CN109234380A - 遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组。本发明针对遗传性耳聋相关基因的33个突变位点设计了特异性引物组，并制备了遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，本发明的试剂盒和特异性引物组能够快速、准确、一次性检测33个遗传性耳聋相关基因突变位点，并且利用特异性引物进行多重PCR建库的均一性和稳定性好，所需起始模板DNA量低，建库获得的文库测序数据利用率及检测准确性高，适用于多种样本类型。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，更具体地涉及遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组。
背景技术
耳聋是最为常见的交流障碍疾病，对个人的生活和社会发展都有重大影响。我国听力残疾者数量接近3000万，占全国总残疾人口的33％，为全国残疾人口首位，听力正常人群耳聋携带者人数多达8000万；在新生儿群体中，耳聋发生比例约为1～3‰，据估算，每年新生聋儿超过3万例，约60％的耳聋是由于遗传因素导致的，其余为环境因素或环境因素与遗传因素共同作用导致的。耳聋按照疾病发生时间和机制分为先天性耳聋、迟发性耳聋和药物性耳聋；先天性耳聋通常是指出生时或者学语前即罹患耳聋；迟发性耳聋则是进行性的或需要某些诱导因素诱导才会发病，比如，大前庭水管综合症患者幼时可能表现为听力正常，但是剧烈运动或者受到意外碰撞后或者感冒喷嚏等都可能会诱发耳聋发生；药物性耳聋最常见的是氨基糖苷类药物诱发型耳聋，该类型患者对糖苷类药物的药毒性较正常人敏感，使用此类药物容易引发药物性耳聋。据大规模耳聋分子流行病学研究显示，GJB2、SLC26A4、GJB3、12S rRNA是我国最常见的致病基因，糖尿病耳聋也是国人较高频的耳聋疾病，其相关基因为MT-TL1。因此，涵盖这5种基因的高频致病位点极具检测价值。
新一代高通量目标序列捕获测序技术的发展已被广泛的应用于各类生物学研究和医学研究中。相比探针捕获，应用多重PCR捕获目标序列具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。然而，一般来说，多重PCR拟捕获目标区域越多，则扩增的特异性、准确性、均一性越低，多重PCR捕获技术的实现难度越大；此外，基于不同的高通量测序平台，多重PCR捕获技术的实现手段也有所差别。
综上，本发明开发一种基于多重PCR捕获技术和半导体测序平台的遗传性耳聋相关基因检测产品，能够快速、准确、一次性检测33个遗传性耳聋相关基因突变位点。
发明内容
本发明的目的在于提供遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组，遗传性耳聋相关基因的建库方法及获得的文库。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一种遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，包括：检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组；所述特异性引物组包括针对下述33个位点进行设计的特异性引物：GJB2基因的c.235delC、c.299_300delAT、c.35delG、c.176_191del16、c.512insAACG、c.427C>T、c.257C>G、c.35insG、c.109G>A位点，GJB3基因的c.538C>T位点，SLC26A4基因的c.917insG、IVS7-2A>G、c.2168A>G、c.1229C>T、c.1174A>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.589G>A、c.1226G>A、c.281C>T、IVS15+5G>A、c.2086C>T、c.754T>C、c.1079C>T、c.1343C>T、c.1336C>T、c.387delC、IVS14+1G>A、IVS13+9C>T、c.1693insA位点，12S rRNA基因的m.1555A>G、m.1494C>T位点，MT-TL1基因的m.3243A>G位点。
作为上述试剂盒优选的，所述特异性引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示的特异性引物。
根据建库需求，所述特异性引物组中的每条特异性引物5’端还连接有建库测序所需的通用序列。所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。其中，公共引物的作用是通过PCR使目标片段与接头和特异性标签连接；特异性标签则用于区分样本，在文库构建时，不同样本用不同的特异性标签的去标记，从而实现高通量。以上建库测序所需的通用序列需要根据平台建库需求选用，例如，可以在特异性引物的5’端只连接公共引物，并且在测序接头的3’连接公共引物，标签接头的3’端连接公共引物，可通过PCR扩增获得“测序接头-公共引物-目的片段-公共引物-标签接头”的扩增子文库；再如，在特异性引物的5’端直接连接标签和接头，可通过PCR扩增直接获得带有特异性标签和接头的扩增子文库，此外，在特异性引物的5’端只连接标签，可通过PCR扩增获得带有特异性标签的扩增子文库，经接头连接后再进行测序；本领域技术人员应当知晓，特异性引物5’端连接建库测序所需的通用序列的方式不限于此。
本发明还提供一种检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组，如上述试剂盒中的特异性引物组所述。
本发明提供一种遗传性耳聋相关基因的建库方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括步骤：根据测序平台建库需求，利用上述试剂盒或上述特异性引物组，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得遗传性耳聋相关基因的文库。
根据半导体测序平台，上述建库方法进一步包括步骤：
(1)在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示的特异性引物序列5’端连接公共引物作为特
异性引物组，并加入测序接头、标签接头和扩增缓冲液，对模板DNA进行多重PCR扩
增，获得扩增子文库；其中，不同模板DNA所用的标签接头不同；测序接头和标签接头
3’端连接了公共引物；
(2)将获得的扩增子文库混合，纯化，获得遗传性耳聋相关基因的文库。
上述建库方法中，所述25μL多重PCR扩增反应体系为：模板DNA含量≥2ng、特异性引物组0.2μL、测序接头0.5μL，标签接头0.5μL、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水为余量。
上述建库方法中，所述多重PCR扩增反应条件为：①95℃3～5min；②34～36个循环扩增，每个循环：95℃15～30s，60℃90～120s，72℃30～45s；③72℃1～2min，④8～16℃保持。
本发明还提供利用上述建库方法获得的遗传性耳聋相关基因的文库。
本发明的有益效果是：
本发明针对遗传性耳聋相关基因的33个突变位点设计了特异性引物组，并制备了遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，本发明的试剂盒和特异性引物组能够快速、准确、一次性检测33个遗传性耳聋相关基因突变位点，并且利用特异性引物进行多重PCR建库的均一性和稳定性好，所需起始模板DNA量低，建库获得的文库测序数据利用率及检测准确性高，适用于多种样本类型。
附图说明
图1是扩增深度盒式图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步解释本发明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未特别说明的试剂和仪器均可市售获得，未特别说明的实验操作均按产商说明书或本领域常规技术实施。
实施例1、检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组
发明人从数据库中筛选出遗传性耳聋5个相关基因33个突变位点，并根据突变位点及两侧翼各300bp的序列信息设计了特异性引物，并经过大量试验筛选、优化、验证，最终优选出扩增效率高，特异性好的21对引物(如表1所示)。
遗传性耳聋5个相关基因33个突变位点为：GJB2基因的c.235delC、c.299_300delAT、c.35delG、c.176_191del16、c.512insAACG、c.427C>T、c.257C>G、c.35insG、c.109G>A位点，GJB3基因的c.538C>T位点，SLC26A4基因的c.917insG、IVS7-2A>G、c.2168A>G、c.1229C>T、c.1174A>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.589G>A、c.1226G>A、c.281C>T、IVS15+5G>A、c.2086C>T、c.754T>C、c.1079C>T、c.1343C>T、c.1336C>T、c.387delC、IVS14+1G>A、IVS13+9C>T、c.1693insA位点，12S rRNA基因的m.1555A>G、m.1494C>T位点，MT-TL1基因的m.3243A>G位点。
表1、遗传性耳聋相关基因的特异性引物
实施例2、遗传性耳聋相关基因检测试剂盒
本实施例根据半导体测序平台，示例性地提供一种基于半导体测序法的遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，值得注意的是，利用本发明的特异性引物组，开发的基于其他测序平台或非基于测序的遗传性耳聋相关基因检测试剂盒也应当是本申请的保护范围，在此不一一示例。
遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，包括：
(1)特异性引物组：在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示的每条特异性引物的5’端加上公共引物，所述公共引物序列为：5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’(SEQ ID NO:43)；
(2)测序接头：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-公共引物-3’(SEQ ID NO:44)；
(3)标签接头：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-公共引物-3’(SEQ ID NO:45)；序列中N表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库；
(4)扩增缓冲液：市售的多重PCR缓冲试剂，如，QIAGEN Multiplex PCR Kit、2GFastMultiplex PCR Kit；
(5)纯化试剂：市售的纯化磁珠，如Ampure XP磁珠。
实施例3、遗传性耳聋相关基因的建库和测序
本实施例采用实施例2的试剂盒以35例检测限参考品(L01～L35)和3例阴性参考品(N01～N03)为模板进行遗传性耳聋相关基因的建库和测序，步骤如下：
1、一步多重PCR
配制25μL多重PCR反应体系，包括：模板DNA 5～20ng、特异性引物组0.2μL、测序接头0.5μL，标签接头0.5μL、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水余量；不同模板使用不同的标签接头。
按下述程序进行扩增：①95℃3min；②35个循环扩增，每个循环：95℃15s，60℃90s，72℃30s；③72℃1min，④16℃保持。
2、扩增产物混合与纯化
从每个PCR管中取出10μL的扩增产物，涡旋混匀，得到混合文库；取100μL的混合文库，使用纯化试剂进行纯化。
3、测序
测序前使用QubitTM dsDNA Hs Assay Kit对纯化后的混合文库进行定量，根据定量的浓度进行上机测序。本实施例采用半导体测序仪进行测序，测序模板制备和富集详见Ion PITM HiQTMOT2 200Kit(A26434)操作使用说明书，将带有模板分子的微珠加载到IonProtonTM测序仪的半导体芯片上进行测序，详细步骤参见Ion PITM Hi QTMSequence 200Kit操作使用说明书。
检测限参考品(L01～L35)和阴性参考品(N01～N03)的测序分析结果如表2所示，可见：检测限参考品检测结果应与理论结果完全一致。
表2、检测限参考品和阴性参考品的检测结果符合情况
实施例4、扩增均一性与稳定性评价
对特异性引物组进行多重PCR建库的均一性及稳定性进行评价，建库方法参考实施例3，分别进行5批次(run)测序，每个run有384个样本，对获得的扩增深度进行统计，结果如图1所示，每个run内，扩增子深度均一，进而确保各位点深度也均一，能大大节约测序成本，提高突变位点检测准确率，并且5个run之间，差异很小，说明特异性引物组进行多重PCR建库的稳定性好。
实施例5、特异性引物进行多重PCR扩增所需模板量低
随机选取5个参考品，每个样本4个平行，每个平行分别以1ng、2ng、5ng、10ng、20ng的模板量进行建库测试，建库方法参考实施例3，评价一次及二次建库成功率，并通过测序分析评价检测准确性。
汇总结果如表3所示，可见在二次实验成功的标准下，特异性引物进行多重PCR扩增所需模板量最低为2ng，一次实验成功的标准下，特异性引物进行多重PCR扩增所需模板量最低为5ng；并且在最低模板量下，能保证检测准确率为100％。
表3、特异性引物进行多重PCR扩增的模板量对建库成功率及检测准确性的影响
| 建库起始量 | 1ng | 2ng | 5ng | 10ng | 20ng |
| 一次成功率 | 60％ | 95％ | 100％ | 100％ | 100％ |
| 两次成功率 | 75％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ |
| 准确率 | 75％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ |
实施例6、遗传性耳聋相关基因的文库测序数据利用率高、检测准确性高
收集36例不同样本类型的模板DNA(白细胞14例、血液12例、血斑10例)，参考实施例3的建库方法，获得遗传性耳聋相关基因的文库，并对其进行测序和分析，输出准确性及数据利用率，其中准确性以sanger测序作为评价基准，一致则认为准确。
结果如表4所示，可见三种样本类型的模板DNA经扩增获得的文库，测序数据利用率高，检测准确性高，详细结果见表5。
表4、不同样本类型的遗传性耳聋相关基因的文库的准确性及数据利用率
| 模板DNA来源 | 准确性 | 平均利用率 | 样本例数 |
| 白细胞 | 100％ | 71.94％ | 14 |
| 血液 | 100％ | 69.68％ | 12 |
| 血斑 | 100％ | 69.77％ | 10 |
表5、36例样本检测详细检测结果汇总
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司
<120> 遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 35
ctttgcatgt gctttcaggg atg 23
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物
<400> 36
ctttaaacat gagcaaatat aattgt 26
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 37
tgcgattgtg atgatcgcca ttct 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 38
tctggtagca gagtagtgaa ggga 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 39
tattccaaaa tacggctgtt ccaa 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 40
caagtccagc aaatgtctca caaa 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 41
gttcagcctc atcttcaagc tca 23
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物
<400> 42
gcccaccatg aagtaggtga agattt 26
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 公共引物
<400> 43
aaatgggcgg taggcttg 18
<210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> 测序接头
<400> 44
cctctctatg ggcagtcggt gataaatggg cggtaggctt g 41
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 标签接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(38)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 45
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnga taaatgggcg gtaggcttg 59
Claims (10)
1.遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，包括：检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组；所述特异性引物组包括针对下述33个位点进行设计的特异性引物：GJB2基因的c.235delC、c.299_300delAT、c.35delG、c.176_191del16、c.512insAACG、c.427C>T、c.257C>G、c.35insG、c.109G>A位点，GJB3基因的c.538C>T位点，SLC26A4基因的c.917insG、IVS7-2A>G、c.2168A>G、c.1229C>T、c.1174A>T、c.1975G>C、c.2027T>A、c.589G>A、c.1226G>A、c.281C>T、IVS15+5G>A、c.2086C>T、c.754T>C、c.1079C>T、c.1343C>T、c.1336C>T、c.387delC、IVS14+1G>A、IVS13+9C>T、c.1693insA位点，12S rRNA基因的m.1555A>G、m.1494C>T位点，MT-TL1基因的m.3243A>G位点。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示的特异性引物。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物组中的每条特异性引物5’端还连接有建库测序所需的通用序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。
5.检测遗传性耳聋相关基因的特异性引物组，如权利要求1～4任一项所述试剂盒中的特异性引物组所述。
6.遗传性耳聋相关基因的建库方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括步骤：根据测序平台建库需求，利用权利要求1～4任一项所述的试剂盒或权利要求5所述的特异性引物组，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得遗传性耳聋相关基因的文库。
7.根据权利要求6所述的建库方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：
(1)在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示的特异性引物序列5’端连接公共引物作为特异性引物组，并加入测序接头、标签接头和扩增缓冲液，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库；其中，不同模板DNA所用的标签接头不同；测序接头和标签接头3’端连接了公共引物；
(2)将获得的扩增子文库混合，纯化，获得遗传性耳聋相关基因的文库。
8.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于：所述25μL多重PCR扩增反应体系为：模板DNA含量≥2ng、特异性引物组0.2μL、测序接头0.5μL，标签接头0.5μL、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水为余量。
9.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于：所述多重PCR扩增反应条件为：①95℃3～5min；②34～36个循环扩增，每个循环：95℃15～30s，60℃90～120s，72℃30～45s；③72℃1～2min，④8～16℃保持。
10.利用权利要求6～9任一项所述建库方法获得的遗传性耳聋相关基因的文库。
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