CN110870917A

CN110870917A - Ews或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用

Info

Publication number: CN110870917A
Application number: CN201811021254.6A
Authority: CN
Inventors: 韦芳; 许迅; 邓骏杰; 姚谢怡; 顾青
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: CN110870917B

Abstract

本发明涉及EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。本发明发现，EWS显著降低了糖尿病大血管、微血管内皮和视网膜组织中高ROS水平和PARP的过度激活；EWS蛋白通过激活同源重组修复(HR)通路和非同源末端连接修复(NHEJ)通路以修复损伤DNA，不仅缓解了血管内皮的高糖毒性，还表现出视网膜保护作用；EWS能显著增强大血管内皮细胞的分解代谢和AMPK活性，并降低JNK活性。提示EWS或其上调剂能用于制备缓解糖尿病血管内皮的功能障碍，或加强DNA损伤修复，或治疗糖尿病，或防治糖尿病并发症，或防治糖尿病个体肿瘤发生的药物。

Description

EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

背景技术

糖尿病(DM)是一种以慢性高血糖为特征的终身性代谢疾病。糖尿病血管病变是糖尿病的特征性病理改变，是患者致病致残的主要原因。长期血糖增高会使大血管、微血管受损，进而严重危及到心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等[1]。美国糖尿病协会(AmericanDiabetes Association，ADA)统计数据显示，3年以上的糖尿病患者出现并发症的几率在46％以上；5年以上的糖尿病患者出现并发症的几率在61％以上；10年以上的糖尿病患者出现并发症的几率高达98％。其中糖尿病心血管病变(冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管事件)和糖尿病肾病(微血管病变，早期表现为蛋白尿，后期为肾衰竭)是导致75％以上糖尿病患者死亡的主要原因，糖尿病视网膜病变(微血管病变)是造成全球成人不可逆性眼盲的主要原因[2-4]。这三种严重并发症的发生都是高糖导致大血管、微血管内皮损伤和功能紊乱所致的结果。另外，与上述并发症相比，糖尿病并发症还包括糖尿病脑血管病变、神经病变、糖尿病足病等，其致死致残的发生率较低，造成的不良后果较轻。

血管内皮功能损伤是糖尿病血管并发症的始动因素和中心环节。著名的糖尿病并发症“统一机制学说”[5]，已被学界公认，该学说的核心：高糖引起靶组织细胞线粒体中活性氧ROS生成过多。过多的ROS使核DNA发生链断裂，引起核内DNA修复酶——聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-(ADP-ribose)polymerase，PARP)的过度激活，通过裂解底物NAD+生成大量的(ADP-核糖)聚合物(PAR)和尼克酸，大量的PAR积聚在3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及其它核内蛋白周围，使得GAPDH发生ADP-核糖基化，从而导致其活性的抑制[6]。GAPDH酶活性的抑制引起糖酵解途径中的代谢中间产物堆积，即GAPDH上游分子3-磷酸甘油醛、6-磷酸果糖乃至葡萄糖堆积，导致这些代谢物转移到其它糖酵解旁路通路(glycolytic side branches)，包括多元醇通路(polyol pathway)的激活[7]、非酶糖基化终产物(advanced glycation end product)的形成[8]、蛋白激酶C(protein kinase C)活性的增强[9]及氨基己糖(hexosaminebiosynthesis pathway)途径的激活[10]，最终引发了靶组织细胞的糖尿病并发症。简而言之，就是：高血糖→高ROS→PARP过度激活→GAPDH失活→GAPDH上游分子堆积后，转移到糖酵解旁路的激活(多元醇通路激活、非酶性糖基化终末产物形成、蛋白激酶C信号通路的激活、已糖胺通路活性增高)→糖尿病并发症发生。尽管业界共识的“统一机制学说”已清楚揭示了高糖毒性的分子机制，但目前仍缺乏直接有效的干预手段。

糖尿病并发症的防治是糖尿病领域的重点与难点。减轻糖尿病并发症的方法主要分为两大类。第一，降低血糖。强调优先选择有心血管保护作用的降糖药物是修正糖尿病治疗指南的最新趋势。糖尿病是心血管疾病的等危症，糖尿病患者的心血管风险显著增加。T2DM里程碑式的研究结果显示，目前糖尿病降糖指南中的传统治疗药物太过于强调降糖治疗而忽视了严重血管并发症的防治，最后并不能转化为显著的对心血管的保护作用。自2015年EMPA-RAG研究、2016年LEADER研究公布至今，仅仅2-3年时间，获得阳性结果的心血管结局试验(CVOT)就给糖尿病治疗领域带来显而易见的变化，各大指南相继更新，推荐对于合并心血管疾病或具有心血管高危因素的2型糖尿病(T2DM)患者，优先选择具有明确心血管获益的降糖药物(如SGLT2抑制剂恩格列净和GLP-1RA利拉鲁肽)。第二、其他非降糖治疗措施。都主要针对病理生理机制的下游环节进行干预。包括：醛糖还原酶抑制剂；蛋白非酶糖基化阻滞剂；生长因子拮抗剂；血管紧张素转换酶抑制剂；神经营养剂。主要用于治疗糖尿病性肾病、视网膜疾病[4,11-12]。但总的来说，目前对糖尿病并发症的防治尚未取得满意的临床效果。

此外，糖尿病患者更易发肿瘤。因为众所周知，DNA修复能力降低，是导致肿瘤发生的一个非常重要的原因。基于人群大样本的研究给“糖尿病与癌症之间有正相关性”提供了充足的证据[13-15]。2型糖尿病患者肝癌、胰腺癌和子宫内膜肿瘤的发病率为一般人的2倍，结直肠癌、肾脏肿瘤、膀胱癌和乳腺癌的发病风险为一般人的1.2～1.5倍[16]。

尤文肉瘤蛋白(Ewing sarcoma，EWS)是重要的脂肪细胞分化调控蛋白，在脂肪细胞的分化和成熟中发挥重要作用[17-18]。EWS蛋白N-端是转录活化区，C-端是RNA结合域，在RNA转录、编辑与选择性剪接中发挥重要功能，参与了各种细胞过程，如前B淋巴细胞发育，减数分裂，有丝分裂[19]。

2015年有研究发现脂肪分化蛋白EWS有调控骨骼肌与脂肪细胞中PGC-1α的新作用[20]。迄今为止还没有一篇文献报道了EWS在防治糖尿病血管并发症及肿瘤中的作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供EWS或其上调剂在制备防治糖尿病并发症或防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

在一个优选例中，所述的糖尿病并发症为糖尿病血管并发症或糖尿病神经病变。

在另一优选例中，所述的糖尿病血管并发症为糖尿病大血管病变或糖尿病微血管病变。

在另一优选例中，所述的糖尿病大血管病变选自冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死和糖尿病性脑血管病。

在另一优选例中，所述的糖尿病微血管病变选自糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。

在另一优选例中，所述的糖尿病神经病变为糖尿病足。

在另一优选例中，所述的上调剂选自小分子化合物或生物大分子。

在本发明的另一方面，提供一种治疗糖尿病并发症的药物组合物，所述的药物组合物以EWS或其上调剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

在本发明的另一方面，提供EWS作为靶点在筛选防治糖尿病或糖尿病并发症或糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种缓解糖尿病血管内皮的功能障碍，或加强DNA损伤修复，或治疗糖尿病，或防治糖尿病并发症，或防治糖尿病个体肿瘤发生的方法，所述方法包括给予需要的对象EWS或其上调剂。

本发明优点在于：

本发明首次证实脂肪分化蛋白EWS能显著降低糖尿病大血管、微血管内皮和视网膜神经组织中高ROS水平和PARP的过度激活；EWS蛋白通过激活同源重组修复(HR)通路和非同源末端连接修复(NHEJ)通路以修复损伤DNA；EWS能通过提高大血管内皮细胞的AMPK活性，降低JNK活性，有益于降低糖尿病血管内皮的胰岛素抵抗。据此提供了EWS或其上调剂在制备缓解糖尿病血管内皮的功能障碍，或加强DNA损伤修复，或治疗糖尿病，或防治糖尿病并发症，或防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

与传统PARP抑制剂相比，EWS不仅抑制了PARP的过度激活，还解决了PARP抑制剂所遗留的DSB(即DNA双链断裂)威胁，占有明显优势，是目前糖尿病并发症治疗手段中值得尝试的一种新思路。且EWS是在糖尿病受损组织的并发症病理生理机制的上游环节进行有效干预，与现有的糖尿病并发症的治疗措施完全不同。

本发明为糖尿病及其相关并发症以及糖尿病个体肿瘤发生的预防和治疗提供了新的方向。

附图说明

图1.降脂药物Fenofibrate降低DM大鼠视网膜神经组织EWS和Fbxw7蛋白的表达。vs Control组，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；vs DM组，^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001；vs DM+Feno组，^⊿P＜0.05。

图2.人来源的原代大血管中，降脂药物Fenofibrate提高大血管、微血管内皮EWS蛋白、FBXW7蛋白和PGC-1a的表达。

图3.微血管内皮细胞中，降脂药物Fenofibrate提高大血管、微血管内皮EWS蛋白、FBXW7蛋白和PGC-1a的表达。

图4.PFKFB3的特异性抑制剂3PO增加EWS蛋白、FBXW7蛋白和PGC-1α蛋白的表达。

图5.过表达EWS蛋白促进正常糖NG组大血管内皮的增殖与迁移，敲减EWS蛋白能对抗重组蛋白VEGF生长因子的促血管增生效应。

图6.过表达EWS蛋白不能促进HG组、HG+Met组和HG+Feno组等所有高糖组的内皮增生。

图7和图8.过表达FBXW7蛋白抑制NG组、HG组、NG+VEGF组的血管内皮增殖与迁移，敲减FBXW7后，大量血管内皮细胞死亡。

图9.在人的微血管内皮中，过表达EWS蛋白只促进了NG组血管内皮的增殖与迁移，对HG组没有显著影响；敲减EWS蛋白会严重抑制NG组和HG组血管内皮增生。过表达FBXW7蛋白可抑制HG组血管内皮的增殖，敲减FBXW7蛋白抑制了HG组微血管内皮细胞的迁移增殖，镜下可见大量细胞死亡。

图10.30mM高糖有很强的毒性作用，抑制了大血管内皮HUVEC的管腔化生长。高糖下过表达EWS或Fbxw7蛋白后大血管内皮的管腔形成能力虽有加强，但没有统计学差异，敲减EWS蛋白或Fbxw7蛋白后加重了HUVEC的高糖毒性效应，会显著削弱其管腔形成能力。

图11.在微血管内皮细胞中，30mM高糖有较明显的糖毒性，过表达EWS能改善30mM高糖所致的毒性效应，敲减内源性表达的EWS或Fbxw7蛋白，进一步削弱了内皮的管腔形成能力。

图12.EWS和Fbxw7蛋白大幅度降低高糖下HUVEC细胞和微血管HREC内皮中的ROS水平。

图13.高糖促进了PARP过量表达，过表达EWS和Fbxw7大幅度降低了高糖下大血管内皮HUVEC和微血管内皮的PARP表达。

图14.高糖使大血管、微血管内皮细胞的PARP酶活性增高，EWS、Fbxw7均能显著降低该酶的活性。

图15.在大血管HUVEC内皮中，高糖显著增加了PAR产量，而EWS、Fbxw7均大幅度下降了PAR产量。

图16.DSB inducer引发了内皮细胞核内大量绿色荧光沉积，即DNA双链大量断裂。高糖培养后，HUVEC核内DSB绿色点状沉积有增多。

图17.高糖下大血管内皮HUVEC的HR和NHEJ通路p-ATR激酶、CHK2蛋白和p-P53蛋白显著增高。EWS蛋白降低了p-ATM、p-ATR、CHK2蛋白和p-P53蛋白的表达水平，Fbxw7蛋白与EWS蛋白完全相同。

图18.高糖降低了大血管内皮HUVEC的ATM和BRCA1基因的表达。EWS蛋白会大幅度提高ATM、ATR、BRCA1、XRCC4和MSH2基因的表达；Fbxw7蛋白也大幅度提高了ATM、ATR、XRCC4和MSH2基因的表达。

图19.在微血管内皮细胞中，p-P53蛋白下降，其它蛋白没有改变。高糖下，EWS降低了CHK2蛋白的表达，p-P53蛋白较NG组有显著下降；Fbxw7蛋白降低了p-ATR和CHK2的表达，仍然会进一步降低p-P53蛋白的表达。

图20.在转录水平，高糖增加了微血管内皮中BRCA1基因的表达。Fbxw7蛋白会大幅度提高高糖下ATM、ATR、BRCA1以及MSH2基因的表达。

图21.HG促进血管内皮细胞进入S期，加快细胞周期运行；在大血管中，EWS、Fbxw7蛋白都将内皮细胞阻滞在G0/G1期，提供充足的时间以利修复受损DNA。

图22.在大血管内皮中，正常糖或高糖下Fbxw7蛋白显著增强了HIF-1α、PGC-1α、S6K1、ERRα、Cox5b、ATP5O、SCAD和VLCAD的表达量；EWS蛋白在正常糖(NG)浓度下也表现了类似Fbxw7的作用，增加了HIF-1α、PGC-1α、S6K1和ATP5O表达，但高糖下仅HIF-1α基因表达保持增高。

图23.高糖促进了大血管内皮HUVEC的JNK活性和糖酵解关键酶PFKFB3的表达。EWS和Fbxw7蛋白能促进血管内皮的能量代谢，不仅能降低p-JNK的活性和PFKFB3的表达，还都能激活AMPK的活性。

图24.早期敲减DM大鼠视网膜组织内源性EWS和Fbxw7的表达，增加了视网膜组织整体ROS水平，包括RGC、内核层和外核层。DM大鼠的视网膜组织整体ROS水平和PAR产物含量均有显著增加，过表达EWS或Fbxw7蛋白能显著降低其视网膜组织整体ROS水平。

图25.早期敲减DM大鼠视网膜组织内源性EWS和Fbxw7的表达，视网膜血管渗漏加重。

图26.过表达EWS或Fbxw7蛋白显著减少了DM大鼠的视网膜组织中PAR产量。

图27.糖尿病视网膜组织蛋白氧化程度明显增加，过表达Fbxw7蛋白显著降低了蛋白的氧化水平，过表达EWS蛋白有部分降低。

图28.过表达EWS能显著缓解视网膜组织的糖基化。

具体实施方式

本申请发明人经过广泛而深入的研究，发现脂肪分化蛋白EWS：①在大血管、微血管、视网膜组织广泛表达，且参与了糖、脂代谢；②高糖下并不促进血管内皮的增殖，管腔形成实验表明还能缓解血管内皮的高糖毒性；③降低糖尿病高糖状态下大血管、微血管、视网膜组织的高ROS水平；④降低了糖尿病大血管、微血管内皮PARP过度激活，表现为PARP表达量减少、酶活性降低、PAR产物下降；⑤EWS能够激活HR通路或NHEJ通路修复DSB；细胞周期阻滞在G0/G1期以利DNA修复；⑥EWS蛋白促进了大血管内皮AMPK活性，降低JNK活性，减弱其对胰岛素的抵抗；⑦视网膜组织保护作用：EWS减轻了视网膜神经组织的ROS水平和PARP的过度激活，减轻了视网膜组织糖基化水平。故EWS可作为靶标用于缓解糖尿病血管内皮的功能障碍及加强DNA损伤修复，EWS或其上调剂可用于制备①治疗糖尿病；②防治糖尿病并发症；或③防治糖尿病个体肿瘤发生的药物。

EWS

尤文肉瘤蛋白(Ewing sarcoma，EWS)是重要的脂肪细胞分化调控蛋白，在脂肪细胞的分化和成熟中发挥重要作用。

在本发明中，所用的EWS蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的EWS蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组EWS蛋白。优选的，本发明可采用重组的EWS蛋白。

任何适合的EWS蛋白均可用于本发明。所述的EWS蛋白包括全长的EWS蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的EWS蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_005243所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同：NM_013986，NM_001163285，NM_001163286，NM_001163287，X66899，JX977847，CR456490，AB016435，XM_011530002，XM_011530000，XM_011529999，XM_011529998，XM_011529997，XM_011529996，XM_005261389，XM_011529995，XM_005261390，XM_011530001，NG_023240，XM_017028666，XM_017028665，XM_017028664，XM_024452181，XM_024452180，XM_017028662，XM_017028661，XM_017028660，XM_017028657，XM_017028656，XM_017028653，XM_017028652，XM_017028651，XM_017028650，XM_017028649，XM_017028648，XM_017028647，XM_017028646，XM_017028645，XM_017028644，XM_017028663，XM_017028659，XM_017028658，XM_017028655，XM_017028654。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的EWS蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。EWS蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。

任何一种EWS蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，EWS蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的EWS蛋白的全部或部分功能。优选的，所述的生物活性片段至少保持50％的全长EWS蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长EWS蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的EWS蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的EWS蛋白。所述经过修饰或改良的EWS蛋白可以是一种EWS蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的EWS蛋白可以是与天然存在的EWS蛋白具有较小的共同点，但也能缓解糖尿病血管内皮的功能障碍或加强DNA损伤修复，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响EWS蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

根据EWS蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

优选的，所述的EWS蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_005243所示的序列基本上相同，也可以与其它变异体序列号所示的序列基本上相同：NM_013986，NM_001163285，NM_001163286，NM_001163287，X66899，JX977847，CR456490，AB016435，XM_011530002，XM_011530000，XM_011529999，XM_011529998，XM_011529997，XM_011529996，XM_005261389，XM_011529995，XM_005261390，XM_011530001，NG_023240，XM_017028666，XM_017028665，XM_017028664，XM_024452181，XM_024452180，XM_017028662，XM_017028661，XM_017028660，XM_017028657，XM_017028656，XM_017028653，XM_017028652，XM_017028651，XM_017028650，XM_017028649，XM_017028648，XM_017028647，XM_017028646，XM_017028645，XM_017028644，XM_017028663，XM_017028659，XM_017028658，XM_017028655，XM_017028654。

上调剂

如本文所用，所述的EWS的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高EWS蛋白的活性、维持EWS蛋白的稳定性、促进EWS蛋白的表达、促进EWS蛋白的分泌、延长EWS蛋白有效作用时间、或促进EWS的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于缓解糖尿病血管内皮的功能障碍或加强DNA损伤修复的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的EWS蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)EWS的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码EWS的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，EWS多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EWS的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

用途

本发明提供EWS或其上调剂在制备缓解糖尿病血管内皮的功能障碍或加强DNA损伤修复的药物中的用途。

本发明还提供EWS或其上调剂在制备治疗①治疗糖尿病；②防治糖尿病并发症；或③防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的用途。

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的终身性代谢疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、脑、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，引起糖尿病并发症。糖尿病并发症有一个众所周知的“统一机制学说”，为业内广泛认可，该学说核心：高血糖→高ROS→PARP过度激活→GAPDH失活→糖酵解旁路的激活(非酶性糖基化终末产物形成、蛋白激酶C信号通路的激活、多元醇通路激活和已糖胺通路活性增高)→糖尿病并发症发生。糖尿病并发症包括但不仅限于糖尿病血管并发症、糖尿病神经病变等。糖尿病血管并发症涉及糖尿病大血管病变和糖尿病微血管病变。糖尿病大血管病变特别突出的为冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死、糖尿病性脑血管病(例如脑动脉硬化、缺血性脑血管病、脑出血、脑萎缩)等心脑血管事件。糖尿病微血管病变特别突出的为糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。糖尿病神经病变特别突出的为糖尿病足(指糖尿病患者足部由于神经病变使下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而发生溃疡和坏疽的疾病状态)。以上严重并发症的发生都是高糖导致大血管、微血管内皮损伤和功能紊乱所致的结果。大血管、微血管病变的实质就在于长期高血糖致使血管功能内稳态失代偿，炎症、氧化应激带来的血管内皮功能障碍是其中共享的核心环节。血管内皮功能损伤是糖尿病血管并发症的始动因素和中心环节。

本发明发现EWS能够：降低ROS；抑制PARP过度激活。通过提高大血管内皮细胞的AMPK活性，降低JNK活性。这是大家公认的降低糖尿病心血管事件的两条通路。最近的研究报告指出，心血管事件的病理机制仍然是高糖→高ROS→过度激活PARP→抑制GAPDH→激活糖代谢旁路，同时高ROS高PARP→降低sirtuin，PGC1α和AMPK活性→扰乱糖、脂代谢同步节律→引发心血管意外事件。

糖尿病个体更易发肿瘤，而众所周知，DNA修复能力降低，是导致肿瘤发生的一个非常重要的原因。本发明第一次发现，糖尿病人细胞、组织内存在DSB(即DNA双链断裂)和DSB修复机制受损，而EWS具有明显的加强糖尿病细胞DNA修复的证据，故可应用于防治糖尿病个体的肿瘤发生。

本发明还提供EWS作为靶点在筛选防治糖尿病或糖尿病并发症或糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用，即一种筛选缓解糖尿病血管内皮的功能障碍，或加强DNA损伤修复，或治疗糖尿病，或防治糖尿病并发症，或防治糖尿病个体肿瘤发生的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达EWS的体系；和检测所述体系中EWS的表达；若所述候选物质可提高EWS的表达，则表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。所述的表达EWS的体系可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达EWS的细胞；或可以是重组表达EWS的细胞。所述的表达EWS的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到EWS的表达的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达EWS的体系。

药物组合物

本发明的药物组合物可含有本文所述的活性试剂和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用于制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。在选择适用于投递合成肽的赋形剂时，主要需考虑此药物组合物的给药方式，本领域技术人员熟知此项技术。可根据不同的治疗用途确定本发明药物中所述活性试剂的含量。可根据已知的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版公司(MackPublishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚(1985))一书中有详细的记载。本发明的药物可以是各种合适的剂型，包括但不限于胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液等。

治疗方法

本发明提供一种缓解糖尿病血管内皮的功能障碍，或加强DNA损伤修复，或治疗糖尿病，或防治糖尿病并发症，或防治糖尿病个体肿瘤发生的方法，所述方法包括给予需要的对象EWS或其上调剂。给予的量为治疗有效量，可根据个体的年龄、体重、性别、疾病种类和严重程度加以确定。对象可以是哺乳动物，尤其是人、鼠、兔子、猪、羊和狗等。给药方法是本领域常规的方法，例如口服、注射等，并可针对不同的试剂进行调整。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、方法

1.过表达EWS(命名：E-OE)或Fbxw7(命名：F-OE)蛋白的病毒载体构建

(1)通过PCR反应扩增EWS、Fbxw7的核苷酸序列(EWS序列如SEQ ID NO:1所示，Fbxw7序列如SEQ ID NO:2所示)，两端连上EcoRI和BamHI酶切位点；

(2)双酶切PCR产物和纯化；

(3)同样双酶切H201pAdeno-MCMV-EGFP-3FLAG载体质粒(上海和元生物技术有限公司)，回收纯化大片段，将步骤(2)中的EWS或Fbxw7基因片段利用分子克隆技术替代EGFP插入到该穿梭质粒的EcoRI和BamHI酶切位点处；

(4)菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；

(5)测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提；

(6)包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度测定与功能鉴定。

2.干扰EWS(命名：E-sh或E-sh RNA)，Fbxw7蛋白(命名：F-sh或F-sh RNA)的病毒载体构建

(1)根据Human EWSR1基因或Fbxw7基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成；

(2)将单链的引物退火成双链oligo序列(EWS shRNA的编码序列如SEQ ID NO:3-4所示，Fbxw7 shRNA的编码序列如SEQ ID NO:5-6所示)，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体pDKD-CMV-Puro-U6-shRNA(上海和元生物技术有限公司)，替换掉原来的ccdB毒性基因；

EWS敲减序列

Fbxw7敲减序列

(3)菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；

(4)测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提；

(5)利用Lipofectamin2000脂质体转染人HUVEC细胞，根据western blot鉴定出敲减EWS或Fbxw7蛋白效率达70％以上的质粒克隆；

(6)将此质粒与腺病毒框架大质粒共转染包装工具细胞株Ad293；

(7)包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度测定与功能鉴定。

3.糖尿病大鼠模型的制备

雄性SD大鼠，体重200g左右，禁食过夜后，以65mg/kg STZ腹腔注射，48小时后血糖仪检测，血糖>16.7mM即造模成功。

4.Fenofibrate灌胃治疗DM大鼠

造模成功后随机分组：Control组，DM组，DM+Feno组。以35mg/kg Fenofibrate每日连续灌胃8周。分别在病程4、8周处死大鼠，剥离视网膜全层组织，加适量RIPA组织蛋白裂解液，冰上超声波破碎以抽提蛋白。经BCA方法蛋白定量后，在该蛋白提取液中加入westernblot上样缓冲液，99℃煮沸10min，冰浴10min，-30℃保存备用。样品待做Western Blot检测EWS、Fbxw7蛋白的表达量。

5.高糖和糖脂代谢调节药物对人的原代大血管内皮EWS和fbxw7蛋白表达的影响

在ECM+ECGS+5％FBS培养基中培养人的原代大血管内皮HUVEC，将处于对数增长期的HUVEC分为4组：NG(葡萄糖浓度5.5mM)，HG(葡萄糖浓度30mM)，HG+Met(1mM)，HG+Feno(100μM)，以上述4种不同处理条件培养48小时。弃去培养基，PBS洗涤后，加入适量RIPA蛋白裂解液，收集样品冰上超声波破碎以抽提蛋白。样品待做Western Blot检测EWS、Fbxw7、PGC-1a蛋白的表达量。

6.高糖和糖脂代谢调节药物对人原代视网膜微血管内皮细胞EWS和fbxw7蛋白表达的影响

将处于对数增长期的人原代视网膜微血管内皮细胞分为4组：NG，HG，HG+Met，HG+Feno，培养48小时后收集细胞用RIPA裂解液抽提蛋白。样品待做Western Blot检测EWS、Fbxw7蛋白的表达量。

7.高糖和糖酵解调节药物对人的原代大血管内皮EWS和Fbxw7蛋白表达的影响

将处于对数增长期的HUVEC分为4组：NG(葡萄糖浓度5.5mM)，NG+3PO(20μM)，HG(葡萄糖浓度30mM)，HG+3PO(20μM)，培养48小时后收集细胞用RIPA裂解液抽提蛋白。样品待做Western Blot检测EWS、Fbxw7、PGC-1a蛋白的表达量。

8.蛋白Western Blot检测

配置7.5％SDS-PAGE凝胶。将50μg蛋白加入SDS-PAGE凝胶的每个加样梳孔，90V，电泳约1.5小时。取出凝胶，与相同大小的尼龙膜相贴，做成传统的三明治(海绵-纸塔-凝胶-尼龙膜-纸塔-海绵)，放入湿转盒中，90V，电泳2小时，将蛋白从凝胶上转移到尼龙膜上。5％脱脂牛奶封闭孵育后，TBST洗涤，将膜按蛋白分子量大小裁剪，分别与EWS、Fbxw7、PGC-1a、actin等抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤三次后，再分别与抗兔或抗小鼠的加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1小时，TBST洗涤三次，ECL曝光检测。用Image J软件分析，并计算各组灰度与actin灰度的比值，分析蛋白的相对表达水平。

9.EWS或Fbxw7蛋白对大血管内皮HUVEC细胞的划痕愈合影响

将HUVEC细胞接种到12孔板，待密度约70-80％时，将过表达或干扰EWS或Fbxw7或Control的腺病毒以100moi用量感染过夜。用200μl枪头做十字划痕，PBS洗涤后，配置不含胎牛血清的培养基，以NG(5.5mM)，HG(30mM)，NG+VEGF(25ng/ml)，HG+Met(1mM)，HG+Feno(100μM)培养48小时。在十字划痕0h、12h、24h、48h显微镜下拍照(100×)，用NIH Image J软件测量细胞迁移面积，并计算细胞的愈合率，愈合率＝1－(处理后空白面积-0小时空白面积)/0小时面积。

10.EWS或Fbxw7蛋白对微血管内皮HREC细胞的划痕愈合影响

方法同上，HREC先感染过表达或干扰EWS或Fbxw7或Control的腺病毒(100moi用量)，十字划痕后配置不含胎牛血清的培养基，以NG(5.5mM)，HG(30mM)培养48小时。在0h、12h、24h、48h显微镜下拍照(100×)，用NIH Image J软件统计细胞迁移面积，并计算细胞的愈合率，公式同上。

11.大血管HUVEC细胞、微血管HREC细胞的管腔形成实验

将50μl/孔的Matrigel凝胶铺入96孔板中，待凝胶凝固后，在其上分别铺入相同数量的血管内皮细胞，并分为不同组别培养：NG(5.5mM)，HG(30mM)，NG+VEGF(25ng/ml)，HG+Met(1mM)，HG+Feno(100μM)。6小时后显微镜下观察并拍照，用NIH Image J软件计算管腔形成的总长度与节点。以NG组为1，计算各处理组/NG组的比值。

12.EWS或Fbxw7蛋白对人的大血管内皮HUVEC或人的微血管内皮HREC管腔形成能力的影响

方法同上，HUVEC或HREC细胞先感染过表达或干扰EWS或Fbxw7或Control的腺病毒(100moi用量)过夜。胰酶消化各实验组成悬浮单细胞液，接种相同数量的细胞悬液于凝固的Matrigel凝胶上，NG(5.5mM)或HG(30mM)培养6小时，显微镜下观察并拍照，用NIH ImageJ软件计算管腔形成的总长度与节点。以NG组为1，计算不同处理条件下HG组/NG组的比值。

13.EWS或Fbxw7蛋白对人的大血管内皮HUVEC或人的微血管内皮HREC内ROS水平的影响

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。两种血管内皮细胞分别种植在六孔板中，待细胞达70％融合状态后，分6组，分别以100moi剂量感染Ad-Control或Ad E-OE或Ad F-OE过夜，换成新鲜的NG或HG培养基置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48小时。去除培养基，避光条件下用无血清培养基按照1:1000稀释DCFH-DA，每孔不少于1毫升，置于37℃孵育30min。收集细胞，用PBS清洗3次，将细胞重悬于300μl预冷的PBS中，送流式细胞仪检测，使用488nm激发波长，525nm发射波长检测细胞平均荧光强度。

14.EWS或Fbxw7蛋白对HUVEC和HREC血管内皮PARP表达量的影响

将100moi剂量的Ad-Control或Ad E-OE或Ad F-OE分别感染血管内皮细胞过夜，换新鲜的NG或HG培养基继续培养48小时。弃去培养基，PBS洗涤后，加入适量RIPA裂解液，冰浴中超声破碎抽提蛋白裂解液，做Western blot检测PARP蛋白的表达水平。

15.EWS或Fbxw7蛋白对血管内皮PARP活性的影响

血管内皮细胞处理同上，接种10000个细胞到96孔板中，贴壁后分别感染Ad-Control或Ad E-OE或Ad F-OE(100moi)过夜，换新鲜的NG、NG+甘露醇(30mM)、HG、HG+Feno培养基继续培养48小时。弃去培养基，PBS洗涤2次，每孔加100μl细胞抽提液，冰上裂解孵育30min，BCA法测定蛋白浓度后待用。取出ELISA检测板条，准备已知浓度的系列PARP标准品曲线。每孔加入50μl 1×I-PAR Assay Buffer，室温孵育30min；拍干1×I-PAR AssayBuffer，每孔加入25μl不同浓度的PARP标准品或待测样品；再加入25μl PARP SubstrateCocktail，室温孵育30min。PBST洗涤2次，PBS再洗涤2次；拍干后每孔再加入50μl anti-PAR单克隆抗体稀释液，室温孵育30min。PBST洗涤2次，PBS再洗涤2次；拍干后每孔再加入50μl羊抗小鼠的IgG-HRP conjugate抗体稀释液，室温孵育30min。PBST洗涤2次，PBS再洗涤2次；拍干后每孔再加入50μl显色底物，室温避光孵育15min，50μl/孔0.2M HCl中止，以450nm波长酶标仪读板记录OD值。根据绘制的标准曲线公式，计算每个样本的PARP酶活性。

16.EWS或Fbxw7蛋白对血管内皮PAR产量的影响

细胞处理同步骤15。六孔板的细胞数量，PBS洗2次，每孔加300μl细胞裂解液，冰上挂下细胞，冰浴15min。收集样品到1.5ml离心管中，加入SDS至终浓度为1％；100℃煮沸5min；冷却至室温；加入相同量的Magnesium Cation和DNase I，混匀后37℃孵育90min；室温下10000g离心10min，取上清做BCA法测定蛋白浓度备用。将50μl上述样品或已知浓度的PAR系列标准品加入ELISA测试板条孔中，4℃孵育16小时过夜。板条平衡至室温后，PBST洗涤4次；加入50μl/孔PAR抗体稀释液，室温孵育2小时；PBST洗涤4次，加入50μl/孔二抗稀释液，室温孵育1小时；PBST洗涤4次，加入100μl/孔显色液A和B，立即用Biotek Synergy2检测化学发光光子数。根据绘制的标准曲线公式，计算每个样本的PAR含量。

17.DSB检测

96孔板接种HUVEC细胞，NG、NG+甘露醇、HG、HG+Feno培养48小时。取阳性对照孔加入DNA DSB诱导剂作用1小时后，弃去所有培养基。加入100μl多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗涤2次；拍干后加入100μl/孔冰冻90％甲醇，放置4℃10min；PBS洗涤1次，拍干后加入200μl/孔封闭液，室温30min；弃去封闭液，加入100μl/孔抗-磷酸化-Histone抗体稀释液，室温孵育1小时；PBST洗涤5次，拍干后加入二抗稀释液，室温孵育1小时，避光；PBST洗涤5次后加入PBS，显微镜下FITC荧光通道拍照。18.EWS或Fbxw7蛋白对高糖损伤血管内皮的修复1

大血管内皮和微血管内皮细胞处理同前，分为六组：NG，NG+E-OE，NG+F-OE，HG，HG+E-OE，HG+F-OE。收集细胞的RIPA蛋白裂解液，做western blot技术检测p-ATM、p-ATR、CHK2、p-P53蛋白的表达量，具体技术步骤参见步骤8。

19.EWS或Fbxw7蛋白对高糖损伤血管内皮的修复2

大血管内皮和微血管内皮细胞处理同前，分为六组：NG，NG+E-OE，NG+F-OE，HG，HG+E-OE，HG+F-OE。采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计测D260/280的值，估算RNA的纯度，并测RNA浓度，计算RNA含量，用TAKARA试剂盒(RR047A)将其逆转为cDNA，用TAKARA试剂盒(RR420A)在荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测ATM、ATR、BRCA1、XRCC4、MSH2的基因转录水平情况。

20.流式细胞周期检测

大血管内皮和微血管内皮细胞处理同前，分为六组：NG，NG+E-OE，NG+F-OE，HG，HG+E-OE，HG+F-OE。胰酶消化，准备待测样品为单细胞悬液；PBS清洗细胞，1500rpm/min离心沉淀细胞；弃去PBS，加入300μl PBS，轻柔拍打细胞沉淀使其松散并重悬；缓慢滴入预冷的无水乙醇700μl，边滴入边混匀，过夜；离心后弃去固定液，PBS清洗1次，离心沉淀细胞，弃去PBS；每样品加入0.5ml FxCycle^TM PI/RNase Staining solution，充分混匀，室温避光孵育30min；直接上机检测，波长选择488nm和532nm激发光，585/42带通滤波器收集发射光。结果用Endofit软件模拟计算出G0/G1，S，G2/M各期细胞数量分布。

21.EWS或Fbxw7蛋白对血管内皮细胞线粒体能量代谢通路的影响1

血管内皮细胞处理同上，过表达病毒感染细胞后，以不同处理条件培养48小时。采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计测D260/280的值，估算RNA的纯度，并测RNA浓度，计算RNA含量，用TAKARA试剂盒(RR047A)将其逆转为cDNA，用TAKARA试剂盒(RR420A)在荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测Cox5b、ATP50、SCAD、VLCAD、ERRa、S6K1、HIF-1a、PGC-1a等基因的转录水平情况。

22.EWS或Fbxw7蛋白对血管内皮细胞线粒体能量代谢通路的影响2

细胞培养和处理同上。收集蛋白样本后，采用western blot技术检测AMPK、JNK、mTOR三条能量通路的磷酸化水平，并测定PGC-1a和糖酵解关键酶PFKFB3的表达水平，步骤参见8。

23.EWS或Fbxw7眼内注射

(1)干扰EWS或Fbxw7

将DM大鼠分成4组。DM建模成功后第3天、第4周时各注射5×10⁷EWS干扰腺病毒或Fbxw7干扰腺病毒或对照空白干扰腺病毒，于建模8周时处死动物取出全层视网膜组织以准备样品做步骤25血管渗漏实验；或摘除全眼球冰冻切片做ROS染色(步骤24)。以眼内注射NS为对照组。

(2)过表达EWS或Fbxw7

将DM大鼠分成4组。DM建模成功后第4周、第8周时各注射5×10⁷EWS过表达病毒或Fbxw7过表达腺病毒或空白对照腺病毒，于建模12周时处死动物取出全层视网膜组织以准备样品做步骤25、26、27三个实验；或摘除全眼球冰冻切片做ROS染色(步骤24)。以眼内注射NS为对照组。

24.视网膜组织的ROS染色

DHE液配置：5mg DHE干粉加入1.59ml DMSO，配置成10mM DHE母液，-80℃分装保存。实验前用0.1M PBS溶液稀释为2μM DHE新鲜溶液。取眼球立即置于OCT中包埋，恒冷切片，切取视神经附近约10μm眼球组织切片；加入2μM DHE工作液，置于37℃温箱，避光孵育30min后，PBS清洗，荧光显微镜下观察、拍照(最大激发波长300nm，发射波长610nm)，NIHImage J软件分析荧光强度。

25.视网膜血管渗漏实验

麻醉大鼠，尾静脉注射Evans Blue染料(30mg/kg)，置保温毛毯上2小时；打开胸腔穿刺左心室，以120mmHg灌注预热柠檬酸钠缓冲液2min。灌注结束后，取出全层视网膜组织，干燥后称取干重。0.3ml甲酰胺溶解视网膜组织，70℃，18h；70000g高速离心45min，4℃；取60μl上清测定OD值，波长620nm。将Evans Blue溶于甲酰胺配置标准曲线浓度，根据公式测算出待测样品中Evans Blue的浓度。

26.视网膜组织PAR定量

取全层视网膜神经组织，加入0.5ml裂解液，剪碎后冰浴超声破碎；加入SDS至终浓度为1％，100℃煮沸5min，立即冰浴10min；10000g离心2min，4℃；取上清用BCA法测蛋白浓度；待测样品可-80℃保存。后续ELISA检测步骤见16。

27.视网膜组织蛋白氧化水平测定

蛋白裂解液裂解，冰浴超声破碎视网膜组织后，取上清做BCA法测定蛋白浓度。将待测样品稀释成10μg/ml，取100μl/孔加入到OxiSelect^TMProtein Carbonyl ELISA板条，4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，拍干后加入100μl/孔DNPH工作液，避光孵育45min，摇匀；250μl/孔PBS/乙醇(1:1)洗涤5次，每次间隔5min；最后再PBS洗涤2次。加200μl/孔封闭液孵育2小时；wash buffer洗涤3次，拍干后加入100μl/孔anti-DNP antibody稀释液，室温孵育1小时；wash buffer洗涤3次，拍干后加入100μl/孔HRP conjugated secondary antibody稀释液，室温孵育1小时；wash buffer洗涤5次，拍干后加100μL/孔Substrate Solution，适当孵育后100μL Stop Solution终止，OD450检测。根据标准曲线计算出待测样品中氧化蛋白含量。

28.视网膜组织糖基化水平测定

蛋白裂解液裂解，冰浴超声破碎视网膜组织后，取上清做BCA法测定蛋白浓度。选择OxiSelect^TMMethylglyoxal(MG)Competitive ELISA Kit，将50μl/孔待测样品或标准品MG-BSAstandard加入到MG Conjugate包被ELISA板中，室温孵育10min；加入50μL/孔anti-MG抗体稀释液，室温孵育1小时，摇匀；Wash Buffer充分洗涤3次，拍干后每孔加入100μLAnti-HRP Conjugate二抗稀释液，室温孵育1小时；Wash Buffer充分洗涤5次，每孔加入100μL底物溶液，室温孵育2-20minutes，100μL Stop Solution终止，OD450检测。根据标准曲线计算出待测样品中糖基化蛋白含量。

二、结果

1.高糖和糖脂代谢调节药物能显著改变糖尿病视网膜组织和血管内皮EWS和fbxw7蛋白的表达水平。

Western blot结果显示，DM大鼠病程4周的视网膜组织EWS和Fbxw7蛋白表达量均呈现一过性明显升高(vs Control组，P＜0.001or P＜0.05，respectively)，至8周时两者回归正常水平(图1)。口服糖尿病公认的降脂药物Fenofibrate能持续影响糖尿病大鼠视网膜组织EWS和Fbxw7蛋白的表达，使DM大鼠视网膜组织EWS和Fbxw7蛋白的表达量一直持续下降，显著低于正常组和DM组水平(vs DM组，all P＜0.05)。

人来源的原代大血管中，如图2所示，Fenofibrate治疗组显著提高了大血管、微血管内皮EWS蛋白、FBXW7蛋白和PGC-1a的表达水平(vs HG，all P＜0.05)。微血管内皮细胞中，如图3所示，结果相同。

6-磷酸果糖-2-激酶(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase3，PFKFB3)是糖酵解途径的关键酶，在内皮细胞的糖代谢中发挥了重要作用。3PO是PFKFB3的特异性抑制剂，它在高糖状态下显著增加了EWS蛋白、FBXW7蛋白(vs HG，all P＜0.05)和PGC-1α蛋白(vs HG，P＜0.01)的表达水平，提示EWS和FBXW7这两个蛋白还涉及了内皮细胞的糖酵解过程(图4)。

上述证据表明，脂肪分化蛋白EWS/FBXW7不仅存在于大血管、微血管的血管内皮和视网膜组织；而且，它们的表达还明显受到高糖、糖尿病降脂药物Fenofibrate和糖酵解调节药物3PO的影响。

2.EWS和Fbxw7蛋白能影响血管内皮的增殖与迁移，缓解血管内皮的高糖毒性损伤。

我们选择了过表达EWS或FBXW7基因，和携带干扰shRNA序列的敲减(knockdown，KD)质粒，首先观察它们对大小微血管内皮迁移与增殖的影响。

(1)两种蛋白影响血管内皮的增殖与迁移

过表达EWS蛋白，如图5和图6所示，显著促进了正常糖NG组大血管内皮的增殖与迁移(vs NG，P＜0.001)，却并没有促进HG组、HG+Met组和HG+Feno组等所有高糖组的内皮增生，表明EWS促血管迁移和增殖的效应仅表现在正常糖浓度而非高糖状态。敲减EWS蛋白能对抗重组蛋白VEGF生长因子的促血管增生效应(P＜0.001)。

如图7和图8所示，过表达FBXW7蛋白明显抑制了NG组、HG组、NG+VEGF组的血管内皮增殖与迁移(all P＜0.05)，与FBXW7是一种抑癌蛋白[20-21]的功能相符。敲减所有组别的FBXW7后，大量血管内皮细胞死亡(all P＜0.001)，说明FBXW7蛋白的生理功能非常重要。

在人的微血管内皮中，如图9所示，过表达EWS蛋白只促进了NG组血管内皮的增殖与迁移(vs NG，P＜0.001)，对HG组没有显著影响，与大血管内皮HUVEC表现一致；敲减EWS蛋白会严重抑制NG组和HG组血管内皮增生(all P＜0.001)。过表达FBXW7蛋白可抑制HG组血管内皮的增殖(vs HG，P＜0.001)；敲减FBXW7蛋白抑制了HG组微血管内皮细胞的迁移增殖，镜下可见大量细胞死亡(P＜0.001)。

(2)两种蛋白对血管内皮管腔形成的影响

高糖损害了血管内皮细胞的稳态，高糖毒性严重危害血管内皮管腔的形成能力。

如图10所示，30mM高糖有很强的毒性作用，抑制了大血管内皮HUVEC的管腔化生长(vs NG，P＜0.001)。将HG浓度下调至15mM后，高糖下过表达EWS或Fbxw7蛋白后大血管内皮的管腔形成能力虽有加强，但没有统计学差异(vs NG，P>0.05)；而敲减EWS蛋白或Fbxw7蛋白后加重了HUVEC的高糖毒性效应，会显著削弱其管腔形成能力(vs NG，P＜0.01，or P＜0.05respectively)。

在微血管内皮细胞中，如图11所示，30mM高糖有较明显的糖毒性(vs NG，P＜0.01)，过表达EWS能改善30mM高糖所致的毒性效应(vs NG，P＜0.05)；敲减内源性表达的EWS或Fbxw7蛋白，进一步削弱了内皮的管腔形成能力(vs NG，all P＜0.001)，强化了微血管内皮的高糖毒性。

综上所述，EWS和Fbxw7两个蛋白作为一种保护机制，呈现了缓解血管内皮高糖毒性效应，并且都不会促进高糖下血管内皮的增殖与迁移。

3.EWS和FBXW7蛋白大幅度降低了高糖下血管内皮的ROS水平，纠正了高糖PARP的过度激活。

如图12所示，EWS和Fbxw7蛋白大幅度降低高糖下HUVEC细胞的ROS水平，至41.72％(vs HG，P＜0.001)和68.80％(vs HG，P＜0.01)；在微血管HREC内皮中降至55.27％(vs HG，P＜0.05)，65.23％(vs HG，P＜0.05)水平，表现出良好的抗氧化损伤的功能。

PARP的表达量：高糖促进了PARP过量表达，过表达EWS和Fbxw7不仅大幅度降低了高糖下大血管内皮HUVEC的PARP表达(vs HG，P＜0.01；vs HG，P＜0.05，respectively)，也大幅度降低了微血管内皮的PARP表达(vs HG，all P＜0.05)，如图13所示。

PARP蛋白酶的活性：高糖使大血管、微血管内皮细胞的PARP酶活性增高(vs NG，all P＜0.05)；EWS、Fbxw7均能显著降低该酶的活性(vs HG，P＜0.001)，EWS降低PARP酶活性的作用最强大(vs HG+F-OE，P＜0.01)，如图14所示。

polyADP-ribose(PAR)的含量：PARP过度激活导致产生大量PAR产物，抑制下游GAPDH的活性是一系列级联放大效应的源头，因此我们测定了polyADP-ribose(PAR)的含量。如图15所示，在大血管HUVEC内皮中，高糖显著增加了PAR产量(vs NG，P＜0.001)，而EWS、Fbxw7均大幅度下降了PAR产量(vs HG，all P＜0.001)，尤以Fbxw7最明显(vs HG+E-OE，P＜0.05)。在微血管内皮HREC细胞同样高糖培养48h，因30mM高糖组的PAR产量就极低，没有观察到与HUVEC相似的结果。

综上所述，EWS、Fbxw7蛋白以及Fenofibrate能降低高糖下血管内皮PARP的表达量、PARP酶活性以及PAR产量。

4.EWS和Fbxw7蛋白通过激活HR通路或NHEJ通路修复DSB(DNAdouble-strandbreaks，DSBs)。

利用OxiSelect^TMDNA Double Strand Break(DSB)Staining Kit(Cell Biolabs)，如图16所示，DSB inducer引发了内皮细胞核内大量绿色荧光沉积，即DNA双链大量断裂。高糖培养48小时后，HUVEC核内DSB绿色点状沉积有增多。

DSB主要激活细胞的同源重组修复(Homologous recombination repair，HR)和非同源末端链接(Non-homologous end joining，NHEJ)通路，两者协同作用，共同维护基因组的稳定性。

如图17所示，高糖下大血管内皮HUVEC的HR和NHEJ通路发生了显著变化，p-ATR激酶(vs NG，P＜0.01)、CHK2蛋白(vs NG，P＜0.05)和p-P53蛋白(vs NG，P＜0.001)显著增高。相反地，EWS蛋白降低了p-ATM、p-ATR、CHK2蛋白(vs HG，all P＜0.01)和p-P53蛋白(vs HG，P＜0.05)的表达水平；Fbxw7蛋白与EWS蛋白完全相同(vs HG，all P＜0.01)。

在基因转录水平，如图18所示，高糖降低了大血管内皮HUVEC的ATM和BRCA1基因的表达(vs NG，P＜0.05)。EWS蛋白会大幅度提高ATM、ATR、BRCA1、XRCC4和MSH2基因(vs HG，all P＜0.001)的表达；Fbxw7蛋白也大幅度提高了ATM、ATR、XRCC4和MSH2基因(vs HG，allP＜0.001)的表达。

在微血管内皮细胞中，如图19所示，p-P53蛋白下降(vs NG，P＜0.001)，其它蛋白没有改变。高糖下，EWS仅降低了CHK2蛋白的表达(vs HG，P＜0.01)，但p-P53蛋白较NG组仍有显著下降(vs NG+E-OE，P＜0.001)；Fbxw7蛋白降低了p-ATR和CHK2(vs HG，all P＜0.01)的表达，仍然会进一步降低p-P53蛋白的表达。

如图20所示，在转录水平，高糖增加了微血管内皮中BRCA1基因的表达(vs NG，P＜0.001)。Fbxw7蛋白会大幅度提高高糖下ATM、ATR、BRCA1以及MSH2基因(vs HG，all P＜0.001)的表达，与NG+F-OE组相比，五种基因的表达都得到了显著提高(all P＜0.001)。

DNA损伤的检测和修复不仅有赖于DNA修复系统的作用，还依赖于细胞周期检测点信号通路的作用。如图21所示，HG促进血管内皮细胞进入S期，加快细胞周期运行；在大血管中，EWS、Fbxw7蛋白都将内皮细胞阻滞在G0/G1期，提供充足的时间以利修复受损DNA(vsHG，P＜0.05)。

5.EWS和Fbxw7蛋白对血管内皮细胞线粒体的数量、功能以及涉及的信号通路的影响。

EWS和Fbxw7能影响细胞内PGC-1α的表达量，我们进一步研究了它们对糖尿病血管内皮线粒体功能的影响。

HIF-1α、PGC-1α、S6K1、ERRα基因是线粒体能量代谢上游的主要调节基因，其下游靶基因包括糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化、脂质合成等相关基因；Cox5b和ATP5O反映了线粒体呼吸功能；SCAD和VLCAD反映了脂肪酸氧化(FAO)水平。在大血管内皮中，正常糖或高糖下Fbxw7蛋白显著增强了上述所有这些基因的表达量(图22，vs NG，P＜0.01；vs HG，P＜0.01)；EWS蛋白在正常糖(NG)浓度下也表现了类似Fbxw7的作用，增加了HIF-1α、PGC-1α、S6K1和ATP5O表达(vs NG，P＜0.05)，但高糖下仅HIF-1α基因表达保持增高(vs HG，P＜0.01)。

相应地，我们检测了几条与能量代谢有关的信号通路上关键酶的活性。如图23所示，高糖促进了大血管内皮HUVEC的JNK活性和糖酵解关键酶PFKFB3的表达(vs NG，P＜0.001)；而EWS和Fbxw7蛋白能促进血管内皮的能量代谢，不仅能降低p-JNK的活性(vs HG，P＜0.001)和PFKFB3的表达(vs HG，P＜0.05)，还都能激活AMPK的活性(vs HG，P＜0.05，P＜0.01respectively)。

6.EWS和Fbxw7对DM视网膜组织的保护

在糖尿病性视网膜病变中，早期敲减DM大鼠视网膜组织内源性EWS和Fbxw7的表达，增加了视网膜组织整体ROS水平，包括RGC、内核层和外核层，干扰Fbxw7尤为显著(图24，vs DM，P＜0.05)；视网膜血管渗漏也有一定程度加重(图25，vs DM，P>0.05)。

DM大鼠的视网膜组织整体ROS水平和PAR产物含量均有显著增加(图24，vsControl，P＜0.01；图26，vs Control，P＜0.05)，过表达EWS或Fbxw7蛋白不仅能显著降低其视网膜组织整体ROS水平(图24，vs DM，P＜0.05or P＜0.01，respectively)，还显著减少了组织中PAR产量(图26，vs DM，P＜0.05or P＜0.001，respectively)。

随着糖尿病视网膜组织PAR产量的下降，EWS和Fbxw7蛋白也表现出了一定程度的抵抗视网膜氧化应激损伤的作用。高水平的ROS可以直接或间接地氧化修饰蛋白，利用OxiSelect^TMProtein Carbonyl ELISAKit我们检测了蛋白氧化的最常见形式，如图27所示，糖尿病视网膜组织蛋白氧化程度明显增加(vs Control，P＜0.001)，过表达Fbxw7蛋白显著降低了蛋白的氧化水平(vs DM，P＜0.001)，过表达EWS蛋白有部分降低。

高水平ROS激活了PARP活性，导致GAPDH被PAR化，丧失了其正常的酶活性，使上游大量淤积的糖酵解产物转向至旁路，包括蛋白的糖基化，促使DM并发症发生。我们检测了DM视网膜组织的糖基化水平，病程12week时未见显著增加，但是过表达EWS能显著缓解视网膜组织的糖基化(图28，vs DM，P＜0.05)。

三、讨论

本研究首次确认了EWS/FBXW7与糖尿病血管并发症及糖尿病个体肿瘤发生的关系。

本研究发现，脂肪分化蛋白EWS/FBXW7普遍存在于血管内皮和视网膜神经组织，它们广泛参与了血管内皮的多个糖、脂代谢过程。大血管和微血管内皮中过表达的EWS和FBXW7蛋白都能明显降低高糖所致的高ROS水平和PARP的过度激活，缓解了血管内皮的高糖毒性；EWS和FBXW7蛋白影响了同源重组修复(HR)通路或非同源末端连接修复(NHEJ)通路中重要调控分子ATM、ATR、BRCA1、P53、CHK2等，并使损伤的内皮细胞停滞在G0/G1期以利修复损伤DNA。糖尿病大鼠视网膜组织中，过表达EWS和Fbxw7蛋白表现了视网膜保护功能，均能降低高ROS水平和PAR产量，减轻视网膜组织的氧化应激损伤。这些结果表明，将调脂蛋白EWS/FBXW7作为抵抗糖尿病血管并发症的靶标分子有着较好的应用前景，其降低高糖所致的ROS和氧化应激的作用机制与目前学界公认的糖尿病并发症“统一机制学说”[22-23]非常一致。

糖尿病并发症“统一机制学说”(A Unifying Mechanism)由2005年Banting奖得主Brownlee教授提出，他回顾了近40年本研究领域的重要研究成果。该学说的核心是高糖引起靶组织细胞线粒体中活性氧ROS生成过多。过多的ROS使核DNA发生链断裂，引起核内DNA修复酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-(ADP-ribose)polymerase，PARP)的过度激活，通过裂解底物NAD+生成大量的(ADP-核糖)聚合物(PAR)和尼克酸，大量的PAR积聚在3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及其它核内蛋白周围，使得GAPDH发生ADP-核糖基化，从而导致其活性的抑制[6]。GAPDH酶活性的抑制引起糖酵解途径中的代谢中间产物堆积，即GAPDH上游分子3-磷酸甘油醛、6-磷酸果糖乃至葡萄糖堆积，导致这些代谢物转移到其它糖酵解旁路通路(glycolytic side branches)，包括多元醇通路(polyol pathway)的激活[7]、非酶糖基化终产物(advanced glycation end product)的形成[8]、蛋白激酶C(protein kinase C)活性的增强[9]及氨基己糖(hexosaminebiosynthesis pathway)途径的激活[10]，最终引发了靶组织细胞的糖尿病并发症。

高糖引起线粒体中ROS生成过多，无疑，ROS是DR防治的关键靶点；其次，阻滞PARP的过度激活恢复GAPDH活性是防止信号级联放大产生ROS瀑布式损伤的重要环节。有证据表明，使线粒体ROS水平正常化可以补救甘油醛-3-磷酸脱氢酶失活和葡萄糖转移到糖酵解旁路通路[5，21]，抑制PARP可阻断高血糖诱导的多种血管损伤通路的激活[22-23]。本研究首次发现，脂肪分化蛋白EWS和FBXW7既从源头上显著降低高ROS水平，又通过抑制PARP的过度激活掌控住级联效应放大的关键上游，这两重效应的叠加更加保证了它们抵抗血管内皮并发症的效率与力度；这些效应广泛体现在多种细胞或组织，包括大血管、微血管、甚或视网膜神经组织，提示EWS和Fbxw7蛋白的保护作用可能普遍存在于糖尿病患者的多组织多器官中，有较广的组织实用性。

因此，EWS和Fbxw7两个蛋白作为一种保护机制，能缓解血管内皮的高糖毒性；鉴于它们又都不会促进高糖环境中血管内皮的增殖与迁移可以大胆地被应用于糖尿病患者。所以，我们认为两者有望成为缓解糖尿病血管内皮并发症的新型靶标分子。要注意的是，EWS和FBXW7蛋白因能影响正常血管内皮的增殖与迁移不能被应用于正常人群。

EWS和Fbxw7激活同源重组修复(HR)通路或非同源末端连接修复(NHEJ)通路，也给了我们一个新的启示，是目前的糖尿病并发症治疗手段中值得尝试的一种新思路。高糖高ROS导致PARP的过度激活，以修复DNA损伤维护受累细胞基因组的稳定性，是高糖下高等真核细胞为了避免自身死亡而采取的一种自我保护策略。目前，抑制PARP过度激活的治疗手段主要是使用PARP抑制剂，它与PARP1或PARP2催化位点结合，使PARP蛋白无法从DNA损伤位点上脱落而丧失修复DNA损伤的能力，因此主要被当作一种成功利用合成致死(SyntheticLethality)概念的热门抗癌药物在临床使用。基于这样的作用机制，在治疗糖尿病并发症时，PARP抑制剂如烟酰胺、3-氨基苯甲酰胺和竞争性特异性抑制剂PJ34[22]仅简单地保证了GAPDH的正常活性，在一定程度上减缓了体外糖酵解旁路如PKC激活、AGEs形成、多元醇积聚的压力；在体内，PJ34可抑制糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞死亡和周细胞丢失，防止糖尿病性视网膜病变早期的损伤[24]。但是，这种传统PARP抑制剂治疗措施都忽略了一个很严重的问题，即受累细胞的基因组存在的大量DSB损伤并未被修复，高糖高ROS所致的基因组不稳定性等严重问题依然没有得到有效解决，这些受累的细胞仍随时面临死亡的可能。所以临床上治疗并未取得良好效果，效力较低，作用非特异。

与传统PARP抑制剂的作用机制完全不同，调脂蛋白EWS和Fbxw7自身具有DNA损伤修复功能，可通过影响同源重组修复(HR)或非同源末端连接修复(NHEJ)中重要调控分子ATM、ATR、BRCA1、P53、CHK2、XRCC4和MSH2发挥修复作用。DSB作为基因组DNA最严重的损伤形式，严重威胁了细胞的存活，同源重组修复(HR)或非同源末端连接修复(NHEJ)是机体修复DSB损伤的最主要形式。其中，ATM蛋白负责启动细胞对DNA双链断裂损伤的响应，是调控基因组稳定性的最核心激酶，能直接磷酸化细胞内超过1000个重要底物，包括p53蛋白、细胞周期调控蛋白等。NHEJ修复中的Ku蛋白能与PARP竞争结合DSB的末端，Ku蛋白对DNA的高亲和力以及其它类型损伤的竞争作用都限制了PARP在DSB修复通路中的作用；只有当经典DNA-PK通路缺失时，PARP的功能对DSB的修复则有着重要的意义[25]，这就是EWS和Fbxw7蛋白能抑制高糖下PARP过度激活的原因。所以，EWS和Fbxw7蛋白不仅抑制了PARP的过度激活，还解决了传统PARP抑制剂遗留的问题，即它们还能修复高糖高ROS所致的DNA损伤，这种两方面同时兼顾又协调一致的治疗思路，与目前传统常用的PARP抑制剂相比，占有明显的优势。

本研究第一次发现Fbxw7蛋白和EWS蛋白在糖尿病血管内皮糖脂毒性中表现出DNA修复功能。Fbxw7一直被认为是肿瘤抑制基因，它可以泛素化Notch1、C-myc、Cyclin E、c-Jun、mTOR发挥抗癌作用。EWS的生理功能仍不清楚，它因常常与TET family发生染色体易位，生成的嵌合体蛋白具有高转录活性导致多种人类恶性肿瘤而臭名昭著。因此，研究EWS与DNA损伤修复的报道非常少，机制也非常不明了。本研究首次发现EWS蛋白可通过激活ATM、ATR、CHK2和P53而激活HR和NHEJ修复高糖下血管内皮的DNA损伤。

在大血管内皮中，EWS和Fbxw7蛋白不仅促进了线粒体拷贝数量的增加，还激活了线粒体生物合成相关基因的转录，通过刺激PGC-1α、HIF-1α、雌激素相关受体(ERRα)、S6K1等转录调控因子活性，增强线粒体的呼吸链功能如Cox5b和ATP5O，加强了线粒体的能量代谢。在蛋白表达水平，EWS和Fbxw7蛋白提高了高糖下内皮细胞的AMPK活性，降低其JNK活性以及糖酵解关键酶PFKFB3的表达，使内皮细胞处于旺盛的分解代谢状态。据报道，AMPK活性增加，JNK活性降低[26-27]都可增加高糖下血管内皮对胰岛素的敏感性，降低内皮细胞对胰岛素的抵抗有益于胞内伴随脂质沉积的大血管粥样硬化、冠心病等并发症的防治[28]。最近的研究报告指出，伴随糖尿病发生的动脉粥样硬化加剧、冠心病、增加的心血管意外事件的发生，其机制仍然是高糖→高ROS→过度激活PARP→抑制GAPDH→激活糖代谢旁路，同时高ROS高PARP→降低sirtuin，PGC1α和AMPK活性→扰乱糖、脂代谢同步节律→引发心血管意外事件[29]。所以，调脂蛋白EWS和Fbxw7在这方面有益于减少糖尿病心血管意外发生。

PCR引物序列：

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第一人民医院

<120> EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应

用

<130> /

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1971

<212> DNA

<213> human

<400> 1

atggcgtcca cggattacag tacctatagc caagctgcag cgcagcaggg ctacagtgct 60

tacaccgccc agcccactca aggatatgca cagaccaccc aggcatatgg gcaacaaagc 120

tatggaacct atggacagcc cactgatgtc agctataccc aggctcagac cactgcaacc 180

tatgggcaga ccgcctatgc aacttcttat ggacagcctc ccactggtta tactactcca 240

actgcccccc aggcatacag ccagcctgtc caggggtatg gcactggtgc ttatgatacc 300

accactgcta cagtcaccac cacccaggcc tcctatgcag ctcagtctgc atatggcact 360

cagcctgctt atccagccta tgggcagcag ccagcagcca ctgcacctac aagaccgcag 420

gatggaaaca agcccactga gactagtcaa cctcaatcta gcacaggggg ttacaaccag 480

cccagcctag gatatggaca gagtaactac agttatcccc aggtacctgg gagctacccc 540

atgcagccag tcactgcacc tccatcctac cctcctacca gctattcctc tacacagccg 600

actagttatg atcagagcag ttactctcag cagaacacct atgggcaacc gagcagctat 660

ggacagcaga gtagctatgg tcaacaaagc agctatgggc agcagcctcc cactagttac 720

ccaccccaaa ctggatccta cagccaagct ccaagtcaat atagccaaca gagcagcagc 780

tacgggcagc agagttcatt ccgacaggac caccccagta gcatgggtgt ttatgggcag 840

gagtctggag gattttccgg accaggagag aaccggagca tgagtggccc tgataaccgg 900

ggcaggggaa gagggggatt tgatcgtgga ggcatgagca gaggtgggcg gggaggagga 960

cgcggtggaa tgggcagcgc tggagagcga ggtggcttca ataagcctgg tggacccatg 1020

gatgaaggac cagatcttga tctaggccca cctgtagatc cagatgaaga ctctgacaac 1080

agtgcaattt atgtacaagg attaaatgac agtgtgactc tagatgatct ggcagacttc 1140

tttaagcagt gtggggttgt taagatgaac aagagaactg ggcaacccat gatccacatc 1200

tacctggaca aggaaacagg aaagcccaaa ggcgatgcca cagtgtccta tgaagaccca 1260

cccactgcca aggctgccgt ggaatggttt gatgggaaag attttcaagg gagcaaactt 1320

aaagtctccc ttgctcggaa gaagcctcca atgaacagta tgcggggtgg tctgccaccc 1380

cgtgagggca gaggcatgcc accaccactc cgtggaggtc caggaggccc aggaggtcct 1440

gggggaccca tgggtcgcat gggaggccgt ggaggagata gaggaggctt ccctccaaga 1500

ggaccccggg gttcccgagg gaacccctct ggaggaggaa acgtccagca ccgagctgga 1560

gactggcagt gtcccaatcc gggttgtgga aaccagaact tcgcctggag aacagagtgc 1620

aaccagtgta aggccccaaa gcctgaaggc ttcctcccgc caccctttcc gcccccgggt 1680

ggtgatcgtg gcagaggtgg ccctggtggc atgcggggag gaagaggtgg cctcatggat 1740

cgtggtggtc ccggtggaat gttcagaggt ggccgtggtg gagacagagg tggcttccgt 1800

ggtggccggg gcatggaccg aggtggcttt ggtggaggaa gacgaggtgg ccctgggggg 1860

ccccctggac ctttgatgga acagatggga ggaagaagag gaggacgtgg aggacctgga 1920

aaaatggata aaggcgagca ccgtcaggag cgcagagatc ggccctacta g 1971

<210> 2

<211> 1884

<212> DNA

<213> human

<400> 2

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ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120

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cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240

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ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420

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cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560

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gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800

aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860

gactttgatg tggacatgaa gtga 1884

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<400> 8

tgattgactc tgcagccaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtggtcatga gccgattttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctggtagtc ctccaagctg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcatgccagc tcattacagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taagccaggc tgtttgcttt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttggacacca ttgcagaaaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcggtcagc agtcatttca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtgttttgt gccatgtgag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttccaacatt tcagccatga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgggttgga gagggagatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttgttggaga tggaggggac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccaaagtggc tgcttctgtt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

actgtgcaag gtacctctcc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtgatactcc gggccttcat 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tggcttctgg aaccttgaca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aatcagttct tgggacccgt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cagtgccagc caagatgatc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctactaaagg ccttggccct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgagcatctc caagaacagc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggacgctgga gaagttcaag 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cggatttttg gttcaaagga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccagatctcg gcgaagtaaa 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cctcacacgc aaatagctga 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gcccaggtac agtgagtctt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gtgaggactg aggacttgct 20

Claims

1.EWS或其上调剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

2.EWS或其上调剂在制备防治糖尿病并发症或防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病并发症为糖尿病血管并发症或糖尿病神经病变。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病血管并发症为糖尿病大血管病变或糖尿病微血管病变。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病大血管病变选自冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死和糖尿病性脑血管病；所述的糖尿病微血管病变选自糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病神经病变为糖尿病足。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的上调剂选自小分子化合物或生物大分子。

8.一种治疗糖尿病并发症的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以EWS或其上调剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

10.EWS作为靶点在筛选防治糖尿病或糖尿病并发症或糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用。