CN117402976A - 横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了通过多重荧光PCR检测RMS亚型特征变异基因的引物探针组，可以用于检测多达15种RMS亚型特征性基因变异类型，也可分别用于检测腺泡型RMS、先天性/婴儿型梭形细胞RMS、MYOD1突变型梭形细胞硬化性RMS和骨内梭形细胞RMS的特征变异，可以任意选择和组合，既可以用于已知变异类型的样本，也可以用于未知变异类型的样本；本发明提供的探针引物组具有高灵敏度，针对融合基因的可检测下限最低为100个拷贝，针对MYOD1的可检测下限是1%突变量，具有高特异性，检测范围内的扩增曲线线性特征良好，结果易判读。

Description

横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）是儿童最常见的软组织恶性肿瘤，发病率约占儿童肿瘤总量的5%。其临床表现多样，预后差异大，低危、中危和高危组3年无事件生存率分别为88%、55%~76%和<30%。目前尚无特异性实验室指标用于RMS辅助诊断。病理组织学诊断为本病确诊的“金标准”，根据肿瘤细胞的组织形态分为胚胎型、腺泡型、梭形细胞/硬化性和多型性四个亚型，各亚型预后差异巨大。由于病理诊断高度依赖医生的个人经验，存在较大误诊漏诊风险。
中国专利CN114182023A公开了横纹肌肉瘤中F-circP3F的检测试剂盒及方法，包括检测横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂、引物组合物和探针；该发明基于一步法RT-PCR和qRT-PCR技术，检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的试剂盒，可用于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。
发明内容
本发明的目的在于提供横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用，对横纹肌肉瘤检测灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了横纹肌肉瘤检测引物探针组，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物A1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物A1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针A1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物A2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物A2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针A2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物B1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物B1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针B1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物B2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物B2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针B2-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物B3-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的引物B3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针B3-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的引物C1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物C1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针C1-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物D1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的引物D1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针D1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的引物D2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物D2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针D2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物E1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的引物E1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的探针E1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的引物E2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的引物E2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的探针E2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的引物F1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的引物F1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的探针F1-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的引物G1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的引物G1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的探针G1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的引物G2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的引物G2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的探针G2-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的引物G3-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的引物G3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的探针G3-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的引物H1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的引物H1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的探针H1-P。
优选的，所述探针的5'端标记有报告基团；
和/或，所述探针的3'端标记有淬灭基团。
优选的，所述报告基团选自FAM、VIC、ROX、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3中的一种或几种；
所述野生型探针的报告基团与所述突变型探针的报告基团不同。
优选的，所述淬灭基团选自NFQ-MGB、BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA中的一种或几种。
优选的，所述探针进行了锁核酸修饰。
优选的，由探针序列5’端起算，所述探针F1-P的第4个碱基进行了锁核酸修饰。
本发明还提供了上述引物探针组在制备检测横纹肌肉瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述引物探针组。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括如下基因中的一种或几种：
核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的PAX3-FOXO1融合基因A；
核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示的PAX3-NCOA1融合基因B；
核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的NSD3-FOXO1融合基因C；
核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示的SRF-NCOA2融合基因D；
核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示的VGLL2-NCOA2融合基因E；
核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示的突变型MYOD1基因基因F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示的EWSR1-TFCP2融合基因G；
核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的MEIS1-NCOA2融合基因H。
本发明还提供了上述引物探针组，或上述试剂盒在制备横纹肌肉瘤诊断试剂或预后试剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明设计了通过多重荧光PCR检测RMS亚型特征变异基因的8种引物探针组，覆盖的变异类型多，可以用于检测多达15种RMS亚型特征性基因变异类型，也可分别用于检测腺泡型RMS、先天性/婴儿型梭形细胞RMS、MYOD1突变型梭形细胞硬化性RMS和骨内梭形细胞RMS的特征变异，可以任意选择和组合，既可以用于已知变异类型的样本，也可以用于未知变异类型的样本；本发明提供的探针引物组具有高灵敏度，针对融合基因的可检测下限为100个拷贝，针对MYOD1的可检测下限是1%突变量，具有高特异性，检测范围内的扩增曲线线性特征良好，结果易判读。
附图说明
图1为PAX3-FOXO1融合检测结果图；
图2为PAX7-FOXO1融合检测结果图；
图3为PAX3-NCOA1融合检测结果图；
图4为PAX3-NCOA2融合检测结果图；
图5为PAX3-INO80D融合检测结果图；
图6为NSD3-FOXO1融合检测结果图；
图7为SRF-NCOA2融合检测结果图；
图8为TEAD1-NCOA2融合检测结果图；
图9为VGLL2 Exon 2-NCOA2 Exon13融合检测结果图；
图10为VGLL2 Exon 2-NCOA2 Exon14融合检测结果图；
图11为MYOD1突变检测结果图；
图12为EWSR1-TFCP2融合检测结果图；
图13为FUS-TFCP2融合检测结果图；
图14为EWSR1-UBP1融合检测结果图；
图15为MEIS1-NCOA2融合检测结果图；
图16为PAX3-FOXO1融合阳性病例结果图；
图17为PAX7-FOXO1融合阳性病例结果图；
图18为VGLL2-NCOA2融合阳性病例结果图；
图19为TFCP2重排阳性病例结果图；
图20为MYOD1 L122R突变病例结果图。
具体实施方式
本发明提供的引物探针组包括如下组合：
引物探针组A检测涉及腺泡型横纹肌肉瘤中PAX3第7外显子、PAX7第7外显子与FOXO1第2外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1~6所示；
引物探针组B检测涉及腺泡型横纹肌肉瘤中PAX3第6外显子、第7外显子与非FOXO1伙伴基因的融合，包括NCOA1 外显子15、NCOA2 外显子12与INO80D外显子9，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7~15所示；
引物探针组C检测涉及腺泡型横纹肌肉瘤中NSD3第8外显子与 FOXO1第2外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16~18所示；
引物探针组D检测涉及先天性梭形细胞横纹肌肉瘤中NCOA2重排，包括SRF第6外显子与NCOA2第12外显子或TEAD1第8外显子与NCOA2 第13外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19~24所示；
引物探针组E检测涉及先天性梭形细胞横纹肌肉瘤中VGLL2重排，包括VGLL2第2外显子和NCOA2第13外显子、第14外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQID NO.25~30所示；
引物探针组F检测涉及MYOD1突变型梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤中MYOD1基因p.L122R突变，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.31~33所示；
引物探针组G检测涉及骨内梭形细胞横纹肌肉瘤中TFCP2和UBP1重排，包括EWSR1基因的第5与TFCP2基因第2外显子、FUS基因第6外显子与TFCP2基因第2外显子和EWSR1基因第6外显子与UBP1基因第2外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ IDNO.34~42所示；
引物探针组H检测涉及骨内梭形细胞横纹肌肉瘤中MEIS1第6外显子与NCOA2第12外显子的基因融合，其中包含的引物探针核苷酸序列如SEQ ID NO.43~45所示。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
对RMS检测的目标基因和变异位点进行选择，结果如下表1所示：
表1 RMS检测的目标基因和变异位点
针对上述目标基因和变异位点，进行引物探针组的设计，如下表2-1、表2-2和表2-3所示：
表2-1 引物探针序列①
表2-2 引物探针序列②
表2-3 引物探针序列③
注：表中，序列括号内+代表锁核酸修饰。
配制试剂盒，包括上述表2中的引物探针组、标准品、缓冲液、和对照品，对照品具体组成如下表3所示：
表3 各管反应体系（20 μL为例）
注：其中2×探针法qPCR反应缓冲液含有Taq酶、Mg2+、PCR缓冲液、dNTPs和水。
试剂盒中还设置有阴性对照和阳性对照。其中，阴性对照为纯水，阳性对照为融合基因质粒（反应管A~E和G、H，10000 copies/μL）或突变质粒和野生型质粒混合物（突变型占比10 %，100000 copies/μL，反应管F）。各管阳性对照对应的基因变异及其核苷酸序列如下所示：
反应管A：PAX3-FOXO1融合，5’-CTGTGTCAGATCCCAGCAGCACCGTTCACAGACCTCAACCGCTTCCTCCAAGCACTGTACACCAAAGCACGATTCCTTCCAACCCAGACAGCAGCTCTGCCTACTGCCTCCCCAGCACCAGGCATGGATTTTCCAGCTATACAGACAGCTTTGTGCCTCCGTCGGGGCCCTCCAACCCCATGAACCCCACCATTGGCAATGGCCTCTCACCTCAGAATTCAATTCGTCATAATCTGTCCCTACACAGCAAGTTCATTCGTGTGCAGAATGAAGGA-3’，如SEQ ID NO.46所示。
反应管B：PAX3-NCOA1融合，5’-GTCTGGTTTAGCAACCGCCGTGCAAGATGGAGGAAGCAAGCTGGGGCCAATCAACTGATGGCTTTCAACCATCTCATTCCCGGGGGGTTCCCTCCCACTGCCATGCCGACCTTGCCAACGTACCAGCTGTCGGAGACCTCTTACCAGCCCACATCTATTCCACAAGGATTACCTGAGCTGGAATTGGAAGCAATTGATAACCAATTTGGACAACCAGGAACAGGCGATCAGATTCCATGGACAAATAATACAGTGACAGCTATAAATCAGAGTAAATCAGAAGA-3’，如SEQ ID NO.47所示。
反应管C：NSD3-FOXO1融合，5’-GGAATTGGTAACAAAACAGAAATAAGTGTCAGGGGGCAAGACAGGCTTATAATTTCTACACCAAACCAGAGAAATGAAAAGCCAACGCAGAGTGTATCATCTCCTGAAGCAACATCTGGTTCTACAGGCTCAGTAGAAAAGAAGCAACAGAGAAGATCAATTAGAACTCGTTCTGAATCAGAGAAATCCACTGAGGTTGTGCCAAAGAAGAAGATCAAAAAGGAGCAGAATTCAATTCGTCATAATCTGTCCCTACACAGCAAGTTCATTCGTGTGCAGAATGAAGGAACTGGAAAAAGTTCTTGGTGGATGCTCAATCCAGAGGGTGGCAAGAGCGGGAAATCTCCTAGGAGAAGAGCTGCATCCATGGACAACAACAGTAAATTTGCTAAGAGCCGAAGCCGAGCTGCCAAG-3’，如SEQID NO.48所示。
反应管D：SRF-NCOA2融合，5’-TGACGCTGCCCGCCACCATCATGACGTCATCCGTGCCCACAACTGTGGGTGGCCACATGATGTACCCTAGCCCGCATGCGGTGATGTATGCCCCCACCTCGGGCCTGGGTGATGGCAGCCTCACCGTGCTGAATGCCTTCTCCCAGGCACCATCCACCATGCAGGTGTCACACAGCCAGGTCCAGGAGCCAGGTGGCGTCCCCCAGGTGTTCCTGACAGCATCATCTGGGACAGTGCAGATCCCTGTTTCAGCAGTTCAGCTCCACCAGCCTGGCAGTGAGCTGGACAACTTGGAGGAGATTTTGGATGATTTGCAGAATAGTCAATTACCACAGCTTTTCCCAGACACGAGGCCAGGCGCCCCTGCTGGATCAGTTGACAAGCAAGCCATCATCAATGACCTCATGCAACTCACAGCTGAAAACAGCCCTGTCACACCTGTTGGAGCCCAGAAAACAGCACTGCGAATTTCACAGAGCA-3’，如SEQ ID NO.49所示。
反应管E：VGLL2-NCOA2融合，5’-AAACTAGCCTATTATTCCAAAATGCAGGAAGCGCAGGAGTGCAATGCCAGCCCCAGCAGCAGTGGCAGCGGCAGCTCCTCATTTTCCAGCCAAACCCCAGCCAGTATAAAAGAGGAAGAAGGCAGCCCAGAGAAAGAGCGCCCACCAGAGGCAGAGTACATCAACTCCCGCTGCGTCCTCTTCACTTATTTCCAGGGGGACATCAGCTCCGTGGTGGATGAACATTTCAGCAGGGCCCTGAGCCAACCCAGCAGCTACTCTCCTAGCTGTACCAGCAGCAAAGCACCAAGGAGCTCTGGGCCCTGGCGAGCTTTTAATAACCCACGACCAGGGCAACTGGGCAGGTTATTGCCAAACCAGAATTTACCACTTGACATCACATTGCAAAGCCCAACTGGTGCTGGACCTTTCCCACCAATCAGAAACAGTAGTCCCTACTCAGTGATACCTCAGCCAGGAATGATGGGTAATCAAGGGATGATAGGAAACCAAGGAAATTTAGGGAACAGTAGCACAG-3’，如SEQ ID NO.50所示。
反应管F：突变型MYOD1基因，5’-CTGAAACCCGAAGAGCACTCGCACTTCCCCGCGGCGGTGCACCCGGCCCCGGGCGCACGTGAGGACGAGCATGTGCGCGCGCCCAGCGGGCACCACCAGGCGGGCCGCTGCCTACTGTGGGCCTGCAAGGCGTGCAAGCGCAAGACCACCAACGCCGACCGCCGCAAGGCCGCCACCATGCGCGAGCGGCGCCGCCGGAGCAAAGTAAATGAGGCCTTTGAGACACTCAAGCGCTGCACGTCGAGCAATCCAAACCAGCGGTTGCCCAAGGTGGAGATCCTGCGCAACGCCATCCGCTATATCGAGGGCCTGCAGGCTCTGCTGCGCG-3’，如SEQ ID NO.51所示。
反应管G：EWSR1-TFCP2融合，5’-GTTATACTACTCCAACTGCCCCCCAGGCATACAGCCAGCCTGTCCAGGGGTATGGCACTGGTGCTTATGATACCACCACTGCTACAGTCACCACCACCCAGGCCTCCTATGCAGCTCAGTCTGCATATGGCACTCAGCCTGCTTATCCAGCCTATGGGCAGCAGCCAGCAGCCACTGCACCTACAAGTGATGTCCTTGCATTGCCCATTTTTAAGCAAGAAGAGTCGAGTTTGCCTCCTGATAATGAGAATAAAATCCTGCCTTTTCAATATGTGCTTTGTGCTGCTACCTCTCCAGCAGTGAAACTCCATGATGAAACCCTAACGTATCTCAATCAAGGACAGTCTTATGAAATTCGAATGCTAGACAATAGGAAACTTGGAGAACTTCCAGAAATTAATGGCAAATTGGTGAAG-3’，如SEQ ID NO.52所示。
反应管H：MEIS1-NCOA2融合，5’-ATGATTCAAGCCATACAAGTATTAAGGTTTCATCTATTGGAATTAGAGAAGGTACACGAATTATGTGACAATTTCTGCCACCGGTATATTAGCTGTTTGAAAGGGAAAATGCCTATCGATTTGGTGATAGACGATAGAGAAGGAGGATCAAAATCAGACAGTGAAGATATAACAAGATCAGCAAATCTAACTGACCAGCCTGGCAGTGAGCTGGACAACTTGGAGGAGATTTTGGATGATTTGCAGAATAGTCAATTACCACAGCTTTTCCCAGACACGAGGCCAGGCGCCCCTGCTGGATCAGTTGACAAGCAAGCCATCATCAATGACCTCATGCAACTCACAGCTGAAAACAGCCCTGTCACACCTGTTGGAGCCCAGAAAACAGCACTGCGAATTTCACAGAGCA-3’，如SEQ IDNO.53所示。
检测使用的反应程序如下表4所示：
表4 扩增反应程序
检测RMS样本的cDNA核酸时，检测结果及其判读标准如下表5-1和表5-2所示：
表5-1 结果判读标准①
表5-2 结果判读标准②
实验例2
对实施例1提供的试剂盒进行性能检测，采用携带各相应变异的质粒做反应标准品，配置成相应浓度的标准品溶液（A、B、C、D、E、G反应管各引物探针组：101、102、103、104、105、106、107拷贝数/μl；F管：50%、20%、10%、5%、2%、1%、0.1%、0%比例的突变型标准品溶于4*10-6ng/μl野生型标准品中），各管检测结果如图1~15所示。图1、图2分别为PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。图3、图4、图5图分别为PAX3-NCOA1、PAX3-NCOA2和PAX3-INO80D融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。图6为NSD3-FOXO1融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。图7、图8为SRF-NCOA2和TEAD1-NCOA2融合基因在103-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是103copies。图9、图10为VGLL2-NCOA2融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。图11示最低可检测出1%比例的MYOD1 L122R基因突变（溶度4*10- 6ng/μl）。图12、图13、图14为EWSR1-TFCP2、FUS-TFCP2及EWSR1-UBP1融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。图15为MEIS1-NCOA2融合基因在102-107copies范围内有良好的扩增曲线，最低检测限是102copies。
实验例3
使用42例真实RMS肿瘤样本(6例胚胎型横纹肌肉瘤，18例腺泡型横纹肌肉瘤，17例梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤和1例多形性横纹肌肉瘤，两个高年资病理医师复审全部组织学切片)测试试剂盒的检测性能，一共检测出了9例PAX3-FOXO1融合，3例PAX7-FOXO1融合，1例VGLL2-NCOA2融合，1例TFCP2融合和7例MYOD1基因突变（表6-1和表6-2）。所有的PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1基因融合均发生在腺泡型横纹肌肉瘤中；除一例胚胎型横纹肌肉瘤发生MYOD1 L122R外，余MYOD1 L122R、NCOA2-VGLL2、TFCP2融合病例均为梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤。此42例肿瘤患者样本的试剂盒检测结果与形态学诊断结果全部吻合，方法学的一致性达到了100%。部分检测结果如图16~20所示。图16为真实病例PAX3-FOXO1融合检测结果，图17为PAX3-FOXO1融合检测结果，图18为VGLL2-NCOA2融合，图19为TFCP2重排，图20为MYOD1 L122R突变检测。
表6-1 42例RMS肿瘤样本检测①
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表6-2 42例RMS肿瘤样本检测②
实施例4
腺泡型横纹肌肉瘤常伴有PAX3/7-FOXO1基因融合。临床上主要采用荧光原位杂交（FISH）方法检测FOXO1基因重排间接反映有无PAX3/7-FOXO1基因融合。使用本试剂盒反应管A检测34例腺泡型RMS样本，结果如表7所示，与金标准荧光原位杂交相比，本方法灵敏性可达100%{10/(10+0)×100%）}，特异性可达100%{24/(0+24)×100%}，准确性可达100%{(10+24)/(20+0+0+24)×100%}，实现了显著更优的效果。
表7 试剂盒反应管A检测结果与金标准对比
实施例5
伴有MYOD1 L122R突变的横纹肌肉瘤患者预后差。临床上通常采用Sanger测序检测MYOD1突变。为了检测本试剂盒的性能，采用上述检测方案，利用本发明提供的试剂盒反应管F和检测方法对62例肿瘤含量大于50%的样本进行了MYOD1突变检测，其中11例为突变型，同时以Sanger测序法为对照。
Sanger测序法：62例肿瘤样本组织石蜡切片（3μm，5-10张/例），采用石蜡样本DNA提取试剂盒进行核酸提取，使用MYOD1基因上游引物5’-CTGAAACCCGAAGAGCACTCGC-3’（如SEQ ID NO.78所示）和下游引物5’-GGATCTCCACCTTGGGCAACC-3’（如SEQ ID NO.79所示）进行核酸扩增，对PCR产物进行Sanger测序，与野生型MYOD1基因序列对比，分析是否发生L122R突变。
检测结果如下表8所示，与金标准Sanger测序相比，本方法灵敏性可达100%{11/(11+0)×100%）}，特异性可达100%{51/(0+51)×100%}，准确性可达100%{(11+51)/(11+0+0+51)×100%}，实现了显著更优的效果。
表8 试剂盒反应管F检测结果与金标准对比
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物A1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物A1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针A1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物A2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物A2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针A2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物B1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物B1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针B1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物B2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物B2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针B2-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物B3-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的引物B3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针B3-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的引物C1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物C1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针C1-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物D1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的引物D1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针D1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的引物D2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物D2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针D2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物E1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的引物E1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的探针E1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的引物E2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的引物E2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的探针E2-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的引物F1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的引物F1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的探针F1-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的引物G1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的引物G1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的探针G1-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的引物G2-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的引物G2-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的探针G2-P；
核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的引物G3-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的引物G3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的探针G3-P；
和/或，所述横纹肌肉瘤检测引物探针组包括如下引物和探针：
核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的引物H1-F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的引物H1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的探针H1-P。
2.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，所述探针的5'端标记有报告基团；
和/或，所述探针的3'端标记有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，所述报告基团选自FAM、VIC、ROX、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3中的一种或几种；
所述野生型探针的报告基团与所述突变型探针的报告基团不同。
4.根据权利要求2所述的横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，所述淬灭基团选自NFQ-MGB、BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，所述探针进行了锁核酸修饰。
6.根据权利要求5所述的横纹肌肉瘤检测引物探针组，其特征在于，由探针序列5’端起算，所述探针F1-P的第4个碱基进行了锁核酸修饰。
7.权利要求1~6任一项所述的引物探针组在制备检测横纹肌肉瘤的试剂或试剂盒中的应用。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~6任一项所述的引物探针组。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括如下基因中的一种或几种：
核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的PAX3-FOXO1融合基因A；
核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示的PAX3-NCOA1融合基因B；
核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的NSD3-FOXO1融合基因C；
核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示的SRF-NCOA2融合基因D；
核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示的VGLL2-NCOA2融合基因E；
核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示的突变型MYOD1基因基因F；
核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示的EWSR1-TFCP2融合基因G；
核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的MEIS1-NCOA2融合基因H。
10.权利要求1~6任一项所述的引物探针组，或权利要求8或9所述的试剂盒在制备横纹肌肉瘤诊断试剂或预后试剂中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811055A (zh) * 2019-01-08 2019-05-28 广州金域医学检验中心有限公司 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
US20200165687A1 (en) * 2017-06-27 2020-05-28 The University Of Tokyo Probe and method for detecting transcript resulting from fusion gene and/or exon skipping
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113416785A (zh) * 2021-07-27 2021-09-21 武汉良培医学检验实验室有限公司 基因标志物组合在制备用于检测儿童实体瘤的探针组合和/或试剂盒和/或系统中的应用
CN113462763A (zh) * 2021-04-21 2021-10-01 四川大学华西医院 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒
CN114686486A (zh) * 2022-04-25 2022-07-01 中南大学湘雅二医院 检测myod1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用
US20230015647A1 (en) * 2019-11-18 2023-01-19 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Inhibitors of histone demethylases (pfi-63 and pfi-90) for the treatment of cancer and for the inhibition of histone demethylase in cells
US20230365637A1 (en) * 2020-09-28 2023-11-16 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200165687A1 (en) * 2017-06-27 2020-05-28 The University Of Tokyo Probe and method for detecting transcript resulting from fusion gene and/or exon skipping
CN109811055A (zh) * 2019-01-08 2019-05-28 广州金域医学检验中心有限公司 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
US20230015647A1 (en) * 2019-11-18 2023-01-19 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Inhibitors of histone demethylases (pfi-63 and pfi-90) for the treatment of cancer and for the inhibition of histone demethylase in cells
US20230365637A1 (en) * 2020-09-28 2023-11-16 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113462763A (zh) * 2021-04-21 2021-10-01 四川大学华西医院 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒
CN113416785A (zh) * 2021-07-27 2021-09-21 武汉良培医学检验实验室有限公司 基因标志物组合在制备用于检测儿童实体瘤的探针组合和/或试剂盒和/或系统中的应用
CN114686486A (zh) * 2022-04-25 2022-07-01 中南大学湘雅二医院 检测myod1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KHIN THWAY等: "The comparative utility of fluorescence in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction in the diagnosis of alveolar rhabdomyosarcoma", VIRCHOWS ARCH, 26 April 2015 (2015-04-26), pages 1 - 8 *
MICHAEL A. ARNOLD等: "Molecular diagnostics in the management of rhabdomyosarcoma", EXPERT REVIEW OF MOLECULAR DIAGNOSTICS, 6 January 2017 (2017-01-06), pages 1 - 7 *
ROBERTA LA STARZA PHD等: "Molecular Cytogenetics Detect an Unbalanced t(2;13)(q36;q14) and PAX3–FOXO1 Fusion in Rhabdomyosarcoma With Mixed EmbryonalAlveolar Features", PEDIATRIC BLOOD & CANCER, vol. 62, no. 12, 14 July 2015 (2015-07-14), pages 2238 - 2241 *

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