CN115011672A - 一种超低频基因突变检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超低频基因突变检测方法，包括设计探针和引物，将所设计的探针与样品DNA杂交形成双链DNA。然后，选用特定的DNA内切酶，切割完全杂交的双链DNA而不能切割未能完全杂交的双链DNA，初次富集含有突变位点的双链DNA。其次，将DNA内切酶产物预扩增，所设计的探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因更倾向于与引物序列结合而得以延伸。因此，选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，进一步富集含有突变位点的DNA片段。最后，将含有突变位点的DNA片段构建高通量测序文库，上机测序并进行测序数据分析，从而达到超低频基因突变检测的目标。

Description

一种超低频基因突变检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种超低频基因突变检测方法。

背景技术

近年来，体细胞突变研究已成为生物学研究和临床精准医疗的研究基础和研究热点。随着高灵敏度检测技术的出现，越来越多的研究发现体细胞突变通常表现为低频率(<1％)，而且，大多数低频或超低频的体细胞突变在肿瘤异质性、耐药性和产前诊断的发展中起着关键作用。高通量测序技术具有大规模、高通量、低成本等特点，目前已广泛应用于生物学和医学等领域，并正在加速改变生命科学及医学领域的研究。然而，高通量测序技术的错误率约为10^-3-10^-2，并且在不同测序平台和数据处理策略之间存在差异。高通量测序技术的高错误率使低频甚至超低频突变(<0.01％)的检测仍然是一项巨大的挑战。为了克服高通量测序技术的高错误率对低频甚至超低频突变检测的影响，研究者开发了分子标签技术(unique molecule identity,UMI)以抑制错误，从而实现低频突变检测。该类技术包括DuplexSeq、NanoSeq和SaferSeqS等。UMI技术通过将DNA分子的正反两条链合成一个双链家族来区分测序错误和真正的突变，从而在突变频率为0.01％或者更低的情况下实现可靠的低频变突变识别，从而进一步减少错误。然而，由于所有DNA模板分子，无论是野生型序列还是突变型序列，都无差别地进行冗余测序，且大幅依赖于每个双链家族的read数进行错误校正，这不仅导致了巨大的reads浪费和非常低的数据利用率，而且测序深度需求极高；另外，对低频突变检测的样本量需求极高。例如，频率为0.005％的突变，总共需要75,000个二倍体人类基因组DNA(gDNA)，相当于大约500ng gDNA，才能实现平均3.75个突变拷贝。如此高的测序深度需求和起始样本量需求让研究人员、临床医生和患者难以承受。本发明提供一种超低频基因突变检测方法，该方法通过两次富集，大幅去除样本中含量大的野生型序列，而保留样品中的低频突变序列。首次富集通过采用DNA内切酶去除能与探针完美结合的野生型样本序列而保留未能与探针完美结合的含有突变位点的序列；第二次富集通过将DNA内切酶产物预扩增，扩增的过程中引物和探针竞争性杂交，所设计的探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因倾向于与引物序列结合而得以延伸，最终选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，使含有突变位点的DNA片段进一步富集。最后，将含有突变位点的DNA片段构建高通量测序文库，然后根据测序数据进行突变识别，从而达到痕量DNA超低频突变检测的目标。该方法能有效降低测序深度、提高测序数据利用率，减少数据浪费，为低频突变的检测提供一种有效的检测方法，有望为医学检测和临床诊断提供一种有效的检测手段，以推动个体化医疗的发展。

发明内容

本发明旨在解决高通量测序错误率高导致超低频突变检测困难的问题，提供一种超低频基因突变检测方法，为微量模板以及超低频基因突变的检测提供一种灵敏度更高、准确性更好的方法。该方法将所设计的探针与样品DNA杂交形成双链DNA。如果样本DNA存在突变，那么突变位点与探针序列就不能完全杂交，反之，如果样本DNA不存在突变，则样本DNA与探针序列能完全杂交。通过选用特定的DNA内切酶，切割完全杂交的双链DNA而不能切除未能完全杂交的双链DNA，初次富集含有突变位点的双链DNA。然后，将DNA内切酶产物预扩增，所设计的探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因倾向于与引物序列结合而得以延伸。因此，选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，进一步富集含有突变位点的DNA片段。最后，将含有突变位点的DNA片段构建高通量测序文库，上机测序并进行测序数据分析，从而达到超低频突变检测的目标。

鉴于此，本发明采用的技术方案是：一种超低频基因突变检测方法，包括以下步骤：

(1)探针与引物设计：根据样品目标捕获区域设计探针和引物，使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合；所设计的探针能与样品目标捕获区域完全互补，而与含有突变位点的序列在突变位点不能完全互补。

(2)杂交：将步骤(1)中设计的探针与样品DNA进行杂交形成双链DNA。

(3)首轮突变富集：采用特异性DNA内切酶消化杂交后产生的双链DNA；所述特异性DNA内切酶采用双链特异性核酸酶，能消化完全互补的双链DNA，而保留不能完全互补的双链DNA，使含有突变位点的DNA片段得以富集。

(4)预扩增：采用步骤(1)的探针与引物竞争性与消化后的产物进行PCR扩增，使探针与引物竞争性地与消化产物杂交，进一步富集含有突变位点的DNA片段；扩增时，探针与引物竞争性与模板杂交，由于所设计的探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列(即样本序列)的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因倾向于与引物序列结合而得以延伸。因此，选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，进一步富集含有突变位点的DNA片段。

(5)接头连接；将测序接头连接到所述预扩增产物两端。

(6)进行上机测序和数据分析，将接头连接后的测序文库采用二代测序平台进行测序；去除低质量reads及duplication，完成reads在参考基因组的比对，最后进行突变识别与注释。

进一步，所述探针序列5’端与引物序列3’端有4-12个碱基互补配对(互补配对的区域称之为重叠区域)，使探针和引物竞争性杂交。

进一步，所述探针序列的3’端封闭。

进一步，所述使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合，通过调整探针与引物序列重叠区域、引物未重叠部分、以及探针未重叠部分的自由能实现。

进一步，所述引物未重叠部分、探针与引物序列重叠区域、以及探针未重叠部分的自由能分别为～-7千卡/摩尔、～-4.5千卡/摩尔、以及～-10千卡/摩尔。

进一步，所述接头连接中的接头为通用测序接头。

进一步，所述数据分析的流程为数据清洗、质量控制、比对到参考基因组、突变识别与注释。

本发明的主要优点包括：

本发明通过两次富集，大幅去除样本含量颇丰的野生型序列，而保留样品中的突变序列。首次富集通过采用DNA内切酶，去除能与探针完美结合的野生型样本序列而保留未能与探针完美结合的含有突变位点的序列；第二次富集通过将DNA内切酶产物预扩增，扩增过程中引物和探针竞争性杂交，所设计的探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因倾向于与引物序列结合而得以延伸，最终选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，使含有突变位点的DNA片段进一步富集。最后，将含有突变位点的DNA片段构建高通量测序文库，然后根据测序数据进行突变识别，从而达到痕量DNA超低频突变检测的目标。本发明通过有效富集含有突变的序列，避免了无论是野生型还是突变型模板序列都进行深度测序，有效地降低了测序深度需求和样本量需求，从而降低测序成本。

附图说明

图1为本发明一种超低频基因突变检测方法的原理图；

图2为本发明方法所获得的突变频率、野生型read数目与突变型read数目。

具体实施方式

为了能清晰地描述本发明的技术内容，下面结合实施例子来进一步描述。

如图1所示，原理图；样本DNA经过变性后，与所设计的探针杂交形成双链DNA。如果样本DNA存在突变，那么突变位点与探针序列就不能完全杂交；反之，如果样本DNA不存在突变，则样本DNA与探针序列能完全杂交。通过选用特定的DNA内切酶，切除完全杂交的双链DNA而不切除未能完全杂交的双链DNA，使含有突变位点的双链DNA得以富集。然后，将DNA内切酶产物预扩增，预扩增时探针比引物更倾向于与样本序列结合，且探针与野生型序列的结合更稳定，使野生型序列结合探针后不能延伸，而含有突变位点的序列因倾向于与引物序列结合而得以延伸。因此，选择性地扩增含有突变位点的DNA片段，使含有突变位点的DNA片段进一步富集。最后，将上述获得的DNA片段构建高通量测序文库，上机测序并进行测序数据分析。

本实施例中基因组中25个SNPs位点作为研究对象设计测序panel，上述25个SNPs在NA18537或者NA18562上是纯合子。然后采用细胞系NA18562和NA18537基因组DNA混合物制备混合液样本，其中NA18562基因组DNA占比0.2％，NA18537基因组DNA占比99.8％。因此，在所有25个位点的扩增子中，如果认为NA18537是野生型，那么NA18562特异性的突变位点含量均为0.2％。分别采用(A)本发明的方法进行突变检测和(B)采用传统方法进行突变检测的突变检测分析，以比较不同方法对突变识别效果的影响。

A、采用本发明的方法进行突变检测

(1)样品制备

首先，选取基因组中25个SNPs位点作为研究对象设计测序panel，上述25个SNPs在NA18537或者NA18562上是纯合子。其次，采用细胞系NA18562和NA18537基因组DNA混合物制备混合比例为99.8％:0.2％的混合液。因此，对于所述25个SNPs扩增子，如果认为NA18537是野生型，那么NA18562特异性等位基因的突变频率预计约为0.2％。

(2)探针和引物设计

针对细胞系NA18537和NA18562基因组DNA序列设计探针检测目标捕获区域中25个突变位点，所设计的探针能与样品野生型序列完全互补，而与含有突变位点的序列在突变位点不能完全互补；而且，探针序列5’端与引物3’端有4-12个碱基互补，使探针和引物竞争性杂交。所有探针序列的3’端封闭，3'末端封闭的方法为3'末端的核苷酸被去磷酸化、被氨基化或被巯基化。

引物和探针序列的长度和序列设计时通常使引物热力学上更倾向于与含有突变位点的模板杂交，而不倾向于与野生型模板杂交。该过程可以通过调整探针与引物序列重叠区域、引物未重叠部分、以及探针未重叠部分的自由能完成。本实施中引物未重叠部分、探针与引物序列重叠区域、以及探针未重叠部分的自由能分别为

千卡/摩尔，

千卡/摩尔,以及

千卡/摩尔。此时，引物更倾向于与含有突变位点的模板杂交，而不倾向于与野生型模板杂交。另外，由于已知G-T错配在热力学上比所有其他单碱基错配形成的气泡更不稳定，如SNP等位基因为T>C或G>A，在设计时，选择针对DNA的(-)链设计探针和引物，而不是默认的(+)链。探针序列如表1所示。

表1.针对细胞系NA18562和NA18537所设计的探针序列。

表1.针对细胞系NA18562和NA18537所设计的探针序列(续)。

注：/iSpC3/代表C3间隔；

(3)杂交

将上述所设计的探针与样品杂交。将突变含量为0.2％的混合液样本和25nM探针序列放入PCR仪中进行反应。反应条件为：98℃变性2min，70℃杂交1min，取出待用。

(4)首轮突变序列富集

当探针与0.2％混合样本杂交后的温度降低至～65℃时，在反应体系中加入特异性DNA内切酶消化20min，升温至95℃2min使特异性DNA内切酶失活。特异性DNA内切酶可以用Duplex-specific nuclease(双链特异性核酸酶，DSN)。样本经异性DNA内切酶消化后可以直接用于PCR预扩增。

表2.预扩增细胞系NA18562和NA18537所用的正向和反向引物序列。

表2.预扩增细胞系NA18562和NA18537所用的正向和反向引物序列(续)。

(5)杂交

将上述所设计的探针与样品杂交。将突变含量为0.2％的混合液样本和25nM探针序列放入PCR仪中进行反应。反应条件为：98℃变性2min，70℃杂交1min，取出待用。

(6)首轮突变序列富集

当探针与0.2％混合样本杂交后的温度降低至～65℃时，在反应体系中加入特异性DNA内切酶消化20min，升温至95℃2min使特异性DNA内切酶失活。特异性DNA内切酶可以用Duplex-specific nuclease(双链特异性核酸酶，DSN)。样本经异性DNA内切酶消化后可以直接用于PCR预扩增。

(7)预扩增

扩增时，探针与引物竞争性与模板杂交。所用的探针序列如表1所示，正反向引物序列如表2所示。经双链特异性核酸酶消化后的样本进行PCR扩增；(a)反应溶液：1×Phusion超保真酶缓冲液，1μL已制备的混合液，10-100nM浓度的探针序列，引物各0.3μM，0.05U/μL Phusion hot start flex DNA聚合酶，1.5mM MgCl2，以及四种dNTPs各200μM；(b)反应程序：98℃预变性30s；扩增22个循环：98℃变性10s，T_m退火5min，72℃延伸2min；4℃保持。

(8)末端补齐

(a)反应溶液：1x Polynucleotide Kinase缓冲液，四种dNTPs各250μM，1U/μL T4DNA聚合酶，0.25U/μL Klenow Fragment酶，1U/μL T4 Polynucleotide Kinase；(b)反应程序：Thermomixer中20℃温浴30min。

(9)A-tailing

为已经修复为平末端的DNA片段3'端末尾加上“A”碱基。反应体系如下：1x blue缓冲液，0.7U/μL Klenow(3'-5'exo-)酶，dATP 250μM；(b)反应程序：Thermomixer中37℃温浴30min。

(10)接头连接

(a)反应溶液：1x Rapid ligation缓冲液，4μM接头混合液，1U/μL T4 DNA连接酶；(b)反应程序：Thermomixer中20℃温浴15min。

(11)Index PCR扩增

(a)反应溶液：1×Pfx Amplification缓冲液，44μL已连上接头的文库，Index和P1接头各0.08μM，0.02U/μL Pfx DNA聚合酶，200μM MgSO₄以及四种dNTPs各0.4mM；(b)反应程序：94℃预变性2min；扩增8个循环：94℃变性15s，T_m退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min；4℃保持。

(12)上机测序

采用Illumina Hiseq 2000进行测序；

(13)数据分析：

测序数据采用传统高通量测序突变识别分析技术策略，具体如下：

a.质量控制：对测序原始数据进行清洗处理，得到清洗后的数据；质量控制的测序质量检测通过FastQC软件实现，序列碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。FASTQ文件中测序Reads需要与指定的参考基因组进行序列比对，定位待测片段在基因组或基因上的位置。在序列比对之前，要确保这些Reads具有足够高的质量，需要去除测序接头以及引物序列，过滤掉低质量值数据，确保数据质量，得到高质量的Reads或碱基，以保证后续分析的准确性。

b.与参考基因组进行比对：质量控制分析后得到的高质量Reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息，进而对基因进行注释和定量。通过比对软件Bowtie，将高通量Reads比对到基因组上。通常情况下，测序reads中超过70％可在参考基因组中找到相应的定位，如果比对到参考基因组上的reads比例较低，则可能是由于参考基因组本身不适合或在前期实验过程中出现污染。

c.序列排序、去重复：用Samtools软件进行排序、建索引，得到reads在参考序列中的位置及质量值，并进行数据格式的转换，得到BAM文件。排序完成后去除PCR重复序列，然后对BAM文件创建索引，从而能够随机访问文件中的任意位置。

d.碱基质量重校正：对BAM文件中reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件的reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率，使用GATK对重新比对的BAM文件做质量校正。

e.变异和基因型识别：用GATK得到vcf文件，从高通量数据中识别基因组变异，包括单核苷酸多态性(SNP)和DNA插入和缺失(indels)。

B、采用传统方法进行突变检测

(1)样品制备：

首先，选取基因组中25个SNPs位点作为研究对象设计测序panel，上述25个SNPs在NA18537或者NA18562上是纯合子。其次，采用细胞系NA18562和NA18537基因组DNA混合物制备成混合液，其中NA18562基因组DNA占比0.2％，NA18537基因组DNA占比99.8％，并。

(2)预扩增

(a)反应溶液：1×Phusion超保真酶缓冲液，1μL已制备的混合液，引物各0.3μM，0.05U/μL Phusion hot start flex DNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，以及四种dNTPs各200μM；(b)反应程序：98℃预变性30s；扩增12个循环：98℃变性10s，T_m退火5min，72℃延伸2min；4℃保持。

(3)末端补齐

(a)反应溶液：1x Polynucleotide Kinase缓冲液，四种dNTPs各250μM，1U/μL T4DNA聚合酶，0.25U/μL Klenow Fragment酶，1U/μL T4 Polynucleotide Kinase；(b)反应程序：Thermomixer中20℃温浴30min。

(4)A-tailing

为已经修复为平末端的DNA片段3'端末尾加上“A”碱基。反应体系如下：1x blue缓冲液，0.7U/μL Klenow(3'-5'exo-)酶，dATP 250μM；(b)反应程序：Thermomixer中37℃温浴30min。

(5)接头连接

(a)反应溶液：1x Rapid ligation缓冲液，4μM接头混合液，1U/μL T4 DNA连接酶；(b)反应程序：Thermomixer中20℃温浴15min。

(6)Index PCR扩增

(a)反应溶液：1×Pfx Amplification缓冲液，44μL已连上接头的文库，Index和P1接头各0.08μM，0.02U/μL Pfx DNA聚合酶，200μM MgSO₄以及四种dNTPs各0.4mM；(b)反应程序：94℃预变性2min；扩增8个循环：94℃变性15s，T_m退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min；4℃保持。

(7)上机测序

采用Illumina Hiseq 2000进行测序。

(8)数据分析：

测序数据采用传统高通量测序突变识别分析技术策略，具体如下：

a.质量控制：对测序原始数据进行清洗处理，得到清洗后的数据；质量控制的测序质量检测通过FastQC软件实现，序列碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。FASTQ文件中测序Reads需要与指定的参考基因组进行序列比对，定位待测片段在基因组或基因上的位置。在序列比对之前，要确保这些Reads具有足够高的质量，需要去除测序接头以及引物序列，过滤掉低质量值数据，确保数据质量，得到高质量的Reads或碱基，以保证后续分析的准确性。

b.与参考基因组进行比对：质量控制分析后得到的高质量Reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息，进而对基因进行注释和定量。通过比对软件Bowtie，将高通量Reads比对到基因组上。通常情况下，测序reads中超过70％可在参考基因组中找到相应的定位，如果比对到参考基因组上的reads比例较低，则可能是由于参考基因组本身不适合或在前期实验过程中出现污染。

c.序列排序、去重复：用Samtools软件进行排序、建索引，得到reads在参考序列中的位置及质量值，并进行数据格式的转换，得到BAM文件。排序完成后去除PCR重复序列，然后对BAM文件创建索引，从而能够随机访问文件中的任意位置。

d.碱基质量重校正：对BAM文件中reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件的reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率，使用GATK对重新比对的BAM文件做质量校正。

e.变异和基因型识别：用GATK得到vcf文件，从高通量数据中识别基因组变异，包括单核苷酸多态性(SNP)和DNA插入和缺失(indels)。

如图2所示，样本中25个SNPs位点突变型比例均为0.2％的混合样本，采用本发明的方法所获得的突变频率、野生型read数目与突变型read数目。由图可知，经本发明方法富集后，在传统方法中突变频率均为0.2％的25个突变位点，突变频率约为10％-95％，且大部分样本突变频率高于40％，甚至部分位点突变频率高达90％以上。

Claims (9)

1.一种超低频基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)探针与引物设计：根据样品目标捕获区域设计探针和引物，使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合；所设计的探针能与样品目标捕获区域完全互补，而与含有突变位点的序列在突变位点不能完全互补；

(2)杂交：将步骤(1)中设计的探针与样品DNA进行杂交形成双链DNA；

(3)首轮突变富集：采用特异性DNA内切酶消化杂交后产生的双链DNA；

(4)预扩增：采用步骤(1)的探针与引物竞争性与步骤(3)消化后的产物进行PCR扩增，使探针与引物竞争性地与消化产物杂交，进一步富集含有突变位点的DNA片段；

(5)接头连接；将测序接头连接到所述预扩增产物两端；

(6)进行上机测序和数据分析。

2.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述探针序列5’端与引物序列3’端有4-12个碱基互补配对。

3.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述探针序列的3’端封闭。

4.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合通过调整探针与引物序列重叠区域、引物未重叠部分、以及探针未重叠部分的自由能实现。

5.根据权利要求4所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述引物未重叠部分、探针与引物序列重叠区域、以及探针未重叠部分的自由能分别为～-7千卡/摩尔、～-4.5千卡/摩尔、以及～-10千卡/摩尔。

6.根据权利要求1-5任一项所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述特异性DNA内切酶采用双链特异性核酸酶，能消化完全互补的双链DNA，而保留不能完全互补的双链DNA。

7.根据权利要求6所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述PCR扩增体系为，反应溶液：1μL消化后的产物杂交混合液，1X缓冲液，20-100nM探针序列和引物各0.3μM，0.05U/μL DNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，以及四种dNTPs各200μM；

反应程序：98℃预变性30s；扩增22个循环：98℃变性10s，T_m退火5min，72℃延伸2min；4℃保持。

8.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述接头连接中的接头为通用测序接头。

9.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述数据分析的流程为数据清洗、质量控制、比对到参考基因组、突变识别与注释。

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