KR20090003308A

KR20090003308A - Ｒｅｇ４ 단백질을 이용한 췌장암 진단 방법

Info

Publication number: KR20090003308A
Application number: KR1020087024246A
Authority: KR
Inventors: 유스케 나카무라; 히데와키 나카가와; 슈이치 나카츠루
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2009-01-09
Also published as: RU2008139098A; CN101438167A; US20090155799A1; BRPI0708409A2; JP2009528507A; WO2007102526A1; CA2645125A1; EP1991872A1

Abstract

REG 패밀리의 새로운 구성원인 REG4는 췌장 선암의 바이오마커로 확인되었다. 본 발명은 절제가능한 췌장암 환자, 즉 PDAC의 혈청 REG4를 검출하기 위한 샌드위치 ELISA 법을 제공한다. 또한 본 발명은 혈청학적 마커로서 REG4를 사용하여 췌장암을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

ＲＥＧ４ 단백질을 이용한 췌장암 진단 방법{METHODS FOR DIAGNOSING PANCREATIC CANCER USING REG4 PROTEIN}

본 출원은 2006년 3월 2일 제출된 미국 가출원 번호 제 60/779,161호의 우선권 주장을 통해서 청구하고, 본 발명의 내용은 전체적으로 상기 문헌의 내용으로 통합된다.

본 발명은 생물과학, 보다 상세하게는 암 진단 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈청학적 마커로서 REG4 단백질을 이용한 췌장암 진단 방법 및 진단용 시약 및 키트에 관한 것이다.

췌관선암(Pancreatic ductal adenocarcinoma; PDAC)은 서구세계에서 암 사망의 다섯번째 주요한 원인이고, 오직 4%만이 5년 생존율을 나타내는 악성종양 중 가장 높은 사망률을 나타낸다(DiMagno EP, et al., (1999) Gastroenterology.;117(6): 1464-84., Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.;11(1): 23-31.). 미국에서 대략 30,700명의 환자들이 췌장암으로 진단되 면, 그들의 대략 30,000명은 상기 질환으로 사망할 것이다(Jemal A, et al., (2003) CA Cancer J Clin.; 53(1): 5-26.). PDAC 환자의 대부분은 진행 단계에서 진단되기 때문에, 현재까지 효과적인 치료법은 없다; 오직 외과 절제술에 의해서만 약간의 치료 가능성이 있지만, 수술한 PDAC 환자의 80-90%는 재발하고, 상기 질환으로 사망한다(DiMagno EP, et al., (1999) Gastroenterology.;117(6):1464-84., Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.;11(1):23-31). 방사선을 이용하거나 이용하지 않고, 5-FU 또는 젬시타빈(gemcitabine) 등의 화학요법 및 수술 등의 시도들은 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있지만(DiMagno EP, et al., (1999) Gastroenterology.; 117(6):1464-84., Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.; 11(1):23-31), 상기 치료들이 극단적으로 침습적이고 화학-저항성 특성에 기인하여 PDAC 환자의 긴 생존 기간에는 제한된 효과를 나타낸다. 그러므로 진행 단계의 대부분의 PDAC 환자들의 치료는 일시적으로 고통을 경감하는 수단에 집중된다(DiMagno EP, et al., (1999) Gastroenterology.; 117(6):1464-84., Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.; 11(1):23-31).

PDAC의 상기 무서운 예후는 초기단계에 PDAC를 검출하기 어려운 점 등을 포하하여 여러 원인으로부터 발생한다(Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.; 11(1):23-31). 내시경 초음파검사(endoscopic ultrasonography; EUS) 또는 자기 공명 담관이자조영술(magnetic resonance cholangiopancreatography; MRCP)과 같은 영상화 진단의 발전에도, 대부분의 환자들은 질병 후기까지 증상이 나타나지 않아서, 증상이 명시적으로 나타날 때까지 영상화 진찰 절차를 수행하지 않는다. 전립 선암에서 전립선 특이적 항원(prostate-specific antigen; PSA)과 같은 정확하고 용이한 혈청학적 검사는 명확하게 드러나는 증상 없이 초기에 PDAC를 검출할 수 있도록 하고, 상기 검사에 의한 탐색은 초기 PDAC를 검출하기 위하여 수많은 개체에게 적용될 수 있다. 초기 췌장암의 외과 절제술의 생존률은 5년 생존률이 50-60%로 상대적으로 양호한 예후를 제공할 수 있지만, 진행성 췌장암의 생존률은 고각 몇 %이다(Zervos EE, et al., (2004) Cancer Control.; 11(1):23-31). PDAC의 화학요법에 대한 생물학적 적극성 그리고 저항성을 고려하면, 치명적인 PDAC의 예후를 개선하기 위한 가장 현실적인 전략은, 고위험 개체군을 비침습성 혈청학적 검사에 의하여 탐색하고 외과 절제술로 치료할 수 있는 초기-단계 PDAC를 검출하는 것이다. 현재 CA19-9는 PDAC에 대한 유일하게 상업적으로 이용 가능한 혈청학적 마커이나, 개인의 대략 10-15%의 개인들은 그들의 루이스(Lewis) 항원 상태 때문에 CA19-9를 분비하지 않고, 췌장암이 초기 단계이고 징후가 없으면 CA19-9 수준은 보통 정상범위 안에 있고 수치에 별 차이가 없다(Sawabu N, et al., (2004) Pancreas.;28(3):263-7., Pleskow DK, et al., (1989) Ann Intern Med.;110(9):704-9). 그러므로 PDAC에 대한 신규 종양 마커의 확립 및 전립선 암의 PSA와 같은 혈청학적 마커를 이용하여 초기 단계 췌장암을 검출하는 탐색 전략이 긴급하게 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 췌장암에서 특이적으로 과발현하는 REG4 유전자를 발견한 것으로부터 기인한다.

본 발명자들의 전유전체 cDNA 마이크로어레이분석 중(Nakamura T, et al., (2004) Oncogene.; 23(13):2385-400, WO2004/031412) PDAC 세포에서 발현량이 증가하는 것으로 확인된 많은 유전자들 중, 본 발명자들은 본 연구를 위해 REG4(GenBank Accession NO. AY126670; 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열)에 집중했다. 시험된 유익한 10개의 경우에서 REG4의 발현량이 고농도로 증가하는 것이 본 발명자들의 20개의 미세절편 PDAC 개체의 마이크로어레이 데이타에서 나타났고(Nakamura T, et al., (2004) Oncogene; 23(13):2385-400), 또한 이번에 이것의 과발현이 이전의 마이크로어레이 분석에서 사용되었던 12개의 미세절편-PDAC 세포 개체군의 6개에서 RT-PCR에 의해 확인되었다(도 1A). 이전 연구에서, 또한 REG4가 REGIV (GenBank Accession Number AA316525)로 참조되었더라도, REG4와 REGIV는 동일한 분자이다.

본 발명자들이 췌장암 조직에서 REG4 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인했더라도, 초기 단계 종양 또는 예후가 좋은 것으로 기대되는 PDAC 환자의 혈액에서 REG4의 발현량이 증가된 것을 발견한 것은 본 발명에서 처음이다. 게다가 췌장암 환자의 혈액에서 REG4의 향상된 발현은 상기 유전자 및 이의 단백질이 신규의 진단 마커로서 유용한 것을 제안한다(즉, 전혈, 혈청, 또는 혈장). 또한, 본 발명자들은 절제가능한 PDAC 환자에서 혈청 REG4를 검출하기 위한 샌드위치 ELISA법을 수립하였다.

또한 본 발명은 개체로부터 수득한 혈액 시료에서 REG4의 발현량을 결정하고, 상기 발현량을 참조용 시료, 일반적으로 정상 대조군의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 개체의 췌장암 진단 방법을 제공한다. 시료에서의 REG4의 고농도 발현은 상기 개체가 췌장암에 걸렸거나 췌장암 유발 위험에 처한 것을 나타낸다. 상기 용어 "정상의 대조군 발현량"은 정상의 건강한 개인 또는 췌장암에 걸리지 않은 것을 알고 있는 개인의 개체군과 관련된 발현량을 지시한다.

REG4의 발현량은 ELISA와 같은 면역측정법을 사용하여 REG4 단백질을 검출함으로서 결정될 수 있다.

개체-유래 혈액 시료는 개체, 예를 들면 췌장암에 걸린 것이 알려졌거나 의심되는 환자로부터 수득한 전혈, 혈청 및 혈장에서 수득할 수 있다.

추가로, 본 발명은 개체-유래 혈액 시료에서 CA19-9의 발현량을 결정하고, 상기 발현량을 참조 시료, 일반적으로 정상 대조군의 CA19-9 발현량과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 개체에서의 췌장암 진단 방법을 제공한다. 본 발명자들은 REG4 및 CA19-9 발현량을 함께 고려함으로써 더욱 감도 높게 췌장암 환자를 확인할 수 있는 것을 발견하였다.

추가로, 본 발명은 항-REG4 항체를 포함하는 REG4 검출용 면역측정용 시약을 제공한다. 상기 항-REG4 항체는 각각의 REG4의 상이한 항원 결정기를 인식하는 다클론 항체 및 단일클론 항체 또는 적어도 두 개의 단일클론 항체를 포함할 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 (i) 혈액 시료의 REG4 발현량을 측정하기 위한 면역측정용 시약; 및, (ii) REG4에 대한 양성 대조군 시료를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 추가로 (iii) 혈액 시료의 CA19-9 발현량을 결정하기 위한 면역측정용 시약; 및 (iv) CA19-9에 대한 양성 대조군 시료를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다. 본 발명의 전술한 요약 및 하기 상세한 설명은 바람직한 구체화이고, 본 발명 또는 본 발명의 다른 구체화에 제한되지 않는다.

본 명에서에서 사용된 용어 "하나", "하나의", 및 "상기"는 특별히 지시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미한다.

본 발명에서 REG(regenerating islet-derived) 패밀리(Hartupee JC, et al., (2001) Biochim Biophys Acta.; 1518(3):287-93)의 새로운 구성원인 REG4는 체장 선암의 바이오마커로 확인되었다. 본 발명자들은 미세절편 췌장암 세포의 전유전체 cDNA 마이크로어레이를 보고한 바 있다(Nakamura T, et al., (2004) Oncogene.; 23(13):2385-400). 비록, 상기 보고서에서 REG4가 췌장암 세포에서 과발현되는 것이 발견되었더라도, 혈액에서 REG4의 발현량이 췌장암과 어떻게 관련된 것인지에 대한 증거는 없다. REG 패밀리는 소화기관의 조직 재생 및 염증과 관련된 분비 분자이고(Hartupee JC, et al., (2001) Biochim Biophys Acta.; 1518(3):287-93., Watanabe T, et al., (1990) J Biol Chem.; 265(13):7432-9., Unno M, et al., (1992) Adv Exp Med Biol.; 321:61-6; discussion 67-9), REG 패밀리는 여러 위장 암에서 발현량이 증가하며(Unno M, et al., (1992) Adv Exp Med Biol.; 321:61-6; discussion 67-9., Lasserre C, et al., (1992) Cancer Res.; 52(18):5089-95., Kamarainen M, et al., (2003) Am J Pathol.; 163(1):11-20), 종양에서 영양 또는 항-아폽토시스 인자로 작용할 수 있으나(Lasserre C, et al., (1992) Cancer Res.; 52(18):5089-95), 그들의 병태 생리 기능, 특히, 신규 구성원인, REG4의 기능 및 발현 양상은 아직 불명확하다. 본 발명자들은 REG4-특이적 항체를 제조하였고, 항-REG4 항체를 이용한 면역조직화학법에 의해 PDAC 세포에서 REG4의 과발현을 증명하였다. 추가로 본 발명자들은 PDAC 환자의 혈청에서 REG4 발현량을 측정하기 위한 샌드위치 ELISA 시스템을 수립하였고, 췌장암의 새로운 혈청학적 마커로서 REG4의 용도를 증명하였다.

췌장암 진단:

개체-유래 혈액 시료에서 REG4의 발현량을 측정함으로써, 췌장암 발생 또는 개체에서 췌장암으로 발전할 경향을 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 혈액 시료에서 REG4의 발현량을 결정(예를 들면, 측정)하는 단계를 포함한다. 본 발명에서 또한 췌장암 진단 방법은 췌장암 검사 또는 검출 방법을 포함한다. 또한 차선책으로 본 발명에서 췌장암 진단은 개체에서 췌장암의 의심, 위험, 또는 가능성을 나타내는 것에 관련된다.

REG4 유전자 또는 REG4 단백질이 시료에서 검출될 수 있는 한, 어떠한 혈액 시료들도 REG4 발현량 결정을 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는 상기 혈액 시료는 전혈, 혈청 및 혈장을 포함한다.

본 발명에서 "혈액 시료 내 REG4의 발현량"은 전혈에서 미립자의 부피를 보정한 후, 상기 혈액에 존재하는 REG4의 농도를 나타낸다. 당업자는 혈액 내 미립자의 부피의 백분율이 개인 사이에 매우 다르다는 것을 인식하고 있을 것이다. 예를 들면, 전혈에 있는 적혈구의 백분율은 남자와 여자 사이에서 아주 다르다. 게다가, 개인 차도 무시될 수 없다. 그러므로 미립자 성분을 포함하는 상기 전혈 내 물질의 분명한 농도는 미립자 부피의 백분율에 따라 매우 변화한다. 예를 들면, 비록 혈청 내 농도가 동일하더라도, 다량의 미립자의 성분을 가진 시료에 대한 측정값은 소량의 미립자 성분을 가진 시료를 위한 수치 보다는 더 낮을 것이다. 그러므로 혈액 내 성분의 측정된 값을 비교하기 위해, 보정된 미립자의 부피 값이 보통 이용된다.

예를 들면, 전혈에서 혈구 세포를 분리해서 수득한 혈청 또는 혈장을 시료로 사용하여 상기 혈액 내 성분 측정에 의해, 미립자 부피가 제거된 효과로부터 측정된 값을 수득할 수 있다. 그러므로 본발명에서 REG4의 발현량은 혈청 또는 혈장에 있는 농도로 보통 결정될 수 있다. 차선책으로, 첫째로 전혈 내 농도로 측정될 수 있고, 그 후에 미립자 부피로부터 효과가 보정될 수 있다. 전혈시료 내 미립자의 부피 측정 방법은 알려져 있다.

본 발명에 다른 췌장암으로 진단될 수 있는 개체들은 바람직하게는 포유류이고, 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 및 소를 포함한다. 본 발명의 바람직한 개체는 인간이다. 본 발명에서 개체는 위장계(예를 들면, 췌장)에 종양이 있을 것으로 의심되는 환자 또는 건강한 개인이다. 상기 환자는 임상학적 의사결정을 용이하게 하기 위해 본 발명에 의해 진단될 수 있다. 또 다른 구체화에서, 본 발명은 위장계(즉, 췌장)의 종양을 탐색하기 위해 건강한 개인에게 적용될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체화에서, REG4의 발현량은 혈액 시료에서 REG4 단백질의 양을 측정하기 위해 결정될 수 있다. 혈액 시료에서 REG4 단백질의 정량 또는 농도를 측정하기 위한 방법에는 면역측정법을 포함한다.

본 발명의 진단 방법에서, 췌장암을 검출하기 위해 REG4의 혈액 농도에 추가로 CA19-9의 혈액 농도가 결정될 수 있다. 그러므로 본 발명은 REG4의 혈액농도 또는 CA19-9의 혈액농도, 또는 두 값이 모두 건강한 개인보다 높을 때, 췌장암이 검출되는 것을 특징으로 하는 췌장암 진단 방법을 제공한다.

CA19-9이 췌장, 결장, 위 및 난소종양에 대한 혈청학적 종양 마커인 것을 이미 잘 알려져 있다. CA19-9의 에피토프는 루이스(a) 혈액 그룹 결정기에 대응하는 시알산 잔기가 추가된 당단백(뮤신)의 당지질이다. 상기 항원은 인간 결장직장암세포주에서 찾아낸 결정기에 대하여 증가한 단일클론 항체에 의해 정의된다. 또한 상기 항원은 성인 췌장, 타액관, 위 및 결장 상피, 췌장액, 위액, 침 및 태변뿐만 아니라 정상적인 태아 조직 등에도 있다. CA19-9는 담즙 체계에 의해 순환계에서 제거된다. 상기 항원은 개체의 대략 5%에 해당하는 루이스(a-b-) 유전자형을 가진 사람에서는 발현되지 않는다.

상기 기술한 대로, CA19-9는 이미 췌장암 진단 또는 검출을 위한 혈청학적 마커로 사용되고 있다. 그러나 완벽한 췌장암 검출을 위한 마커로는 CA19-9의 감도는 약간 부족하다. 그러므로 췌장암 진단의 감도를 개선하는 것이 요구된다.

본 발명에서 신규 췌장암 진단용 혈청학적 마커인 REG4가 제공된다. 췌장암 진단 또는 검출 방법의 감도의 향상은 본 발명에 의해 달성될 수 있다. 즉, 본 발명은

(a) 진단할 개체의 혈액 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 혈액 시료에서 REG4 발현량을 결정하는 단계; 및,

(c) 단계 (b)에서 측정된 REG4 발현량을 정상 대조군의 REG4 발현량과 비교하여, 상기 정상 대조군 보다 상기 혈액 시료의 REG4 발현량이 높은 경우, 췌장암 환자로 표시하는 단계를 포함하는 개체의 췌장암 진단 방법을 제공한다.

바람직한 구체화에서, 본 발명의 진단 또는 검출 방법은

(e) 상기 혈액 시료 내의 CA19-9 발현량을 결정하는 단계;

(f) 단계 (e)에서 측정된 CA19-9 발현량을 정상 대조군의 CA19-9 발현량과 비교하는 단계; 및

(g) 상기 정상 대조군과 비교하여, 상기 혈액 시료의 REG4 및 CA19-9 발현량 각각 또는 모두가 높은 경우, 췌장암 환자로 표시하는 단계를 추가로 포함한다.

REG4 및 CA19-9의 조합에 의해, 췌장암 검출 감도는 현저히 개선될 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에서 분석된 그룹에서, 췌장암에 대한 CA19-9의 양성 비율은 대략 76.3%이다. 비교예에서, CA19-9 및 REG4를 조합한 결과 88.1%로 증가하였다(도 6). 본 발명에서 "CA19-9 및 REG4의 조합"은 마커로 사용되는 CA19-9 및 REG4 각각 또는 모두의 발현량을 나타낸다. 바람직한 구체화에서, CA19-9 및 REG4 중 어느 것이든 양성인 환자는 높은 췌장암 위험성을 가진 것으로 판단될 수 있다. 췌장암 진단을 위한 혈청학적 마커로 REG4 및 CA19-9의 조합의 용도는 신규하다.

그러므로 본 발명은 CA19-9를 단독으로 측정한 결과에 근거한 결정과 비교하여 췌장암 환자 검출 감도를 현저히 증가시킬 수 있다. 상기 개선의 배후는 CA19-9-양성 환자 그룹 및 REG4-양성 환자 그룹이 완벽하게 일치하지 않는 다는 사실이다. 상기 사실은 추가로 하기에서 특이적으로 기술된다.

첫째로, CA19-9 측정 결과에 따라 표준값보다 낮은 값으로 결정된 환자들 중(즉, 췌장암이 아님), 췌장암에 걸린 환자가 실제로 특정 비율로 존재한다. 그런 환자는 CA19-9-거짓 음성 환자로 불린다. CA19-9에 근거한 결정과 REG4에 근거한 결정을 조합함으로써, CA19-9-거짓 음성 환자 중 표준값보다 더 높은 REG4 값의 환자를 발견할 수 있다. 다시 말하면 본 발명은 CA19-9의 낮은 혈액농도 때문에 "음성"으로 결정된 환자 중에서, 실제로 췌장암이 있는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 췌장암 환자 검출을 위한 감도는 본 발명에 의해 하기와 같이 개량된다. 일반적으로, 단순히 다수의 마커를 사용하여 결정된 결과를 조합하는 것은 검출 감도를 증가할 수도 있으나, 반면에 종종 특이성의 감소를 일으키는 원인이 된다. 그러나 감도와 특이성 사이에서 최고의 균형을 결정함으로써, 본 발명은 특이성의 손상 없이 검출 감도를 증가할 수 있는 독특한 조합을 결정했다.

예를 들면 본 발명에서 동시에 CA19-9 측량의 결과를 고려하기 위하여, REG4의 측정값 및 표준값 사이의 전술한 비교와 동일한 방법으로 CA19-9의 혈액 농도가 측정 되고 표준값과 비교될 수 있다. 예를 들면, CA19-9의 혈액농도를 측정하고 표준값과 비교하는 방법은 이미 알려져 있다. 게다가, CA19-9를 위한 ELISA 키트는 상업적으로 이용 가능하다. 알려진 보고에서 기술된 상기 방법은 본 발명의 췌장암 진단 또는 검출을 위한 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 REG4의 혈액 농도의 표준값은 통계적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 건강한 개인의 REG4의 혈액 농도는 REG4의 표준 혈액농도를 통계적으로 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 통계적으로 충분한 개체가 수집될 때, 평균값으로부터 2 내지 3 배의 표준 편차(standard deviation ; S.D.) 범위 내의 수치는 표준값으로 자주 사용한다. 그러므로 평균값 + 2 x S.D. 또는 평균값 + 3 x S.D. 에 상응하는 값은 표준값으로 이용될 수 있다. 이론적으로 기술된 대로 놓인 표준값은 건강한 개인의 90% 및 99.7%를 각각 포함한다

또한 차선책으로, 표준값은 췌장암 환자의 REG4의 실제적인 혈액 농도에 근거를 두어 놓일 수 있다. 일반적으로, 표준값은 거짓 음성의 백분율을 최소화하는 방법으로 놓이고, 검출 감도를 최대화할 수 있는 조건을 만족시키는 수치의 범위에서 선정된다. 본 명세서에서, 거짓 가능성의 백분율은 건강한 개인 중에서 REG4의 혈액 농도가 표준값보다 높은 것으로 판단된 환자의 백분율을 나타낸다. 반대로, 건강한 개인 중에서, REG4의 혈액 농도가 표준값보다 낮은 것으로 판단된 환자의 백분율은 특이성을 나타낸다. 다시 말하면 거짓 가능성 백분율 및 특이성의 합계는 항상 1이다. 상기 검출 감도는 췌장암의 존재가 결정된 개인들의 개체군 내의 모든 췌장암 환자 중에서 REG4의 혈액농도가 표준값 보다 높은 것으로 판단된 환자의 백분율을 나타낸다.

게다가, 본 발명에서 REG4 농도가 표준값보다 높은 것으로 판정된 환자들 중 췌장암 환자의 백분율은 양성 예상값을 나타낸다. 반면에 REG4 농도가 표준값보다 낮은 것으로 판정된 환자들 중 건강한 개인의 백분율은 음성 예상값을 의미한다. 상기 값들의 상관 관계는 표 1에서 요약하였다. 하기에서 보여진 관계가 나타낸 대로, 췌장암 진단 정확도 평가를 위한 인덱스인 감도, 특이성, 양성 예상값, 및 음성 예상값에 대한 각각의 값들은 REG4의 혈액 농도의 수준을 평가하기 위한 표준값에 따라 변화한다.

REG4의 혈액 농도	췌장암 환자	건강한 개인
고	a: 진양성	b: 거짓 양성	양성 예상값 a/(a+b)
저	c: 거짓 음성	d: 진음성	음성 예상값 d/(c+d)
	감도 a/(a+c)	특이성 d/(b+d)

이미 언급되는 것과 같이, 표준값은 보통 거짓 양성 비율이 낮고, 감도가 높아지도록 정해진 것을 사용한다. 그러나 또한 상기 보여진 관계에서 명백한 것처럼, 거짓 양성 비율 및 감도 사이에는 교환(trade-off)이 있다. 다시 말하면 표준값이 감소할 경우, 상기 검출 감도는 증가한다. 그러나 또한 거짓 양성 비율이 증가하기 때문에, "낮은 거짓 양성 비율"을 갖는 조건을 만족하기 어렵다. 상기 상황을 고려하여, 예를 들면, 하기 예상 결과를 주는 값은 본 발명에서 바람직한 표준값으로 선택될 수 있다.

거짓 양성 비율이 50% 이하인 표준값(다시 말하면 특이성이 50% 이하인 표준값).

감도가 20% 이하가 아닌 표준값.

본 발명에서 상기 표준값은 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 사용하여 조절될 수 있다. ROC 곡선은 수직축에 검출 감도를 나타내고, 수평축에서 거짓 양성 비율(즉, "1-특이성")을 나타내는 그래프이다. 본 발명에서 ROC 곡선은 REG4의 혈액 농도의 고/저 정도를 결정하기 위해 표준값을 지속적으로 다양하게 하여 수득되는, 상기 특이성 및 거짓 양성 비율의 변화를 도표화하여 수득될 수 있다.

상기 ROC 곡선을 수득하기 위한 상기 "표준값"은 통계 분석에 일시적으로 사용된 값이다. 상기 ROC 곡선을 수득하기 위한 상기 "표준값"은 일반적으로 모든 선택할 수 있는 표준값을 포함하는 것을 허용하는 범위 안에서 지속적으로 변화될 수 있다. 예를 들면, 표준값은 분석한 개체에서 가장 작고 가장 큰 REG4 측정값 사이에서 변화될 수 있다.

수득한 ROC 곡선을 근간으로, 본 발명에서 사용될 바람직한 표준값은 상술하는 조건을 만족시키는 범위에서 선정될 수 있다. 차선책으로, 표준값은 REG4 측정값의 대부분을 포함하는 범위에서 표준값을 변화해서 생성한 ROC 곡선에 근거하여 선정될 수 있다.

혈액 내 REG4는 단백질을 정량할 수 있는 어떤 방법으로도 측정될 수 있다. 예를 들면, 면역측정법, 액체 크로마토그래피, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR), 질량 분석 등이 본 발명에서 이용될 수 있다. 질량 분석에서, 단백질은 적당한 내부 표준을 사용해서 정량할 수 있다. 예를 들면, 동위원소로 표지된 REG4를 내부 표준으로 이용할 수 있다. 혈액 내 REG4의 농도는 혈액 내 REG의 피트 감도 및 내부 표준의 피트 감도로부터 결정될 수 있다. 일반적으로, 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석법(matrix-assisted laser desorption/ionization; MALDI)이 단백질의 질량 분석을 위해 사용된다. 또한 질량 분석 또는 액체 크로마토그래피를 사용하는 분석 방법으로, REG4는 다른 종양 마커들(예를 들면 CA19-9)과 동시에 분석될 수 있다.

본 발명에서 REG4 측정을 위한 바람직한 방법은 면역측정법이다. REG4의 아미노산서열은 알려져 있다(Genbank Accession Number AY126670). REG4의 아미노산 서열은 서열번호 14로 기재되고, 이를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13으로 기재된다. 그러므로 당업자들은 REG4의 아미노산 서열에 근거하여 필요한 면역원을 합성함으로써 항체를 제조할 수 있다. 면역원으로 이용된 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 합성 펩티드는 담체 단백질에 연결해서 면역원으로 이용될 수 있다.

KLH(Keyhole limpet hemocyanin), 미오글로빈, 알부민 등이 담체 단백질로 이용될 수 있다. 바람직한 담체 단백질은 KLH, 소혈청 알부민 등이다. 일반적으로 메일이미도벤조일-N-하이드로숙신아마이드 에스테르 방법(maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester method; 이하 MBS 방법으로 함) 등이 담체 단백질에 합성 펩티드를 연결하기 위하여 이용된다.

특히, 시스테인이 합성 펩티드로 도입되고, 상기 펩티드는 상기 시스테인의 SH 그룹을 이용하여 MBS 방법에 의해 KLH에 교차 결합된다. 상기 시스테인 잔기는 합성 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 도입될 수 있다.

차선책으로, REG4는 REG4의 뉴클레오티드 서열(Genbank Accession Number AY126670), 또는 그의 일부분을 사용하여 제조될 수 있다. 필요한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA는 REG4 발현 조직으로부터 준비한 mRNA를 사용하여 클로닝될 수 있다. 차선책으로, 상업적으로 이용 가능한 cDNA 라이브러리를 클로닝 출처로 이용할 수 있다. 또한 수득한 REG4의 유전적 재조합체, 또는 이의 단편도 면역원으로 이용될 수 있다. 이와 같이 발현된 REG4 재조합체는 본 발명에서 이용된 항체를 수득하기 위한 면역원으로 바람직하다. 상업적으로 이용 가능한 REG4 재조합체(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Product No: PRO-424)도 면역원으로 사용될 수 있다.

이와 같이 수득한 면역원은 적당한 면역보조제와 혼합하여 동물을 면역하기 위하여 이용된다. 알려진 면역보조제에는 Freund의 완전한 면역보조제(Freund's complete adjuvant; FCA) 및 불완전한 보조제가 포함된다. 상기 면역주사 절차는 적합한 간격으로 항체 역가의 증가가 확인될 때까지 반복된다. 본 발명에서 면역화된 동물에는 특정한 제한이 없다. 특히, 마우스, 래트, 또는 토끼와 같은 면역주사를 위해 통용되는 동물이 이용될 수 있다.

단일클론 항체를 수득할 때에는, 생산에 유리한 동물이 이용될 수 있다. 예를 들면 마우스에서 세포융합을 위한 많은 골수종 세포주가 알려져 있고, 높은 확률을 가진 융합세포 설립을 위한 기술이 이미 잘 알려져 있다. 그러므로 마우스는 단일클론 항체를 얻기에 바람직한 면역화된 동물이다.

게다가, 면역주사 처리는 생체외 처리로 제한되지 않는다. 또한 생체외에서 배양한 면역적격세포를 면역학으로 감작하기 위한 방법이 채택될 수 있다. 상기 방법에 의해 수득한 항체-생산 세포는 형질전환 및 클로닝 될 수 있다. 단일클론 항체를 수득하기 위해 항체-생산 세포를 형질전환하기 위한 방법은 세포융합으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 바이러스 감염에 의해 클로닝될 수 있는 형질전환체를 수득하기 위한 방법이 알려져 있다.

본 발명에서 이용된 단일클론 항체를 생성하는 융합세포는 REG4에 대한 반응성에 근거하여 탐색될 수 있다. 특히, 항체-생산 세포는 면역원으로 사용된 REG4, 또는 이의 도메인 펩티드에 대한 결합 활성을 인덱스로 하여 일차로 선정된다. 상기 탐색에 의해 선택된 양성 클론은 필요한 만큼 서브클로닝 된다.

본 발명에서 사용될 단일클론 항체는 적당한 조건 하에서 설립한 융합세포를 배양하고 생산된 항체를 모아서 수득할 수 있다. 상기 융합세포가 동형융합세포 일때, 동계 동물의 복강내로 접종해서 생체내에서 배양될 수 있다. 이런 경우에, 단일클론 항체는 복수액(ascites fluid)으로 모아진다. 이형융합세포가 이용될 때, 누드 마우스를 숙주로 사용하여 생체내에서 배양될 수 있다.

또한 생체내 배양 이외에, 융합세포는 적당한 배양 환경에서 일반적으로 ex vivo로 배양된다. 예를 들면, RPMI 1640 및 DMEM과 같은 기본 배지는 융합세포를 위한 배지로 일반적으로 사용된다. 동물 혈청과 같은 첨가물은 항체-생산 능력을 높게 유지하게 위하여 상기 배지에 첨가될 수 있다. 융합세포가 ex vivo로 배양될 때, 상기 단일클론 항체는 배양 상등액으로 모아질 수 있다. 배양 상등액은 배양 후에 세포로부터 분리하여 수집될 수 있거나, 중공사(hollow fiber)를 사용한 배양 기구를 사용하여 배양하는 동안 연속적으로 수집될 수 있다.

본 발명에서 이용된 단일 클론 항체는 포화된 염화 황산염 침전에 의해 면역글로불린 분획을 분리하고 젤 여과, 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 추가로 정제하여 복수액 또는 배양상등액으로 모아진 단일클론 항체에서 준비된다. 더하여, 상기 단일클론 항체가 IgG인 경우에, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피에 근거를 둔 정제 방법이 효과적이다.

본 발명의 면역측정법에서 사용될 수 있는 단일클론 항체의 실시예는 클론 21-1 마우스 단일클론 항체이다. 더욱 상세하게는, 클론 21-1 마우스 단일클론 항체, 또는 이의 가변 영역을 포함하는 항체 단편은, 본 발명의 면역측정법에서 사용된 단일클론 항체가 바람직하다. 예를 들면, 클론 21-1 단일클론 항체, 또는 상기 항체와 동일한 항원-결합 활성을 갖는 단일클론 항체는 샌드위치 방법에 근거를 두는 면역측정법을 위한 고정화된 항체로 유용하다. 본 발명의 바람직한 구체화에서는, REG4는 담체에 고정화된 단일클론 항체 및 표지된 다클론 항체를 이용한 샌드위치 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 항체의 조합은 REG4의 매우 민감한 검출을 가능하게 하는 바람직한 조합이다.

클론 21-1 단일클론 항체의 VH 및 VL의 아미노산서열은 각각 서열번호 16 및 24로 기재된다. 당업계의 숙련된 자는 상기 아미노산 서열 정보를 근거로 유전공학적 방법에 의해, 동일한 결합 활성을 갖는 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 게다가, 다른 면역글로불린의 프레임워크에 VH 및 VL의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 이식함으로써, 동일한 결합 활성을 갖는 단일클론 항체를 재구성할 수 있다. 클론 21-1의 VH 및 VL의 CDR들은 하기에 기재한 아미노산 서열로 구성된다. 각각의 아미노산 서열은 하기에서 나타난 서열번호의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 그러므로 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA로 다른 면역글로불린의 상응하는 CDR을 치환함으로써, 클론 21-1의 항원-결합 활성을 다른 면역글로불린에 이식할 수 있다.

중쇄 뉴클레오티드 서열 아미노산 서열

CDR1 서열번호 17 서열번호 18

CDR2 서열번호 19 서열번호 20

CDR3 서열번호 21 서열번호 22

경쇄

CDR1 서열번호 25 서열번호 26

CDR2 서열번호 27 서열번호 28

CDR3 서열번호 29 서열번호 30

본 발명에 의해 제공된 클론 21-1은 REG4의 면역측정법에 유용한 신규의 단일클론 항체이다. 따라서, 본 발명은 전술한 아미노산 서열을 CDRs로 포함하는 항-REG4 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명의 단일클론 항체는 바람직하게는 VH 및 VL의 아미노산 서열로 각각 서열번호 16 및 24의 아미노산 서열을 포함한다.

그들의 가변영역에서 서열번호 16 및 24의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린은 적당한 발현벡터에 상기 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 통합함으로써 발현될 수 있다. 또한 불변 영역을 암호화하는 DNA와 함께 상기 DNA를 발현해서, 불변 영역을 갖춘 면역글로불린도 얻어질 수 있다. 본 발명의 면역측정법에서, 불변 영역을 갖춘 완전한 면역글로불린은 항체로 이용될 수 있거나, 또한 항원 결합 영역을 운반하는 면역글로불린 단편은 항체로 이용될 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포로부터 발현 산물을 분비하기 위하여 가변영역의 N-말단에 추가될 수 있다. 신호 서열이 추가된 VH 및 VL의 아미노산 서열은 각각 서열번호 32 및 34로 기재되고, 상기 아미노산 서열들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 31 및 33으로 기재된다.

반면, 본 발명에서 사용된 항체를 다클론 항체로 수득하기 위하여, 면역주사 이후 항체 역가가 증가된 동물로부터 혈액을 수득하여, 항-혈청을 수득하기 위해 상기 혈청을 분리하였다. 본 발명에서 사용될 항체를 제조하기 위하여, 이미 알려진 방법에 따라 항-혈청으로부터 면역글로불린을 정제하였다. REG4-특이적 항체는 리간드로 REG4를 이용하는 면역친화도 크로마토그래피 방법 및 면역글로불린 정제법을 조합하여 정제될 수 있다.

REG4에 대한 항체가 REG4에 접촉하면, 상기 항체가 항원-항체 반응을 통해서 인식하는 항원결정기(에피토프)에 결합한다. 항원에 대한 항체의 결합은 다양한 면역측정법 원리에 의해 검출될 수 있다. 면역측정법은 이형 분석 방법 및 동형 분석 방법으로 대체로 분류될 수 있다. 고도에 면역측정법의 감도 및 특이성을 유지하기 위해, 단일클론 항체의 사용이 바람직하다. REG4 측정을 위한 본 발명의 방법은 각종 면역측정법 형태에 의하여 특히 설명된다.

첫째로, 이형 면역측정법을 사용하여 REG4 측정을 위한 방법이 기술된다. 이형 면역측정법에서는, REG4에 결합하지 않은 것들을 분리한 후, REG4에 결합한 항체를 검출하기 위한 메카니즘이 필요하다.

분리를 촉진하기 위해서, 고정화된 시약이 일반적으로 이용된다. 예를 들면, REG4를 인식하는 항체가 고정화된 고체 상이 첫째로 준비된다(고정화 항체). REG4는 이들에 결합하게 되고, 이차 항체가 추가로 그들에 반응한다.

상기 고체 상이 액체로부터 분리되고, 필요에 따라 추가로 세척될 때, REG4의 농도에 비례하여 상기 고체 상에 이차 항체가 남는다. 상기 이차 항체를 표지함으로써, REG4는 상기 표지로부터 유래한 신호를 측정해서 정량될 수 있다.

고체 상에 항체를 결합기 위하여 모든 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 항체는 폴리스티렌과 같은 소수성 물질에 물리적으로 흡착될 수 있다. 차선책으로, 항체는 표면에 작용기를 갖는 다양한 물질에 화학적으로 결합될 수 있다. 게다가, 결합 리간드로 표지된 항체는 상기 리간드의 결합 파트너를 사용하여 그것들을 잡음으로써 고체 상에 연결되도록 할 수 있다. 결합 리간드 및 이의 결합 파트너의 조합은 아비딘-바이오틴과 같은 것들을 포함한다. 상기 고체 상 및 항체는 일차 항체 및 REG4 사이의 반응과 동시 또는 그 전에 결합될 수 있다.

유사하게, 이차 항체가 직접 표지될 필요는 없는다. 즉, 이차항체들은 아비딘-바이오틴과 같은 결합 반응을 이용하여 또는 항체에 특이적인 항체를 이용하여 간접적으로 표지될 수 있다.

시료내 REG4의 농도는 REG4 농도가 알려진 표준 시료를 이용하여 수득한 신호 감도에 근거하여 결정된다.

REG4를 인식하는 항체, 또는 그의 항원-결합 영역을 포함하는 단편 등의, 어떠한 항체든지 상기에서 언급한 이형 면역측정법을 위한 고정화 항체 및 이차 항체로 이용될 수 있다. 그러므로 단일클론 항체, 다클론 항체, 또는 이들의 혼합물 또는 조합일 수 있다. 예를 들면, 단일클론 항체와 다클론 항체의 조합은 본 발명에서 바람직한 조합이다. 차선책으로, 두 항체가 단일클론 항체일 때 다른 에피토프를 인식하는 단일클론 항체로 조합하는 것이 바람직하다.

측정된 항원이 항체 사이에 끼어졌기 때문에, 이러한 이형 면역측정법은 샌드위치 방법으로 불린다. 샌드위치 방법은 측정 감도 및 재현성에서 탁월하기 때문에, 본 발명에서 바람직한 측정 원리이다.

또한 경쟁적인 억제 반응의 원리도 이형 면역측정법에 적용될 수 있다. 특히, 그들은 농도가 알려진 REG4 및 항체 사이의 결합을 시료 내 REG4가 경쟁적으로 억제하는 현상에 근거를 둔 면역측정법이다. 농도가 알려진 REG4를 표지하고, 상기 항체와 결합(또는 결합하지 않은)한 REG4의 양을 측정함으로써, 시료 내 REG4의 농도가 결정될 수 있다.

경쟁적인 반응 체계는 농도가 알려진 항원 및 시료 내 항원이 항체에 동시에 작용할 때 발생한다. 게다가, 억제 반응 체계에 의한 분석은 항체가 시료 내 항원과 작용하고, 농도가 알려진 항원은 이후에 작용할 때 가능하다. 두가지 유형의 반응 체계에서, 조작 능력이 뛰어난 반응 체계는 검출 시약 성분으로써 농도가 알려진 항원 또는 표지된 성분으로써의 상기 항체, 및 고정화 시약으로써의 다른 하나 중 어느 하나에 의해 구성되어 제조될 수 있다.

방사성 동위원소, 형광물질, 발광성 물질, 효소 활성을 갖는 물질, 육안으로 보이는 물질, 자성을 띄는 물질 등과 같은 것들이 상기 이형 면역측정법에 사용된다. 상기 표지된 물질의 특정한 예는 하기에서 기재한다.

효소 활성을 갖는 물질:

퍼옥시다아제,

알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase),

우레아제(urease), 카탈라제,

글루코오스산화효소(glucose oxidase),

젖산탈수효소(lactate dehydrogenase), 또는

아밀라제, 등등.

형광 기질:

형광 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate),

테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate),

치환된 로다민 이소티오시아네이트(substituted rhodamine isothiocyanate), 또는

디클로로트리아진 이소티오시아네이트(dichlorotriazine isothiocyanate), 등.

방사선동위원소:

삼중수소(tritium),

¹²⁵I, 또는

¹³¹I, 등.

이들 중, 효소와 같은 비-방사성 표지는 안정성, 조작성, 감도 등에서 이점을 갖는다. 효소 표지는 과요오드산(periodic acid) 방법 또는 말레이미드(maleimide) 방법과 같은 알려진 방법에 의해 항체 또는 REG4에 연결될 수 있다.

고체 상으로는 비드, 용기의 내벽, 미세 입자, 다공성 담체, 자성 입자 등이 사용된다. 폴리스티렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리 염화 비닐(polyvinyl chloride), 나일론(nylon), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 라텍스(latex), 젤라틴(gelatin), 아가로스(agarose), 유리(glass), 금속(metal), 세라믹(ceramic) 등의 물질을 사용하여 형성된 고체 상이 이용될 수 있다. 또한 화학적으로 항체를 결합하는 작용기와 그러한 것들이 상기 고체 물질의 표면에 도입된 고체 물질은 알려져 있다. 폴리- L-라이신 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 처리와 같은 화학적 결합 및 물리적 흡착을 포함하는 기존에 알려진 결합 방법들은 고체 상 및 항체(또는 항원)에 적용될 수 있다.

액체 상으로부터 고체 상을 분리하는 단계 및 세척 단계가 본 명세서에서 예시하는 모든 이형 면역측정법에서 필요하더라도, 상기 단계들은 상기 샌드위치 방법의 변형된 형태인 면역크로마토그래피 방법을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

특히, 고정될 항체는 모세관 현상에 의해 시료 용액을 수송할 수 있는 다공성 담체에 고정되고, 그 후에 REG4 및 표지된 항체를 포함하는 시료 혼합물은 모세관 현상에 의해 전개된다. 전개 도중, REG4는 표지된 항체와 반응하고, 추가로 고정화 항체와 접촉할 때 그 위치에서 잡히게 된다. REG4와 반응하지 않은 표지된 항체들은 고정화 항체에 잡히지 않고 통과된다.

그 결과, REG4의 존재는 고정화된 항체의 위치에 남아 있는 표지된 항체의 신호를 인덱스로 사용하여 검출될 수 있다. 표지된 항체가 다공성 담체에서 이미 상류에서 유지되는 경우에, 모든 반응은 시료 용액이 똑똑 떨어져서 개시 및 완료되며, 매우 간단한 반응 체계를 제조할 수 있다. 면역크로마토그래피 방법에서, 착색한 입자와 같이 거시적으로 구별될 수 있는 표지된 성분은 특별한 리더기를 요구하지 않는 분석 장치를 제조하기 위하여 결합될 수 있다.

게다가, 면역크로마토그래피 방법에서, REG4에 대한 검출 감도는 조정될 수 있다. 예를 들면, 하기에 기술한 바와 같은 컷오프 값의 근처로 검출 감도를 조정해서, 전술한 표지된 성분은 컷오프 값이 초과될 때 검출될 수 있다. 그런 장치를 사용해서 개체가 양성 또는 음성인 것을 아주 간단히 판정할 수 있다. 표지의 거시적인 구별을 허용하는 방법을 채택해서, 필요한 검사 결과는 단순히 면역크로마토그래피 장치에 혈액 시료를 적용해서 얻어질 수 있다.

면역크로마토그래피방법의 검출 감도 조정을 위한 각종 방법은 알려져 있다. 예를 들면, 검출 감도 조정을 위해 이차 고정화 항체를 시료가 적용되는 위치와 고정화 항체 사이에서 놓을 수 있다(일본특허출원 Kokai 공개번호(JP-A) H06-341989 (미심사, 공개 일본특허 출원)). 시료 내 REG4는 상기 시료가 표지 검출을 위한 일차 고정화 항체의 위치에 적용된 위치에서 전개되는 동안에 이차 고정화 항체에 의해 잡힌다. 이차 고정화 항체가 포화된 후에, REG4는 하류에 위치한 일차 고정화 항체의 위치로 도달할 수 있다. 그 결과, 시료에 함유된 REG4의 농도가 미리 결정된 농도를 초과할 때, 표지된 항체에 결합한 REG4는 일차 고정화 항체의 위치에서 검출된다.

다음은 동형 면역측정법을 설명한다. 상기 기술한 대로 반응액 분리가 필요한 이형 면역학 분석 방법과 반대로, REG4는 동형 분석 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 동형 분석 방법은 반응액으로부터의 분리단계 없이 반응액에서 항원-항체 반응 산물의 검출을 가능하게 한다.

대표적인 동형 분석 방법은 항원-항체 반응 다음 생성되는 침전물을 실험하여 항원 물질이 정량적으로 분석되는 면역침강법 반응이다. 다클론 항체는 일반적으로 면역침강법 반응을 위하여 이용된다. 단일클론 항체가 적용될 때, REG4의 다른 에피토프에 결합하는 단일클론 항체의 다수 유형이 바람직하게 이용된다. 면역학 반응을 따르는 침전 반응의 산물은 육안으로 관찰될 수 있거나 수치 자료로의 변환을 위해 광학적으로 측정될 수 있다.

항체-감작 미세 입자의 항원에 의한 교착의 인덱스로 사용되는 면역 입자 교착 반응은 일반적인 동형 분석 방법이다. 또한 전술한 면역침강법 반응에서와 같이, 다클론 항체 또는 단일클론 항체의 다수 유형의 조합이 상기 방법에서 사용될 수 있다. 미세 입자는 항체의 혼합물을 이용한 감작을 통해 항체를 감작할 수 있거나, 따로 감작한 각 항체와 입자를 섞어서 준비될 수 있다. 이와같이 얻어진 미세 입자는 REG4와의 접촉에 의해 기질-유사 반응 산물을 준다. 반응 산물은 입자 응집물로서 검출될 수 있다. 입자 응집물은 육안으로 관찰될 수 있거나 수치 자료로의 변환을 위해 광학적으로 측정될 수 있다.

에너지 전달과 효소 채널에 근거를 둔 면역학 분석 방법은 동형 면역측정법으로 알려져 있다. 에너지 전달을 이용하는 방법에서, 공여자/수락자 관계를 갖는 다른 광학적 표지는 항원에 인접한 에피토프를 인식하는 다수의 항체에 연결된다. 면역학 반응이 발생할 때, 2개의 부속이 접근하고 에너지 전달 현상은 형광 파장의 소거 또는 변화와 같은 신호의 결과로 생긴다. 반면 효소 채널은 인접한 에피토프를 인식하는 다수의 항체에 대한 표지를 이용하고, 상기 표지는 하나의 효소의 반응 산물이 다른 하나의 기질인 것과 같은 관련성을 갖는 효소의 조합이다. 면역학적 반응에 기인하여 2개의 부속의 접근이 발생할 때, 상기 효소 반응이 촉진되고, 그리하여 그들의 결합은 효소 반응 비율의 변화로 검출될 수 있다.

본 발명에서 REG4 측정을 위한 혈액은 환자에서 수득한 혈액에서 준비될 수 있다. 바람직한 혈액시료는 혈청 또는 혈장이다. 혈청 또는 혈장시료는 측정 전에 희석될 수 있다. 차선책으로, 전혈은 시료로 측정되고, 수득한 측정값은 혈청농도를 결정하기 위하여 보정될 수 있다. 예를 들면, 전혈에 있는 농도는 동일한 혈액시료에 있는 미립자의 양의 백분율을 결정해서 혈청농도로 보정될 수 있다.

바람직한 구체화에서, 면역측정법은 ELISA를 포함한다. 본 발명자들은 절제가능한 PDAC 환자의 혈청 REG4를 검출하기 위한 샌드위치 ELISA를 설립하였다.

이후 혈액 시료 내 REG4 발현량은 정상 대조군 시료와 같은 참조 시료와 연관된 REG4 발현량과 비교된다. "정상의 대조군 발현량"의 문구는 췌장암에 걸린 개체군의 혈액 시료에서 일반적으로 측정된 REG4의 발현량을 나타낸다. 상기 참조 시료는 바람직하게는 검사 시료와 유사한 특성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면, 검사 시료가 환자 혈청을 포함하면, 또한 상기 참조 치료도 혈청이어야 한다. 대조군 및 검사 개체의 혈액 시료 내의 REG4 발현량은 동일한 시간에 결정될 수 있고, 차선책으로, 상기 정상 대조군의 발현량은 대조군 그룹으로부터 이전에 수집한 시료 내의 REG4의 발현량을 분석하여 수득한 결과를 기본으로하여 통계적 방법으로 결정될 수 있다.

상기 REG4 발현량은 췌장암 치료 과정을 감시하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 검사 혈액 시료는 췌장암 치료 중인 개체로부터 제공된다. 바람직하게는 치료 전, 중, 또는 후의 세 차례에 걸쳐 개체로부터 수득한 다수의 검사 혈액 시료이다. 이후, 치료후 시료 내의 REG4 발현량은 치료전 시료, 또는 차선책으로, 참고 시료(예를 들면, 정상 대조군 발현량) 내의 REG4 발현량과 비교될 수 있다. 예를 들면, 만약 치료후 REG4 발현량이 치료전 REG4 발현량보다 낮으면, 치료 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다. 유사하게, 치료후 REG4 발현량이 정상 대조군 REG4 발현량과 유사하면, 또한 치료 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다.

"효과 있는" 치료는 개체에서 REG4 발현량의 감소 또는 췌장암의 크기, 전이, 또는 췌장암의 전이 가능성의 저하를 유도하는 것을 의미한다. 질병 예방적으로 치료가 적용될 때, "효과 있는" 치료는 췌장암을 늦추거나 발생을 방지하거나 췌장암의 임상 증후를 완화하는 것을 의미한다. 췌장암의 평가는 표준 임상 프로토콜을 사용하여 할 수 있다. 게다가, 치료의 효능성은 췌장암 진단 또는 치료를 위한 알려진 모든 방법들과 관련하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 췌장암은 병리학적 또는 징후 변칙을 확인해서 일반적으로 진단된다.

하기 기술된 실시예의 결과에 따라, 본 발명에 의해 제공된 췌장암의 혈청학적 마커인 REG4는 또한 췌장암 이외에 암에 걸린 환자에서도 높은 측정치를 보여줄수 있다. 구체적으로, 높은 혈액농도가 특히 위암과 결장 암에서 관찰되었다. 높은 REG4 발현은 위암(Oue N., et al., (2005) J. Pathol., 207(2):185-98) 및 결장암(Violette S., et al., (2003) Int. J. Cancer, 103(2):185-93)에서 면역조직학적 염색에 의해 실제로 확인되었다. 그러나 상기 암들의 가능성은 다른 진단 지시자를 이용하여 쉽게 제외될 수 있다. 그러므로 REG4 또는 CA19-9 및 REG4의 조합에 근거하여 췌장암 환자로 판단된 환자가 위암 또는 결장암일 가능성을 쉽게 배제될 수 있다.

다른 위장(gastrointestinal; GI)의 악성종양의 진단 또는 탐색은 대변잠혈(fecal occult blood) 및 혈청 펩티노겐과 같은 당업자에게 잘 알려진 그 외의 내시경적 또는 비침습성 방법으로 수행될 수 있지만, 초기 단계 췌장암의 진단 및 검출은 매우 어렵다. 만약 청구된 방법을 GI 질환 탐색 및 고농도의 혈청 REG4 검출에 적용할 경우, 내시경적 절차로 GI 질병을 검출할 수 있고, 이는 이미 설립된 믿을 수 있는 과민한 방법이다. 위 또는 대장에서 아주 큰 병원성 병반이 없어서 내시경적 연구로 볼 수 없으면, 침습성 또는 비침습성 진단 과정(내시경 역행 담췌관 조영술; Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography(ERCP), 내시경 초음파술; Endoscopic ultrasoundscopy(EUS), 자기 공명 담췌관 조영술;Magnetic resonance cholangiopancreatography(MRCP), 등)을 초기 단계 췌장암 검출에 사용될 수 있다. 그러나 선행 기술에서 초기 단계 췌장암을 탐색하기 위한 믿을 수 있는 방법을 제공하지는 않는다. 다른 GI 악성종양 탐색을 위해, 대변잠혈 및 혈청 펩티노겐이 일반적으로 이용된다. 본 발명에서 청구한 방법은 다른 혈청 마커, 예를 들면 CA19-9 및 침습성 내시경 절차를 함께 조합함으로써 췌장암 탐색을 위한 유용한 방법이다.

본 발명에 따른 췌장암 진단을 실행하기 위하여 이용된 성분은 미리 조합되어 검사 키트로 공급될 수 있다. 따라서, 본 발명은

(i) 혈액 시료의 REG4 발현량을 측정하기 위한 면역측정용 시약; 및,

(ii) REG4에 대한 양성 대조군 시료를 포함하는 췌장암 검출용 키트를 제공한다.

바람직한 구체화에서, 본 발명의 키트는

(iii) 혈액 시료의 CA19-9 발현량을 측정하기 위한 면역측정용 시약; 및,

(iv) CA19-9에 대한 양성 대조군 시료를 추가로 포함한다.

본 발명의 키트를 구성하는 면역측정법을 위한 시약은 상기 기술된 각종 면역측정법에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 구체적으로, 면역측정법을 위한 시약은 측정될 물질을 인식하는 항체를 포함한다. 상기 항체는 면역측정법의 분석 형태에 따라서 변경될 수 있다. ELISA는 본 발명의 바람직한 분석 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, ELISA에서는 고체 상에 고정화된 일차 항체 및 표지된 이차 항체가 일반적으로 사용된다.

그러므로 ELISA를 위한 면역측정용 시약은 고체 상 담체에 고정된 일차 항체를 포함할 수 있다. 미세 입자 또는 반응 용기의 내벽은 고체 상 담체로 사용될 수 있다. 자성 입자는 미세 입자로 이용될 수 있다. 차선책으로, 96-웰 마이크로플레이트와 같은 멀티-웰플레이트가 반응 용기로 자주 사용된다. 또한 96-웰 마이크로플레이트 보다 더 작은 부피의 웰로 구성된, 많은 수의 시료의 처리를 위한 용기가 알려져 있다. 본 발명에서는 상기 반응 용기의 내벽은 고체 상 담체로 사용될 수 있다.

ELISA를 위한 면역측정용 시약은 표지된 이차 항체를 추가로 포함할 수 있다. ELISA를 위한 상기 이차 항체는 효소가 직접 또는 간접적으로 연결된 항체일 수 있다. 화학적으로 항체에 효소를 연결하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 면역글로불린은 가변영역을 포함하는 단편을 얻기 위하여 효소로 쪼개질 수 있다. 상기 단편에 포함된 -SS- 결합을 -SH 기로 환원하기 위하여, 이중기능성 링커(Bifunctional linker)가 붙을 수 있다. 미리 이중기능성 링커에 효소를 연결해서, 항체 단편에 효소가 연결될 수 있다.

차선책으로, 간접적으로 연결된 효소, 예를 들면 아비딘-바이오틴 결합이 이용될 수 있다. 다시 말하면 아비딘이 붙어 있는 효소와 바이오틴화된 항체를 접촉해서, 효소는 항체에 간접적으로 연결될 수 있다. 추가로, 효소는 이차 항체를 인식하는 효소로 표지된 항체인 3차 항체를 사용하여 이차 항체에 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 예시화된 효소들은 항체를 표지하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 키트는 REG4에 대한 양성 대조군을 포함한다. REG4에 대한 양성 대조군은 농도가 미리 결정된 REG4를 포함한다. 예를 들면, 바람직한 농도는 본 발명의 검사 방법에서 표준값으로 사용한 농도이다. 차선책으로, 또한 더 높은 농도의 양성 대조군이 조합될 수 있다. 본 발명에서 REG4에 대한 양성 대조군은 추가로 농도가 미리 결정된 CA19-9을 포함할 수 있다. REG4 및 CA19-9를 포함하는 양성 대조군은 본 발명의 바람직한 양성 대조군이다.

그러므로 본 발명은 정상값 이상의 농도로 REG4 및 CA19-9를 포함하는 췌장암 검출용 양성 대조군을 제공한다. 차선책으로, 본 발명은 췌장암 검출용 양성 대조군의 생산에 있어서 정상값 이상의 농도로 REG4 및 CA19-9를 포함하는 혈액 시료의 용도와 관련된다. CA19-9가 췌장암에 대한 인덱스 역할을 하는 것은 알려져있다; 그러나 REG4가 췌장암에 대한 인덱스 역할을 하는 것은 본 발명에 의해 얻어진 신규의 발견이라 할 수 있다. 그러므로 CA19-9 이외에 REG4를 포함하는 양성 대조군은 신규하다. 본 발명의 양성 대조군은 혈액 시료에 표준값 이상의 농도로 CA19-9 및 REG4를 첨가해서 제조될 수 있다. 예를 들면, 표준값 이상의 농도로 CA19-9 및 REG4를 포함하는 혈청은 본 발명의 양성 대조군으로 바람직하다.

본 발명에서 양성 대조군은 액체 형태가 바람직하다. 본 발명에서 혈액 시료가 시료로 이용된다. 그러므로 대조군으로 이용된 시료 또한 액체 형태일 필요가 있다. 차선책으로, 건조된 양성 대조군을 사용 시기에 미리 정의한 양의 액체에 녹여서, 검사 농도의 대조군으로 제조될 수 있다. 건조된 양성 대조군과 함께, 상기 대조군을 녹이는 데에 필요한 양의 액체를 포장함으로써, 사용자는 단지 그것들을 섞어서 필요한 양성 대조군을 얻을 수 있다. 양성 대조군으로 사용된 REG4는 자연적으로 발생한 단백질일 수 있고 또는 재조합 단백질일 수 있다. 유사하게, 탄수화물 항원인 CA19-9에 대해, 자연적으로 발생한 탄수화물 항원 또는 화학적으로 합성한 시알릴(sialyl) 루이스 유형 탄수화물 항원을 대조군으로 이용할 수 있다. 양성 대조군 뿐만 아니라, 또한 음성 대조군도 본 발명의 키트에 조합될 수 있다. 양성 대조군 또는 음성 대조군은 면역측정법에 의해 나타난 결과가 정확하다는 것을 확인하기 위하여 이용된다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하고 동일한 것을 제조 및 사용하는 당업자를 돕기 위한 것이다. 실시예는 발명의 기술적 사상을 제한하지 않는다.

다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적인 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련된 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미이다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 검사에서 사용될 수 있더라도, 적절한 방법 및 재료는 아래에 기술한 바와 같다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에 언급된 다른 참고문헌은 본 명세서에 참고에 의해 완전히 통합된다.

이하, 본 발명은 실시예를 이용하여 특이적으로 기술될 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 (A) RT-PCR로 PDAC 세포의 미세절편(1-12)에서 REG4 및 ACTB의 mRNA 발현을 정상 체관 상피세포(N)의 미세절편과 비교한 결과; 및, (B) 항-REG4 항체를 이용한 면역조직화학적 연구로 일부 PDAC 세포에서 매우 짙은 염색 결과를 나타낸 도면이다(상부 도면, 본래 배율 x200). 세포질에서 REG4의 양성 염색이 관찰되었다. 정상 췌장 조직에서, 포상세포는 약하게 염색되었으나(하부 도면, 본래 배율 x200), 정상 도관 상피세포 및 도세포에서는 그러지 않았다.

도 2는 REG4 발현량 측정을 위한 샌드위치 ELISA의 표준 곡선을 나타낸 도면 이다.

도 3은 123명의 건강한 사람의 REG4 발현 분포를 나타낸 도면이다. 혈청 REG4 농도는 ELISA 방법으로 측정되었다.

도 4는 7명의 절제가능한 PDAC 환자의 수술전 및 수술후 혈청 REG4 발현량을 나타낸 도면이다. 빈 막대, 수술전; 및 꽉찬 막대, 수술후. 혈청 REG4의 정상 범위는 9.0 ng/㎖(점선) 이하로 추정되었다.

도 5는 REG4 발현량 결정을 위한 변형된 샌드위치 ELISA의 표준 곡선을 나타낸 도면이다.

도 6은 (A) 마커로 REG4 또는 CA19-9를 사용한 진단 결과의 목록; 및 (B) REG4-양성군 및 CA19-9-양성군 사이의 중복된 것의 벤 다이어그램이다. "+"는 양성 결과; 및 "-"는 음성결과를 지시한다. 췌장암 시료 59개, REG4-양성 시료 29개 및 CA19-9-양성 시료 45개를 이용하였다. 상기 중 22개의 시료가 REG4 및 CA19-9에 양성으로 나타났고, 7개의 시료가 REG4 및 CA19-9에 음성으로 나타났다.

도 7은 각각의 항-REG4 단일클론 항체(클론 21-1, 24-1, 34-1)들을 REG4 발현량 측정에 사용한 샌드위치 ELISA의 표준 곡선을 나타낸 도면이다.

도 8은 9명의 췌장암 환자 및 28명의 건강한 사람의 혈청에서 REG4 단백질 검출 결과를 나타낸 도면이다.

[실시예 1] 임상학적 시료

통지해 준 동의에 대한 적합한 규칙에 따라, 수술전 및 수술후(수술 한달 후) 혈청 시료를 체장선암에 대한 췌십이지장절제술을 수행한 7명의 환자들로부터 수득하였다. 전통적인 파라핀이 끼워진 PDAC의 조직 단면은 통지해 준 동의에 대한 적합한 규칙에 따라, 외과 견본에서 수득하였다. 혈청시료는 59명의 췌장암환자에서, 35명의 다른 췌장질환환자, 및 56명의 정상의 건강한 기증자로부터 수득하였다.

[실시예 2] REG4 에 대한 반-정량 RT-PCR 분석

PDAC 세포 및 정상체관 상피의 분리 방법은 이미 기술되었다(Nakamura T, et al., (2004) Oncogene.;23(13):2385-400); 분리된 세포 개체의 RNA는 T7-기반 in vitro 전사에 의해 2 라운드로 증폭되었다(Epicentre Technologies, Madison, WI). 본 발명자들은 정량 대조군으로 b-액틴(ACTB)를 모니터하여 연속 PCR 증폭을 위한 각각의 단일-가닥 cDNA에 대한 적절한 희석을 준비했다. 프라이머 서열은 하기와 같다:

ACTB에 대해

5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3'(서열번호 1) 및

5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(서열번호 2);

REG4에 대해

5'-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3'(서열번호 3) 및

5'-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG -3'(서열번호 4).

모든 반응은 하기 조건에 의해 수행되었다: 초기 변성 94℃, 2 분; 94℃, 30 초, 58℃, 30 초, 및 72℃, 1 분으로 21 사이클(ACTB의 경우) 또는 28 사이클(REG4의 경우), GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems, Foster, CA).

[실시예 3] 재조합 hREG4의 생산(rhREG4)

(1) 발현 카세트 벡터의 제조

CMV 프로모터의 조절하에 IRES에 의해 표적 유전자 및 퓨로마이신(puromycin)-EGFP 융합 단백질을 공동발현하는 표적 유전자 발현 벡터를 제조하였다.

유전자 증폭을 위한 모든 PCR 과정에 KOD-Plus-(TOYOBO; KOD-201)을 사용하였다.

우선, 5'-TTAATTAACTCGAGGGATCCCCCTTCGAACAAAAACTCATC-3'(서열번호 5) 및

5'-GGCGAGAAAGGAAGGGAAG-3'(서열번호 6)을 사용한 PCR에 의해 pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen; V800-2)로부터 myc-His 태그 유전자를 증폭하였고, pBluescriptII SK+(TOYOBO)의 SmaI 자리에 삽입하여 pBlue/myc-His를 제조하였다. pBlue/myc-His의 EcoRV 자리에 5'-ATCAGATCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'(서열번호 7) 및 5'-ATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'(서열번호 8)을 사용하여 증폭된 EGFP 유전자를 삽입하여 pBlue/myc-His/EGFP를 제조하였다. 추가로 5'-AATAGATATCCGCCCCTCTCCCTCCCC-3'(서열번호 9) 및 5'-AATAGGATCCGGCACCGGGCTTGCG-3'(서열번호 10)을 사용하여 pQCXIP(Clontech; 9136-1)로부터 IRES-퓨로마이신 유전자 서열을 증폭하였고, EcoRV 및 BamHI 제한효소로 처리한 후, pBlue/myc-His/EGFP의 PmeI-BglII 자리에 삽입하여 pBlue/myc-His/IRES-Puro-EGFP를 제조하였다. 마지막으로 pQCXIP의 PacI-EcoRV 단편을 PacI 및 EcoRV에 의해 pBlue/myc-His/IRES-Puro-EGFP로부터 삭제된 myc-His/IRES-Puro-EGFP의 유전자 단편으로 치환하여 표적 유전자 발현 벡터 pQCXmHIPG를 제조하였다.

(2) REG4mH 발현 벡터의 제조

5'-AATATTAATTAAGGAAGATGGCTTCCAGAAGCA-3'(서열번호 11) 및 5'-AATAGGATCCTGGTCGGTACTTGCACAGGA-3'(서열번호 12)를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 REG4 유전자를 pQCXmHIPG의 PacI-BamHI 자리에 삽입하여 pQC/REG4mH/IPG를 제조하였다.

(3) 발현 세포주의 제조

항원-발현 세포주 제조를 위해 Pantropic Retroviral Expression System (Clontech; K1063-1)를 이용하였다.

융합성 GP2-293 세포(Clontech; K1063-1)를 콜라겐으로 코팅된 100 ㎜ 디쉬 에 준비한 후, 리포펙타민 2000을 이용하여 각각 11.2 ㎍의 pQC/REG4mH/IPG 및 pVSV-G(Clontech; K1063-1)로 공동감염시켰다. 48 시간 후, 바이러스 입자를 포함하는 상등액을 수득하여, 상기 바이러스를 초원심분리(18,000 rpm, 1.5 시간, 4℃)로 침전시켰다. 상기 침전물을 30 ㎕의 TNE(50 mM Tris-HCl [pH 7.8], 130 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 현탁하여 레트로바이러스 벡터 용액을 제조하였다.

상기 레트로바이러스 벡터 용액 5 ㎕을 헥사디메틸렌 브로마이드(hexadimethrine bromide; SIGMA; H-9268)를 8 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 DMEM(SIGMA; D5796)-10%FBS 배지 150 ㎕에 희석하여 바이러스 입자를 포함하는 배지를 제조하였다. 96-웰 플레이트에서 293T 세포가 대략 40%의 컨플루언시(confluency)에 도달하면 상기 준비된 바이러스 입자를 포함하는 배지로 교환함으로써, 상기 세포에 pQC/REG4mH/IPG를 도입하였다. 유전자 도입 후, 상기 세포는 퓨로마이신(SIGMA; P-8833)을 5 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 DMEM(SIGMA; D5796)-10%FBS 배지에서 배양하여 발현 세포주(REG4mH/293T)를 제조하였다.

(4) 항원의 정제

상기 제조된 발현 세포주의 배양 상등액 대략 1 L를 수득하여, 이로부터 TALON Purification Kit(Clontech; K1253-1)를 이용하여 His-태깅된 단백질을 정제하였다. 상기 정제된 단백질은 PBS에서 투석되었고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅에 의해 확인되었다. 상기 단백질의 농도는 Protein Assay Kit II(BioRad; 500-0002JA)를 이용하여 측정되었다. 상기 단백질은 정제된 단백질로 이용하였다.

[실시예 4] 다클론 항체

상기 항원 용액을 면역보강제(Freund's complete adjuvant)로 에멀젼화하여 주사용 rhREG4 단백질을 제조하였다. 정제된 rhREG4 전장 단백질에 대한 다클론 항-REG4 항체(항-REG4 pAb)가 토끼(Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)에서 증가하였다

상기 항혈철의 친화도 정제를 하기에 따라 수행하였다. 세파로오즈 4B(Amersham) 레진을 브로모시안 용액으로 활성화하였고, rhREG4 단백질과 결합시켰다. 상기 여과된 항혈철을 상기 기술된 레진에 첨가한 후, 인산 완충용액(pH8.0)으로 3분동안 세척하였다. 글라이신-HCl 완충용액(pH2.3)을 이용하여 rhREG4-특이적 항체를 용리한 후, 트리스-HCl(pH8.0)로 중화하였고, PBS로 투석하였다.

[실시예 5] 단일클론 항체

(1) 면역주사

BALB/C 마우스(4 주, 암컷)(Japan SLC)를 면역화 동물로 사용하였고, 상기 면역주사를 풋 패드 방법으로 수행하였다. 0.1 ㎎/㎖의 농도로 조정된 100 ㎕의 면역원과 면역보강제(완전 면역보강제(FREUND) Mitsubishi Kagaku latron RM606-1)를 혼합하여 제조한 50 ㎕의 에멀젼을 마우스 4마리의 풋 패드에 각각 주사하였다. 2차 및 3차(최종) 면역주사를 매 3일 마다 수행하였고(2일 간격), 세포 융합은 3차 면역주사 후 3일째에 수행되었다.

(2) 세포 융합

확대된 림프절은 면역화된 마우스 2마리의 양발 전부에서 절제되었고, 림프절을 잘라내었고, 겸자 등에 의해 세포를 밀어 내어서, 림프절에서 수득한 상기 세포를 원심 분리로 수득하였다. 골수종 세포(P3U1)는 2:1 내지 10:1의 비율로 섞었다. 상기 혼합물을 원심분리 하여, 동일한 부피의 RPMI(RPMI1640; SIGMA Cat No R8758)로 희석된 50% PEG(PEG4000; MERCK Cat No 1097270100)를 상기 세포 융합을 진행하기 위하여 수득한 펠렛에 첨가하였다. 세척 후, 상기 세포는 HAT 첨가물(×50)(GIBCO Cat No 21060-017)이 첨가된 160 ㎖의 15% FBS-HAT 배지에 현탁하였고, 200 ㎕/웰의 농도로 16개의 96-웰 플레이트에 주입하였다. 3일 후 상기 배지를 교환한 후, 콜로니 형성을 확인하였고(1 내지 2 주 후), 일차 탐색을 면역침강법에 의해 수행하였다.

(3) 면역침강법

PBS에 세척한 50 ㎕의 단백질 G 세파로오즈 비드를 딥 웰 플레이트의 각 웰에 준비한 후, 350 ㎕의 상기 융합세포 배양 상등액을 각 비드에 부어, 회전하면서 4℃에서 1시간 동안 반응하도록 하였다. PBS로 세척한 후, 350 ㎕의 배양 상등액(단백질 G 세파로오즈 비드에 의해 흡착된 비특이적으로 결합하는 물질)을 각 웰의 항원으로서 첨가하였고, 항원-항체 반응을 회전하면서 4℃에서 1시간 동안 수행하도록 하였다. 상기 플레이트는 PBS로 다시 세척하였다. 30 ㎕의 2x 시료 완충용액을 각 웰에 첨가한 후, 시료를 제조하기 위해 끓였고, 면역침강될 수 있는 클론 들을 웨스턴 블랏팅에 의해 태깅된 항원 검출에 의해 선택하였다.

(4) 단일클론 융합세포의 제조

상기 선택된 융합세포는 단일클론 융합세포를 수득하기 위한 제한된 희석 방법에 의해 클로닝 되었다. 상기 융합세포는 96-웰 플레이트에 주입되었고, 단일 콜로니를 포함하는 각 웰의 배양 상등액을 수집하여, 상기 면역침강법에 의해 항체 활성을 확인하였다. 활성이 확인된 웰의 세포들을 증폭하였고, 면역침강법에 의해 강하게 양성을 띄는 클론 21-1, 24-1, 및 34-1을 수득하였다.

(5) 항체 정제

상기 항체를 흡착하기 위해, 상기 융합세포의 상기 배양 상등액을 초당 한 방울의 비율로 단백질 A 컬럼에 적용되고, PBS/0.1%NaN3로 세척하였고(흡수 분광계로 측정될 때 A280이 0.05 또는 그 이하로 될 때까지), 상기 흡착된 항체는 0.5 M 알지닌-HCl 완충용액(pH 4.1)으로 용리하였다. 용리 단계에서, 1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)의 1/5 양을 중성화를 위해 용리된 시료에 즉시 첨가하였다. 각 분획물에서 A280을 측정한 후, A280이 0.1 또는 그 이상인 분획물들을 합하여 PBS로 투석하였다. 투석 후, 상기 하기 식에 근거하여 농도를 계산하였다: 농도 = A280 x 0.7 [㎎/㎖].

[실시예 6] 면역조직화학 염색법

Petagene Inc.(Seoul, Korea)로부터 구입한 췌장암의 조직-마이크로어레이 단면(AccuMax Array)은 31개의 PDAC 조직 및 2개의 내분비선 종양 조직이 이중으로 점착되어 있다. 상기 단면은 pH6.0의 구연산염 완충용액으로 108℃에서 15분간 파라핀 제거 및 멸균하였다. 내인성 퍼옥시다아제 활성은 메탄올에 희석된 0.33% 수소 과산화물로 30분 동안 인큐베이션 하여 소멸하였다. 우태혈청으로 차단한 후, 상기 단면은 실온에서 1시간 동안 항-REG4 다클론 항체로 인큐베이션 되었다. PBS로 세척한 후, 퍼옥시다아제로 표지된 항-마우스 면역글로불린(Envision kit, Dako Cytomation, Carpinteria, CA)을 이용하여 면역검출을 수행하였다. 마지막으로 3, 3'-디아미노벤지딘(3, 3'-diaminobenzidine; Dako)으로 반응액을 전개한 후, 상기 세포를 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하였다.

PDAC 조직의 다른 계열에서 REG4에 대한 다클론 항체를 사용하여 수행한 면역조직화학적분석 결과, 췌장의 포상세포는 REG4에 약한 염색을 나탄내 반면, 암세포의 세포질에서는 REG4의 강한 신호를 나타내었다(도 1B). 추가로 다른 계열의 31개의 PDAC 조직으로 점착된 조직-마이크로어레이는 31개의 PDAC 중 15개에서 고 농도로 REG4 발현하였다(데이타는 보여주지 않음). 완전히 64개의 PDAC 중 35개(55%)는 항-REG4 항체에 양성 염색을 나타내었다(데이타는 보여주지 않음). 상기 결과는 이전의 미세절편 세포의 RNA 연구와 일치한다.

[실시예 7] ELISA 검사 시스템

(1) 항체 평가를 위한 샌드위치 ELISA 시스템

샌드위치 ELISA 시스템용 마이크로플레이트로 C8 MAXI NUNC-Immuno BreakApart Module(NUNC)가 사용되었다. 항-REG4 단일클론 항체(클론 21-1, 24-1, 및 34-1)를 0.1 M 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후, 마이크로플레이트에 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였고, 물리적 흡착에 의해 항체를 고정하기 위해 4℃에서 밤새 방치하였다. 1% BAS/PBS로 차단한 후(RT, 2 시간), 상기 차단 용액을 제거하였고, 상기 잔류액을 공기로 건조하여 검사 플레이트를 제조하였다. 표본을 반응 완충용액(PBS, 0.1% Tween20, 1% BSA, pH 7.3)에 5배로 희석하여 50 ㎕/웰의 농도로 검사 플레이트에 첨가하였고, 실온에서 한시간 동안 반응하였다. 세척 완충용액(0.13% Tween20, 0.15 M NaCl/10 mM NaH₂PO₄)으로 4번 세척 후, HRP로 표지된 항-REG4 다클론 항체를 효소로 표지된 항체 희석액(1% BAS, 0.135 M NaCl/20 mM HEPES)으로 1.5 ㎍/㎖의 농도로 조정한 후, 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실온에서 한시간 동안 반응한 후, 상기 플레이트를 세척 완충용액으로 4번 세척하였다. 효소 기질액(Moss Inc.; TMB Ultra Sensitive Substrate)을 발색을 위해 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하고 30분 후, 0.36N H₂SO₄을 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하여 발색 반응을 종료하였다. 상기 흡광도(A450/A620)는 각 항체의 보정 곡선에 근거하여 혈청에서 REG4 발현량을 계산하여 위하여 측정되었다(도 7).

상기 샌드위치 ELISA 시스템을 이용하여 췌장암 환자 9명, 건강한 개체 28명의 표본으로부터 각 클론의 항체 역가를 평가하기 위해 REG4 발현량이 측정되었다. 클론 24-1 및 34-1의 상기 검출 감도는 클론 21-1과 비교하여 낮았고(도 7), 췌장암 환자의 표본에서 REG4는 오직 클론 21-1에서만 검출될 수 있었다(도 8). 추가로, 클론 21-1을 사용하여 샌드위치 ELISA 시스템에 의해 측정된 표본들의 REG4 발현량은 건강한 개체에 비해 췌장암 환자에서 높은 수치를 나타내었고, 건강한 개체 및 췌장암 환자의 표본에서 REG4 발현량은 유의하게 다른 것(P<0.05)을 확인하였다(도 8).

클론 21-1의 가변 영역 및 각 CDR의 아미노산 서열 및 그들을 암호화하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

뉴클레오티드 서열 아미노산 서열

중쇄 서열번호 15 서열번호 16

CDR1 서열번호 17 서열번호 18

CDR2 서열번호 19 서열번호 20

CDR3 서열번호 21 서열번호 22

경쇄 서열번호 23 서열번호 24

CDR1 서열번호 25 서열번호 26

CDR2 서열번호 27 서열번호 28

CDR3 서열번호 29 서열번호 30

추가로, 상기 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 32 및 32에서 기재된 신호 서열을 포함하는 것으로 발견되었다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 신호서열을 포함하며, 서열번호 31 및 33으로 기재되었다.

(2) 샌드위치 ELISA 시스템

샌드위치 ELISA 시스템용 마이크로플레이트로, C8 MAXI NUNC-Immuno BreakApart Module(NUNC)가 사용되었다. 항-REG4 단일클론 항체(클론 21-1)를 0.1 M 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후, 마이크로플레이트에 100 ㎕/웰의 농도로 첨가한 후, 물리적 흡착에 의해 항체를 감작하게 하기 위해 4℃에서 밤새 방치하였다. 차단 과정 후(RT, 2 시간), 상기 차단 용액을 제거한 후, 상기 잔류액을 건조하여 검사 플레이트를 제조하였다. 환자의 혈청을 표본 희석액(PBS, 0.1% Tween20, 1% BSA, pH 7.3)에 5배 희석하여 0.5 ㎍/㎖의 바이오틴화된 항-PEG4 다클론 항체를 첨가하였다. 반응 개시 15분 후, 상기 혈청을 100 ㎕/웰의 농도로 검사 플레이트에 첨가한 후, 2 시간 동안 반응시켰다. 5번 세척 후, 8000배로 희석된, HRP로 표지된 스트렙타비딘(Amersham; RPN4401)을 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하여 한 시간 동안 반응 한 후, 5번 세척하였다. 100 ㎕/웰의 TMB 기질액(MOSS Inc.; TMB Ultra Sensitive Substrate)을 첨가하여 발색하였다. 15분 후, 100 ㎕/웰의 0.18 M 황산을 첨가하여 발색 반응을 종료하였고, 7명의 환자로부터 수득한 수술전 및 수술후의 REG4 발현량을 흡광도(A450/A620)로 측정하였다.

상기 샌드위치 ELISA 시스템을 더욱 개량하여, 췌장암 환자 59명, 염증성 췌장 질환자 35명, 및 건강한 개체 56명의 혈청에서 REG4 발현량을 하기 샌드위치 ELISA 시스템에 따라 측정하였다. C8 MAXI NUNC-Immuno BreakApart Module(NUNC) 을 마이크로플레이트로 이용하였다. 항-REG4 단일클론 항체(클론 21-1)를 0.1 M 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후, 마이크로플레이트에 50 ㎕/웰의 농도로 첨가한 후, 물리적 흡착에 의해 항체를 감작하게 하기 위해 4℃에서 밤새 방치하였다. 1% BSA/PBS로 차단한 후(RT, 2 시간), 상기 차단 용액을 제거하였고, 상기 잔류액을 건조하여 검사 플레이트를 제조하였다. 환자의 혈청을 표본 희석액(PBS, 0.1% Tween20, 1% BSA, pH 7.3)에 5배 희석하여 0.5 ㎎/㎖의 바이오틴화된 항-REG4 다클론 항체를 첨가하였다. 반응 개시 15분 후, 상기 혈청을 50 ㎖/웰의 농도로 검사 플레이트에 첨가한 후, 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 완충용액(0.13% Tween20, 0.15 M NaCl/10 mM NaH2PO4)으로 4번 세척 후, REG4-특이적 다클론 항체를 반응 완충용액(상기와 같음)을 0.25 ㎍/㎖의 농도로 조정한 후, 50 ㎕/웰로 첨가하였고, 한시간 동안 실온에서 반응하였다. 세척 완충용액으로 4번 세척한 후, 효소로 표지된 항체 희석액(1% BSA, 0.135 M NaCl/20 mM HEPES)으로 150,000배 희석된 HRP로 표지된 스트렙타비딘(Amersham; RPN4401)을 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였고, 한시간 동안 실온에서 반응한 후, 세척 완충용액으로 4번 세척하였다. 50 ㎕/웰의 TMB 기질액(Moss Inc.; TMB Ultra Sensitive Substrate)을 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 발색반응 하도록 하였다. 50 ㎕/웰의 0.36N 황산을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 흡광도(A450/620)를 측정하고, 보정곡선을 이용하여 혈청 내 REG4 발현량을 결정하였다(도 5).

(3) ELISA로 측정된 혈청 REG4 발현량

REG4는 분비 단백질이다. 본 발명자들은 REG4 단백질이 췌장암 세포주의 배 양 배지로 분비된 것을 본 발명자들이 제조한 항체를 이용한 면역침강법에 의해 증명하였다(데이타는 보여주지 않음). 췌장암 환자의 혈청에 있는 REG4 발현량을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 인간 REG4에 가장 강한 친화력을 나타내는, 마우스 단일클론 항체(클론 21-1) 및 인간 REG4에 대한 토끼 다클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA 시스템을 설계하였다. 상기 샌드위치 ELISA의 성능 특성(표준 곡선)은 도 2에서 나타내었다. 또한 본 발명자들은 상기 항체들을 이용한 변형된 샌드위치 ELISA를 설계하였다. 상기 변형된 샌드위치 ELISA의 성능 특성(표준 곡선)은 도 5에서 나타내었다.

진단 검사로 증진된 REG4의 감도를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 건강한 사람 123명의 혈청 REG4를 측정하였고, 건강한 대조군에서의 평균 REG4 발현량 이상의 수준 2 SD를 9.0 ng/㎖의 컷오프 수치를 정의했다(도 3).

이후 본 발명자들은 췌장 선암 수술 환자의 수술전 및 수술후 혈청을 분석하였다(도 4). 상기 7명 중 넷(케이스 2, 3, 4, 및 5)은 수술전에 9.0 ng/㎖ 이상의 REG4 발현량을 나타내었고, 상기 네 명의 REG4 발현량은 종양 절제 후, 4주에 정상 범위로 REG4 발현량이 낮아졌다. 상기 결과는 혈청 REG4가 췌장암 조직으로부터 발생하고, REG4가 췌장암의 혈청 마커일 가능성을 제안한다. 나머지 환자들은 수술전 및 수술후에 9.0 ng/㎖ 이하의 REG4 발현량을 나타내었다.

게다가, 본 발명자들은 췌장암 환자 59명, 다른 췌장 질환자 35명, 정상의 건강한 사람 56명의 혈청 REG4를 변형된 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 췌장암 환자 및 정상의 건강한 사람(p<0.01), 및 췌장암 환자 및 다른 췌장 질환 환 자(p<0.05) 사이에 유의한 차이가 있었다. 증진된 REG4의 감도를 진단 검사로 결정하기 위하여, 본 발명자들은 건강한 대조군에서의 평균 REG4 발현량 이상의 수준 3 SD를 3.78 ng/㎖를 컷오프 값을 정의했다(도 3). 그 결과, 췌장암 환자 59명 중 29명(49.2%), 췌장 질환 환자 35명 중 10명(28.6%), 및 정상의 건강한 대조군 56명 중 1명(1.8%)이 양성으로 판명되었다. 반면에 췌장암 환자 59명 중 45명(76.3%), 췌장 질환 환자 35명 중 13명(37.1%), 및 정상의 건강한 대조군 56명 중 5명(8.9%)이 CA19-9(컷오프 값 25 ng/㎖)(CA19-9 EIA Kit; CanAg Diagnostics AB)를 검출하기 위한 ELISA 시스템에 의해 양성으로 판명되었다 두가지 단백질 중 적어도 하나는 췌장암 환자 59명 중 52명(88.1%), 췌장 질환 환자 35명 중 19명(54.3%), 및 정상의 건강한 대조군 56명 중 6명(10.7%)을 양성으로 판명하였다(도 6).

본 명세서에서, 본 발명자들은 PDAC의 대략 절반에서 REG4 단백질이 과발현 하고, 일부의 PDAC 환자에서 혈청 REG4이 본 발명자들에 의해 설계된 ELISA 시스템에 의해 검출될 수 있는 것을 발견했다. 표 2에서 본 발명자들에 의해 검사된 7명의 환자에서의 임상 병리적인 특징들 및 수술전 혈청 REG4, CA19-9, 및 CEA 발현량을 정리하였고, 상기 7명 중 4명은 정상의 건강한 대조군(9.0 ng/㎖ 이상)의 혈청 REG4 수준 이상을 나타내었다. 흥미롭게도, 혈청 REG4는 초기-단계 또는 비침습성 췌장암 환자(환자 3 및 4) 및 오래 생존한 환자(환자 3, 4, 및 5)에서 발현량이 높았고, 이는 혈청 REG4를 초기 단계 암 또는 좋은 예후를 갖을 것으로 예상될 PDAC 환자에서 검출될 수 있는 가능성을 제안한다. 혈청 CA19-9 및 CEA는 상기 초기-단계 또는 비침습성 환자를 발견할 수 있고, 혈청 REG4는 췌장암 탐색을 위한 혈청 마커로 사용될 수 있다.

혈청 마커 발현량 및 임상 병리적인 특징들

케이스	나이	위치	TNM	단계	조직학	REG4¹ ⁾	CA 19-²⁾	CEA³ ⁾	예후⁴⁾
1	56	머리	T2N1M0	III	저분화형 관상 선암	6.2	84	1.3	14 M 사망
2	64	머리	T2N1M0	III	중등도 분화형관상 선암	20.5	1945	12.1	9 M 사망
3	69	머리	T2N0M0	I	관내 관상 선암	24.7	24	4.2	14 M 생존
4	78	머리	T1N0M0	I	췌관내 유두상 점액성 악성 종양	24.6	16	2.8	18 M 생존
5	56	머리	T2N1M0	III	중등도 분화형관상 선암	14.5	311	1.6	13 M 생존
6	68	꼬리	T2N0M0	I	중등도 분화형관상 선암	8.0	5	1.0	8 M 사망
7	70	머리	T2N1M0	III	저분화형 관상 선암	2.5	17	4.6	3 M 사망

¹⁾정상 범위 < 9.0 ng/㎖

²⁾ 정상 범위 < 36 U/㎖

³⁾ 정상 범위 < 5.0 ng/㎖, 각 마커의 정상 범위 이상의 수치에 밑줄

⁴⁾M: 개월

PDAC의 종양 마커로 혈청 REG4의 감도 및 특이성은 많은 연구를 분석해서 결정되어야 한다. 몇몇 이전 연구들은 결장직장암(Violette S, et al., (2003) Int J Cancer.; 103(2):185-93), 위암(Oue N, et al., (2005) Cancer Res.; 64(7):2397-405) 및 염증성장질환(Hartupee JC, et al., (2004) Biochim Biophys Acta.; 1518(3):287-93)에서 REG4 발현량을 보고했고, 혈청 REG4에 의해 상기 질환들로부터 췌장암을 구분할 수 있는지의 추가의 연구들이 요구된다. 추가로 만성 췌장염은 본 발명자들에 의해 PDAC와 구별될 양성 질환의 하나이다. 또한 REG 패밀리가 조직 재생과 연관될 가능성이 높은 것을 고려해서, 본 발명자들은 만성 췌장염 환자의 혈청을 분석할 필요가 있다. 그러나 고발현 혈청 REG4와 관련된 다른 장 또는 위 병반은 내시경 검사에 의해 쉽게 검출될 수 있으나, 췌장암, 특히 초기 단계 PDAC는 검출하기 매우 어렵고, 만약 혈청 REG4가 상기 소화기계통 질환에서 증가되더라도, 혈청 REG4 측정은 췌장암 탐색에 가치가 있을 것으로 생각된다. 다른 종양 마커들 같이, 혈청 REG4에는 PDAC의 모든 환자를 검출하거나 다른 질병과 PDAC를 구별하는 충분한 기능이 없을지도 모르지만, CA19-9와 같은 다른 종양 마커들 또는 진단 영상화와 혈청 REG4을 조합하여 PDAC의 초기 단계 또는 전구체 병반 검출 및 더욱 효율적으로 상기 질환을 탐색하는 것을 가능하도록 할 것이다.

본 발명은 정상 대조군과 비교하여, 췌장암 환자의 혈청에서 REG4 발현량이 증가하는 것을 발견한 것과 관련되어 있다. 따라서, REG4 단백질은 진단용 마커(즉, 혈청)로 이용가능하다. REG4의 발현량을 인덱스로 사용하여, 본 발명은 암 환자의 암 치료의 진행을 감시하고 진단하는 방법을 제공한다. 선행 기술은 췌장암에 적당한 혈청학적 마커를 제공하는 하지 못했다. 본 발명의 신규 혈청학적 마커 REG4는 췌장암 검출 감도를 향상시킬 것이다. 또한, REG4 및 CA19-9를 조합하여 사용하면 췌장암 검출 감도 증가에 기여한다.

본 발명은 하기 실시예에서 상세히 기재하고 있고, 각종 변화 및 수정이 본 발명의 기술적 사상 및 범위에 포함될 수 있는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적인 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련된 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미이다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 검사에서 사용될 수 있더라도, 적절한 방법 및 재료는 아래에 기술한 바와 같다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에 언급된 다른 참고문헌은 본 명세서에 참고에 의해 완전히 통합된다. 대립되는 경우에는, 본 명세서가, 정의를 포함하여, 통제할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 제한하지 않는다.

본 발명은 구체화된 실시예 및 바람직한 구체화에 대해 참고에 의해 설명되었다. 본 발명은 상기 기술에 의해 제한되지 않고, 부가의 청구항 및 그들의 동등물에 의해 정의되어야 한다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> METHODS FOR DIAGNOSING PANCREATIC CANCER USING RSEG4 PROTEIN <130> 8FPI-09-02 <150> US 60/779,161 <151> 2006-03-02 <150> PCT/JP2007/054375 <151> 2007-02-28 <160> 34 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 1 catccacgaa actaccttca act 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 2 tctccttaga gagaagtggg gtg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 3 ccaattgcta tggttacttc agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 4 gaaaaacaag caggagttga gtg 23 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for RT-PCR <400> 5 ttaattaact cgagggatcc cccttcgaac aaaaactcat c 41 <210> 6 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primer for PCR <400> 12 aataggatcc tggtcggtac ttgcacagga 30 <210> 13 <211> 1518 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (441)..(914) <400> 13 ataagacttt tatggatgga ttgtttttct caaataatat tatcgcttag tgactaaagt 60 aaagattatt aattcctgag gcaagaagat ataaaagctc cagaaacgtt gactgggacc 120 actggagaca ctgaagaagg caggggccct tagagtcttg gttgccaaac agaatgccca 180 tatccgtctt acctgtgagg aagcttgcct tgggcgccct ctgctggccc tcctgaagct 240 aacaggggcg agtgctcggt ggtttacaaa ttgcctccat gcagactatg aaactgttca 300 gcctgctata gttagatctc tggcactggc ccaggaggtc ttgcagattt gcagatcaag 360 gagaacccag gagtttcaaa gaagcgctag taaggtctct gagatccttg cactagctac 420 atcctcaggg taggaggaag atg gct tcc aga agc atg cgg ctg ctc cta ttg 473 Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 ctg agc tgc ctg gcc aaa aca gga gtc ctg ggt gat atc atc atg aga 521 Leu Ser Cys Leu Ala Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg 15 20 25 ccc agc tgt gct cct gga tgg ttt tac cac aag tcc aat tgc tat ggt 569 Pro Ser Cys Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly 30 35 40 tac ttc agg aag ctg agg aac tgg tct gat gcc gag ctc gag tgt cag 617 Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln 45 50 55 tct tac gga aac gga gcc cac ctg gca tct atc ctg agt tta aag gaa 665 Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu 60 65 70 75 gcc agc acc ata gca gag tac ata agt ggc tat cag aga agc cag ccg 713 Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln Pro 80 85 90 ata tgg att ggc ctg cac gac cca cag aag agg cag cag tgg cag tgg 761 Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp 95 100 105 att gat ggg gcc atg tat ctg tac aga tcc tgg tct ggc aag tcc atg 809 Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly Lys Ser Met 110 115 120 ggt ggg aac aag cac tgt gct gag atg agc tcc aat aac aac ttt tta 857 Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn Asn Asn Phe Leu 125 130 135 act tgg agc agc aac gaa tgc aac aag cgc caa cac ttc ctg tgc aag 905 Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg Gln His Phe Leu Cys Lys 140 145 150 155 tac cga cca tagagc aagaatcaag attctgctaa ctcctgcaca gccccgtcct 960 Tyr Arg Pro cttcctttct gctagcctgg ctaaatctgc tcattatttc agaggggaaa cctagcaaac 1020 taagagtgat aagggcccta ctacactggc ttttttaggc ttagagacag aaactttagc 1080 attggcccag tagtggcttc tagctctaaa tgtttgcccc gccatccctt tccacagtat 1140 ccttcttccc tcctcccctg tctctggctg tctcgagcag tctagaagag tgcatctcca 1200 gcctatgaaa cagctgggtc tttggccata agaagtaaag atttgaagac agaaggaaga 1260 aactcaggag taagcttcta gcccccttca gcttctacac ccttctgccc tctctccatt 1320 gcctgcaccc caccccagcc actcaactcc tgcttgtttt tcctttggcc atgggaaggt 1380 ttaccagtag aatccttgct aggttgatgt gggccataca ttcctttaat aaaccattgt 1440 gtacataaga ggttgctgtg ttccagttca gtaatggtga atgtggaaaa gtgaaataag 1500 accaagaaat acacccag 1518 <210> 14 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro 20 25 30 Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu 35 40 45 Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly 50 55 60 Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu 85 90 95 His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met 100 105 110 Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His 115 120 125 Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn 130 135 140 Glu Cys Asn Lys Arg Gln His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 145 150 155 <210> 15 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH of anti-REG4 mous antibody. <400> 15 gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccaccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aggcccatct 300 ctactgggat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VH of anti-REG4 mous antibody <400> 16 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ser Leu Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH CDR1 of anti-REG4 mous antibody. <400> 17 agctactgga tgcac 15 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VH CDR1 of anti-REG4 mous antibody. <400> 18 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 19 <211> 14 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH CDR2 of anti-REG4 mous antibody. <400> 19 gatactagct acaa 14 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VH CDR2 of anti-REG4 mous antibody. <400> 20 Asp Thr Ser Tyr Asn 1 5 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH CDR3 of anti-REG4 mous antibody. <400> 21 ccatctctac tgggatttgc tta 23 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VH CDR3 of anti-REG4 mous antibody. <400> 22 Pro Ser Leu Leu Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 23 <211> 312 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL of anti-REG4 mous antibody. <400> 23 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctcctcggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tg 312 <210> 24 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VL of anti-REG4 mous antibody. <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL CDR1 of anti-REG4 mous antibody. <400> 25 aaggccagtc aggatgtgag tactgctgta gcc 33 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VL CDR1 of anti-REG4 mous antibody. <400> 26 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL CDR2 of anti-REG4 mous antibody. <400> 27 tcggcatcct accggtacac t 21 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VL CDR2 of anti-REG4 mous antibody. <400> 28 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL CDR3 of anti-REG4 mous antibody. <400> 29 cagcaacatt atagtactcc tcgg 24 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus An amino acid sequence of VL CDR3 of anti-REG4 mous antibody. <400> 30 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 1 5 <210> 31 <211> 408 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH of anti-REG4 mous antibody with signal sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> mat_peptide <222> (58)..(408) <400> 31 atg gaa tgt aac tgg ata ctt cct ttt att ctg tcg gta act tca ggg 48 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 gtc tac tca gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg 96 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg atg cac tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att ggc gct att tat cct gga aat agt gat act agc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser 85 90 95 act gcc tac atg gag ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt aca ggc cca tct cta ctg gga ttt gct tac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Thr Gly Pro Ser Leu Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 ggg act ctg gtc act gtc tct gca 408 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 32 <211> 136 <212> PRT <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VH of anti-REG4 mous antibody with signal sequence. <400> 32 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Gly Pro Ser Leu Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 33 <211> 384 <212> DNA <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL of anti-REG4 mous antibody with signal sequence. <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> mat_peptide <222> (73)..(384) <400> 33 atg ggc atc aaa atg gag tca cag att cag gtc ttt gta ttc gtg ttt 48 Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe 1 5 10 15 ctc tgg ttg tct ggt gtt gac gga gac att gtg atg acc cag tct cac 96 Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His 20 25 30 aaa ttc atg tcc aca tca gta gga gac agg gtc agc atc acc tgc aag 144 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 35 40 45 gcc agt cag gat gtg agt act gct gta gcc tgg tat caa cag aaa cca 192 Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 gga caa tct cct aaa cta ctg att tac tcg gca tcc tac cgg tac act 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 65 70 75 80 gga gtc cct gat cgc ttc act ggc agt gga tct ggg acg gat ttc act 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ttc acc atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt 336 Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 cag caa cat tat agt act cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 <210> 34 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus An nucleotide sequence of VL of anti-REG4 mous antibody with signal sequence. <400> 34 Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe 1 5 10 15 Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His 20 25 30 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125

Claims

(a) 진단할 개체의 혈액 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 혈액 시료에서 REG4 발현량을 결정하는 단계; 및,

(c) 단계 (b)에서 측정된 REG4 발현량을 정상 대조군의 REG4 발현량과 비교하여, 상기 정상 대조군 보다 상기 혈액 시료의 REG4 발현량이 높은 경우, 췌장암 환자로 표시하는 단계를 포함하는 상기 개체의 췌장암 진단 방법.
제 1항에 있어서, 상기 혈액 시료는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 REG4 발현량은 상기 혈액 시료 내의 REG4 단백질을 검출하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 REG4 단백질은 면역측정법에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 면역측정법은 ELISA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 면역측정법은 담체에 고정화된 항-REG4 단일클론 항체를 이용하는 샌드위치 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬에서 상기 각 CDR의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

VH CDR1: 서열번호 18;

VH CDR2: 서열번호 20;

VH CDR3: 서열번호 22;

VL CDR1: 서열번호 26;

VL CDR2: 서열번호 28; 및,

VL CDR3: 서열번호 30,

또는 이들의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제 7항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

(e) 상기 혈액 시료 내의 CA19-9 발현량을 측정하는 단계;

(f) 단계 (e)에서 측정된 CA19-9 발현량을 정상 대조군의 CA19-9 발현량과 비교하여, 상기 정상 대조군 보다 상기 혈액 시료의 REG4 및 CA19-9 발현량이 높은 경우, 췌장암 환자로 표시하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
항-REG4 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료의 REG4 검출용 면역측정용 시약.
제 10항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 담체에 고정화된 것을 특징으로 하는 시약.
제 11항에 있어서, 상기 항-REG4 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬에서 상기 각 CDR의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약:

VH CDR1: 서열번호 18;

VH CDR2: 서열번호 20;

VH CDR3: 서열번호 22;

VL CDR1: 서열번호 26;

VL CDR2: 서열번호 28; 및,

VL CDR3: 서열번호 30,

또는 이들의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제 12항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
(i) 혈액 시료의 REG4 발현량을 측정하기 위한 면역측정용 시약; 및,

(ii) REG4에 대한 양성 대조군 시료를 포함하는 췌장암 진단용 키트.
제 14항에 있어서,

(iii) 혈액 시료의 CA19-9 발현량을 측정하기 위한 면역측정용 시약; 및,

(iv) CA19-9에 대한 양성 대조군 시료를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 15항에 있어서, 상기 양성 대조군 시료는 REG4 및 CA19-9에 양성인 것을 특징으로 하는 키트.
제 16항에 있어서, 상기 양성 대조군 시료는 액체 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
정상 수준 이상의 REG4 및 CA19-9를 포함하는 혈액 시료인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 양성 대조군 혈액 시료.
VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬에서 상기 각 CDR의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항-REG4 단일클론 항체:

VH CDR1: 서열번호 18;

VH CDR2: 서열번호 20;

VH CDR3: 서열번호 22;

VL CDR1: 서열번호 26;

VL CDR2: 서열번호 28; 및,

VL CDR3: 서열번호 30,

또는 이들의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
제 19항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.