JPH04193900A - 網膜芽腫遺伝子産物の抗体とその利用 - Google Patents
網膜芽腫遺伝子産物の抗体とその利用Info
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Classifications
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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-
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-
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
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- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は腫瘍細胞の検出、網膜芽腫遺伝子(RB1)
によってコードされている蛋白に対する抗体、腫瘍中の
RBI蛋白を検出する方法、網膜芽腫遺伝子において欠
損しているいろいろな腫瘍タイプや細胞のタイプでの腫
瘍の進行を診断する方法に関する。
によってコードされている蛋白に対する抗体、腫瘍中の
RBI蛋白を検出する方法、網膜芽腫遺伝子において欠
損しているいろいろな腫瘍タイプや細胞のタイプでの腫
瘍の進行を診断する方法に関する。
従来の技術
ある種の癌における腫瘍の発生は変異によって1つある
いはそれ以上の劣性のrj!!瘍抑制因子」遺伝子がマ
スクされなかった結果と考えられている。網膜芽腫上ウ
ィルム’(Wi 1m)腫瘍の2つの小児癌はこの種の
癌のプロトタイプである。網膜芽腫は20.000回の
出生当り約1回の頻度で起こる希な視覚の悪性化である
。網膜芽腫は遺伝性と特発性の両方に起こり、約40%
が遺伝性である。細胞遺伝学の研究によって網膜芽腫に
関与する染色体領域が130I4であることがわかった
。最近、網膜芽腫遺伝子(RB1)はクローン化され、
配列が決められた。初代の網膜芽腫の少なくとも40%
にRBIに明かな構造的異常があり、その異常のタイプ
は全体の遺伝子の欠失、もつと小さな内部的欠失、転移
、点変異が含まれている。
いはそれ以上の劣性のrj!!瘍抑制因子」遺伝子がマ
スクされなかった結果と考えられている。網膜芽腫上ウ
ィルム’(Wi 1m)腫瘍の2つの小児癌はこの種の
癌のプロトタイプである。網膜芽腫は20.000回の
出生当り約1回の頻度で起こる希な視覚の悪性化である
。網膜芽腫は遺伝性と特発性の両方に起こり、約40%
が遺伝性である。細胞遺伝学の研究によって網膜芽腫に
関与する染色体領域が130I4であることがわかった
。最近、網膜芽腫遺伝子(RB1)はクローン化され、
配列が決められた。初代の網膜芽腫の少なくとも40%
にRBIに明かな構造的異常があり、その異常のタイプ
は全体の遺伝子の欠失、もつと小さな内部的欠失、転移
、点変異が含まれている。
臨床的には、生存している網膜芽腫患者は他の、多くは
骨肉腫であり、繊維肉腫や黒色腫は頻度として少ないよ
うな特殊のタイプの初代腫瘍を起こす危険性が有意に高
い。さらに、病気にかかっていない親族は予想以上に頻
度高く他の癌になり、この癌のタイプはいろいろである
。網膜芽腫患者の二次継代細胞からとったDNAを分析
するとRBI遺伝子の両対立遺伝子にはっきりとした異
常がみられる。
骨肉腫であり、繊維肉腫や黒色腫は頻度として少ないよ
うな特殊のタイプの初代腫瘍を起こす危険性が有意に高
い。さらに、病気にかかっていない親族は予想以上に頻
度高く他の癌になり、この癌のタイプはいろいろである
。網膜芽腫患者の二次継代細胞からとったDNAを分析
するとRBI遺伝子の両対立遺伝子にはっきりとした異
常がみられる。
さらに、網膜芽腫の履歴のない患者からの繊維肉腫や骨
肉腫から採取したDNAまたはRBI遺伝子を欠いてい
る。かくして、RBI遺伝子の機能の欠如はヒトの発ガ
ンにおいて普遍的な役割を持つものだろう。
肉腫から採取したDNAまたはRBI遺伝子を欠いてい
る。かくして、RBI遺伝子の機能の欠如はヒトの発ガ
ンにおいて普遍的な役割を持つものだろう。
RBI遺伝子の機能の欠如は網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉
腫、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部等の癌や軟組織
の癌とも関連している。
腫、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部等の癌や軟組織
の癌とも関連している。
構造的な異常はまた小細胞肺癌(SCLC)の初代培養
では13%、5CLCの継代培養株では18%に検出さ
れている。もつと有意には5CLC細胞系統の60%に
R旧のm−RNAの欠失がみられた。
では13%、5CLCの継代培養株では18%に検出さ
れている。もつと有意には5CLC細胞系統の60%に
R旧のm−RNAの欠失がみられた。
3CLCは網膜芽腫と同様に神経内分泌起源の腫瘍であ
る。RBI遺伝子に対してしばしば変化が起きているこ
とも初代の乳腺癌においてみられている。神経内分泌性
の分化の表現型特性を表わす2つの腫瘍タイプにRBI
遺伝子が関与していることは重要であろう。しかし、乳
腺癌は神経内分泌性ではなく強い家族的な傾向を示し、
その家系はまた非常に強い遺伝的な要素があることを示
している。骨肉腫や軟組織癌の子供の母親が乳腺癌が高
率であるという証拠がある一方、乳腺癌と網膜芽腫との
間に関連があるという何の直接的な証拠はない。
る。RBI遺伝子に対してしばしば変化が起きているこ
とも初代の乳腺癌においてみられている。神経内分泌性
の分化の表現型特性を表わす2つの腫瘍タイプにRBI
遺伝子が関与していることは重要であろう。しかし、乳
腺癌は神経内分泌性ではなく強い家族的な傾向を示し、
その家系はまた非常に強い遺伝的な要素があることを示
している。骨肉腫や軟組織癌の子供の母親が乳腺癌が高
率であるという証拠がある一方、乳腺癌と網膜芽腫との
間に関連があるという何の直接的な証拠はない。
R旧遺伝子産物(RBI蛋白)の構造はRBlcDNA
の配列を解析することから推定されている。
の配列を解析することから推定されている。
もっとも長いRBIリーディングフレームは928アミ
ノ酸残基の蛋白をコードしている。trypE−RB融
合蛋白に対する抗血清を使うと、見かけの分子量が11
0,000から114,000ダルトンの蛋白が免疫沈
降した。RB融合蛋白は燐蛋白である。合成オリゴペプ
チドかまたは細菌で発現したペプチドに対して調製され
た抗血清はRBI蛋白の天然型と信じられる約105キ
ロダルトンの蛋白を免疫沈降する。
ノ酸残基の蛋白をコードしている。trypE−RB融
合蛋白に対する抗血清を使うと、見かけの分子量が11
0,000から114,000ダルトンの蛋白が免疫沈
降した。RB融合蛋白は燐蛋白である。合成オリゴペプ
チドかまたは細菌で発現したペプチドに対して調製され
た抗血清はRBI蛋白の天然型と信じられる約105キ
ロダルトンの蛋白を免疫沈降する。
RBI蛋白をコードしているcDNA配列(第1図に示
されている)は609から615の位置の蛋白中にアミ
ノ酸の配列(VR3PKKK)が存在し、それがSV4
0の大きなT抗原とポリオーマの大きなT抗原にみられ
る核性の転移シグナルを思わせるものである。これはR
B蛋白が核蛋白であることを意味している。RBI蛋白
は核と核分画おのおので細胞成分を分画することによっ
て免疫染色することと細胞画分を確かめることによって
検出できている。
されている)は609から615の位置の蛋白中にアミ
ノ酸の配列(VR3PKKK)が存在し、それがSV4
0の大きなT抗原とポリオーマの大きなT抗原にみられ
る核性の転移シグナルを思わせるものである。これはR
B蛋白が核蛋白であることを意味している。RBI蛋白
は核と核分画おのおので細胞成分を分画することによっ
て免疫染色することと細胞画分を確かめることによって
検出できている。
上記のRBI遺伝子における変異を検出することはDN
AプローブとDNAハイブリダイゼーション法を用いる
ことによってできる。その技術は一般にこの技術分野に
通じるものにはしられたもので、特に1988年lθ月
31日に出願されたアメリカ特許第07/312.77
7号に記載されている。
AプローブとDNAハイブリダイゼーション法を用いる
ことによってできる。その技術は一般にこの技術分野に
通じるものにはしられたもので、特に1988年lθ月
31日に出願されたアメリカ特許第07/312.77
7号に記載されている。
発明が解決しようとする課題
遺伝子の変化を検出するためにDNAハイブリダイゼー
ション法を使うことはRBI遺伝子に欠陥のある一つの
細胞の存在がDNAハイブリダイゼーション法を行うた
めに使われるDNA標品では検出できないのでその感度
で限定される。
ション法を使うことはRBI遺伝子に欠陥のある一つの
細胞の存在がDNAハイブリダイゼーション法を行うた
めに使われるDNA標品では検出できないのでその感度
で限定される。
さらに、DNAハイブリダイゼーション法は時間がかか
り、従って、DNAハイブリダイゼーション法によって
RBI遺伝子の有無を検出することは結果を得るのに必
要な時間の長さによってさらに妨げられる。
り、従って、DNAハイブリダイゼーション法によって
RBI遺伝子の有無を検出することは結果を得るのに必
要な時間の長さによってさらに妨げられる。
今日まで腫瘍組織標本中のRBI遺伝子の変異を検出す
る敏感な、特異的なそして迅速な方法はない。そのよう
な方法は機能的なRBI遺伝子の有無を確かめるのに助
けになり、それによって網膜芽腫患者の診断と同時に処
置法を決めることを評価させる。
る敏感な、特異的なそして迅速な方法はない。そのよう
な方法は機能的なRBI遺伝子の有無を確かめるのに助
けになり、それによって網膜芽腫患者の診断と同時に処
置法を決めることを評価させる。
本発明の目的は変化した網膜芽腫遺伝子を持つ腫瘍細胞
を検出する感度のよい方法を提供することである。本発
明のもう一つの目的は網膜芽腫遺伝子の蛋白産物(RB
I蛋白)を検出するためのポリクローナル抗体を提供す
ることである。
を検出する感度のよい方法を提供することである。本発
明のもう一つの目的は網膜芽腫遺伝子の蛋白産物(RB
I蛋白)を検出するためのポリクローナル抗体を提供す
ることである。
RB】蛋白の検出のためにモノクローナル抗体を提供す
ることは本発明のさらに別の目的である。本発明のもう
一つの目的はRBI蛋白に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマを提供することである。
ることは本発明のさらに別の目的である。本発明のもう
一つの目的はRBI蛋白に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマを提供することである。
網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉腫、乳腺、肺、卵巣、胆嚢、
子宮けい部等の癌腫、及び軟組織肉腫からなる群から選
ばれるいろいろな腫瘍の程度や段階を決定するもう一つ
の方法を提供することが本発明の別の目的である。
子宮けい部等の癌腫、及び軟組織肉腫からなる群から選
ばれるいろいろな腫瘍の程度や段階を決定するもう一つ
の方法を提供することが本発明の別の目的である。
いろいろな腫瘍の程度や段階を決める付加的な尺度を提
供し、従って腫瘍患者について診断と将来の治療方法の
助けとすることが本発明のもう一つの目的である。
供し、従って腫瘍患者について診断と将来の治療方法の
助けとすることが本発明のもう一つの目的である。
これまで示した目的に加えて1本発明の一1面にしたが
ってRB1蛋白に結合するポリクローナル抗体が提供さ
れている。ねずみのハイブリドーマによって生産され、
その抗体がRB1蛋白と特異的に免疫反応するモノクロ
ーナル抗体を提供している。
ってRB1蛋白に結合するポリクローナル抗体が提供さ
れている。ねずみのハイブリドーマによって生産され、
その抗体がRB1蛋白と特異的に免疫反応するモノクロ
ーナル抗体を提供している。
もう一つの内容において腫瘍組織から採った組織切片を
調製し、その組織切片と抗体(モノクローナルでもポリ
クローナルでも)と反応させて抗体−抗原結合体を形成
させ、そしてそうして作られた抗原−抗体結合体の形成
を検出するステップを含むRBI蛋白を検出する方法が
提供されている。
調製し、その組織切片と抗体(モノクローナルでもポリ
クローナルでも)と反応させて抗体−抗原結合体を形成
させ、そしてそうして作られた抗原−抗体結合体の形成
を検出するステップを含むRBI蛋白を検出する方法が
提供されている。
この発明のもう一つの内容は骨肉腫、繊維肉腫、黒色腫
、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部、軟組織の肉腫と
いったような腫瘍と関連のある細胞の存在を検出する方
法やそのような腫瘍を持った患者の診断と発症の予防法
を決めるための方法を提供する。この方法は腫瘍を生検
し、その組織から組織切片を作り、本発明のRBIモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体とその切片を反応
させ、その抗体を組織と特異的に結合させて抗体−抗原
結合体を形成させ、その抗体−抗原結合体を検出するこ
とを包含している。
、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部、軟組織の肉腫と
いったような腫瘍と関連のある細胞の存在を検出する方
法やそのような腫瘍を持った患者の診断と発症の予防法
を決めるための方法を提供する。この方法は腫瘍を生検
し、その組織から組織切片を作り、本発明のRBIモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体とその切片を反応
させ、その抗体を組織と特異的に結合させて抗体−抗原
結合体を形成させ、その抗体−抗原結合体を検出するこ
とを包含している。
本発明は網膜芽腫遺伝子産物(RBI蛋白)に欠陥のあ
る広い範囲の腫瘍を検出し、その腫瘍患者の発症予防と
将来の治療法を決めるのに有用である。
る広い範囲の腫瘍を検出し、その腫瘍患者の発症予防と
将来の治療法を決めるのに有用である。
その他の目的、特徴、利点は添付された図面と一緒に発
明の目的について示された以下の本発明の望ましい実施
例から明らかになろう。
明の目的について示された以下の本発明の望ましい実施
例から明らかになろう。
課題を解決するための手段
以下に示される本発明の種々な置換え、修正が本発明の
目的、精神の範囲内で行われることは当業者にとって容
易に理解できることである。
目的、精神の範囲内で行われることは当業者にとって容
易に理解できることである。
抗原は免疫応答を起こし、ある特異性を持って標的とす
る抗原と反応し、結合する抗体の生産を付随的に起こす
ことのできる化合物である。ウィルスとその特殊な決定
基、いろいろな素材からとれるペプチドや蛋白質、炭水
化物分子や広範囲の生体高分子などに特異的な抗体プロ
ーブが当業者には知られている。
る抗原と反応し、結合する抗体の生産を付随的に起こす
ことのできる化合物である。ウィルスとその特殊な決定
基、いろいろな素材からとれるペプチドや蛋白質、炭水
化物分子や広範囲の生体高分子などに特異的な抗体プロ
ーブが当業者には知られている。
そのような抗体を作る一般的な方法も当業者には知られ
ている。
ている。
簡単には、ポリクローナル抗体はR旧遺伝子によってコ
ードされているペプチド配列で宿主動物を免疫すること
によって調製される。
ードされているペプチド配列で宿主動物を免疫すること
によって調製される。
望ましくはその抗原はRBI蛋白の疎水的なC末端かま
たはその近くにあるペプチド配列である。その抗原は宿
主に週間隔で皮下投与され、ついで最終の週間隔投与後
−ケ月で追加投与される。その後に宿主から血清を採り
、使用まで保存する。RBIポリクローナル抗血清は本
発明の免疫組織学的方法には直接使用できよう。さらに
、RBI抗体は当業者には知られている方法で血清から
沈澱され、より濃縮された形で使用でき、また、RBI
抗体はアフィニティ技術で精製され、純粋な形で使用で
きる。この抗体はまた当業者にとって知られた方法で標
識され検出される。
たはその近くにあるペプチド配列である。その抗原は宿
主に週間隔で皮下投与され、ついで最終の週間隔投与後
−ケ月で追加投与される。その後に宿主から血清を採り
、使用まで保存する。RBIポリクローナル抗血清は本
発明の免疫組織学的方法には直接使用できよう。さらに
、RBI抗体は当業者には知られている方法で血清から
沈澱され、より濃縮された形で使用でき、また、RBI
抗体はアフィニティ技術で精製され、純粋な形で使用で
きる。この抗体はまた当業者にとって知られた方法で標
識され検出される。
免疫されたドナーからの牌細胞とミエローマ細胞との融
合は均質な抗体を引き出す方法として示されている。す
なわち、種々の抗原に対して大量のモノクローナル抗体
を生産することのできる遺伝的に安定なハイブリドーマ
である継続的細胞系統が開発されている。
合は均質な抗体を引き出す方法として示されている。す
なわち、種々の抗原に対して大量のモノクローナル抗体
を生産することのできる遺伝的に安定なハイブリドーマ
である継続的細胞系統が開発されている。
コブロウスキー(Koprowski)らに与えられた
アメリカ特許節4.172.124号によれば悪性化し
た腫瘍に特異性を示す抗体はヒボキサンチンホスフォリ
ボシルトランスフェラーゼ欠損のミエローマ細胞とさき
に腫瘍細胞で感作された動物の牌細胞またはリンパ細胞
との体細胞融合細胞によって生産される。また、コブロ
ウスキー(Koprowski)らのアメリカ特許節4
.196.265号によれば特殊なウィルスやそれらの
抗原決定基に対する大量のモノクローナル抗体を生産で
きる遺伝的に安定な融合細胞の継続的細胞系統が開発さ
れている。
アメリカ特許節4.172.124号によれば悪性化し
た腫瘍に特異性を示す抗体はヒボキサンチンホスフォリ
ボシルトランスフェラーゼ欠損のミエローマ細胞とさき
に腫瘍細胞で感作された動物の牌細胞またはリンパ細胞
との体細胞融合細胞によって生産される。また、コブロ
ウスキー(Koprowski)らのアメリカ特許節4
.196.265号によれば特殊なウィルスやそれらの
抗原決定基に対する大量のモノクローナル抗体を生産で
きる遺伝的に安定な融合細胞の継続的細胞系統が開発さ
れている。
そのような細胞融合技術または抗RBI抗体の信頼でき
る標準的な供給をするために使われる。本発明によれば
抗RBI抗体を発現する新規な継続的ハイブリドーマ細
胞系統がRBI遺伝子産物の疎水的C末端またはその近
傍のアミノ酸配列、好ましくは第1図に示されるP2+
P3+ P4+ またはP5のFBIペプチドからな
る群から選ばれる合成配列に相応するペプチド配列で動
物を免疫し、免疫した動物からの抗体生産細胞とミエロ
ーマ細胞との間で融合した雑種細胞を形成し、その雑種
細胞をクローニングし、抗RBI抗体を発現しているク
ローンを選別することによって得ることができる。もっ
と特異的にはマウスまたはその他の動物に精製したRB
I抗原を投与し、動物の牌細胞の抗体を生産している細
胞を癌化したタイプのマウス細胞またはミエローマ細胞
と融合する。そうして作られたその牌細胞の親の抗RB
I抗体分子を生産し、その親のミエローマ細胞と同様に
継続的に生育し、分裂する。
る標準的な供給をするために使われる。本発明によれば
抗RBI抗体を発現する新規な継続的ハイブリドーマ細
胞系統がRBI遺伝子産物の疎水的C末端またはその近
傍のアミノ酸配列、好ましくは第1図に示されるP2+
P3+ P4+ またはP5のFBIペプチドからな
る群から選ばれる合成配列に相応するペプチド配列で動
物を免疫し、免疫した動物からの抗体生産細胞とミエロ
ーマ細胞との間で融合した雑種細胞を形成し、その雑種
細胞をクローニングし、抗RBI抗体を発現しているク
ローンを選別することによって得ることができる。もっ
と特異的にはマウスまたはその他の動物に精製したRB
I抗原を投与し、動物の牌細胞の抗体を生産している細
胞を癌化したタイプのマウス細胞またはミエローマ細胞
と融合する。そうして作られたその牌細胞の親の抗RB
I抗体分子を生産し、その親のミエローマ細胞と同様に
継続的に生育し、分裂する。
そのような抗体を生産するクローンを選別し、継続的な
細胞系統として生育し、それから大量の抗RBI抗体を
採集する。そのようなりローンの一つがRBI−MAB
P2と名付けられこの先さらに説明する。
細胞系統として生育し、それから大量の抗RBI抗体を
採集する。そのようなりローンの一つがRBI−MAB
P2と名付けられこの先さらに説明する。
別の面では、クローン化された雑種細胞がそれが増殖し
ている組織適合性の動物に投与され動物の腹水から回収
した高濃度の抗RBI抗体を生産させることができる。
ている組織適合性の動物に投与され動物の腹水から回収
した高濃度の抗RBI抗体を生産させることができる。
かくして、本発明はRB]蛋白発現の免疫組織化学的検
出に使うための抗RBI抗体の比較的大規模の確実な標
準的な供給に用いられる、あるいはRBI蛋白の欠乏が
腫瘍の特殊なタイプ、程度、あるいは段階によっている
ような腫瘍検体におけるRBI蛋白の発現がないことを
検出するのに用いられる。そうして作られたモノクロー
ナル抗体はまた当業者にとって知られた方法で標識とす
ることができる。
出に使うための抗RBI抗体の比較的大規模の確実な標
準的な供給に用いられる、あるいはRBI蛋白の欠乏が
腫瘍の特殊なタイプ、程度、あるいは段階によっている
ような腫瘍検体におけるRBI蛋白の発現がないことを
検出するのに用いられる。そうして作られたモノクロー
ナル抗体はまた当業者にとって知られた方法で標識とす
ることができる。
検出できる標識は検出、できる物理学的、あるいは化学
的特性を持つものである。
的特性を持つものである。
そのような検出可能な標識は免疫測定法の分野でよく開
発され一般にそのような方法に用いられる標識のは七ん
どは本発明に利用できる。特に有用なのは酵素(例えば
、アルカリフォスファターゼやパーオキシダーゼのよう
な(CIin、Chem、、22 : 1243 (+
976)参照)、酵素の基質(英国特許節1.548.
741号明細書参照)、補酵素(米国特許第4,230
,797号及び4,238,565号参照)、酵素阻害
剤(米国特許第4.134.792号参照)のような酵
素的に活性物群、蛍光剤(CIin、Chem、、25
+ 353 (1979)参照)、化学発光剤や生物
発光体のような発光体(C1in、Chem、、25
: 512 (+979)参照)及びラジオアイソト−
プである。通常用いられる検出可能な放射活性標識体は
32p、 14C11251、+t H、:+ 5c、
などであるが、それらに限定されるものではない。ビオ
チン化したプローブはアビジン/ストレプトアビジン、
蛍光性、酵素的あるいはコロイド性金結合体を使ってハ
イブリダイゼーションの後で検出される。
発され一般にそのような方法に用いられる標識のは七ん
どは本発明に利用できる。特に有用なのは酵素(例えば
、アルカリフォスファターゼやパーオキシダーゼのよう
な(CIin、Chem、、22 : 1243 (+
976)参照)、酵素の基質(英国特許節1.548.
741号明細書参照)、補酵素(米国特許第4,230
,797号及び4,238,565号参照)、酵素阻害
剤(米国特許第4.134.792号参照)のような酵
素的に活性物群、蛍光剤(CIin、Chem、、25
+ 353 (1979)参照)、化学発光剤や生物
発光体のような発光体(C1in、Chem、、25
: 512 (+979)参照)及びラジオアイソト−
プである。通常用いられる検出可能な放射活性標識体は
32p、 14C11251、+t H、:+ 5c、
などであるが、それらに限定されるものではない。ビオ
チン化したプローブはアビジン/ストレプトアビジン、
蛍光性、酵素的あるいはコロイド性金結合体を使ってハ
イブリダイゼーションの後で検出される。
抗体もまた他の蛍光化合物、免疫的に検出できる蛍光性
誘導体あるいはビオチンアナログなどで標識される。間
接的な蛍光免疫細胞化学的な方法も利用される。
誘導体あるいはビオチンアナログなどで標識される。間
接的な蛍光免疫細胞化学的な方法も利用される。
抗原−抗体複合体の形成を検出するために検出できる標
識が利用される。検出できる標識(すなわちレポーター
分子)を対象の組織とインキュベートする前に抗RB+
抗体分子に直接結合しうる。それとは別に、非標識のR
BI抗体は対象となる組織とインキュベートし、RBI
組織抗原と結合するRBI抗体に結合する第2の検出で
きるように標識した抗体を加えることによって抗原−抗
体複合体が検出される。
識が利用される。検出できる標識(すなわちレポーター
分子)を対象の組織とインキュベートする前に抗RB+
抗体分子に直接結合しうる。それとは別に、非標識のR
BI抗体は対象となる組織とインキュベートし、RBI
組織抗原と結合するRBI抗体に結合する第2の検出で
きるように標識した抗体を加えることによって抗原−抗
体複合体が検出される。
腫瘍組織検体の特異的な細胞にRB+蛋白に有無が直接
的には肉眼で見つけられるレポーター分子を利用するこ
とによって、または間接的に組織切片を見えるようにす
るとき放射性の標識体のようなレポーター分子を利用し
て現像されたオートラジオグラフを検査することによっ
て測定することができる。
的には肉眼で見つけられるレポーター分子を利用するこ
とによって、または間接的に組織切片を見えるようにす
るとき放射性の標識体のようなレポーター分子を利用し
て現像されたオートラジオグラフを検査することによっ
て測定することができる。
本発明の一つの態様にRBI蛋白と結合するポリクロー
ナル抗体の利用がある。RBI蛋白(RBI−AB20
)に対するポリクローナル抗体は第1図に示されている
ようなヒトRB1cDNA配列から推定される蛋白配列
のC末端またはその近傍に位置しているRBI蛋白の疎
水部分に相当するペプチド配列でウサギに免疫すること
によって調製される。代表的な内容において23アミノ
酸残基に相当する合成ペプチド(以下P5という)が調
製された。
ナル抗体の利用がある。RBI蛋白(RBI−AB20
)に対するポリクローナル抗体は第1図に示されている
ようなヒトRB1cDNA配列から推定される蛋白配列
のC末端またはその近傍に位置しているRBI蛋白の疎
水部分に相当するペプチド配列でウサギに免疫すること
によって調製される。代表的な内容において23アミノ
酸残基に相当する合成ペプチド(以下P5という)が調
製された。
3つの他のペプチド配列も合成された。合成R旧ペプチ
ドのアミノ酸配列は次のようである。
ドのアミノ酸配列は次のようである。
P2 : HN2− Cys−Arg−Met−Gln
−Lys−Gln−Lys−Met−Asn−Asp−
3er−Met−Asp−Thr−3er−Asn−L
ys−Glu−Glu−Lys。
−Lys−Gln−Lys−Met−Asn−Asp−
3er−Met−Asp−Thr−3er−Asn−L
ys−Glu−Glu−Lys。
P3 : HN2− Cys−Arg−Thr−Pro
−Arg−Arg−Gly−Gln−Asp−Arg−
3er−Ala−Arg−11e−Ala−I+ys−
Gln−Leu−Glu−Asp−Asp。
−Arg−Arg−Gly−Gln−Asp−Arg−
3er−Ala−Arg−11e−Ala−I+ys−
Gln−Leu−Glu−Asp−Asp。
P4°HN2− Cys−Glu−Glu−jle−T
yr−Leu−Lys−Asp−Lys”Asp−Le
u−Asp−Ala−Arg−Leu−Phe−Leu
−Asp−His−Asp−Lys。
yr−Leu−Lys−Asp−Lys”Asp−Le
u−Asp−Ala−Arg−Leu−Phe−Leu
−Asp−His−Asp−Lys。
P5 : HN2− Cys−Lys−Pro−Le
u−Lys−Lys−Leu−Phe−Arg−Asp
−11e−Glu−Gly−3er−Asp−Glu−
Ala−Asp−Gly−3er−Lysシスティン残
基がカップリングの目的に各ペプチドのN末端に加えら
れた。かくして、N−末端のシスティン残基はRBI蛋
白のものではない。
u−Lys−Lys−Leu−Phe−Arg−Asp
−11e−Glu−Gly−3er−Asp−Glu−
Ala−Asp−Gly−3er−Lysシスティン残
基がカップリングの目的に各ペプチドのN末端に加えら
れた。かくして、N−末端のシスティン残基はRBI蛋
白のものではない。
RBI蛋白の存在または不在、変異を見つけるためにポ
リクローナルをモノクローナル抗体が用いられる。態様
の一つではRBI蛋白の検出する方法は腫瘍組織の生検
標本からの組織切片を作り、その組織標本切片とモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体を反応させ、抗体−
抗原結合体を作り、そして抗原−抗体結合体の形成を検
出するステップを含んでいる。
リクローナルをモノクローナル抗体が用いられる。態様
の一つではRBI蛋白の検出する方法は腫瘍組織の生検
標本からの組織切片を作り、その組織標本切片とモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体を反応させ、抗体−
抗原結合体を作り、そして抗原−抗体結合体の形成を検
出するステップを含んでいる。
本発明の別の態様ではI’lBI蛋白の欠陥のある細胞
を上記の免疫組織学的な手法で腫瘍組織の中で分類する
ことができる。
を上記の免疫組織学的な手法で腫瘍組織の中で分類する
ことができる。
疾患の進んだ段階の腫瘍細胞は多くの網膜芽腫蛋白の欠
陥を示すから腫瘍細胞の段階を検診し、同時にこの腫瘍
を持つ患者の予診のためにこの方法が使われる。
陥を示すから腫瘍細胞の段階を検診し、同時にこの腫瘍
を持つ患者の予診のためにこの方法が使われる。
患者に対する現在の処置法の決定は特別の予診パラメー
ターに基づいていることが多い。
ターに基づいていることが多い。
例えば、乳腺癌の主な予診上の要素は脇の下のリンパ節
に腫瘍細胞が有るか無いか、腫瘍細胞にホルモンの受容
体が有るか無いかがある。疾患の逆戻りや患者の生存に
関連するその他の予診要素ははじめの病巣の大きさと診
断の際の疾患の段階がある。スレイマン(Slamon
)はHER−2/neu遺伝子の増加が乳ガン患者の全
体の生存期間と逆戻りする時間の両方の予測要素として
リンパ節の関係を除く他の従来使われている項目よりも
高い予診価値を持つと考えている(Science 2
35 : 17? :1987)。
に腫瘍細胞が有るか無いか、腫瘍細胞にホルモンの受容
体が有るか無いかがある。疾患の逆戻りや患者の生存に
関連するその他の予診要素ははじめの病巣の大きさと診
断の際の疾患の段階がある。スレイマン(Slamon
)はHER−2/neu遺伝子の増加が乳ガン患者の全
体の生存期間と逆戻りする時間の両方の予測要素として
リンパ節の関係を除く他の従来使われている項目よりも
高い予診価値を持つと考えている(Science 2
35 : 17? :1987)。
本発明の方法は広範囲の腫瘍の段階や程度を評価するの
に用いられる。例えば、その欠陥は網膜芽腫、骨肉腫、
繊維肉腫、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部の癌や軟
組織癌などに見られている。これらの腫瘍の全てはDN
AレベルでRB遺伝子の欠陥を持っている。
に用いられる。例えば、その欠陥は網膜芽腫、骨肉腫、
繊維肉腫、乳腺、卵巣、胆嚢、肺、子宮けい部の癌や軟
組織癌などに見られている。これらの腫瘍の全てはDN
AレベルでRB遺伝子の欠陥を持っている。
あるものは網膜芽腫遺伝子の変化した、あるいは欠落し
た細胞の亜群がある。かくして、確認できるRBI蛋白
が無いことはこれらの腫瘍の同定しうる項目として利用
される。RBI蛋白の発現が失われている程度が乳腺腫
瘍で従来の方法で同定されるような腫瘍の程度の進行と
共に増加するから本発明はそのような腫瘍の程度、段階
を決定するもう一つの評価項目を提供する。この方法は
腫瘍患者の予診と将来の治療コースをきめるためのもう
一つの評価項目を提供するだろう。
た細胞の亜群がある。かくして、確認できるRBI蛋白
が無いことはこれらの腫瘍の同定しうる項目として利用
される。RBI蛋白の発現が失われている程度が乳腺腫
瘍で従来の方法で同定されるような腫瘍の程度の進行と
共に増加するから本発明はそのような腫瘍の程度、段階
を決定するもう一つの評価項目を提供する。この方法は
腫瘍患者の予診と将来の治療コースをきめるためのもう
一つの評価項目を提供するだろう。
ここにこの発明を概説してきたが、より完全に理解する
ために以下の特別の例を参照すべきである。これらの例
は単に説明の目的で供されており他に特定されてなけれ
ば限定するものではない。
ために以下の特別の例を参照すべきである。これらの例
は単に説明の目的で供されており他に特定されてなけれ
ば限定するものではない。
実施例
実施例I
R旧抗体の生産
ポリクローナル抗体はRBIペプチドであるP2.Pて
l+ p4. P5の一つをニューシーラント雌ウサギ
に免疫することによって調製した。ウサギは2週間隔で
追加免疫され、採集された血清は抗体の素として用いら
れた。抗血清RBI−AB20はペプチドP5で感作さ
れたもので実施例2に記されるようにその後の免疫染色
法に使われた。RBI−AB20抗体はIgGサブタイ
プを持っている。RBI−AB20抗血清は2図(参考
写真1)の第1列に示されるように32pで標識した細
胞からR旧蛋白を沈降した。従来法で精製したポリクロ
ーナル抗血清のIgG画分も2図(参考写真1)の第2
列のようにRBI蛋白を沈澱させる。
l+ p4. P5の一つをニューシーラント雌ウサギ
に免疫することによって調製した。ウサギは2週間隔で
追加免疫され、採集された血清は抗体の素として用いら
れた。抗血清RBI−AB20はペプチドP5で感作さ
れたもので実施例2に記されるようにその後の免疫染色
法に使われた。RBI−AB20抗体はIgGサブタイ
プを持っている。RBI−AB20抗血清は2図(参考
写真1)の第1列に示されるように32pで標識した細
胞からR旧蛋白を沈降した。従来法で精製したポリクロ
ーナル抗血清のIgG画分も2図(参考写真1)の第2
列のようにRBI蛋白を沈澱させる。
本発明のハイブリドーマは次のようにして調製される。
PBSに溶かした対象とするペプチI・200 mgを
Ba1b/cマウスの肺臓に直接注入した。31後免疫
したマウスを殺し、牌細胞を採集した。牌細胞(10”
)を2分間0.8mQの50%ポリエチレングリコール
(PEG4000)中でマウスのミエローマN5−1細
胞(107)と混合した。1分間静かに静置したのち、
細胞を20%のウシ胎児血清を含む70m12のHAT
(ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン)培地
に再懸濁した。それから細胞を96ウエル培養プレート
にまき、加湿したCO□環境下で培養した。
Ba1b/cマウスの肺臓に直接注入した。31後免疫
したマウスを殺し、牌細胞を採集した。牌細胞(10”
)を2分間0.8mQの50%ポリエチレングリコール
(PEG4000)中でマウスのミエローマN5−1細
胞(107)と混合した。1分間静かに静置したのち、
細胞を20%のウシ胎児血清を含む70m12のHAT
(ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン)培地
に再懸濁した。それから細胞を96ウエル培養プレート
にまき、加湿したCO□環境下で培養した。
RBI抗体を生産しているハイブリドーマ細胞を検出す
るために免疫した抗原をつかったELISA法によって
陽性のハイブリドーマコロニーを探した。ELISAで
陽性のコロニーは段階的な希釈をしてまかれ、またEL
ISAテストを繰り返された。数回のサイクルののち、
陽性のハイブリドーマ細胞系統をBa1b/cマウスの
腹腔に投与し、腹水として生育させた。腹水はハイブリ
ドーマ源として用いられた。
るために免疫した抗原をつかったELISA法によって
陽性のハイブリドーマコロニーを探した。ELISAで
陽性のコロニーは段階的な希釈をしてまかれ、またEL
ISAテストを繰り返された。数回のサイクルののち、
陽性のハイブリドーマ細胞系統をBa1b/cマウスの
腹腔に投与し、腹水として生育させた。腹水はハイブリ
ドーマ源として用いられた。
RBI−MAbP2と定められたものを含む数種の細胞
系統がRBI抗体を生産していることか見つけられ、腫
瘍組織の免疫学的組織染色にとって有用であった。ハイ
ブリドーマ系統は液体窒素中に保存された。
系統がRBI抗体を生産していることか見つけられ、腫
瘍組織の免疫学的組織染色にとって有用であった。ハイ
ブリドーマ系統は液体窒素中に保存された。
RBI−MAbP2としたハイブリドーマ細胞系統は米
国標準株集積所(American Type Cu1
tureCollection、 (ATCC)、米国
メリーランド州ロックビル)に1989年3月31日に
Na HBI0093として寄託された。寄託様は米国
及びこの発明の写しがファイルされている米国以外の国
の特許法や規制に従い利用できる。寄託を利用できるこ
とはこれに示されるいかなる特許権あるいはこの発明の
分割または継続についての権利を低下させることにおい
てこの発明を実施するライセンスを構成するものでない
。
国標準株集積所(American Type Cu1
tureCollection、 (ATCC)、米国
メリーランド州ロックビル)に1989年3月31日に
Na HBI0093として寄託された。寄託様は米国
及びこの発明の写しがファイルされている米国以外の国
の特許法や規制に従い利用できる。寄託を利用できるこ
とはこれに示されるいかなる特許権あるいはこの発明の
分割または継続についての権利を低下させることにおい
てこの発明を実施するライセンスを構成するものでない
。
実施例2
RBI蛋白の免疫組織学的観察
RBI蛋白の有無とR旧遺伝子の有無との相関は本発明
のRBI抗体を用いて証明される。RBI遺伝子陽性の
乳腺腫瘍細胞系統の5W613. RBI陰性の7L腺
腫瘍ii’lll胞のMl)A−MB411i8を含む
組織培養されだ補胞を48時間、20%のウシ胎児血清
と0.1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含むR
PM11640培地で培養した。細胞を2回冷PBSで
洗った。細胞を95%エタノール中5%酢酸を含む液で
6分間、4℃で固定した。
のRBI抗体を用いて証明される。RBI遺伝子陽性の
乳腺腫瘍細胞系統の5W613. RBI陰性の7L腺
腫瘍ii’lll胞のMl)A−MB411i8を含む
組織培養されだ補胞を48時間、20%のウシ胎児血清
と0.1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含むR
PM11640培地で培養した。細胞を2回冷PBSで
洗った。細胞を95%エタノール中5%酢酸を含む液で
6分間、4℃で固定した。
冷PBSで2回洗ったのち、細胞を1%の正常ウマ血清
、3%BSA及び0.2%のTritonX−100を
含むPBSでインキュベートすることによって非特異的
な結合をブロックした。固定された細胞は冷PBSで洗
われ、PBS (1: 10)で希釈した特異的なRB
I−MABP2の培養上清と1時間、37℃で反応され
た。それから細胞は冷PBS、1%のTritonX−
100を含むPBS、最後にPBSで洗浄された。
、3%BSA及び0.2%のTritonX−100を
含むPBSでインキュベートすることによって非特異的
な結合をブロックした。固定された細胞は冷PBSで洗
われ、PBS (1: 10)で希釈した特異的なRB
I−MABP2の培養上清と1時間、37℃で反応され
た。それから細胞は冷PBS、1%のTritonX−
100を含むPBS、最後にPBSで洗浄された。
細胞に対するRBI抗体の特異的結合は細胞なビオチン
化した抗マウスIgG抗体(PBSで1:200に希釈
したもの)と1時間、37℃反応させることによって観
察できるようにした。
化した抗マウスIgG抗体(PBSで1:200に希釈
したもの)と1時間、37℃反応させることによって観
察できるようにした。
細胞を3回冷PBSで洗浄後、37℃、30分間ABC
試薬(アビジン:ビオチン結合体)と反応し、冷PBS
で洗ったのち新たに調製したDAS(3,3’−ジアミ
ノベンチジン・テトラヒドロクロリド)液と4分間室温
で反応した。DAB溶液は0.3%のソジウムアジドと
101の過酸化水素を含む0.05Mのトリス塩酸緩衝
液(pH7,6)10+nQに6 mgのDABを溶か
すことによって調製した。それから細胞を蒸留水で洗い
染色された細胞を顕微鏡観察で解析した。結果は第3図
a (参考写真2a)と第3図b(参考写真2b)に示
されている。
試薬(アビジン:ビオチン結合体)と反応し、冷PBS
で洗ったのち新たに調製したDAS(3,3’−ジアミ
ノベンチジン・テトラヒドロクロリド)液と4分間室温
で反応した。DAB溶液は0.3%のソジウムアジドと
101の過酸化水素を含む0.05Mのトリス塩酸緩衝
液(pH7,6)10+nQに6 mgのDABを溶か
すことによって調製した。それから細胞を蒸留水で洗い
染色された細胞を顕微鏡観察で解析した。結果は第3図
a (参考写真2a)と第3図b(参考写真2b)に示
されている。
モノクローナル抗体RBI−MAb20はRBI遺伝子
に対して陽性と知られる5W613細胞系統の全ての細
胞を染めた(第3図a(参考写真2a)) 、 RB陰
性細胞のMDA−MB468の培養細胞は抗原抗体結合
体の形成は全く起こらなかった(第3図b(参考写真2
h))。
に対して陽性と知られる5W613細胞系統の全ての細
胞を染めた(第3図a(参考写真2a)) 、 RB陰
性細胞のMDA−MB468の培養細胞は抗原抗体結合
体の形成は全く起こらなかった(第3図b(参考写真2
h))。
乳腺腫瘍組織がRBI蛋白を発現していないことをみる
ための本発明のRBI抗体の能力なテストシた。当業者
には知られる多くの従来の方法によって調製された組織
切片にこの染色法が用いられた。例えば、乳腺組織中に
RBI蛋白があるかないかを検出するために使われる免
疫染色法はパラフィン切片でも凍結切片でもよい。パラ
フィンに包埋されたJfl織切片は5分間キシレンと接
触させ、ついで5分間ずつ100%エタノールに2回、
70%エタノールに5分間、そして50%エタノールに
浸すことによって脱パラフィンし、脱水した。
ための本発明のRBI抗体の能力なテストシた。当業者
には知られる多くの従来の方法によって調製された組織
切片にこの染色法が用いられた。例えば、乳腺組織中に
RBI蛋白があるかないかを検出するために使われる免
疫染色法はパラフィン切片でも凍結切片でもよい。パラ
フィンに包埋されたJfl織切片は5分間キシレンと接
触させ、ついで5分間ずつ100%エタノールに2回、
70%エタノールに5分間、そして50%エタノールに
浸すことによって脱パラフィンし、脱水した。
それから5分間PBS中で洗った。切片を10%の正常
ヤギ血清を含むPBS中で30分間インキュベートした
。そしてPBSで1:80に希釈したRBI抗体と4℃
で一晩インキユベートした。
ヤギ血清を含むPBS中で30分間インキュベートした
。そしてPBSで1:80に希釈したRBI抗体と4℃
で一晩インキユベートした。
バッファーでlO分間組組織片を洗ったのち、60分間
希釈したビオチン化した第2抗体溶液と60分間インキ
ュベートした。第2抗体はマウスIgGに対する抗体で
ある。第2抗体に検出できる標識を使うことは組織化学
法で非標識のRBI抗体を使うことができる。バッファ
ーで10分間、組織切片を洗ったのち、ABC試薬で3
0分間切片をインキュベートシた。PBSで10分間組
組織片を洗ってからペルオキシダーゼ基質溶液(DAB
)中で10−20分間インキュベートした。水で5分間
洗浄後、マイヤー・ヘマルム液で染色し、顕微鏡観察の
前に固定した。
希釈したビオチン化した第2抗体溶液と60分間インキ
ュベートした。第2抗体はマウスIgGに対する抗体で
ある。第2抗体に検出できる標識を使うことは組織化学
法で非標識のRBI抗体を使うことができる。バッファ
ーで10分間、組織切片を洗ったのち、ABC試薬で3
0分間切片をインキュベートシた。PBSで10分間組
組織片を洗ってからペルオキシダーゼ基質溶液(DAB
)中で10−20分間インキュベートした。水で5分間
洗浄後、マイヤー・ヘマルム液で染色し、顕微鏡観察の
前に固定した。
望ましい実施例の一つでは、乳腺組織の生検試料の凍結
切片(6−8μm)を−20°Cでクリオスタットで切
断し、室温で2分間アセトン中におき、ついで4°Cで
8分間pH7,4の過ヨウ素酸−リジンーパラフォルム
アルデヒド溶液で固定した。非特異的結合を免疫してい
ないブタの血清(pH7,2の燐酸緩衝化生理食塩水、
PBSで1=5に希釈したもの)で10分間ブロックし
たのち、組織切片を室温で60分間RBI−Ab20
(PBSで1:100に希釈)とインキュベートし、そ
れから洗浄した。それからビオチン化したブタの抗ウサ
ギイムノグロブリン抗血清を加え、ついでアビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ複合体を加えた。ペルオキシ
ダーゼはジアミノベンチジン−過酸化水素反応で発色さ
せる。核は簡単にメイヤー氏のヘマルム液で染色された
。
切片(6−8μm)を−20°Cでクリオスタットで切
断し、室温で2分間アセトン中におき、ついで4°Cで
8分間pH7,4の過ヨウ素酸−リジンーパラフォルム
アルデヒド溶液で固定した。非特異的結合を免疫してい
ないブタの血清(pH7,2の燐酸緩衝化生理食塩水、
PBSで1=5に希釈したもの)で10分間ブロックし
たのち、組織切片を室温で60分間RBI−Ab20
(PBSで1:100に希釈)とインキュベートし、そ
れから洗浄した。それからビオチン化したブタの抗ウサ
ギイムノグロブリン抗血清を加え、ついでアビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ複合体を加えた。ペルオキシ
ダーゼはジアミノベンチジン−過酸化水素反応で発色さ
せる。核は簡単にメイヤー氏のヘマルム液で染色された
。
この固定法は本発明の目的や概念に影響を与えることな
しに変えることができよう。
しに変えることができよう。
RBI蛋白のあるがままの状態を保ち、RBI蛋白の部
位にR旧抗体が入ることのできるようないかなる染色法
が用いられる。また、RBI抗原に対するRBI抗体の
結合を妨げることのない固定法が必要である。
位にR旧抗体が入ることのできるようないかなる染色法
が用いられる。また、RBI抗原に対するRBI抗体の
結合を妨げることのない固定法が必要である。
実施例3
乳腺癌の程度、段階とRB+蛋白の減少を検出すること
の関係 腫瘍の生検を使って獲られるDNAプローブによるデー
タを説明する大きな問題は用いる組織試料の不均一さで
ある。標準の組織学的分析によって生検試料中の腫瘍細
胞の割合を示すことは可能であるが、DNAを調製する
ために使われる試料中で腫瘍細胞の9j合を確定するこ
とは難しい。試験に使った試料の大部分は腫瘍細胞が5
0 %、以下のもので、残りは基質細胞、リンパ球その
他である。腫瘍細胞の50%で一つのRBI遺伝子座の
欠損が全体の12.5%のハイブリダイゼーションシグ
ナルの減少をもたらすだけである。それ故、この程度の
RBIの損失を持った腫瘍生検試料の割合はこの方法の
限界のためにDNAプローブ分析では見過ごされる可能
性がある。
の関係 腫瘍の生検を使って獲られるDNAプローブによるデー
タを説明する大きな問題は用いる組織試料の不均一さで
ある。標準の組織学的分析によって生検試料中の腫瘍細
胞の割合を示すことは可能であるが、DNAを調製する
ために使われる試料中で腫瘍細胞の9j合を確定するこ
とは難しい。試験に使った試料の大部分は腫瘍細胞が5
0 %、以下のもので、残りは基質細胞、リンパ球その
他である。腫瘍細胞の50%で一つのRBI遺伝子座の
欠損が全体の12.5%のハイブリダイゼーションシグ
ナルの減少をもたらすだけである。それ故、この程度の
RBIの損失を持った腫瘍生検試料の割合はこの方法の
限界のためにDNAプローブ分析では見過ごされる可能
性がある。
腫瘍組織標本に対して本発明のRBI抗体を用いる免疫
組織学的検出法はRBI蛋白の存在のより鋭敏な検出法
を提供した。正常な乳腺、良性の嚢胞性の乳腺、l88
1性アデノーマなどの乳腺組織でRBI−Ab20抗体
によって染めることは優勢な核染色と共に乳腺中の上皮
細胞をすべて均一に染色することを示した。
組織学的検出法はRBI蛋白の存在のより鋭敏な検出法
を提供した。正常な乳腺、良性の嚢胞性の乳腺、l88
1性アデノーマなどの乳腺組織でRBI−Ab20抗体
によって染めることは優勢な核染色と共に乳腺中の上皮
細胞をすべて均一に染色することを示した。
第4図a (参考写真3a)は正常乳腺小葉の上皮組織
の核及び細胞質染色を示している(白矢印)。筋上皮細
胞や基質細胞はRBI−Ab20を反応せず、従って陰
性のようである(黒矢印)。P旧蛋白の核におけるSV
40の大きいT抗原のような核蛋白にみられる核の存在
シグナルに特徴的なアミノ酸配列(PKKKすなわち、
Pro−Lys−Lys−Lys)がみられることに一
致している。かくして、通常は乳腺上皮細胞はすべては
っきりと検出しうるレベルの蛋白としてのRBIを発現
している。
の核及び細胞質染色を示している(白矢印)。筋上皮細
胞や基質細胞はRBI−Ab20を反応せず、従って陰
性のようである(黒矢印)。P旧蛋白の核におけるSV
40の大きいT抗原のような核蛋白にみられる核の存在
シグナルに特徴的なアミノ酸配列(PKKKすなわち、
Pro−Lys−Lys−Lys)がみられることに一
致している。かくして、通常は乳腺上皮細胞はすべては
っきりと検出しうるレベルの蛋白としてのRBIを発現
している。
77種のRB1組織についてDNA解析によって調べた
癌の標本のうち56について実施例2に記載した免疫組
織化学的分析を行った。これらの癌標本のうち40では
、染色の度合において若干の違いがあっても全ての腫瘍
細胞は核の反応性を示した。第4図b(参考写真3b)
は本質的に全ての腫瘍細胞核が染色程度にわずかの違い
を持って反応している(矢印)典型的なこれら癌細胞の
染色パターンを示している。周りの基質細胞(S)はR
BI−Ab20抗体と反応している証拠はみられない。
癌の標本のうち56について実施例2に記載した免疫組
織化学的分析を行った。これらの癌標本のうち40では
、染色の度合において若干の違いがあっても全ての腫瘍
細胞は核の反応性を示した。第4図b(参考写真3b)
は本質的に全ての腫瘍細胞核が染色程度にわずかの違い
を持って反応している(矢印)典型的なこれら癌細胞の
染色パターンを示している。周りの基質細胞(S)はR
BI−Ab20抗体と反応している証拠はみられない。
残りの16株の癌細胞では染色されない腫瘍細胞がいろ
いろな程度に存在している。これらのうち11はRBI
遺伝子に変異があり (第1表参照)、染色される腫瘍
細胞はRBIをほとんど失った腫瘍細胞では5%以下で
あるところ(第4図C(参考写真3c)の4]OCaの
場合)から他の場合には約95%の細胞が反応性である
ところまである。第4図C(参考写真3c)では患者4
10からとった腫瘍切片の染色パターンが小群の腫瘍細
胞がRBI抗体と反応しく矢印)、残りの腫瘍細胞は陰
性であることを示している。これは癌組織の中の染色の
大部分の領域であった。殆どの癌組織では染色された腫
瘍細胞の割合とRBIに対する欠損あるいは再配列の程
度の間に明確な関係はなかった。反応しない核の分布は
腫瘍細胞の小さな群あるいは島(クラスター)といわれ
るもの、あるいは腫瘍の全体にばらまかれた細胞のよう
であった。後者のパターンは反応性が余り失われていな
い腫瘍においては優勢であった。
いろな程度に存在している。これらのうち11はRBI
遺伝子に変異があり (第1表参照)、染色される腫瘍
細胞はRBIをほとんど失った腫瘍細胞では5%以下で
あるところ(第4図C(参考写真3c)の4]OCaの
場合)から他の場合には約95%の細胞が反応性である
ところまである。第4図C(参考写真3c)では患者4
10からとった腫瘍切片の染色パターンが小群の腫瘍細
胞がRBI抗体と反応しく矢印)、残りの腫瘍細胞は陰
性であることを示している。これは癌組織の中の染色の
大部分の領域であった。殆どの癌組織では染色された腫
瘍細胞の割合とRBIに対する欠損あるいは再配列の程
度の間に明確な関係はなかった。反応しない核の分布は
腫瘍細胞の小さな群あるいは島(クラスター)といわれ
るもの、あるいは腫瘍の全体にばらまかれた細胞のよう
であった。後者のパターンは反応性が余り失われていな
い腫瘍においては優勢であった。
RBIにはっきりした変化のある癌の602Caだけは
RBI−Ab20に対する反応性をなくしたという証拠
はなかった。一つのRBIDNAプローフと再配列(第
2のRB’1DNAプローフを使った)によってこの腫
瘍からのDNAの分析が欠損を明らかにした。これら2
つの変異が同じ遺伝子座に関与し、正常な遺伝子座から
正常なRBI蛋白を生産させるということのようである
。
RBI−Ab20に対する反応性をなくしたという証拠
はなかった。一つのRBIDNAプローフと再配列(第
2のRB’1DNAプローフを使った)によってこの腫
瘍からのDNAの分析が欠損を明らかにした。これら2
つの変異が同じ遺伝子座に関与し、正常な遺伝子座から
正常なRBI蛋白を生産させるということのようである
。
RBI遺伝子に変異が検出されない5つの検体では検出
しうるRBI蛋白が欠けていて従って染色されない腫瘍
細胞がその中にあった。
しうるRBI蛋白が欠けていて従って染色されない腫瘍
細胞がその中にあった。
これらの場合のうち4個は切片中5%以下の腫瘍細胞が
染まらなかったが、一つは50%の細胞がR旧蛋白に対
して陰性であった。これらの試料はRBI発現に対して
陰性の細胞が少なくとも29%の腫瘍を含んでいる。
染まらなかったが、一つは50%の細胞がR旧蛋白に対
して陰性であった。これらの試料はRBI発現に対して
陰性の細胞が少なくとも29%の腫瘍を含んでいる。
以下余白
第1表
1 試料は全て他に示さなければ分泌腺癌である。
tub:導管の癌
2 試料は全て示されたもの以外は正常のR旧遺伝子構
成を持つ −:RB1の欠損、R:RB1再配置″ こ
の欄の数値はRBI特異性抗体と反応する腫瘍細胞の切
片中の割合を示す。
成を持つ −:RB1の欠損、R:RB1再配置″ こ
の欄の数値はRBI特異性抗体と反応する腫瘍細胞の切
片中の割合を示す。
4 この疾患の段階はわからない。しかし節は含まれな
い。
い。
5 疾患の段階は不明であるが節陽性である。
* 患者は乳癌(双方の)症歴を持つ。
初代の乳腺腫瘍細胞におけるRBI発現について得られ
たデータは、その腫瘍細胞にはRBIDN/にの欠損が
検出できるばかりかRBI蛋白の発現によって測定され
るRBIの機能の欠失もまた検出できる。さらに、組織
切片にRBI蛋白を検出するためにRBI抗体を使うこ
とで遺伝子の変異にみられるよりも大きなIIIBI機
能の欠損を見つけることができることを示している。R
旧抗体による組織切片の染色法はこの状況において非常
に有用である。
たデータは、その腫瘍細胞にはRBIDN/にの欠損が
検出できるばかりかRBI蛋白の発現によって測定され
るRBIの機能の欠失もまた検出できる。さらに、組織
切片にRBI蛋白を検出するためにRBI抗体を使うこ
とで遺伝子の変異にみられるよりも大きなIIIBI機
能の欠損を見つけることができることを示している。R
旧抗体による組織切片の染色法はこの状況において非常
に有用である。
本発明の抗体を使うことによってRBI遺伝子と遺伝子
の機能での変異は特別な腫瘍のタイプと同時に、その腫
瘍の程度や段階と関連付けられた。検出できる程度の遺
伝子の欠損はグレード■の腫瘍(導管の癌)にのみ見ら
れ、段階■の腫瘍には見られない。一般に、遺伝的なR
1変化の頻度は腫瘍の分化が少ないところと伝搬の程度
に応じて増加した(第2表)。また、腫瘍細胞における
RBI蛋白発現の欠失はより進んだ、余り分化していな
い腫瘍と関連している(第2表)。RBI蛋白の発現の
変異や欠失が短期間の(24ケ月以下の)乏しい予診と
関連付けられないけれど、RBI遺伝子の変化や欠失が
進んだ症状と関連できるので症状のない間隔とか5年間
生存との関係は長期間のフォローアツプデータがとれる
ときにはあきらかになろう。
の機能での変異は特別な腫瘍のタイプと同時に、その腫
瘍の程度や段階と関連付けられた。検出できる程度の遺
伝子の欠損はグレード■の腫瘍(導管の癌)にのみ見ら
れ、段階■の腫瘍には見られない。一般に、遺伝的なR
1変化の頻度は腫瘍の分化が少ないところと伝搬の程度
に応じて増加した(第2表)。また、腫瘍細胞における
RBI蛋白発現の欠失はより進んだ、余り分化していな
い腫瘍と関連している(第2表)。RBI蛋白の発現の
変異や欠失が短期間の(24ケ月以下の)乏しい予診と
関連付けられないけれど、RBI遺伝子の変化や欠失が
進んだ症状と関連できるので症状のない間隔とか5年間
生存との関係は長期間のフォローアツプデータがとれる
ときにはあきらかになろう。
第2表
グレードIの腫瘍が最も大きく、グレード■は最も少な
い分化をした腫瘍である。もし限定した範囲の腫瘍があ
るならばステージはIであり、腫瘍が存在し、一部のリ
ンパ節の関与が検出されるならステージは2である。
い分化をした腫瘍である。もし限定した範囲の腫瘍があ
るならばステージはIであり、腫瘍が存在し、一部のリ
ンパ節の関与が検出されるならステージは2である。
ステージ3は皮膚のつながりをもって多くの腫瘍が存在
すること(部分的な侵食)はステージ3を示す。ステー
ジ4の疾患は腫瘍プラス遠方への転移である。
すること(部分的な侵食)はステージ3を示す。ステー
ジ4の疾患は腫瘍プラス遠方への転移である。
ここに示したデータはRBI機能の損失がヒトの乳腺癌
の進行にとって重要である。網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉
腫等の患者での証拠では遺伝子の機能の欠失が腫瘍の遺
伝学にとって決定的な重要性を持つことが示されている
。
の進行にとって重要である。網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉
腫等の患者での証拠では遺伝子の機能の欠失が腫瘍の遺
伝学にとって決定的な重要性を持つことが示されている
。
この技術に通じたものはここに内在するものと同時に上
記の目的と成果を得るためのものとして本発明が容易に
評価できよう。ここに述べられた抗体や方法、技術等は
好ましい実施内容の代表的なもの、或は模範的と考えよ
うとしているが、本発明の展望を限定する意図はない。
記の目的と成果を得るためのものとして本発明が容易に
評価できよう。ここに述べられた抗体や方法、技術等は
好ましい実施内容の代表的なもの、或は模範的と考えよ
うとしているが、本発明の展望を限定する意図はない。
当業者は、この発明の精神の中にある、あるいはここに
おける請求の範囲の目指すところによって定義される修
正及び他の使用法を行えよう。
おける請求の範囲の目指すところによって定義される修
正及び他の使用法を行えよう。
本発明は以下の明細を読み、その一部を形成する添付の
図面を参照することによってよりよく理解されよう。 第1図はcDNAの5′端の染色体配列の部分を含むR
BlcDNA配列を示している。ATGゴドンにあるA
残基が1位として示されている。最も長し1リーデイン
グフレームのアミノ酸はそれをコードしているおのおの
の下に示されている。 第2図(参照写真1)はポリクローナル抗血清のRB−
AB20とRB−AB20から精製されたIgG両分に
よる標識されたRBI蛋白の沈降を示してしAる。 第3図(参照写真2a及び2b)はR1陽性の細胞系統
(SW613)とRBI陰性の細胞系統(IJDA−M
B468)のモノクローナル抗体RB−MAB20によ
る免疫組織学的染色を示している。 第4図(参照写真3a、3b及び3c)はヒトの乳腺組
織のRBI蛋白の免疫組織学的検出を示している。倍率
はすべて250倍。 図面は必ずしも等倍になっていない、本発明のある特徴
を尺度において誇張されたり、明快さと具体性のために
図解的な形で示されてしする。 (j < (j (j < (j 3 ← I−? (j < (j <く (≧
05゜。(j 、 (jら
ロ。 ′ Σ ′ >” ”、p”zく4
← 0 トー く←
[″−<−68−81
図面を参照することによってよりよく理解されよう。 第1図はcDNAの5′端の染色体配列の部分を含むR
BlcDNA配列を示している。ATGゴドンにあるA
残基が1位として示されている。最も長し1リーデイン
グフレームのアミノ酸はそれをコードしているおのおの
の下に示されている。 第2図(参照写真1)はポリクローナル抗血清のRB−
AB20とRB−AB20から精製されたIgG両分に
よる標識されたRBI蛋白の沈降を示してしAる。 第3図(参照写真2a及び2b)はR1陽性の細胞系統
(SW613)とRBI陰性の細胞系統(IJDA−M
B468)のモノクローナル抗体RB−MAB20によ
る免疫組織学的染色を示している。 第4図(参照写真3a、3b及び3c)はヒトの乳腺組
織のRBI蛋白の免疫組織学的検出を示している。倍率
はすべて250倍。 図面は必ずしも等倍になっていない、本発明のある特徴
を尺度において誇張されたり、明快さと具体性のために
図解的な形で示されてしする。 (j < (j (j < (j 3 ← I−? (j < (j <く (≧
05゜。(j 、 (jら
ロ。 ′ Σ ′ >” ”、p”zく4
← 0 トー く←
[″−<−68−81
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、網膜芽腫遺伝子の網膜芽腫遺伝子(RB1)蛋白産
物に特異的に結合する親和性をもつた抗体。 2、抗体がポリクロナール抗体である請求項1記載の抗
体。 3、抗体がモノクロナール抗体である請求項1記載の抗
体。 4、網膜芽腫遺伝子(RB1)蛋白配列のC末端、また
はその近傍にあるペプチドで宿主動物を免疫することに
よって生産される請求項1記載の抗体。 5、【遺伝子配列があります】 及び 【遺伝子配列があります】 からなる群からペプチドが選ばれる請求項4記載の抗体
。 6、網膜芽腫遺伝子(RB1)蛋白と特異的な免疫反応
するモノクロナール抗体を生産するネズミのハイブリド
ーマ。 7、【遺伝子配列があります】 及び 【遺伝子配列があります】 からなる群から選ばれたペプチド配列に特異的に結合す
る親和力を持つモノクロナール抗体を生産する請求項6
記載のハイブリドーマ。 8、抗体が網膜芽腫遺伝子(RB1)−MAb20であ
る請求項7記載のハイブリドーマ。 9、請求項7記載のハイブリドーマによって生産される
モノクロナール抗体。 10、腫瘍から組織切片を調製し、請求項1−5記載の
いずれかの抗体あるいは請求項8記載の抗体をその組織
切片とインキュベートし、その組織切片への抗体の特異
的結合の有無を検出するステップを含む腫瘍中の網膜芽
腫遺伝子(RB1)蛋白のないことを検出する方法。 11、腫瘍から組織切片を作り、請求項1−5記載のい
ずれかまたは請求項8記載の抗体と調製した組織切片と
をインキュベートし、その組織切片に対する抗体の特異
的結合を検出するステップを含む網膜芽腫遺伝子(RB
1)蛋白を欠いている細胞を検出する方法。 12、請求項11記載の方法によって網膜芽腫遺伝子(
RB1)蛋白を欠損している腫瘍細胞の数を測定するこ
とを含む癌患者の予診として予測する方法。 13、患者の腫瘍から組織切片を作り、請求項1−5記
載のいずれかまたは請求項8記載の抗体と調製した組織
切片とをインキュベートし、その組織切片に対する抗体
の特異的結合を検出し、網膜芽腫遺伝子(RB1)蛋白
を欠損している細胞の数を測定するステップを含む癌患
者の予診としての予測する方法。 14、腫瘍が乳腺の癌、卵巣癌、胆嚢癌、肺癌、子宮け
い部の癌、および軟組織肉腫からなる群から選択される
腫瘍からのものである請求項12記載の方法。 15、腫瘍が乳腺の癌、卵巣癌、胆嚢癌、肺癌、子宮け
い部の癌、および軟組織肉腫からなる群から選択される
腫瘍からのものである請求項13記載の方法。 16、腫瘍が網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉腫からなる群か
ら選択される請求項12記載の方法。 17、腫瘍が網膜芽腫、骨肉腫、繊維肉腫からなる群か
ら選択される請求項13記載の方法。 18、腫瘍を生検し、その腫瘍組織から組織切片を調製
し、その組織切片を抗体−抗原結合体を形成させるため
に請求項1−5記載のいずれかまたは請求項8記載の抗
体とインキュベートし、そして、形成された抗体−抗原
結合体を検出するステップを含む癌患者の診断と予診を
するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33208289A | 1989-03-31 | 1989-03-31 | |
US332082 | 1989-03-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04193900A true JPH04193900A (ja) | 1992-07-13 |
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JP (1) | JPH04193900A (ja) |
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AU (1) | AU638238B2 (ja) |
CA (1) | CA2013544C (ja) |
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IL (1) | IL93941A (ja) |
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US5550020A (en) * | 1994-07-08 | 1996-08-27 | Visible Genetics Inc. | Method, reagents and kit for diagnosis and targeted screening for retinoblastoma |
US5545527A (en) * | 1994-07-08 | 1996-08-13 | Visible Genetics Inc. | Method for testing for mutations in DNA from a patient sample |
JP2000510330A (ja) * | 1996-04-05 | 2000-08-15 | トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ | 癌の診断および予後のための方法 |
US5840506A (en) * | 1996-06-05 | 1998-11-24 | Thomas Jefferson University | Methods for the diagnosis and prognosis of cancer |
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