JPH03264864A - 哺乳動物系におけるｃｏｕｐ転写因子の相互作用の測定法 - Google Patents

哺乳動物系におけるｃｏｕｐ転写因子の相互作用の測定法

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JPH03264864A
JPH03264864A JP2094895A JP9489590A JPH03264864A JP H03264864 A JPH03264864 A JP H03264864A JP 2094895 A JP2094895 A JP 2094895A JP 9489590 A JP9489590 A JP 9489590A JP H03264864 A JPH03264864 A JP H03264864A
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Ming-Jer Tsai
ミング‐ジャー　ツァイ
Lee-Ho Wang
リー‐ホゥ　ワン
Sophia Yang Tsai
ソフィア　ヤン　ツァイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＣＯＵＰ転写因子（ＣＯＵＰ−ＴＦ）に関して
いる。さらに特定すれば、ＣＯＵＰ−ＴＦをコードして
いる遺伝子のｃＤＮＡクローン、ＣＯＵＰ−ＴＦに対す
る抗体、Ｃ０ＤＰ−ＴＦの量を決定する測定法、その結
合能、及びそれのプロモータ相互作用に関している。本
発明はまたＣＯＵＰ−ＴＦ系の中にある欠陥によって起
される糖尿病の検出にも関している。
〔従来の技術〕
ニワトリのオボアルブミンの上流プロモータ転写因子（
ＣＯＵＰ−ＴＦ）は、ＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡ
の配列を認識し、ニワトリオボアルプミン遺伝子の転写
を促がす。Ｃ０ＤＰ配列は］」ユ■の研究でちｎ月±■
の研究でちニワトリのオボアルブミン遺伝子の５１！現
を制御するｃｉｓ作動要素であることが示されている。
ＤＮＡに接触する部位の認識配列がＣＯＵＰ−ＴＦにつ
いてキャラクタリゼーションされている。ＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆは多くのいろいろな組織やＨｅ　Ｌ　ａ細胞を含む細
胞系統にみつけられている。ＣＯＵＰ−ＴＦは先に従来
からのクロマトグラフィーと配列に特異的なりＮＡ親和
性クロマトグラフィーを組み合わせてＨｅ　Ｌ　ａ細胞
から２００，０００倍に精製されている。この精製され
た蛋白は細胞のない系ではオボアルプミン遺伝子プロモ
ーターからの正確な転写開始が要求される。さらに、二
二工劇ではＣＯＵＰ−ＴＦが介在するオボアルブミン遺
伝子の転写にはＳ　３００　ＩＩが必要である。またＣ
ＯＵＰ−ＴＦは特にラットのインスリンプロモーター要
素（ＲＩＰＥ）と結合することが知られている。興味深
いことにｃｏｕｐもＲＩＰＥもその結合部位は配列に同
等性は有していない。
受容体遺伝子の保持された配列を使ってｃＤＮＡライブ
ラリーを交互に検索する方法を使って配列の相同性によ
ってステロイド受容体群の一員とされる多数の「受容体
」が得られたが、それらの機能は分っていない。ＣＯＵ
Ｐ−ＴＦはこれらの「オーファン受容体ＪＣＤＮＡクロ
ーンの一つとして報告されｅａｒｍと名付けられている
。
このｃＤＮＡクローンはｖ−ｅｒｂＡプローブを用いた
交互検索によってＤＮＡライブラリーから得られた。
Ｃ００Ｐ−ＴＦは多種の、ラットインスリン遺伝子やト
リのオボアルブミン遺伝子を含む遺伝子の上流にあるプ
ロモータ配列に結合することが知られている。この結合
がインスリンやオボアルプミン蛋白の転写を促進する。
かくして、ＣＯＵＰＴＦはインスリンやオボアルプミン
合成の速度をコントロールする強い制御効果をちってい
る。
インスリンは成長や代謝をコントロールする鍵となるペ
プチドホルモンの一つである。インスリンの生合成の乱
れやインスリンに対する応答の乱れは糖尿病をもたらす
。患者数が多く社会的影響も大きいために糖尿病は詳細
に研究されてきた。強力に研究された領域の一つはイン
スリンの翻訳と分泌の制御についてである。この遺伝子
発現の研究はＤＮＡレベルでその分子を調べる技術を使
えるようになったことによって可能となった。
〔発明が解決しようとする課題〕
インスリン制御系の欠陥を検出することができれば糖尿
病を検出する方法が提供され、糖尿病の発症を予防した
り、治療したりするための治療処方を決めたり、それを
実行することができる。
本発明はインスリンプロモータを測定し、糖尿病に対す
る蛋白の欠陥を制御する新しいタイプの方法について記
している。これら糖尿病の状態を検出する新しい方法は
病気をひきおこす基本的な構造上の欠陥を検査し、新し
い治療を工夫するための別の材料を提供している。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の目的はインスリンプロモータの欠陥を検出する
方法の提供である。
本発明のもう一つの目的はＣＯＵＰ−ＴＦの欠陥を検出
するための方法である。
本発明のさらに別の目的はＣＯＵＰ−ＴＦプロモータの
相互作用における欠陥を確かめる方法である。
本発明のさらに付加的な目的はＣＯＵＰ−ＴＦを測定す
るための抗体を提供することである。
本発明のもう一つの目的はＣＯＵＰ−ＴＦ遺伝子のｃＤ
ＮＡクローンを提供することである。
本発明のさらに別の目的としてｃＤＮＡクローン、抗体
、あるいはＣＯＵＰ−ＴＦを糖尿病の病状を検出するた
めに開発し、それを使用することがある。
かくして、上記の目的に付ずいして本発明の一観点に従
って、生物試料とＣＯＵＰ−ＴＦの少くとも一つの抗原
部位と結合する抗体とを結合させ、生物試料／抗体混合
物を抗体結合について測定するステップを含む生物試料
中のＣＯＵＰ−ＴＦ量を測定する方法を提供することが
ある。抗体が生物試料と結合することによって作られる
抗体／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体を測定することが本発明に
よる方法の特別な一内容となっている。
本発明のもう一つの観点はＣＯＵＰ−ＴＦを生物試料か
ら得た核抽出物と結合させ、ＣＯＵＰ−ＴＦ／プロモー
タの結合量を測定することを含むＣＯＵＰ−ＴＦプロモ
ータを測定する方法である。
本発明のもう一つ別の観点はＣＯＵＰ−ＴＦオリゴヌク
レオチドを生物試料と結合させ、形成されるＣＯＵＰオ
リゴヌクレオチド／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体の量を測定す
るステップを含む生物試料中の生来のＣＯＵＰ−ＴＦ結
合能を測定する方法である。
望ましい内容においては、ＣＯＵＰ−ＴＦ量や、ＣＯＵ
Ｐ−ＴＦプロモータやＣＯＵＰ−ＴＦの結合能を測定す
る方法は病気につながるＣＯＵＰ−ＴＦ結合系における
欠陥を検出するために使われている。さらに、超低密度
リボプロティン（ＶＬＤＬ）遺伝子やプロオピオメラノ
コルチン遺伝子に関連したプロモータも測定できる。
本発明の付加的な観点は約１．５ｋｂまでのＣＯＵＰＴ
ＦｃＤＮＡクローン、ＣＯＵＰ−ＴＦに対するポリクロ
ーナル及びモノクローナル抗体、及びそのモノクローナ
ル抗体を生産するネズミのハイブリドーマを含んでいる
。
その他の目的、特徴、及び利点は添付の図面と結びつけ
てみるとき本発明の明細の目的を示す実施内容について
の以下の記述の中で明らかとなろう。
この技術分野に通じたものにとって、この発明について
その目的や精神からはずれることなく、いろいろな置き
かえや修正ができることは容易に明白であろう。
ここに使われている「オリゴヌクレオチド」という言葉
は３つ以上のデオキシリボヌクレオチドかりボヌクレオ
チドから成る分子を定義している。その正確な長さは最
終的な機能に関与する多くの要素やそのオリゴヌクレオ
チドの使い方に左右されよう。
ここに用いられている「機能的な」という言葉はその分
子がそれのちり機能を正常に働かせることを示している
。例えば、機能的な遺伝子は蛋白あるいはその一部を合
成し、その蛋白が正常に機能するようなものである。機
能的なＣＯ［ＪＰ−ＴＦはプロモータと結合し、下流に
ある遺伝子にその蛋白の転写をさせる。
「ステロイド受容体群」とはステロイド／甲状腺ホルモ
ン／ビタミン受容体群を含むＺｎ指絞蛋白の群を指して
いる。このステーイドホルモン受容体群は遺伝子のとな
りにあるプロモー夕要素に結合し、活性化する蛋白であ
る遺伝子制御因子を構成している。この系の特徴は２０
の変りうる残基と１２の固定的な残基があることである
。ＣＯＵＰ−ＴＦは２０の変りうる残基の全てと１２の
固定的残基のうち１１を含んでいる。保存されたＺｎ−
指絞配列と異なる唯一のアミノ酸は第２指紋部に保持さ
れたリジンに置きかわったグルタミンである。このクロ
ーンの挿入は長さで１５１３ヌクレオチドであった。ま
た１２５４塩基のオープンリーディングフレームを含ん
でいた。
「生来の」という言葉は生体試料からとられるものと変
らない分子を意味している。これは合成された、あるい
は組換えによる分子、あるいは合成分子または組換えに
よる分子の生成物と対比される。
ここに使われる「生物試料」という言葉はヒトを含む生
体から採取された嶽料を意味している。例えば、これに
限定するものでないが、血液、あるいはその成分、赤血
球、白血球、血小板、血清、皮膚からの組織標本、臓器
５毛髪、尿、唾液、汗、涙、羊漿液等である。
ここに用いられる「プロモータ」という言葉は蛋白が結
合し、それによって転写が開始されるＤＮＡ鎖の認識部
位をさしている。プロモータ配列はそれが制御する遺伝
子の上流にある。
ここに用いられている「ハイブリドーマ」という語は特
定の抗体を産生ずる肺細胞をミエローマ細胞と融合して
作られた融合細胞を意味している。融合細胞はミエロー
マの生育特性と肺細胞の抗体分泌特性を有している。
本発明の一内容はＣＯＵＰ−ＴＦの少くとも一つの抗原
性部位に結合する抗体を生体試料に結合し、抗体の結合
について生体試料／抗体混合物を測定するステップを含
む生体試料中のＣＯＵＰ−ＴＦ量を測定する方法である
。
本発明の一特定内容は、その測定段階が結合ステップで
作られる抗体／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体を測定することを
含んでいる。
本発明に使われる抗体はポリクローナルでもモノクロー
ナルでもよく、ＣＯＵＰ−ＴＦの抗原性部位の少くとも
１つに特異的に結合する。ポリクローナル抗体はＨｅ　
Ｌ　ａ細胞の核抽出物からＣＯＵＰ−ＴＦを精製するこ
とによって調製された。核抽出物はＤＥＡＥ、ホスホセ
ルロース、七フアクリルＳ−３００、そしてヘパリンセ
ファロース、カラムクロマトグラフィーを順次用いて分
画された。ＣＯＵＰ−ＴＦを含む両分は集めてＣＯＵＰ
配列特異的な親和クロマトグラフィーにかけられ、吸着
されない部分を集めた。ＣＯＵＰ−ＴＦはそれから０　
、６　Ｍ　Ｎ　ａ　ｃ　ｌを含む緩衝液でカラムから溶
出される。
別法として、この工程はＨｅ　Ｌ　ａの核抽出物を直接
配列に特異的なりＮＡ親和カラムに３回続けてかけるこ
とによってちできる。この第２の方法は約ＩＱの遠沈し
たＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞から大量１８μｇの精製ＣＯＵＰ
−ＴＦが得られる。
親和カラムを３回通すことで溶出した蛋白をウサギに注
射した。ニューシーラント白ウサギに精製ＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆの１０μｇを２回注射した。最初の注射は完全フロイ
ント　アジュバントと共に腹腔投与し、追加投与は４週
間の後、不完全アジュバントと皮下に注射された。１０
日間隔でウサギから採血し抗体は採集された。
ＣＯＵＰ−ＴＦに特異的に免疫反応するモノクローナル
抗体を生産するネズミのハイブリドーマはＨｅＬａ細胞
から精製した蛋白をＢａ１ｂ／ｃマウスに２週間毎に注
射することによって調製される。
４〜８週後、肺細胞を分離しマウスのミエローマ細胞と
融合される。得られる融合細胞を播種、コロニーとして
とり、ドツトイムノプロット法によって生来の蛋白に対
する反応性について検索した。反応したハイブリドーマ
がさらにクローン化される。これらのサブクローンは単
一のコロニーを形成するようにみえるが、再度ドツトイ
ムノプロット法で検査される。さの再クローン化された
ハイブリドーマはさらにマイクロタイタープレートかま
たは培養フラスコ中にフィーダーレーヤー細胞を用いる
ことなしにサブクローン化される。
大量のモノクローナル抗体を高濃度に生産するためにハ
イブリドーマクローンをマウスの腹水腫瘍として増殖さ
せる。大量１週間腫瘍を生育させた後、その抗体を生化
学的な分画法によって腹水から精製する。モノクロナー
ル抗体はタイプ分けされ、精製される。精製したモノク
ロナール抗体は分注され使用するまで保存される。
抗体はラジオアイソトープ、蛍光剤、化学発光剤、酵素
、抗体などを含むいろいろな化合物で標識される。Ｃ０
ＤＰ−ＴＦの量を測定するために多くの標準的な方法が
使われる。これらは放射活性を伴う光、色を出す酵素、
蛍光剤、オートラジオグラフィー、誘導を使う測定、直
接結合ＥＬＩＳＡ、　ｉｌ１合ＥＬＩＳＡ、直接結合Ｒ
ＩＡ、競合ＲＩＡ、電気泳動、競合結合及びこの分野技
術に通じる者にはよく知られたその他の方法での測定法
が含まれる。
多くの要因が標識と測定法の選択に影響するだろう。こ
れらには抗体抗原結合の割合、測定法のタイプ、標識の
感度、標識化合物を作る難度、自動化しやすさ、利用で
きる装置、便利さ等々に及ぼす影響が含まれる。
本発明のもう一つの目的は生体試料からの核の抽出物と
ＣＯＵＰ−ＴＦを結合させ、ＣＯＵＰ−ＴＦプロモータ
の結合量を測定するというステップを含むＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆ誘導性のプロモータを定量する方法である。先にのべ
たように多種の標準的な標識と測定法がＣＯＵＰ−ＴＦ
／プロモータの結合を測定するのに使われる。
ＣＯＵＰ−ＴＦ誘導性のプロモータの測定法はいろいろ
な遺伝子と関連づけられるプロモータの検査に使われる
。例えば、インスリン、ＶＬＤＬ、プロ・オピオメラノ
コルチン、オボアルブミンをコードしている遺伝子のプ
ロモータが全てＣＯＵＰ−ＴＦ誘導性である。かくして
、もしこれらの遺伝子のいずれかのプロモータが修飾さ
れれば、ＣＯＵＰ−ＴＦを結合する能力が変えられ、こ
れをこの方法で検出できる。
もう一つの本発明の目指すところはＣＯＵＰオリゴヌク
レオチドを生体試料と結合させ、形成したＣＯＵＰオリ
ゴヌクレオチド／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体の量を測定する
ステップを含む生体試料中の生来のＣＯＵＰ−ＴＦ結合
能を定量する方法である。先に述べたように多種の標準
的な標識と測定法によってＣＯ，ＵＰオリゴヌクレオチ
ド／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体を測定するのに使用できる。
Ｃ００Ｐオリゴヌクレオチドのいくつかの例には ５’　−ＴＡＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴ
Ｔ−３’　。
５’−ＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＴＴ−３’。
５’−ＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴ
ＧＡＣＣＣＣＴ−３’。
５’−ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴ
ＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡ−３’。
及びそれらからの断片及び誘導体が含まれる。
これらの配列は夫々オボアルブミン、インスリン、ＶＬ
ＤＬ、プロオピオメラノコルチンのプロモータ認識部位
に相応している。
本発明の上記の方法には多くの応用ができる。
例えば、抗体を使って生体試料中のＣＯＵＰ−ＴＦの量
を測る方法はＣ０ＤＰ−ＴＦの生産過剰あるいは生産不
足を測定するのに使用できる。これはＣＯＵＰ−ＴＦの
疾患を検出するのに使われる。さらに、これはインスリ
ン遺伝子のプロモータに結合するのに十分なＣＯＵＰ−
ＴＦを生産できない患者について糖尿病の診断に使用で
きる。
疾患を測定するもう一つの方法は異常なプロモータを探
すためにＣＯＵＰ−ＴＦ系を使うことがある。この方法
では、ＣＯＵＰ−ＴＦ蛋白が生体試料からのプロモータ
と結合される。ちし、ＣＯＵＰ−ＴＦのプロモータへの
結合があれば、構造遺伝子から下流に合成される生産物
に結合し、あるいはそれを測定することが正常なＣＯＵ
Ｐ−ＴＦプロモータ結合を測定するのに使われる。もし
欠陥のあるプロモータがあれば結合は変化し、従ってそ
の下流の転写も変わるだろう。このことはプロモータ配
列における欠陥から生じるような形の糖尿病を検出する
のに用いられる。
もう一つの方法は糖尿病に生じうるＣＯＵＰ−ＴＦ蛋白
における変化を測定することである。正常なプロモータ
オリゴヌクレオチド、その断片あるいは誘導体を生来の
ＣＯＵＰ−ＴＦに結合される。
もし、ＣＯＵＰ−ＴＦが正常なら、結合して適切な結合
が測定される。しかし、もし、ＣＯＵＰ−ＴＦ蛋白が異
常なら、例えば配列に変化がある異常ではその結合に起
こる変化を示すことによって検出される。かくして、こ
の測定法は異常なＣＯＵＰ−ＴＦ蛋白によって起こされ
る糖尿病でのこのようなケースを検出することができる
。
インスリン遺伝子に結合するのに加えて、ＣＯＵＰ−Ｔ
ＦはＶＬＤＬ遺伝子やプロオピオメラノコルチン遺伝子
に対するプロモータとも結合する。
これらの遺伝子の異常な機能と関連している疾患が糖尿
病であり、リボプロティン異常（多分動脈硬化症）や神
経原性、腎不全等々とである。
本発明のもう一つの方向は約１．５キロベースのＣＯＵ
Ｐ−ＴＦポリペプチドの断片をコードしているｃＤＮＡ
クローンである。
そのｃＤＮＡクローンの特定の内容が第１表に示される
ｃＤＮＡ配列である。
（以下余白） ５−　　　１Ｏ ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣ ０ ＡＣＣＣＣＧＧＣＧＧ ０ ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ ３０ ＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣ ７０ ＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣ １０ ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣ ５０ ＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴ ９０ ＧＣＣＡＡＴＴＣＡＣ ３０ ＧＡＧＣＧＴＣＣＧＣ ７０ ＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣ １０ ＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧ ５０ ＧＣＧＧＧＡＡＧＣＧ ９０ ＣＣＣＡＡ丁ＣＣＡＧ ３０ ＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡ ０ ＧＡＧＡＴＣＣＧＣＡ ０ ＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣ ００ ＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧ ４０ ＣＧＣＡＣＡＣＧＣＣ ８０ ＣＡＣＣＣＣＣＧＧＣ ２０ ＧＧＴ丁ＣＧＧＧＣＣ ６０ ＧＣＧＧＧＧＡＣＡＡ ００ ＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣ ４０ ＡＧＧＡＡＣＴＴＡＡ ８０ ＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡ ２０ ＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧ ６０ ＧＴＴＣＡＧＣＧＡＧ ００ ＧＣＣＡＧＴＡＣＧＣ ４０ ＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧ ０ ＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧ ０ ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧ １０ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ ５０ ＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧ ９０ ＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧ ３０ ＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡ ７０ ＧＴＣＧＡＧＣＧＧＣ １０ ＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴ ５０ ＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧ ９０ ＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣ ３０ ＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧ ７０ ＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣ １０ ＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣ ５０ ＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡ ０ ＧＣＣＧＧＧＧＧＣＡ ０ ＣＧＧＣＣＣＧＣＧＧ ２０ ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣ ６０ ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧ ００ ＡＣＡＡＧＧＧＣＣＡ ４０ ＧＣＡＣＡＴＣＧＡＧ ８０ ＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧ ２０ ＴＣＴＴＣＡＡＧＡＧ ６０ ＣＣＧＴＧＣＣＡＡＣ ００ ＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣ ４０ 丁ＧＧＧＣＡＴＧＡＧ ８０ ＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧ ２０ ＧＧＧＧＡＣＣＣＣＣ ６０ ＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴ ７０ ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣ １０ ＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣ ５０ ＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ ９０ ＧＴ、ＧＧＧＣＣＣＧＣ ３０ ＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧ ７０ ＴＧＴＴＣＧＴＧＣＴ １０ ＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧ ５０ ＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧ ９０ ＴＣＣＧＣＡＴＣＴＴ ３０ ＡＣＡＣＧＴＣＧＡＣ ７０ ＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡ ０１０ ＣＣＣＡＣＡｆｆＣＧＡ ０５０ ＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣ ０９０ ＣＧＴＴＴＴＧＧＣＡ ８０ ＧＡＧＣＣＣＴＡＣＣ ２０ ＡＧＣＣＣＡＡＣＡＡ ６０ ＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣ ００ ＡＡＣＡＴＣＣＣＣ丁 ４０ 丁ＧＴＣＣＣＴＧＣＴ ８０ ＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣ ２０ ＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧ ６０ ＣＣＧＡＣＣＧＣＧＴ ００ ＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧ ４０ ＴＣＡＧＣＣＧＡＧＴ １１０ ＣＧＴＣＡＧＡＣＧＣ ０２０ ＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧ ０６０ ＧＴＧＡＧＧＡＧＣＣ １００ ＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴ ９０ ＣＣＡＣＧＴＣＧＣＧ ３０ ＣＡＴＴＡＴＧＧＧＣ ７０ ＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡ １０ ＴＣＴＴＣＣＣＧＧＡ ５０ ＡＣＧＣＣＴＣＡＣＣ ９０ ＣＡＧＴＧＣＴＣＴＡ ３０ ＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴ ７０ ＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣ １０ ＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣ ５０ ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴ ９０ ＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧ ０３０ ＧＡＧＡＡＧＴＣＧＣ ０７０ ＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡ １１０ ＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣ ００ ＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣ ４０ ＡＴＣＧＡＧＡＡＣＡ ８０ ＧＣＧＣＣＧＴＣＧＡ ２０ ＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣ ６０ ＴＧＧＡＧＣＧＡＧＣ ００ ＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡ ４０ ＧＣＡＴＧＣＣＴＣＧ ８０ ＡＴＧＧＡＣＣＡＣＡ ２０ ＴＣＡＡＧＧＣＧＣＴ ６０ ＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣ 】０００ ＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧ ０４０ ＡＧＴＧＣＧＣＡＣＴ ０８０ ＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣ １２０ ＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡ ＋＋３０　　　　　　１１４０　　　　　　１１５０　
　　　　　１１６０ＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴ
ＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴ　　ＴＣＴＴＣＧＴＣＣ
Ｇ１１７０　　　　　１１８０　　　　　　１１９０　
　　　　　１２００ＴＴＴＧＧＴＡＧＧＴ　　ＡＡＡＡ
ＣＣＣＣＣＡ　　ＴＣＧＡＡＡＣＴＣＴ　　ＣＡＴＣＣ
ＧＣＧＡＴ１２＋０　　　　　１２２０　　　　　　１
２３０　　　　　　１２４０ＡＴＧＴＴＡＣＴＧ丁　　
ＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧ　　　ＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧ　　
　ＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴ１２５０　　　　　１２６０　
　　　　　１２７０　　　　　１２８０ＣＣＡＴＣＣＡ
ＧＴＧ　　ＣＴＣＣＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧＧＣＧＣＴＴ
　　ＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣ１２９０１３００１３＋０　
　　　　１３２０ＣＣＧＴＣＣＣＣＣＴ　　ＡＧＡＧＡ
ＣＴＣＡＧ　　ＡＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡ
ＧＧ１３３０　　　　　　１３４０　　　　　　１３５
０　　　　　　１３６０ＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧ
ＧＧＧＡＣＡ　　ｆ：ｃＧＧＧＡＡＧＴＧ　　ＣＡＧＣ
ＧＧＧＣＣＡ１３７０　　　　　１３８０　　　　　１
３９０　　　　　　１４００ＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧ　　
ＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡ　　ＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡ　　Ｇ
ＡＣＡＧＧＡＧＣＡ１４１０　　　　　　１４２０　　
　　　　１４３０　　　　　　１４４０ＧＣＣＣＡＣＣ
ＣＡＧ　　ＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡ　　ＡＴＣＣＧＡＧＣ
ＴＡ　　ＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧ１４５０　　　　　１４
６０　　　　　　１４７０　　　　　１４８０ＧＡＡＡ
ＡＡＧＡＧＡ　　ＣＴＣＴＴＴＴＡＧＧ　　ＡＴＣＡＧ
ＡＴＣＴＧ　　ＴＧＡＧＣＡＣＧＴＴ１４９０　　　　
　１５００　　　　　　１５１０　　　　　１５２０Ｇ
ＧＣＣＡＧＧＡＡＡ　　ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡ　　ＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＣＣＧ−３’及びそれからの断片
及び誘導体でその断片や誘導体は機能的なＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆをコードしているもの。
本発明のもう一つの内容はＣＯＵＰ−ＴＦを活性化する
ためのリガンドである。その蛋白は内分泌的に制御され
るような形で標的とする細胞に合威され、あるいは生産
される。そのリガンドはＣＯＵＰ−ＴＦに結合し、ステ
ロイド、甲状腺ホルモンやビタミンのようなホルモンに
ついて知られるものと類似の標準的なメカニズムによっ
てＣＯＵＰ−ＴＦを活性化する。このリガンドは生体試
料とＣＯＵＰ−ＴＦを結合させ、先述のようにＣＯＵＰ
−ＴＦ／リガンドの結合を測定することによって分析さ
れる。
以下に示す実施例は本発明を説明するために提出される
もので、いかなる形でもこの発明を限定するものでない
。これらの例において、全て百分率は固体に対しては重
量比で、液体では容量で表わしている。また全ての温度
は特にことわらなければ摂氏である。
実施例Ｉ ＣＯＵＰ−ＴＦのｃＤＮＡクローン このクローンは無作為に感作されＨｅ　Ｌ　ａ細胞から
ポリ（Ａ）”−ｍＲＮＡを使ってλｇｔｌｌに構築され
たオリゴｄＴ感作のｃＤＮＡのライブラリーから構築さ
れた。元のライブラリーは６Ｘ１０６個の独立した組換
え体があり増幅することなしに用いられた。はじめのス
クリーニングでは陽性のクローンを検出するために１１
２５化プロテインＡを用いて、＋（１（１万個のファー
ジプラークがＣＯＵＰ−ＴＦに対する抗血清で探索され
た。２回目のスクリーニングでは、第一のフィルターを
抗体で調べられたうつしとったフィルターを３２Ｐで標
識した連鎖したＣＯＵＰ配列で調べた。
１つだけクローンが相方のプローブに交叉反応した。
そのクローンを単離し既に分っているＣＯＵＰ配列に特
異的に結合するかテストした。ファージをニトロセルロ
ース濾紙に移し、そして融合蛋白を変性させるために６
Ｍの塩酸グアニジンで処理した。ファージの融合蛋白を
含む濾紙をいろいろな放射標識したＤＮＡプローブで検
索した。連鎖したＣＯＵＰ配列は融合蛋白ときつく結合
したが、一方、非特異的な超音波処理したサケ精子のＤ
ＮＡはその標品に結合しているのは検出できなかった。
溶解させた細胞抽出液はこの組換えプラークから調製さ
れ、ＣＯＵＰ配列を含むＤＮＡ断片とインキュベートし
、ゲル電気泳動法で分析した。いくつかの蛋白−ＤＮＡ
複合体がＩＰＴＧで誘導した細胞抽出物では形成されて
いたが誘導していない抽出物では作られていない（第２
図レーン１と２）でこのことはｃＤＮＡによってコード
されている蛋白がＣＯＵＰ配列を含むＤＮＡ断片と結合
することができることを示している。結合の特異性は競
合解析法によって照明された。複合物の形成は野生株ｃ
ｏｕｐ配列に相当する非標識オリゴヌクレオチドを使う
と焼却され（第２図、レーン３及び４）、一方変異した
オリゴヌクレオチドは５０倍あるいは１００倍の過剰量
で競合できなかった（第２図、レーン５及び６）。
特異的な蛋白−ＤＮＡ複合体に複数の種類があることは
ウェスタンプロット分析によっても理解される。１３０
〜１６５ＫＤａの大きさの範囲にある３つの蛋白種の１
１ＬＫＤａのβ−ガラクトシダーゼを含むＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆ融合蛋白が誘導された細胞抽出物においてＣＯＵＰ−
ＴＦに対する抗血清と反応することがみられたが誘導し
ていない細胞抽出物の場合にはみられなかった。さらに
メチル化による阻害分析によって融合タンパクのＣＯＵ
Ｐ配列に対するプリン接触部位がＨｅ　Ｌ　ａのＣＯＵ
Ｐ−ＴＦで見られたものと同一であることが示された（
第３図）。これらの結果は細菌性の融合蛋白がＣＯＵＰ
　　ＤＮＡ配列に対して予測されたように正確に結合す
るという結論を支持している。
実施例２ ＣＯＵＰ−ＴＦ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから合成された蛋白の
アミノ酸配列、ヌクレオチド配列は第１表にあり、その
推定されるアミノ酸配列は第２表に示されている。
第２表　ＣＯＵＰ−ＴＦの推定アミノ酸配列５ＥＲ−５
ＥＩＩＩ−ＴＲＰ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＰＲＯ−ＧＬＮ−
ＡＳ　Ｐ−Ａ　ＳＰ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ＧＬＹ
ＡＳＮ−ＰＲＯ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＰＲＯ−ＡＳＮ−Ｐ
ＲＯ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＧＬＮ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲ
Ｇ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＡＬＡ
−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ−ＧＬＮ−ＧＬＮ−
ＡＬＡＧＬＹ−Ｓ　ＥＲ−ＧＬ　Ｙ−Ａ　ＬＡ−Ｐ　Ｒ
Ｏ−ＨＩ　５−ＴＨＲ−Ｐ　ＲＯ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−Ｐ
　ＲＯ−ＧＬ　Ｙ−Ｇ　ＬＮ−ＰＲＯ−Ｇ　Ｌ　Ｙ−Ａ
　ＬＡ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＰＲ０−ＧＬ　Ｙ−
ＴＨＲ−Ａ　ＬＡ−ＧＬＹ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＣＹＳ　−Ｇ
　ＬＹ−Ｇ　ＬＮ−ＧＬＹ−ＰＲＯ−Ｐ　ＲＯ−ＧＬ　
Ｙ−５ＥＲ−ＧＬＹ−ＧＬＮ−５ＥＲ−ＧＬＮ−ＧＬＮ
−ＨＩ　５−ＩＬＥ−ＧＬＩＪ−ＣＹ　５−ＶＡＬ−Ｖ
ＡＬ−ＣＹ　５−ＧＬＹ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＬＹＳ−５ＥＲ
−５ＥＲ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩ　５−ＴＹＲ−ＧＬＹ
−Ｇ　ＬＮ−ＰＨＥ−ＴＨＲ−ＣＹ　５−ＧＬＵ−ＧＬ
Ｙ−ＣＹ　Ｓ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ｓ　ＥＲ−ＰＨＥ−Ｐ
ＨＥ−ＬＹ　５−ＡＲＧ−Ｓ　Ｅ　Ｒ−ＶＡ　Ｌ−ＡＲ
Ｇ−ＡＲＧ−Ａ　５Ｎ−ＬＥＵ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＴＨ
Ｒ−ＣＹ　Ｓ　−ＡＲＧ−Ａ　ＬＡ−Ａ　５Ｎ−ＡＲＧ
−Ａ　Ｓ　Ｎ−ＣＹ　Ｓ−Ｐ　ＲＯ−Ｉ　ＬＥ−Ａ　Ｓ
　Ｐ−ＧＬＮ−ＨＩ　Ｓ−ＨＩ　５−ＡＲＧ−Ａ　ＳＮ
−ＧＬＮ−ＣＹＳ−ＧＬＮ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−ＡＲＧ−
ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＣＹＳ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−Ｖ
ＡＬ−ＧＬＹ−ＭＥ　Ｔ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−Ｇ　ＬＵ−
ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＲＧ−Ｍ
Ｅ　Ｔ−Ｐ　ＲＯ−Ｐ　ＲＯ−ＴＨＲ−Ｇ　ＬＮ−Ｐ　
ＲＯ−Ａ　ＳＮ−Ｐ　ＲＯ−Ｇ　ＬＹ−Ｇ　ＬＮ−ＴＹ
Ｒ−Ａ　ＬＡ−ＬＥＤ−ＴＨＲ−Ａ　５Ｎ−ＧＬＹ−Ａ
　Ｓ　Ｐ−ＰＲＯ−ＬＥＤ−Ａ　５Ｎ−ＧＬＹ−ＨＩ　
５−ＣＹ　５−ＴＹＲ−ＬＥＵ−３ＥＲ−ＧＬＹ−ＴＹ
Ｒ−Ｉ　Ｌ　Ｅ　−Ｓ　Ｅ　Ｒ−Ｌ　ＥＵ−ＬＥＵ−Ｌ
ＥＵ−ＡＲＧ−Ａ　ＬＡ−Ｇ　ＬＵ−Ｐ　ＲＯ−ＴＹＲ
−Ｐ　ＲＯ−ＴＨＲ５Ｅ　Ｒ−ＡＲＧ−ＴＹＲ−ＧＬ　
Ｙ−ＳＥ　Ｒ−ＧＬＮ−ＣＹＳ−ＭＥ　Ｔ−ＧＬＮ−Ｐ
ＲＯ−Ａ　５Ｎ−Ａ　ＳＮ−Ｉ　Ｌ　Ｅ−ＭＥＴ−ＧＬ
Ｙ−Ｉ　ＬＥ−ＧＬＵ−Ａ　ＳＮ−Ｉ　ＬＥ−ＣＹＳ−
ＧＬＵ−ＬＥ　Ｕ−ＡＬＡ−Ａ　ＬＡ−ＡＲＧ−ＬＥＵ
−ＬＥＵ−ＰＨＥ−Ｓ　ＥＲ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＧＬＵ
−ＴＲＰ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−Ａ　ＳＮ−Ｉ　ＬＥ−ＰＲ
Ｏ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＬＥＤ−Ｇ
ＬＮ−Ｉ　ＬＥ−ＴＨＲ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＧＬＮ−ＶＡＬ
−５ＥＲ−ＬＥＵ−ＬＥＵ−Ａ　ＲＧ−Ｌ　ＥＵ−ＴＨ
Ｒ−ＴＲＰ−５Ｅ　Ｒ−ＧＬＵ−Ｌ　Ｅ　Ｕ−ＰＨＥ−
ＶＡ　Ｌ−Ｌ　ＥＵ−Ａ　Ｓ　Ｎ−Ａ　ＬＡ−Ａ　ＬＡ
ＧＬＮ−ＣＹＳ−Ｓ　ＥＲ−ＭＥＴ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−
ＨＩ　５−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＬＥＤ−ＬＥＤ−
Ａ　ＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ＬＥＵ−ＨＩ　Ｓ
　−Ａ　ＬＡ−５ＥＲ−ＰＲＯ−ＭＥ　Ｔ−５ＥＲ−Ａ
ＬＡ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＡＲＧＶＡＬ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−Ｐ
ＨＥ−ＭＥＴ−ＡＳ　Ｐ−ＨＩ　Ｓ−Ｉ　ＬＥ−ＡＲＧ
−Ｉ　ＬＥ−ＰＨＥ−ＧＬＮ−Ｇ　ＬＵ−ＧＬＮ−ＶＡ
　Ｌ−ＧＬＵ−ＬＹ　５−ＬＥＵ−ＬＹ　Ｓ−Ａ　ＬＡ
−ＬＥＵ−ＨＩ　５−ＶＡＬ−Ａ　Ｓ　Ｐ−５ＥＲ−Ａ
　ＬＡ−ＧＬＵ−ＴＹＲ−５ＥＲ−ＣＹ　５−ＬＥＵ−
ＬＹＳ−ＡＬＡ−Ｉ　ＬＥ−ＶＡＬ−Ｌ　ＥＵ−ＰＨＥ
−ＴＨＲ−５ＥＲ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＡＬＡ−ＣＹＳ−ＧＬ
Ｙ−ＬＥＵ−５ＥＲ−Ａ　Ｓ　Ｐ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−Ｈ
Ｉ　Ｓ−Ｉ　ＬＥ−ＧＬＵ−５ＥＲ〜ＬＥＵ−Ｇ　ＬＮ
−ＧＬＵ−ＬＹ　Ｓ−５ＥＲ−ＧＬＮ−ＣＹＳ−Ａ　Ｌ
Ａ−ＬＥＵ−ＧＬ　Ｕ−ＧＬ　Ｕ−ＴＹＲ−ＶＡＬ−Ａ
ＲＧ−Ｓ　ＥＲ−ＧＬＮ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−Ａ　５Ｎ−
Ｇ　ＬＮ−ＰＲＯ−Ｓ　ＥＲ−ＡＲＧ−ＰＨＥ−ＧＬＹ
−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＬＥＵ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＥＵ−
ＰＲＯ−Ｓ　ＥＲ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＶＡＬ−
Ｓ　ＥＲ−５ＥＲ−５Ｅ　Ｒ−ＶＡ　Ｌ　−Ｉ　Ｌ　Ｅ
−Ｇ　ＬＵ−ＧＬＮ−Ｌ　Ｅ　Ｕ−ＰＨＥ−ＰＨＥ−Ｖ
ＡＬ−ＡＲＧ−Ｌ　ＥＵ−ＶＡＬ−Ｇ　Ｌ　Ｙ−ＬＹＳ
−丁ＨＲ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＧＬＵ−丁Ｊ（Ｉ’ｌ−Ｌ
ＥＵ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＭＥＴ−ＬＥＵ−ＬＥ
Ｕ−５ＥＲ−ＧＬ　Ｙ−５ＥＲ−５ＥＲ−ＰＨＥ−Ａ　
ＳＮ−ＴＲＰ−ＰＲＯ−ＴＹＲ−ＭＥ　Ｔ−５ＥＲ−Ｉ
　ＬＥ−ＧＬＮ−ＣＹＳ−３ＥＲ 生来のＨｅＬａ細胞のＣＯＵＰ転写因子からＮ末端アミ
ノ酸配列を得る試みは成功していなかったので調部用５
Ｄ５−ＰＡＧＥゲルからとり、４６〜４８ＫＤａの範囲
のポリペプチドを得、シアン化臭素分解にかけた。ＣＮ
　Ｂ　ｒ分解の後、その断片を逆相ＨＰＬＣによって単
離した。５つの異なるポリペプチド断片のアミノ酸配列
が４６及び４８ＫＤａのポリペプチドから得られた。こ
れらのペプチド配列をｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンから推定
されたアミノ酸配列と比較すると正しいリーディングフ
レームが確められ、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの同一性に
強い証拠を与えた。５つ全てのポリペプチド断片のアミ
ノ酸配列がシアン化臭素の分解部位であるメチオニンで
始まることに注目すべきである。我々は、この我々の得
たクローンはＣＯＵＰ−ＴＦをコードしているか、ある
いは少くとち非常に近い関係にあるＣＯＵＰ−ＴＦ群の
一員であると結論した。
４３ＫＤａ及び４４ＫＤａのポリペプチドが４６ＫＤａ
及び４８ＫＤａのＣＯＵＰ−ＴＦと同じｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
からコードされているという直接的々証拠はないけれど
も、以下はそれらが密接に関係していることを示唆して
いる。両者のＣＮ　Ｂ　ｒ分解ポリペプチドの逆相ＨＰ
ＬＣ溶出プロファイルが区別されない。さらに加えて、
限定されたアミノ酸配列分析が、それらが共通のペプチ
ドをもっていることを示している。それ故、４つの４３
〜４８ＫＤａポリペプチドは全て（１）同じｍＲＮＡに
よってコードされており、共有結合的に修飾されたかあ
るいは部分的に分解されたものを表わしている、（２）
単一の遺伝子から異なるスプライシングを経て生成され
た、あるいは（３）密接に関連した遺伝子サブファミリ
ーの生産物である、のいずれかであると思われる。我々
の全ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは４５．７ＫＤａの４１８アミノ酸
の蛋白をコードしてイル。これ＆’Ｌ　正ニ４６〜４８
　Ｋ　Ｄ　ａ（７）ＣＯＵＰ−ＴＦノ全長のクローンを
示している。
実施例３ エストロゲン非感受性 ＣＯＵＰ−ＴＦが属しているスーパーファミリーにある
受容体のＺｎ−指絞領域（第１表の塩基２４１から４３
８まで）がＤＮＡ結合に関わっていることが一般に認め
られている。この領域の中でアミノ酸が保存されている
ことを考えると受容体によって認識されるＤＮＡ応答要
素もまた保存されると考えられる。ＣＯＵＰ−ＴＦによ
って認識されるＤＮＡ要素は半ＥＲＥ部位を含んでいる
。かくして、オボアルプミン遺伝子プロモータのｃ。
ＵＰ配列に結合するエストロゲン受容体の能力を大過剰
の受容体を用いて調べることができる。
ＣＯＵＰオリゴヌクレオチドの１００倍のモル過剰でエ
ストロゲンやプロゲステロンの受容体が応答する配列に
対して結合することを競合しなかった。さらにＤＮＮア
ーゼ化よる分解パターン解析によってＣＯＵＰ配列に対
してエストロゲン受容体が弱く結合しているパターンが
ＣＯＵＰ−ＴＦがＣＯＵＰ配列に結合しているものと区
別できることが示されている。最後にＣＯＵＰ配列はエ
ストロゲンには応答しない。一つの受容体が他の受容体
の応答要素に対して非生産的に結合するこの種のものは
既に報告がある。我々はＣＯＵＰ−ＴＦがオボアルプミ
ン遺伝子プロモータの生理学的に重要な活性化剤である
と結論している。
実施例４ ＣＯＵＰ−ＴＦに対する抗血清の特徴 ゲル電気泳動やウェスタンプロット分析によるＣＯＵＰ
−ＴＦに対する抗血清の特徴づけについて第１図が示し
ている。典型的には、１２０　ｍＱの核抽出物を０．２
５Ｍ　ＮａＣ１の濃度で５−のＣＯＵＰ特異的ＤＮＡア
フイニテイーカラムにのせた。
ＣＯＵＰ−ＴＦを含む［１，６Ｍ　ＮａＣ１溶出液を０
，３Ｍ塩漬度に調節し、Ｈｉｎｆｌ消化したｐＢＲ３２
２の３００μｇ／−と３０分間インキュベートし、それ
から２−のアフィニティー樹脂にかけた。アフィニティ
ーカラムを同じようにくり返すが、第３サイクルでは非
特異的ＤＮＡ競合剤は１５０μｇ／−とし、アフィニテ
ィーカラム樹脂は１　ｍＱを用いた。
約３．５μｇのＣＯＵＰ−ＴＦが得られた。４０μｇの
蛋白を集メた後、ヘパリンセファロース　りロマトクラ
フイーによって濃縮し、凍結乾燥して抗体を作るために
用いた。
部分精製したＨｅＬａのＣＯＵＰ−ＴＦを免疫前血清（
第１図、レーン２）、熱をかけた蛋白に対する抗血清（
第１図、レーン３）、及びＣＯＵＰ−ＴＦに対する抗血
清（第１図、レーン４．５）についてゲル電気泳動で分
析した。オボアルブミン遺伝子の−２６９から−４４の
ＤＮＡ断片（ＣＯＵ　Ｐ配列を含んでいる）がプローブ
として使われた。第１図のレーン６はプローブだけであ
る。非特異的競合剤として２μｇのＨｉｎｆｌ消化した
ｐＢＲ３２２の存在下で結合反応が行われた。フリーの
プローブに相当するバンド、４３〜４１１ＫＤａポリペ
プチドＤＮＡ複合物及び６８ＫＤａポリペプチドＤＮＡ
複合物に相当するバンドが夫々Ｆ、ＣＩ。
Ｃ２として示されている（第１図）。
アフィニティーカラムの第３溶出液から得たＣＯＵＰ−
ＴＦの０．４２μｇをトリクロロ酢酸で沈澱させ、Ｓ　
Ｄ　Ｓ−１［１％ＰＡＧＥゲルにかけ銀染色した（第１
図、レーン７）。蛋白質マーカー夫々の大きさがＫＤａ
で示されている。第１図、レーン８には１４０μｇのＨ
ｅＬａ全細胞抽出物が別に５ＤＳ−１０％ＰＡＧＥゲル
にかけられ、次いでイモピロンＰＶＤＦメンプランにう
つしとられた。３％脱脂ミルクでブロッキングした後、
膜を５００倍に希釈したＣＯＵＰ−ＴＦ抗血清と反応さ
せた。
工１２５−プロティンＡが検出に用いられた。
実施例５ 融合タンパクに対するｃｏｕｐ配列の結合細菌で合成さ
れた融合タンパクのＣＯＵＰ配列の特異的結合が第２図
、３図に示されている。
Ｈｅ　Ｌ　ａのＣＯＵＰ−ＴＦを上記のようにして精製
した。
約１０μｇのタンパクを１２％トリクロロ酢酸で沈澱さ
せ、５ＤＳ−１０％ＰＡＧＥゲルで分析した。
ゲルはクマシーブルー染色を行った。４６ＫＤａと４８
ＫＤａのポリペプチドは分離されなかったので両者をと
り出し、−緒に電気的に溶出した。
４３ＫＤａと４４ＫＤａのＣＯＵＰ−ＴＦペプチドち同
様に処理した。それからポリペプチドを室温、暗所で１
６時間、７０％ギ酸中でＣＮ　Ｂ　ｒ分解にかけた。
過剰のＣＮ　Ｂ　ｒは凍結乾燥で除去した。分解産物を
Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ　−３００Ｃ８逆相Ｔ（ＰＬＣ
カラムにかけ０．１％トリプルオロ酢酸を含む０％から
６４％のアセトニトリルのグラジェントで０，６ｍＪ２
／　ｍ　ｉ　ｎの流速で８０分間かけて溶出した。ポリ
ペプチドは］２０Ａ型ＰＴＨ−アナライザーをつけたア
プライド・バイオシステム社！！！４７７Ａ型蛋白配列
分析機で配列を分析した。ｃＤＮＡクローンは一本鎖ま
たは二本鎖分解によって制限マツピングを行った。Ｍ　
１３　ｍ　ｐ　１　ｇまたはＭ１３ｍｐ１９にサブクロ
ーン化された制限断片はジデオキシ鎖ターミネーション
法によって配列が決められた。ある断片については部分
的に化学分解によって配列を決めた。ＧＣに富んだ領域
はデオキシグアノシン・三燐酸混合の代りにＣ７デアザ
デオキシグアノシン三燐酸を混合することで配列を決め
た。
競合実験はゲル電気体動分析によって行われた。誘導さ
れていない細胞（第２図、レーン１）またはＩＰＴＧで
誘導した細胞（第２図、レーン２〜６）の抽出物１μＱ
を転写バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，
９，１００ｍＭ　ＫＣＱ　、　　１ｍＭ　ＤＴＴ、　０
．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２．５ｍＭ　ＭｇＣＱｚ、　
　６％グリセロール、２％フィコール）８μＱ中でＨｉ
ｎｆ■消化したｐＢＲ３２２の４μ区と室温で１０分間
インキュベートした。その後２μＱの標識したオボアル
ブミン遺伝子プローブを二本鎖の野生タイプのオリゴヌ
クレオチド（第２図、レーン３゜４）または二本鎖の変
異したオリゴヌクレオチド（第２図、レーン５，６）と
ともに１５分間混合液に加えて、その後５％のポリアク
リルアミドゲルに流した。野生タイプのオリゴヌクレオ
チドの５’−ＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡ
ＡＡＣＴＴＣＴＧＡ−３’はオボアルブミン遺伝子の転
写開始部位から−９１から一６４塩基の配列に相当して
いる。変異したオリゴヌクレオチドは−７４と−８１の
位置で２つのＣをＧにとりかえることで合成した。加え
たオリゴヌクレオチドの量はオリゴヌクレオチドののプ
ローブに対するモル比で示されている。比較のためにレ
ーン１とレーン２にはオリゴヌクレオチド競合剤は加え
られていない（第２図）。
メチル化による阻害実験が細菌で合成されたＣＯＵＰ−
ＴＦについて行われた。β−ガラクトシダーゼ−ＣＯＵ
Ｐ−ＴＦ融合蛋白を配列特異的ＤＮＡアフィニティーカ
ラムを使って精製された。オボアルブミン遺伝子プロモ
ータのＤＮＡ断片（−２６９から−４４）が部分的にメ
チル化され、調製用ゲル電気泳動におけるプローブとし
て使われた。フリーのプローブ（第２図ｂ、レーン１と
４）、ＨｅＬａＣＯＵＰ因子との複合体を表わす泳動の
遅いバンドに存在するＤＮＡ（第３図、レーン３）、及
び細菌で発現した融合蛋白（第３図、レーン２）が単離
された。夫々のＤＮＡバンドをアルカリで修飾されたプ
リン残基のところで分解されて、それから変性条件下で
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。星印はプリ
ンの接する部位を示している。
実施例６ 糖尿病の検出 ３２ｐ標識したオリゴペプチドの５’　−ＣＣＡＧＧＧ
ＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＴＴ−３’が糖尿病
患者と健常者についてＣＯＵ’Ｐ−ＴＦを検出するため
に結合プローブとして使われた。条件は実施例５で記し
たとおりである。ＣＯＵＰ−ＴＦをコードしている遺伝
子の制御に欠陥があると正常な検体に比べ結合活性が低
くなる。もう一つのアプローチはノーザンプロット分析
によってｍ　ＲＮ　Ａ濃度を検出するためにプローブと
してＣＯＵＰ−ＴＦ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを使うことである
。ＣＯＵＰ−ＴＦ　ｍ　ＲＮ　Ａの減少はＣＯＵＰ−Ｔ
Ｆの生産が不十分なことを示している。
ＣＯＵＰ−ＴＦ蛋白は正常に対する糖尿病患者において
インスリン遺伝子プロモータのくみこみを調べるために
使うことができる。インスリンプロモータ断片が単離さ
れ、あるいはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて
増幅され、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＣＯＵＰ−
ＴＦとの結合試験に供される。ＣＯＵＰプロモ一タ配列
における変異はＣＯＵＰ−ＴＦ結合を少なくし、その結
果インスリン遺伝子の発現を乏しくするだろう。
実施例７ 超低密度アポリボプロティン（ＶＬＤＬ）における欠陥
３２ｐ−標識したオリゴヌクレオチド結合プローブ５’
−ＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡ
ＣＣＣＣＴ−３’がＣＯＵＰ−ＴＦの不足またはリポプ
ロティン異常をちたらすＣＯＵＰ−ＴＦ遺伝子の欠陥を
検出するのに使われる。またおそらくは動脈硬化の発症
を予測させるのにも使えよう。方法の条件は実施例６に
記したとおりである。
実施例８ プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）系における欠陥
の検出３２ｐで標識したオリゴヌクレオチド結合プロー
ブの５’　−ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＡ
ＣＧＴＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡ−３’をＣＯＵＰ−
ＴＦの量とＰＯＭＣ遺伝子プロモータの組み込みを調べ
るのに使えるだろう。条件や方法は実施例６に記された
とおりである。ＰＯＭＣ遺伝子発現の異常は腎不全や食
欲不振やうつ病や精神障害などをもたらすだろう。
実施例９ ＣＯＯＰ−ＴＦ活性化ホルモンにおける欠陥ＣＯＵＰ−
ＴＦに対する活性化ホルモン（リガンド）における欠陥
があると、ＣＯＵＰ−ＴＦは不活性の形のまま残り、Ｃ
ＯＵＰ−ＴＦによって制御される全ての遺伝子に悪影響
がでるだろう。リガンドがあれば標準的な競合法でＣＯ
ＵＰ−ＴＦ蛋白への直接的な結合によって検出でき、ま
た定量もできる。
実施例１Ｏ ＣＯＤＰ−ＴＦ活性化ホルモンの検出 ＣＯＵＰ−ＴＦはクローン化したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組換
え発現ベクター挿入し、それを真核または原核細胞に移
すか、あるいは−」三工則でＣＯＵＰ−ＴＦ　ｃＤＮＡ
を転写、翻訳することによって大量に生産できよう。組
換えで作られた蛋白（ＣＯＵＰ−ＴＦ）で一連のリガン
ド（例えば、ステロイド、非ステロイド性のフェノール
化合物、生物フラボノイド、代謝基質や産物、炭水化物
誘導体など）に対する結合親和性を調べられる。どれか
のリガントの特異的な結合が標準的な結合法や競合法で
みつからなければそのリガンドはリポータ−遺伝子を用
いての形質導入法でＣＯＵＰ−ＴＦを活性化する能力が
あるかどうか調べることができる。そのようなリガンド
が証明しうる活性化能をもつならばＣＯＵＰ−ＴＦによ
って活性化される全ての遺伝子を制御するための治療的
な潜在力をもつような化学的に合成する誘導体が作れよ
う（アゴニストやアンタゴニスト）。そのような薬物（
薬剤）はＣＯＵＰ−ＴＦによって制御される遺伝子に悪
影響をもたらすようなヒトの病気を治療するのに使えよ
う。
この技術に通じた者には本発明がその目的を実行し、そ
して、これに包含しているような目標や利益を得るため
に適用できることを容易に評価できよう。ここに記した
方法、手法、技術などはここでは好ましい内容を代表と
して示したもので、その狙いとするところに制限をつけ
るつもりはない。この中における変更やその他の用途は
本発明の精神に包含され、特許請求の中にみられる考え
方に規定されるものはこの技術分野に通じたものにとっ
ては行うことができよう。
【図面の簡単な説明】
第１図はＣ０１ＪＰ−ＴＦに対する抗血清の特性づけの
ためにゲル電気泳動とウェスタンプロットを用いた分析
例である。 第２図は競合解析法によるＣＯＵＰ配列に対するバクテ
リアで合成された融合タンパクの特異的結合を示してい
る。 第３図はバクテリアで合成されたＣＯＵＰ−ＴＦのメチ
ル化阻害分析を示している。 図面や図表は必ずしも等尺ではなく、この発明の特徴が
尺度において誇張され、あるいは明確さや簡明さのため
に略図化した形で示されている。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、生物試料とＣＯＵＰ−ＴＦの少くとも１つの抗原部
    位と結合する抗体を結合させ、生物試料／抗体の混合物
    を抗体結合として測定することを含む生物試料中のＣＯ
    ＵＰ−ＴＦ量を測定する方法。 ２、測定するステップが上記の結合ステップで作られた
    抗体／ＣＯＵＰ−ＴＦ複合体を測定することを含んでい
    る請求項１の方法。 ３、ＣＯＵＰ−ＴＦ疾患を検出するための請求項１の方
    法。 ４、糖尿病を検出するための請求項１の方法。 ５、ＣＯＵＰ−ＴＦを生物試料からの核の抽出物と結合
    させ、ＣＯＵＰ−ＴＦ／プロモータ結合の量を測定する
    ステップを含むＣＯＵＰ−ＴＦ誘導性のプロモータを定
    量する方法。 ６、プロモータがインスリン、ＶＬＤＬ、プロオピオメ
    ラノコルチン、及びオボアルブミンをコードしている遺
    伝子の群から選択される蛋白をコードしている遺伝子に
    関連している請求項５の方法。 ７、糖尿病の検出のための請求項５の方法。 ８、ＣＯＵＰオリゴヌクレオチドを生物試料と結合させ
    、形成されるＣＯＵＰオリゴヌクレオチド／ＣＯＵＰ−
    ＴＦ複合体の量を測定するステップを含む生物試料にお
    ける生来のＣＯＵＰ−ＴＦ結合能を測定する方法。 ９、ＣＯＵＰオリゴヌクレオチドが ５′−ＴＡＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＴ
    −３′５′−ＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
    ＴＧＣＴＴ−３′５′−ＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧ
    ＧＧＧＧＧＴＧＣＴＴ−３′５′−ＧＧＧＧＡＡＡＣＡ
    ＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＣＣＴ−３′及び
    その断片または誘導体に存在する群から選択される請求
    項８の方法。 １０、糖尿病を検出するための請求項８の方法。 １１、次の配列のｃＤＮＡ及びそれらの断片またはその
    誘導体で、その断片や誘導体が機能をもったＣＯＵＰ−
    ＴＦをコードをしているもの。 【遺伝子配列があります】 １２、約１．５ｋｂまでのｃＤＮＡクローンでＣＯＵＰ
    −ＴＦの断片をコードしているクローン。 １３、少くとも１つのＣＯＵＰ−ＴＦ抗原部位に特異的
    に結合するポリクローナル抗体。 １４、ＣＯＵＰ−ＴＦと特異的に免疫反応するモノクロ
    ーナル抗体を生産するネズミのハイブリドーマ。 １５、請求項１４のハイブリドーマによって生産される
    モノクローナル抗体。 １６、リガンドがＣＯＵＰ−ＴＦのＣ−末端結合部位に
    親和力をもつ蛋白であり、内分泌制御機構においてホル
    モンの制御によって活性化する ＣＯＵＰ−ＴＦを標的とする細胞で合成させるようなＣ
    ＯＵＰ−ＴＦの活性化のためのリガンド。 １７、ＣＯＵＰ−ＴＦを生物試料と結合し、ＣＯＵＰ−
    ＴＦ／リガンドの結合を測定することを含む請求項１６
    のリガンドの測定法。
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