CN112080566A

CN112080566A - 基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途

Info

Publication number: CN112080566A
Application number: CN202010864045.9A
Authority: CN
Inventors: 董磊; 刘蕊; 谢嘉玲; 李扬
Original assignee: Singlera Genomics Inc; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Fuyuan Biotechnology Co ltd; Jiangsu Huayuan Biotechnology Co ltd; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN112080566B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲状腺癌检测用引物组合，包括DNA PCR引物和RNA PCR引物，所述DNA PCR引物包括ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TG基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、TTN基因突变检测引物对；所述RNA PCR引物包括RET基因融合检测引物对、NTRK3基因融合检测引物对、BRAF基因融合检测引物对。本发明能够同时检测DNA突变和RNA融合。单个样本检测测序数据量降低至0.2M reads以下，大幅降低测序成本。由于DNA突变和RNA融合在在同一体系完成试验，减少操作工作量。

Description

基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途。

背景技术

甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤，目前甲状腺癌已是发病率上升最快的恶性肿瘤。根据肿瘤起源及分化差异，甲状腺癌又分为：甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、甲状腺滤泡癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)和甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)。其中PTC和FTC合称分化型甲状腺癌(Differentiated thyroid cancer， DTC)。不同病理类型在其发病机制、生物学行为、组织形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面明显不同。

在甲状腺病人就诊过程中通常经过触诊以及B超检查进行初筛，最终经病理来确定来判断良恶性，在FNA(fine-needle aspirate)取材样本中，70％为良性结节，5％可确认为恶性结节，但剩余的20-25％仍为不确定或可疑恶性。

基因检测是一种新的基于分子生物学的诊断方法，将FNA或手术组织固定得到的FFPE样本进行切片，切片确定肿瘤细胞比例后进行核酸纯化、扩增法目标序列富集，然后加入特定DNA序列的接头进行连接，PCR扩增富集引入测序标签，纯化后得到测序库；对测序文库测序，得到DNA序列；经过过滤、比对等生物信息学分析，采用ClinVar 数据库进行变异注释。根据基因检测所检测到的变异，可以为甲状腺癌症的早期诊断、术前诊疗、预后判断、用药指导提供重要帮助。

现行甲状腺癌基因突变检测方法有：

(1)ARMS-PCR方法

概念：突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。

ARMS-PCR原理：

TaqDNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。

ARMS-PCR优缺点

优点：灵敏度高，数据分析要求低。

缺点：单点检测，覆盖甲状腺基因检测位点不全，组合检测工作量增加，试剂成本高。

(2)杂交捕获法测序

概念：杂交捕获法测序：探针设计，探针与目的基因杂交，纯化得到富集的目标DNA片段；构建相应文库，进行高通量测序

杂交捕获法测序原理：

是利用DNA碱基互补配对的原理，进行目标区域的探针设计，探针与目的DNA序列杂交，纯化得到富集的目标DNA片段；构建相应测序文库，进行高通量测序，通常高通量测序使用Illumina测序仪，文库随机连接到固相基质上，经过Bst聚合酶延伸和甲酸胺变性的桥PCR循环，生成大量的DNA簇(DNA cluster)，每个DNA簇中约有 1000个相同序列的DNA片段，DNA簇与单链扩增产物的通用序列杂交，由于终止剂的作用，DNA聚合酶每次循环只延伸一个dNTP。每次延伸所产生的光信号被标准的微阵列光学检测系统分析测序，下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉，然后继续延伸dNTP，进行边合成边测序。

杂交捕获法测序优缺点

优点：大规模测序，相对全基因测序成本低。

缺点：产生数据量大，虽然相对全基因测序成本低，但整体试验成本依然较高，操作复杂，实验周期较长通常需要4-5天得到结果。

关于甲状腺癌的遗传机制很复杂，随着技术的发展，研究发现其中既有DNA突变，也有RNA融合(基因融合)。ARMS-PCR技术仅能单点检测DNA突变，且检测种类不全，存在局限性，另外，甲状腺细针穿刺活检取材较少，所纯化得到核酸总量有限，通常只能单独进行DNA检测中有限位点检测，无法同时满足更多的DNA突变点检测，以及RNA融合检测，不能满足临床检测需求。杂交捕获法测序技术，使高通量测序技术虽然能够满足DNA突变和基因融合，但由于测序数据量需要比较多，依然成本较高，且操作复杂，实验周期较长。

发明内容

目前尚未有基于多重PCR技术的引物针对甲状腺癌相关基因同时进行的DNA突变和RNA融合的检测产品，主要难点在于绝大多数多重PCR技术单独以DNA为模板进行多重PCR，而检测基因融合需要在以RNA起始进行，这样就需要额外的检测流程，再以RNA逆转录的到的cDNA作为模板进行额外的多重PCR，这样增加了工作量的同时也增加了成本；而甲状腺相关基因位点较多，部分位点高GC，高重复序列，也使引物设计变得困难；多重PCR引物对在同一反应体系内工作，引物互相干扰，使得包含部分引物对不能够正常工作也是多重PCR技术对检测甲状腺相关基因的难点之一。

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供基于高通量测序法的人类甲状腺多基因突变检测产品及用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种甲状腺癌检测用引物组合，所述引物组合包括DNAPCR 引物和用于检测基因融合的RNA PCR引物，所述DNA PCR引物包括ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、 TG基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、TTN基因突变检测引物对；所述RNA PCR引物包括基因融合检测引物，所述基因融合检测引物包括RET基因融合检测引物对、NTRK3基因融合检测引物对和BRAF基因融合检测引物对。

本发明的第二方面，提供前述甲状腺癌检测用引物组合用于制备人类甲状腺癌检测产品中的用途。

本发明第三方面，提供一种基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品，包括前述的甲状腺癌检测用引物组合。

本发明第四方面，提供一种人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)获取样本的DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA；

(2)多重PCR：将步骤(1)获得的DNA和cDNA同时进行多重PCR扩增，扩增引物包括DNA PCR引物和RNA PCR引物，获得多重PCR扩增产物；

(3)对所述目标产物进行测序文库构建；

(4)对所述测序文库进行基因测序；

(5)对测序结果进行分析：将测序结果与对照序列进行比对，判断样本基因的受检位点的DNA基因突变和RNA基因融合情况，所述对照序列的相关位点未发生基因突变和基因融合。

本发明第五方面，提供一种人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测装置，包括：

诊断模块，用于将样本的基因的检测位点的DNA和RNA测序数据与对照序列进行比对，判断样本基因的检测位点的DNA基因突变和RNA基因融合情况，所述对照序列的相关位点未发生基因突变和基因融合。

本发明第六方面，提供一种设备，所述设备选自计算机可读存储介质或计算机处理设备或电子终端；所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，所述方法包括以下步骤：

将样本的基因的检测位点的DNA和RNA测序数据与对照序列进行比对，判断样本基因的检测位点的DNA基因突变和RNA基因融合情况，所述对照序列的相关位点未发生基因突变和基因融合；

所述计算机处理设备，包括处理器及前述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序，实现所述人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法；

所述电子终端，包括：处理器、存储器、及通信器；所述存储器用于存储计算机程序，所述通信器用于与外部设备进行通信连接，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行所述人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的基于高通量测序法的人类甲状腺多基因突变检测产品覆盖了中国人群的甲状腺癌基因热点突变位点，以及基因融合区域，能够在一管内同一体系完成DNA突变和RNA 融合的检测。单个样本检测测序数据量降低至0.2M reads以下，相对于杂交捕获法测序(数据量通常需要2M Reads以上)大幅降低测序成本。由于DNA突变和RNA融合在在一管内同一体系完成试验，减少了操作的工作量，同时基于ION TORRENT平台进行测序，试验周期短，约为24小时，相对于杂交捕获法测序降低了试验周期。

具体实施方式

高通量测序方法

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术 ("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定和一般读长较短等特征标志。

基因突变Gene Mutation

即基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。

基因融合RNA Fusion

是指两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一实施例的甲状腺癌检测用引物组合，所述引物组合包括DNA PCR引物和RNA PCR引物，所述DNA PCR引物包括ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、 RET基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TG基因突变检测引物对、TP53 基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、TTN基因突变检测引物对；所述RNA PCR引物包括基因融合检测引物，所述基因融合检测引物包括RET基因融合检测引物对、 NTRK3基因融合检测引物对和BRAF基因融合检测引物对。

所述DNA PCR引物可以分别对相应基因进行扩增。例如，ATM基因突变检测引物对可以对ATM基因的进行扩增。然后将发生突变的位点与未发生突变的位点进行对比，获知该位点的突变情况。

进一步的，所述RNA PCR引物中，还包括用于判断RNA PCR引物是否工作的基因融合质控参照引物。

具体的，无论基因融合检测引物的目的基因是否发生基因融合，所述基因融合质控参照引物的目的基因均能表达，且序列能够被基因融合质控参照引物扩增。

若未发生基因融合，所述基因融合检测引物则无法扩增出基因融合检测引物相关基因的序列；此时，无法判断是基因没有发生融合还是基因融合检测引物没有工作。当基因融合质控参照引物能够扩增出基因融合质控参照引物对应的基因，而基因融合检测引物没有扩增出基因融合检测引物相关基因时，说明RNA PCR引物整体是工作的，即基因融合检测引物是工作的，则可以判断是由于未发生基因融合而导致基因融合检测引物则无法扩增出相应目的基因。

可选的，所述基因融合质控参照引物选自管家基因引物。管家基因是指活细胞中均稳定表达的一类基因。

优选的，所述管家基因引物包括MYC基因扩增引物对和基因融合质控参照LMNA基因扩增引物对。

进一步的，所述ATM基因突变检测引物对检测位点包括：c.5065C>Tp.Gln1689Ter， c.5069A>G p.His1690Arg，c.8977C>T p.Arg2993Ter。

所述BRAF基因突变检测引物对检测位点包括：c.1799T>A p.Val600Glu；

所述HRAS基因突变检测引物对检测位点包括：c.182A>G p.Gln61Arg；

所述NRAS基因突变检测引物对检测位点包括：c.182A>G p.Gln61Arg，c.35G>Ap.Gly12Asp；

所述PTEN基因突变检测引物对检测位点包括：c.404T>A p.Ile135Lys，c.900delp.Ile300MetfsTer7；

所述RET基因突变检测引物对检测位点包括：c.1831T>A p.Cys611Ser，c.2410G>Tp.Val804Leu；

所述TERT基因突变检测引物对检测位点包括：c.1-124C>T，c.1-146C>T；

所述TG基因突变检测引物对检测位点包括：c.3529del p.Ser1177ProfsTer27；

所述TP53基因突变检测引物对检测位点包括：c.721T>G p.Ser241Ala，c.466C>Tp.Arg156Cys；

所述TSHR基因突变检测引物对检测位点包括：c.1349G>A p.Arg450His，c.1915C>T p.Pro639Ser；

所述TTN基因突变检测引物对检测位点包括：c.160G>A p.Val54Met；

所述RET基因融合检测引物对检测位点包括：RET(12)-CCDC6(1)，RET(12)-CCDC6(2)， RET(12)-NCOA4(7)；

所述NTRK3基因融合检测引物对检测位点包括：NTRK3(14)-EML4(2)；

所述BRAF基因融合检测引物对检测位点包括：BRAF(10)-MKRN1(3)。

本发明的产品可同时检测DNA突变和RNA融合，检测引物对的设计是本发明产品的关键。

在一种实施方式中，所述ATM基因突变检测引物对包括ATM基因突变第一检测引物对和ATM基因突变第二检测引物对，所述ATM基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述ATM 基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如 SEQID NO.4所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述BRAF基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.5 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述HRAS基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.7 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述NRAS基因突变检测引物对包括NRAS基因突变第一检测引物对和NRAS基因突变第二检测引物对，所述NRAS基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述NRAS基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述PTEN基因突变检测引物对包括PTEN基因突变第一检测引物对和PTEN基因突变第二检测引物对，所述PTEN基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物；所述PTEN基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述RET基因突变检测引物对包括RET基因突变第一检测引物对和RET基因突变第二检测引物对，所述RET基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物；所述RET 基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述TERT基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.21 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述TG基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述TP53基因突变检测引物对包括TP53基因突变第一检测引物对和TP53基因突变第二检测引物对，所述TP53基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的反向引物；所述TP53基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述TSHR基因突变检测引物对包括TSHR基因突变第一检测引物对和TSHR基因突变第二检测引物对，所述TSHR基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的反向引物；所述TSHR基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述TTN基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.33 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述RET基因融合检测引物对包括RET基因融合第一检测引物对、 RET基因融合第二检测引物对和RET基因融合第三检测引物对，所述RET基因融合第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.36所示的反向引物；所述RET基因融合第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；所述RET基因融合第三检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述NTRK3基因融合检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.39 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的反向引物；

在一种实施方式中，所述BRAF基因融合检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.41 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的反向引物。

在一种实施方式中，所述MYC基因扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的反向引物。

在一种实施方式中，所述LMNA基因扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的反向引物。

具体的，引物序列如表1-1所示。

表1-1

前述的甲状腺癌检测用引物组合可用于制备人类甲状腺癌检测产品中的用途。

本发明一实施例的一种基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品，包括前述的甲状腺癌检测用引物组合。

所述的基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品，可以用于甲状腺癌的诊断、判断、术前诊疗、预后判断、用药指导相关指导等。具体的，可以通过甲状腺细针穿刺样本及石蜡包埋组织经纯化得到的核酸进行相关的基因检测，根据基因检测结果可以进行甲状腺癌诊断、术前诊疗、预后判断、用药指导。

预后判断是指用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。例如如果样本中检出 BRAF基因c.1799T>A p.Val600Glu，表明甲状腺结节约有99％的癌症风险；单独鉴定BRAF 基因c.1799T>A p.Val600Glu可能仅能反应甲状腺乳头状癌的常规形态；该突变联合TERT， TP53等突变可预测肿瘤更具侵袭性。(参考资料College of AmericanPathologists，Thyroid ·Biomarkers，ThyroidBiomarkers 1.0.0.1,2016)

进一步的，所述产品包括独立包装的各组引物对，或包括配置好的含有各组引物对的 DNA PCR引物混合液和RNA PCR引物混合液。

可选的，所述产品中还包括一些基于ION TORRENT平台的高通量测序所需要的常规试剂，如：文库引物混合液、HIFI PCR混合液、FuPa试剂、连接缓冲液、DNA连接酶、HIFI酶混合液、洗脱缓冲液、接头、标签N(N＝1，2…96)等等。使得本发明的产品可基于IONTORRENT平台的高通量测序技术来进行检测。

可选的，所述产品还包括逆转录酶、逆转录酶缓冲液。

本发明的一种具体实施方式中，列举了试剂盒中的主要组成成分及其规格如表1-2所示：

表1-2

主要组成成分	规格
		文库引物混合液	192μL/管，1管
HIFI PCR混合液	384μL/管，1管
		FuPa试剂	192μL/管，1管
连接缓冲液	384μL/管，1管
		DNA连接酶	192μL/管，1管
HIFI酶混合液	1600μL/管，3管
		DNA PCR引物混合液	192μL/管，1管
RNA PCR引物混合液	192μL/管，1管
		洗脱缓冲液	12mL/管，1管
逆转录酶	48μL/管，1管
		逆转录酶缓冲液	96μL/管，1管
接头	192μL/管，1管
		标签N(N＝1，2…96)	2μL/管，96管
文库纯化磁珠	960μL/管，16管

其中，表1-2中的DNA PCR引物混合液为将DNA PCR引物溶于LOW TE中获得，RNAPCR引物混合液为将RNA PCR引物溶于LOW TE中获得。所述DNA PCR引物混合液和所述RNAPCR引物混合液用于目的片段扩增。

表1-2中，所述文库引物混合液用于对连接了接头和标签的DNA进行文库扩增。所述文库引物混合液可以是本领域的常规试剂，功能同Ion Library AmplificationPrimer Mix。

表1-2中的逆转录酶及逆转录酶缓冲液，为本领域常规使用的反转录试剂，只要能够满足对RNA进行反转录的要求即可。以total RNA作为模板，进行反转录。

表1-2中，HIFI PCR混合液和HIFI酶混合液用于对常规模板和高难度模板进行超高保真扩增，HIFI PCR混合液，功能同Ion AmpliSeq^TMHiFi Master Mix，通过多重PCR获得目标产物；HIFI酶混合液，功能同KAPA HiFi高保真DNA聚合酶。

表1-2中，FuPa试剂用于对DNA片段进行消化，功能同FuPa Reagent。

所述产品可以为试剂盒。

本发明中，试剂的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

本发明一实施例的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)获取样本的DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA；

(2)多重PCR：将步骤(1)获得的DNA和cDNA同时进行多重PCR扩增，扩增引物包括用于检测基因突变的DNA PCR引物和用于检测基因融合的RNA PCR引物，获得多重PCR扩增产物；

(3)对所述目标产物进行测序文库构建；

(4)对所述测序文库进行基因测序；

本发明所述的人类甲状腺多基因突变和多基因融合的检测方法用于非诊断和治疗目的。例如可以用于基础研究等。

可选的，步骤(2)中，可以将步骤(1)获得的DNA和cDNA合并在1管内进行多重 PCR扩增。

可选的，步骤(2)中，所述扩增引物选自前述的甲状腺癌检测用引物组合。

优选的，引物组合各引物的终浓度为如表1-1所示。

可选的，在进行步骤(3)之前，还包括以下步骤：

(21)消化引物序列：将步骤(2)获得的多重PCR扩增产物进行消化，获得消化后的多重PCR扩增产物。

可选的，步骤(21)中，可以利用FuPa试剂进行消化。以对多重PCR引物序列进行剪切。

在一种实施方式中，步骤(3)中，测序文库构建包括以下步骤：

将目标产物连接接头和标签，进行片段筛选，获得片段筛选产物；对片段筛选产物进行PCR扩增，获得测序文库。

可选的，片段筛选时，可采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选得到片段集中的DNA后进行洗脱。

可选的，所述人类甲状腺多基因突变和多基因融合的检测方法的步骤(1)-步骤(3)，可以利用前述的基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品实现。

在一种实施方式中，步骤(4)中，基因测序的平台为ION TORRENT平台。该平台更简单：无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对H+的检测，可以改善碱基判读准确性。更快速：标准测序时间仅为2～3 小时。

所述未发生突变的对照序列可以为参考基因组hg19的相应位点的序列。

可选的，步骤(5)中，若样本的检测位点的突变频率≥2％，则认为该检测位点发生基因突变；突变频率＝该检测位点的突变型测序数据序列数目/该检测位点的总的序列数目；

具体的，所述突变型测序数据是指，若与未发生突变的对照序列相比，该位点的序列发生表1-1中所述的检测位点的突变，则该序列为突变型测序数据。

若样本的检测位点中Count≥10，CP100K≥25，则认为该检测位点发生基因融合；其中Count是指融合测序序列的丰度。即所覆盖区域的测序序列总数(和突变区别在于突变的深度是1个点，但融合是1个区域)；CP100K是指每100000个比对上的测序序列中比对上的融合基因的序列数。

在一种优选的方式中，在进行比对时，还需进行位点测序数据的质控，若位点测序数据满足预设值，则认为该位点的测序数据质控合格；可以用于比对分析。

具体的，DNA测序结果中，若受检位点的覆盖度≥100×，视为该位点基因突变质测序数据控合格；RNA(cDNA)测序结果中，若MYC和LMNA位点Count≥10，CP100K ≥25，视为RNA基因融合测序数据质控合格。

其中，所述覆盖度是指该检测位点被测序的次数，也可称为测序深度，即该检测位点的总的序列数目。

在一种具体的实施方式中，所述步骤(5)包括如下步骤：

测序结果经生物信息分析，测序数据序列与参考基因组hg19进行比对。具体的：

DNA突变分析中，受检位点的覆盖度不应低于100×。当突变频率＜2时，低于检测下限，报告为阴性，即受检位点未发生基因突变。当突变频率≥2％时，则判断为阳性，即受检位点发生基因突变。

RNA融合检测中，因为MYC和LMNA引物是设计在RNA转录得到的cDNA上的，受检的样本中MYC和LMNA质控位点Count≥10，CP100K≥25，视为RNA基因融合质控合格，MYC和LMNA检出即表明试验体系工作；此时，若受检位点未发生基因融合，无融合RNA，即无扩增模板，测序数据无数据比对到hg19上，此时Count＜10，CP100K ＜25，报告为阴性，即受检位点未发生基因融合；若发生所覆盖融合基因，DNA翻译为融合RNA，经PCR扩增建库，融合序列得到测序，此时若Count≥10，CP100K≥25，报告为阳性，即受检位点发生基因融合；若满足Count＜10或CP100k＜25中任一条件，报告为阴性，即受检位点未发生基因融合。

本发明一实施例的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测装置，包括：

检测模块，用于将样本的基因的检测位点的DNA和RNA测序数据与对照序列进行比对，判断样本基因的检测位点的DNA基因突变和RNA基因融合情况，所述对照序列的相关位点未发生基因突变和基因融合。

所述样本的基因的受检位点的DNA和RNA测序数据采用采用前述的甲状腺癌检测用引物组合或前述的基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品并利用二代测序检测分析获得。

检测模块中，若样本的检测位点的突变频率≥2％，则认为该检测位点发生基因突变；突变频率＝该检测位点的突变型测序数据序列数目/该检测位点的总的序列数目；

若样本的检测位点中Count≥10，CP100K≥25，则认为该检测位点发生基因融合；其中，Count是指融合测序序列所覆盖区域的测序序列总数；CP100K是指每100000个比对上的测序序列中比对上的融合基因的序列数。

可选的，在进行比对时，还需进行位点测序数据的质控，若位点测序数据满足预设值，则认为该位点的测序数据质控合格；其中，DNA测序结果中，若受检位点的覆盖度≥100×，视为该位点基因突变质测序数据控合格；RNA测序结果中，若MYC和LMNA位点Count≥10，CP100K≥25，视为RNA基因融合测序数据质控合格。

本发明提供的设备一种设备，所述设备选自计算机可读存储介质或计算机处理设备或电子终端；所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，所述方法包括以下步骤：

进一步的，所述电子终端包括处理器、存储器、通信器、通信接口和系统总线；存储器和通信接口通过系统总线与处理器和通信器连接并完成相互间的通信，存储器用于存储计算机程序，通信器、通信接口用于和其他设备进行通信，处理器和通信器用于运行计算机程序，使电子终端执行如上方法的各个步骤。

上述提到的系统总线可以是外设部件互连标准(PeripheralPomponentInterconnect，简称 PCI)总线或扩展工业标准结构(ExtendedIndustryStandardArchitecture，简称EISA)总线等。该系统总线可以分为地址总线、数据总线、控制总线等。但并不表示仅有一根总线或一种类型的总线。通信接口用于实现数据库访问装置与其他设备(例如客户端、读写库和只读库) 之间的通信。存储器可能包含随机存取存储器(RandomAccessMemory，简称RAM)，也可能还包括非易失性存储器(non-volatilememory)，例如至少一个磁盘存储器。

上述的处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(CentralProcessingUnit，简称CPU)、网络处理器(NetworkProcessor，简称NP)等；还可以是数字信号处理器(DigitalSignalProcessing，简称DSP)、专用集成电路(ApplicationSpecificIntegratedCircuit，简称ASIC)、现场可编程门阵列(Field－ProgrammableGateArray，简称FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。

本领域普通技术人员可以理解：实现上述各方法实施例的全部或部分步骤可以通过计算机程序相关的硬件来完成。前述的计算机程序可以存储于一计算机可读存储介质中。该程序在执行时，执行包括上述各方法实施例的步骤；所述计算机可读存储介质可包括，但不限于，软盘、光盘、CD-ROM(只读光盘存储器)、磁光盘、ROM(只读存储器)、RAM(随机存取存储器)、EPROM(可擦除可编程只读存储器)、EEPROM(电可擦除可编程只读存储器)、磁卡或光卡、闪存、或适于存储机器可执行指令的其他类型的介质/机器可读介质。所述计算机可读存储介质可以是未接入计算机设备的产品，也可以是已接入计算机设备使用的部件。

在具体实现上，所述计算机程序为执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等等。

实施例1引物组合的性能分析

根据表1-1中的检测位点，设计检测引物，配置不同的引物浓度，具体为：

实验组：实验组的引物组合序列和引物浓度如表1-3中的序列所示。

对照1组：所述引物与表1-1中列出的序列基本相同，区别仅在于，将表1中的SEQID NO.22 引物替换为下述引物：GGATTCGCGGGCACAGAC(SEQ ID NO.47)；对照1组中，各引物的终浓度均为1uM。

对照2组：所述引物与对照1中的引物相同，区别仅在于，各组引物浓度与表1-1中列出的引物浓度相同。

采用以下方法，进行样本扩增，其中，样本为甲状腺手术获得的石蜡包埋组织切片经核酸纯化得到的DNA和RNA，样本数量为9个，将样本分为3组，每组3个样本；其中，实验组样本编号为：4124-49、4136-50、4181-51；对照1组样本编号为：8526-17、11498-18、

8526-19；对照2组样本编号为30173-12、0094-7、115-8。

(1)获取样本的DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA；

(2)多重PCR：将步骤(1)获得的DNA和cDNA同时进行多重PCR扩增，获得多重 PCR扩增产物；扩增引物分别为实验组、对照1组和对照2组。

(3)消化部分引物序列：将步骤(1)所获得的多重PCR扩增产物，采用FuPa试剂消化，获得消化后的目标产物；

(4)连接接头和标签：将经过FuPa试剂消化的目标产物进行连接接头和标签；

(5)片段筛选：采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选得到片段集中的DNA后进行洗脱；

(6)获得测序文库：将与HiFi酶混合液和文库引物混合液混合均匀，获得混合液，利用混合液将筛选后的连接了接头和标签的DNA进行PCR扩增；获得测序文库；

(7)将PCR扩增后的产物采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选，获得纯化后的测序文库；

(8)用Q-PCR检测扩增产物的浓度，当文库浓度高于Ion S5^TM上机浓度(40pM)时，即可用于Ion S5^TM测序平台。

将测序结果进行数据分析，测序数据与参考基因组Hg19进行比对，统计目标片段覆盖度、Count和CP100K统计结果见下表1-3-1和表1-3-2。

表1-3-1

表1-3-2

由表1-3-1和表1-3-2中可以看出，利用对照1组和对照2组的引物组合扩增样本后进行高通量分析可知，这两组DNA PCR引物获得的目标片段覆盖度均有部分小于100，RNA基因融合质控引物有部分Count＜10，表明以上两组DNA引物序列无法完全扩增出目标片段满足样本目标位点检出。而实验组DNA引物获得的目标片段覆盖度均不小于100，且RNA基因融合质控引物Count≥10，CP100K≥25，表明实验组的引物序列完全可以扩增出目标片段满足样本目标位点检出，适于进行检测。

实施例2人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测

利用实施例1中的实验组引物组合，以及实施例1中的步骤(1)-步骤(8)所述的方法，进行人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测。

受检样本为甲状腺手术获得的石蜡包埋组织切片经核酸纯化得到的DNA和RNA，且已知所述样本包含本发明所述的检测位点基因突变和基因融合，所述受检样本的数量为22例。1例相关位点未发生突变的野生型样本(样本编号为4958-049)。

将测序结果进行数据分析，测序数据与参考基因组Hg19进行比对，判断样本是否发生基因突变和基因融合：

结果判断标准：

样本的检测位点覆盖度≥100，DNA突变频率≥2％，则认为该检测位点发生基因突变；若样本的检测位点的RNA融合Count≥10，CP100K≥25，则认为该检测位点发生基因融合。

目标片段覆盖度、Count和CP100K如表1-4-1、表1-4-2和表1-4-3所示：

表1-4-1

由表1-4-1可知，采用本发明所述的引物组合测序结果中，MYC、LMNA质控Count ≥10，CP100K≥25，表明数据质控合格，可以用于基因融合的判断。

表1-4-2

表1-4-3

由表1-4-2和表1-4-3可知，DNA引物获得的目标片段覆盖度均不小于100，可以用于基因突变的判断。

DNA突变频率如表1-4-4和表1-4-5所示：

表1-4-4

表1-4-5

从表1-4-4和1-4-5中可知，DNA突变检测结果显示，受检样本中，17例受检样本中包含19个位点的基因突变，该结果与样本已知情况相符。野生型样本4958-049，19 个位点均未发生突变，说明本发明所述的19对DNA PCR引物可以用于检测以上位点的突变情况。

具体RNA测序Count和、CP100K如表1-5所示：

表1-4-6

表1-4-6可知，RNA融合检测结果显示，受检样本中，有5例受检样本中所包含5 种基因融合类型的位点，该结果与样本已知情况相符。野生型样本4958-049，相应的5 个位点均未发生基因融合，说明本发明所述的5对RNA PCR引物可以用于检测以上位点的基因融合情况。

综上，本申请所述的检测产品可以用于同时检测甲状腺癌相关的基因突变和基因融合，可以用于甲状腺癌的检测。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

上海鹍远生物技术有限公司

<120> 基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctatatgta gaggctgttg gaagct 26

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccactgaag ttctttatct tcaaataact 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctttgaaag ctttgtattt acagcaga 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaacagttt aaaggccttg ggaata 26

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagtggaaa aatagcctca attcttacc 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt 30

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgtactgg tggatgtcct ca 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctgttgga catcctggat ac 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaatacaca gaggaagcct tcg 23

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaggattct tacagaaaac aagtggtta 29

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctcacctct atggtgggat ca 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acaggttctt gctggtgtga aat 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggaaaggg acgaactggt g 21

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttttccaat aaattctcag atccaggaag a 31

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcagaaaaag tagaaaatgg aagtctatgt g 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actgacctta aaatttggag aaaagtatcg 30

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctgagtggg ctacgtct 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtcttcgggc tcgcagaa 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaagacccaa gctgcctgac 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccactttgc ggctctcg 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaaggaaggg gaggggctg 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtcctgccc cttcacctt 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctctgcaat gtgctcaaga gt 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cttctccgct gtccatgaca c 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tttccttact gcctcttgct tctc 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctggagtct tccagtgtga tg 22

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggcctctgat tcctcactga ttg 23

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agctgctcac catcgctatc 20

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcttattctc ctcaccagcc actac 25

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gagtgtagag gtctacagag gcga 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tctacatcac agtccgaaat ccgc 24

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cttgttcaga attgctgaca gagcatag 28

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctttcaggg aatatcgtcc act 23

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtgaattgtt cttgctcttc aggttttc 28

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caaactgaag tgcaaggcac tg 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

caaactgaag tgcaaggcac tg 22

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gctgtaaatt atgagaaaga agaagaattc ctc 33

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

caggactggc ttacccaaaa gc 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cgtggttgat gtggtgcagt 20

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gtcttgcaat ctctgaagat catgtg 26

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

caaactttgc aactgtagga gcag 24

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gttagttagt gagccaggta atgagg 26

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tggtgctcca tgaggagaca 20

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gcctcttttc cacagaaaca acatc 25

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ctgcagacca tgaaggagga a 21

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgcttcccat tgtcaatctc cac 23

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ggattcgcgg gcacagac 18

Claims

1.一种甲状腺癌检测用引物组合，其特征在于，所述引物组合包括DNA PCR引物和RNAPCR引物，所述DNA PCR引物包括ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TG基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、TTN基因突变检测引物对；所述RNA PCR引物包括基因融合检测引物，所述基因融合检测引物包括RET基因融合检测引物对、NTRK3基因融合检测引物对、BRAF基因融合检测引物对。

2.根据权利要求1所述的甲状腺癌检测用引物组合，其特征在于，所述RNA PCR引物中，还包括用于判断RNA PCR引物是否工作的基因融合质控参照引物。

3.根据权利要求2所述的甲状腺癌检测用引物组合，其特征在于，所述基因融合质控参照引物选自管家基因引物；优选的，所述管家基因引物包括MYC基因扩增引物对和LMNA基因扩增引物对。

4.根据权利要求1所述的甲状腺癌检测用引物组合，其特征在于，

所述ATM基因突变检测引物对检测位点包括：c.5065C>T p.Gln1689Ter，c.5069A>Gp.His1690Arg，c.8977C>T p.Arg2993Ter；

所述TSHR基因突变检测引物对检测位点包括：c.1349G>A p.Arg450His，c.1915C>Tp.Pro639Ser；

所述TTN基因突变检测引物对检测位点包括：c.160G>A p.Val54Met；

所述RET基因融合检测引物对检测位点包括：RET(12)-CCDC6(1)，RET(12)-CCDC6(2)，RET(12)-NCOA4(7)；

所述NTRK3基因融合检测引物对检测位点包括：NTRK3(14)-EML4(2)；

所述BRAF基因融合检测引物对检测位点包括：BRAF(10)-MKRN1(3)。

5.根据权利要求3或4所述的甲状腺癌检测用引物组合，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

(1)所述ATM基因突变检测引物对包括ATM基因突变第一检测引物对和ATM基因突变第二检测引物对，所述ATM基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述ATM基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物；

(2)所述BRAF基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物；

(3)所述HRAS基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；

(4)所述NRAS基因突变检测引物对包括NRAS基因突变第一检测引物对和NRAS基因突变第二检测引物对，所述NRAS基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述NRAS基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物；

(5)所述PTEN基因突变检测引物对包括PTEN基因突变第一检测引物对和PTEN基因突变第二检测引物对，所述PTEN基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物；所述PTEN基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的反向引物；

(6)所述RET基因突变检测引物对包括RET基因突变第一检测引物对和RET基因突变第二检测引物对，所述RET基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物；所述RET基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的反向引物；

(7)所述TERT基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的反向引物；

(8)所述TG基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的反向引物；

(9)所述TP53基因突变检测引物对包括TP53基因突变第一检测引物对和TP53基因突变第二检测引物对，所述TP53基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的反向引物；所述TP53基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的反向引物；

(10)所述TSHR基因突变检测引物对包括TSHR基因突变第一检测引物对和TSHR基因突变第二检测引物对，所述TSHR基因突变第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的反向引物；所述TSHR基因突变第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的反向引物；

(11)所述TTN基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的反向引物；

(12)所述RET基因融合检测引物对包括RET基因融合第一检测引物对、RET基因融合第二检测引物对和RET基因融合第三检测引物对，所述RET基因融合第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；所述RET基因融合第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；所述RET基因融合第三检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；

(13)所述NTRK3基因融合检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的反向引物；

(14)所述BRAF基因融合检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的反向引物；

(15)所述MYC基因扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的反向引物；

(16)所述LMNA基因扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的反向引物。

6.根据权利要求1-5任一所述的甲状腺癌检测用引物组合用于制备人类甲状腺癌检测产品中的用途。

7.一种基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品，包括权利要求1-5任一所述的甲状腺癌检测用引物组合。

8.一种人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，至少包括以下步骤：

(1)获取样本的DNA和RNA，将RNA反转录为cDNA；

(2)多重PCR：将步骤(1)获得的DNA和cDNA同时进行多重PCR扩增，扩增引物包括DNAPCR引物和RNA PCR引物，获得多重PCR扩增产物；

(3)对所述多重PCR扩增产物进行测序文库构建；

(4)对所述测序文库进行基因测序；

9.根据权利要求8所述的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.步骤(2)中，所述扩增引物选自权利要求1-5任一所述的甲状腺癌检测用引物组合；

b.在进行步骤(3)之前，还包括以下步骤：

(21)消化引物序列：将步骤(2)获得的多重PCR扩增产物进行消化，获得消化后的多重PCR扩增产物；

c.步骤(3)中，测序文库构建包括以下步骤：

将目标产物连接接头和标签，进行片段筛选，获得片段筛选产物；对片段筛选产物进行PCR扩增，获得测序文库；

d.步骤(4)中，基因测序的平台为ION TORRENT平台；

e.步骤(5)中，所述对照序列选自人类参考基因组Hg19的相应位点的序列；

f.步骤(5)中，若样本的检测位点的突变频率≥2％，则认为该检测位点发生基因突变；突变频率＝该检测位点的突变型测序数据序列数目/该检测位点的总的序列数目；

10.根据权利要求9所述的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，在进行比对时，还需进行位点测序数据的质控，若位点测序数据满足预设值，则认为该位点的测序数据质控合格；其中，DNA测序结果中，若受检位点的覆盖度≥100×，视为该位点基因突变质测序数据控合格；RNA测序结果中，若MYC和LMNA位点Count≥10，CP100K≥25，视为RNA基因融合测序数据质控合格。

11.一种人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测装置，包括：

12.根据权利要求11所述的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测装置，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.所述样本的基因的受检位点的DNA和RNA测序数据采用采用权利要求1-5任一所述的甲状腺癌检测用引物组合或权利要求7所述的基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品并利用二代测序检测分析获得；

b.检测模块中，若样本的检测位点的突变频率≥2％，则认为该检测位点发生基因突变；突变频率＝该检测位点的突变型测序数据序列数目/该检测位点的总的序列数目；若样本的检测位点中Count≥10，CP100K≥25，则认为该检测位点发生基因融合；其中，Count是指融合测序序列所覆盖区域的测序序列总数；CP100K是指每100000个比对上的测序序列中比对上的融合基因的序列数。

13.根据权利要求12所述的人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测装置，其特征在于，在进行比对时，还需进行位点测序数据的质控，若位点测序数据满足预设值，则认为该位点的测序数据质控合格；其中，DNA测序结果中，若受检位点的覆盖度≥100×，视为该位点基因突变质测序数据控合格；RNA测序结果中，若MYC和LMNA位点Count≥10，CP100K≥25，视为RNA基因融合测序数据质控合格。

14.一种设备，所述设备选自计算机可读存储介质或计算机处理设备或电子终端；所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现人类甲状腺多基因突变和基因融合的检测方法，所述方法包括以下步骤：