entre cada categoria de revelação em relação a AGR2.

Categorias de revelação 3 x^b d.f c P d V <D 95% C.I. e Global 103,16 4 <0,0001 N. A. N. A. - e + /- 68,19 1 <0,0001 24, 1 8,71-66,6 - e + 84,27 1 <0,0001 33,9 12,1-94,8 + + CD 1 84, 80 1 <0,0001 52,9 18,1-155 - e + + + 60,18 1 <0,0001 36,1 12,2-107 + /- e + 1, 08 1 0,298 1, 41 0,94-2,10 +/- e ++ 4,53 1 0,033 2,20 1,33-3,63 +/- e +++ 1, 71 1 0,192 1,50 0,88-2,56 + e + + 2,36 1 0, 124 1,56 0,93-2,61 + e + + + 0,656 1 0, 418 1,07 0,62-1,84 ++ e +++ 0,026 1 0,871 1,46 0,78-2,73 47

Categorias de χΤΈ d. f c P d R. R. ® 95% C. I. ® revelação a Legenda do Quadro 4 a As categorias de revelação em relação a AGR2 são definidas no Quadro 1 e as comparações emparelhadas correspondem àquelas dos gráficos de sobrevivência da Figura 5. b χ2 teste utilizando estatística de Wilcoxon. c Graus de liberdade. d Valores de probabilidade de χ2. Os valores de P que foram significativos são mostrados a negrito. e Risco relativo de sobrevivência do doente (R.R.) e intervalo de confiança a 95% (95% C.I.) da análise de regressão múltipla de Cox.

Quadro 5. Resultados da análise de regressão múltipla de Cox utilizando todas as variáveis patológicas e a maioria das variáveis moleculares.

Variáveis tumorais a β * SE c d.f. P e R.R. f 95% C.I. f mAGR2 2,30 0,61 14,3 1 <0,0001 10, 0 3,03-33,1 Osteopontina 1,65 0,61 7,31 1 0,007 5, 23 1,58-17,3 c-erbB-2 0,82 0,31 6, 83 1 0,009 2,27 1,23-4,21 ERa -0,65 0,27 5, 59 1 0,018 0,52 0,31-0,90 c-met 1,61 0,76 4, 52 1 0,034 5, 00 1,13-22,0 S100A4 0,54 0,31 2,97 1 0,085 1, 71 0,93-3,16

Legenda do Quadro 5 a Variáveis tumorais que mostraram uma associação significativa e independente com a sobrevivência do doente na análise multivariada. As variáveis que não atingiram um nível significativo independente com a sobrevivência do doente foram S100P, índice histológico, tamanho do tumor, estado dos gânglios, p53, PgR, Catepsina D. b Valor do parâmetro β na análise de regressão múltipla de Cox. c Erro padrão de β. d Estatística χ2 gerada da análise de regressão múltipla de Cox. e Probabilidade de χ2. Global χ2 = 77,83, 7 graus de liberdade, P < 0,0001. f Risco relativo (R.R) para a sobrevivência do doente e intervalo de confiança a 95% (95% C.I.) da análise multivariada. 48

REFERENCIAS

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Warburton, M.J., Mitchell, D., Ormerod, E.J., and Rudland, P.S. Distribution of myoepithelial cells and basement membrane proteins in the resting, pregnant, lactating and involuting rat mammary gland. (1982) J. Histochem. Cytochem., 30: 667-676

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> THE UNIVERSITY OF LIVERPOOL BARRACLOUGH, ROGER BARRACLOUGH, DONG LIU RUDLAND, PHILIP

<120> ANTICORPOS, ENSAIOS e HIBRIDOMAS

<130> P90181PWO <150> GB0616929.6 <151> 2006-08-26 <160> 2 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Glu Lys lie Pro Vai Ser Ala Phe Leu Leu Leu vai Ala Leu Ser 15 10 15

Tyr Thr Leu Ala Arg Asp Thr Thr vai Lys Pro Gly Ala Lys Lys Asp 20 25 30

Thr Lys Asp ser Arg Pro Lys Leu Pro Gin Thr Leu ser Arg Gly Trp 35 40 45

Gly Asp Gin Leu ile Trp Thr Gin Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys 50 55 60 ser Lys Thr Ser Asn Lys Pro Leu Met lie ile His His Leu Asp Glu 65 70 75 80 cys Pro His Ser Gin Ala Leu Lys Lys Vai Phe Ala Glu Asn Lys Glu 85 90 95 50 lie Gin Lys Leu Ala Glu Gin Phe vai Leu Leu Asn Leu Val Tyr Glu 100 105 110 Thr Thr Asp 115 Lys His Leu Ser Pro 120 Asp Gly Gin Tyr val 125 Pro Arg lie Met Phe vai Asp pro Ser Leu Thr val Arg Ala Asp ile Thr Gly Arg 130 135 140 Tyr Ser Asn Arg Leu Tyr Ala Tyr Glu Pro Ala Asp Thr Ala Leu Leu 145 150 155 160 Leu Asp Asn Met Lys Lys Ala Leu Lys Leu Leu Lys Thr Glu Leu 165 170 175

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Lys ργο Gly Ala Lys Lys Asp Thr Lys Asp ser Arg Pro Lys Leu 15 10 15

Lisboa, 19 de Outubro de 2010

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epitopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2.

2. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, da reivindicação 1, o qual não se liga a AGR3; e/ou que se liga ao mesmo antigénio que o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma PZ7A10F10 depositado sob o Tratado de Budapeste e a que foi dado o Número de Adesão 06082201.

3. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento está marcado com uma unidade repórter seleccionada do grupo consistindo de; uma unidade luminescente; uma unidade bioluminescente; um material radioactivo; um grupo protético; uma unidade colorimétrica; nanoparticulas detectáveis; e uma unidade cromogénica; e uma unidade fluorescente, que pode ser seleccionada do grupo consistindo de: isotiocianato de fluoresceina (FITC); rodamina (TRITC); ficoeritrina; aloficocianina; cumarina (AMCA); vermelho do Texas; cianina (Cy2), cianina (Cy3); e cianina (Cy5).

4. Método in vitro para diagnóstico de cancro utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epitopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2).

5. Método de diagnóstico de cancro de acordo com a reivindicação 4, em que o método compreende: 2 pôr em contacto uma amostra do doente com um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especif icamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2); e analisar em relação à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente é diagnóstico de doença metastática no doente.

6. Método in vitro para avaliar a probabilidade de desenvolver cancro utilizando um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2).

7. Método para avaliar a probabilidade de desenvolver cancro de acordo com a reivindicação 6, em que o método compreende: pôr em contacto uma amostra do doente com um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especif icamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2); e analisar em relação à ligação do anticorpo à amostra do doente, em que a ligação do anticorpo à amostra do doente indica que o doente tem uma probabilidade elevada de desenvolver doença metastática.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, em que o cancro é um cancro metastático.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 8, em que a análise da ligação do anticorpo à amostra do doente utiliza uma técnica seleccionada do grupo consistindo de: marcação imunocitoquímica de uma amostra de tecido; um ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA); imunoensaio de quimioluminescência; imunoensaio de 3 fluorescência; e classificaçao de células activada por fluorescência (FACS).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, em que: i) a amostra do doente compreende células tumorais, e o ensaio compreende a análise da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, a células tumorais na amostra do doente; e/ou ii) a amostra do doente é seleccionada do grupo consistindo de: uma amostra de sangue; uma amostra de biopsia; uma amostra histológica; e uma amostra de criotomia; e/ou o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, utilizado é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

11. Estojo compreendendo um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2).

12. Estojo de acordo com a reivindicação 11 compreendendo um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, produzido pelo hibridoma PZ7A10F10 depositado sob o Tratado de Budapeste e a que foi dado o Número de Adesão 06082201; e/ou pelo menos um item seleccionado do grupo consistindo de: material de instrução sobre como utilizar o estojo; reagentes para utilizar na detecção da ligação do anticorpo; reagentes para serem utilizados na incubação do anticorpo; e agentes para visualização dos núcleos das células.

13. Suporte sólido compreendendo um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga 4 especificamente a um epítopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) imobilizado sobre o mesmo.

14. Suporte sólido de acordo com a reivindicação 13 compreendendo um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação a antigénio daquele, produzido pelo hibridoma PZ7A10F10 depositado sob o Tratado de Budapeste e a que foi dado o Número de Adesão 06082201; e/ou em que o suporte sólido é uma matriz.

15. Hibridoma PZ7A10F10 depositado sob o Tratado de Budapeste e a que foi dado o Número de Adesão 06082201.

16. Anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, o qual se liga especificamente a um epitopo dentro da sequência KPGAKKDTKDSRPKL (Sequência ID N° 2) de AGR2 para ser utilizado como um medicamento.

17. Anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigénio daquele, de acordo com a reivindicação 16, para ser utilizado como um medicamento na prevenção e/ou tratamento de cancro e/ou uma doença inflamatória. Lisboa, 19 de Outubro de 2010