CN117887760A - SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型及其构建方法，所述方法包括：获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2；获得有活性的Cas9mRNA；将所述gRNA、Cas9mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体(doner)混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；选择F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选获得SQSTM1/p62基因突变敲入模式小鼠。该方法基因编辑效率高，可表达人SQSTM1/p62突变蛋白。

Description

SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型及其 构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种SQSTM1/p62基因的新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型及其构建方法。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是种进行性四肢无力、致死致残的神经系统变性病，患有肌萎缩侧索硬化症后，首先会从手指开始出现肌无力，慢慢的扩散到其他部位；在肌无力时还会伴随着肌萎缩症状；随着病情的加重，会出现肌束颤动、锥体束征、延髓麻痹等表现；出现肺部感染、呼吸肌麻痹等并发症；有些患者还会伴发额颞叶痴呆。

肌萎缩侧索硬化症的致病基因包括常见的SOD1，C9ORF72等，鉴定ALS致病基因和突变有利于帮助明确该病发病机制。突变致病基因为ALS的精准治疗提供新靶点，有必要开发一种针对新突变致病基因的模型，为进一步研究机制以及针对靶点进行筛选提供小鼠模型。

发明内容

本发明目的是提供一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型及其构建方法，该方法基因编辑效率高，为进一步研究机制以及针对靶点进行筛选提供小鼠模型。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的构建方法，所述方法包括：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2分别体外转录成mRNA，获得活性的gRNA1和gRNA2；

获得有活性的Cas9 mRNA；

获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体；

将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和打靶供体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；

选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得SQSTM1/p62基因敲入模式小鼠。

在本发明的第二方面，提供了一种采用所述的方法获得的SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型。

在本发明的第三方面，提供了所述的SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型在SQSTM1/p62突变蛋白机制研究或者筛选药物中的应用。

在本发明的第四方面，提供了用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的打靶供体(doner)，所述打靶供体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的第五方面，提供了用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的gRNA，所述gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2。

在本发明的第六方面，提供了一种用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的成套核酸分子，所述成套核酸分子包括：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2；

(b)编码Cas9的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；

(c)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体(doner)。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明构建的人源SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型，可将基因敲进效率提高近20倍、且快速、便捷，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用。经检测在SQSTM1/p62基因的新致病突变c.1143delC的基因敲入杂合小鼠模型的脑组织中成功表达野生型和突变型p62蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明提供的敲入小鼠模型的策略图。敲入突变位点位于小鼠Sqstm1基因第7外显子，cDNA序列为1149位碱基。

图2为F1代野生型和突变小鼠Sqstm1基因突变位点附近Sanger鉴定的测序图。其中，图2a为野生型的结果，图2b为杂合变异的突变小鼠的结果，与野生型相比，突变小鼠该位点缺失C，导致下游出现移码套峰。

图3为F1代小鼠的脑Sqstm1蛋白表达水平鉴定图。与野生型小鼠相比，突变杂合小鼠半量表达正常Sqstm1蛋白和截短Sqstm1蛋白。

图4为F1代小鼠的脊髓TDP43的免疫荧光染色图。与野生型小鼠相比，突变杂合小鼠的TDP43向细胞质转移增加，证明其磷酸化水平增加，符合ALS小鼠的病理特征。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

术语解释

Wild type allele(WT)：即野生型小鼠；

Targeted allele：即通过受精卵注射得到阳性小鼠，或者F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配获得的F1代阳性杂合子小鼠。

0SQ32：指小鼠的编号，编号原则为：0，指F0代；SQ，指本课题编号的缩写；32，指剪尾编号

为解决上述技术问题，本发明技术方案的总体思路如下：

本申请发明人通过开展实验首次发现在ALS队列基因筛查中检测到1例SQSTM1突变(p.L382CfsTer13)病人，病人表现为典型的上下运动神经元损害，为确诊的ALS病例。突变位于7号外显子，该位点在不同种属里高度保守，所述位点突变为chr5:179260760：c.1143del，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，与SQSTM1/p62基因如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列相比，第1143位的C被删除，导致第382位的亮氨酸变为终止密码，从而产生一个移码突变，使得后面的13个氨基酸发生改变。该突变既往没有报道。在gnomeAD、ExAC等数据库中没有频率报道，生物信息学预测有害，ACMG提示可能致病，预测将产生提前终止的SQSTM1/p62蛋白。并通过家系连锁分析证实了该突变和肌萎缩侧索硬化症表型的相关性；该突变导致编码序列移码、并提前出现终止密码，最终使得ALS发病机制中有重要作用的SQSTM1蛋白产生无义介导的mRNA降解或蛋白截短体，通过单倍型不足或显性负效应致病(具体见实施例1)。

为了进一步研究机制以及针对靶点进行筛选，有必要提供一种小鼠模型。由于该1143delC的人SQSTM1/P62基因突变，小鼠的突变序列为c.1149delC，位于第7号外显子，基因敲入小鼠模型的设计方案如下：

敲入基因名称(NCBI号)：8878；

敲入基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8878；

方案针对的转录本(Ensembl号)：SQSTM1-202(ENST00000389805.9)；

KI片段名称及插入位置：本发明在SQSTM1-202(ENST00000389805.9)转录本的exon7制作对应第1149位的C被删除，从而构成一个移码突变，翻译出截短的Sqstm1蛋白。

利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对靶位点进行基因修饰。具体过程如下：设计并体外转录gRNA，同时直接合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体，并将其体外转录为Donor序列。将Cas9、gRNA、Donor序列同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，Donor通过同源重组修复断裂的双链，从而实现对靶位点的基因修饰(具体见实施例2)。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种人源性SQSTM1/p62转基因小鼠模型的构建方法进行详细说明。

实施例1、肌萎缩侧索硬化症的SQSTM1的p.L382CfsTer13突变致病基因

一、肌萎缩侧索硬化症的SQSTM1的p.L382CfsTer13突变致病基因的发现

1、获取生物样品

男性病人56岁起病，无变性病家族史。肌无力是从双上肢开始，而后缓慢进展至四肢。神经科查体：神清语利，MMSE 30/30分，四肢肌力减退，腱反射活跃，双Babinski征+。肌电图提示广泛神经源性损害。血、腰穿脑脊液、全身筛查均未找到炎症、肿瘤等其它疾病的证据，确诊ALS。症状缓慢进展，起病53个月仍可生活自理。

2、DNA提取

提取外周血单个核细胞，用DNA分离试剂盒(Blood DNAKit V2,#CW2553)提取DNA。

3、构建文库并测序

用Covaris破碎机将基因组DNA随机破碎并剪切成长度为180-280bp的片段。使用Bioruptor UCD-200(Diagenode)、KAPA文库制备试剂盒(Kapa Biosystems,#KR0453)和SureSelect XT2靶标富集系统(Agilent)制备文库。使用Illumina NovaSeq平台进行DNA文库测序，使用Illumina序列控制软件(SCS)进行下游分析。只有当读取深度大于或等于10时才保留变异。用Burrows-Wheeler比对工具将高质量读数与USCS人类基因组(build 37.1version hg19)进行比对。

基因组分析工具包(GATK)和ANNOVAR(版本：2016-05-1110:54:48-0700)用于变异调用和注释。使用标准的重复引物PCR对所有受试者进行C9ORF72重复扩增筛查。在gnomeAD和Exome Aggregation Consotium(ExAC)中初步确定了变异频率，以去除常见的单核苷酸多态性(SNPs)。只有小等位基因频率(MAF)<0.5％或在人群数据库中不存在的非同义点突变、剪接突变和移码突变才被选作进一步评估。

测序结果如SEQ ID NO.6所示，可知患者在c.1143存在碱基C的缺失，且该位点为杂合变异。

二、SQSTM1/p62基因p.L382CfsTer13位点突变与肌萎缩侧索硬化症相关

1、为了确认这些变异在中国人群中的频率，我们还检查了这些罕见变异在中国健康人群中的频率。通过SIFT(https://sift.bii.a-star.edu.sg/www/SIFT4G_vcf_submit.html)、PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)等三种在线软件评估变异的有害效应。

参照《ACMG遗传变异分类标准与指南》，其中，PM2、BS1为变异频率及对照人群的使用的评级指标，PP3、BP4为生物信息分析数据使用的指标。PM2为ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异的指标。BS1为等位基因频率大于疾病发病率的指标。PP3为多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，包括保守型预测、进化预测、剪接位点影响等。BP4为多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物无影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等。

评估指标为：

(1)人群频率

PM2：与基因相关的疾病患病率相比，等位基因频率在对照数据库中极为罕见，低于此阈值的变异可能具有致病性。

BS1：对照数据库中的等位基因频率高于与基因相关疾病的预期，高于此阈值的变异更有可能是良性的。

(2)有害效应

PP3：与基因相关的疾病患病率相比，等位基因频率在对照数据库中极为罕见，高于此阈值变异可能具有致病性。

BP4：对照数据库中的等位基因频率高于与基因相关的疾病的预期。低于此阈值的变异株更有可能是良性的。

2、潜在的ALS致病变异通过Sanger测序得到确认。根据美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)的变异解释指南，对变异进行分类(致病性、可能致病性、不确定意义、可能良性和良性)。应用SWISS-MODEL预测导致蛋白结构变化。

检出SQSTM1；chr5:179260735:c.1118dup(p.L382CfsTer13)变异，没有该变异的相关报道。根据ACMG指南(附录)，该变异被判断为疑似致病变异，PVS1+PM2证据如下：

PVS1:当一个疾病的致病机制为功能丧失(LOF)时，检出变异为无功能变异(无义突变、移码突变、经典±1或2的剪接突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失)。

PM2:ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异(或隐性遗传病中极低频位点)

该位点经过生物信息学分析，可以确认新突变致病位点p.L382CfsTer13为肌萎缩侧索硬化症候选标志物。

实施例2、人SQSTM1/p62基因的新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的构建

1、设计gRNA如表1所示。

表1

gRNA名称	gRNA序列(5’-3’)	PAM
			gRNA1	GGCAGCTTCCTTCAGCCCTG(SEQ ID NO.2)	TGG
gRNA2	GTCACTGCAGGCAAGCCACC(SEQ ID NO.3)	TGG

2、gRNA的显微注射RNA的制备

先将gRNA的序列连入带T7启动子的PT7-4G质粒载体上，然后将质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增T7启动子及gRNA核苷酸序列，最后以该PCR产物为模板进行体外转录，得到gRNA1、gRNA2的显微注射RNA；

并且其制备时反应条件为65℃下反应5min，RNA电泳图表示gRNA在所需浓度下成功转录。

3、Donor的显微注射RNA的制备；

合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体(Donor)。

表2-构建小鼠模型所用序列

4、样品体外转录：Cas9表达质粒(Addgene No.44758)，经AgeⅠ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录；依照T7 Ultra Kit(Ambion，AM1345)试剂盒，体外利用T7 RNA聚合酶合成Cas 9mRNA。

5、F0代小鼠的制备；

Cas9/sgRNA及donor的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA和纯化后的donor片段混合并调整浓度为20ng/μl的Cas9 mRNA，10ng/μl的sgRNA(gRNA1：gRNA2＝1:1)和50ng/μl的donor片段，使用TE2000U显微注射仪将混合物显微注射到C57BL/6小鼠受精卵的原-核和细胞质中，再将受精卵移植到假孕的C57BL/6母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。

6、F0代小鼠基因型检测：

本发明采用Cas9/gRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体；故以F0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠鼠尾检测后确定。

经受精卵显微注射，胚胎移植，获得F0小鼠。通过PCR，测序确认，共获得如下同源重组的阳性F0代小鼠。

表3

对F0代小鼠鼠尾基因型进行鉴定，通过PCR产物和测序表明32#为阳性F0代小鼠。

7、F1代小鼠的制备；

选择F0代小鼠鼠尾基因型鉴定结果中阳性小鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠。

PCR引物如表4所示，测序引物如表5所示。

表4

表5

引物名称	引物序列(5’-3’)	引物说明
			Sqstm1-PCR-F1	taactcatcatacagctggcg(SEQ ID NO.9)	TM产物测序

PCR反应液组成：

Premix Taq(LA Taq Version 2.0plus dye)25μl

模板*Xμl

引物1(20μM)1μl

引物2(20μM)1μl

灭菌水Up to 50μl

【50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量】

人基因组DNA 0.1μg～1μg

PCR反应条件：

98℃10sec

55℃or 60℃30sec

72℃1min/kb

PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在实际操作中需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物的长短等具体情况，设定合适的反应条件(温度、时间等)。经PCR和测序确认，30#，31#，38#小鼠为阳性F1代小鼠。阳性F1代小鼠信息如下：

表6

ID

Gender

color

Gty

DOB

Gen

F/M

30

雌

B

KI/wt

2023/04/13

F1

C57BL/6J/17#

31

雌

B

KI/wt

2023/04/13

F1

C57BL/6J/17#

38

雌

B

KI/wt

2023/04/13

F1

C57BL/6J/17#

提取上述PCR鉴定为阳性的F1代小鼠鼠尾DNA进行测序，检测结果如图2所示。检测结果表明：30#，31#，38#小鼠为正确重组，且没有随机插入；同时，通过对突变鼠脑组织检测，确认表达突变截短蛋白(图3)，提示模型构建成功。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2分别体外转录成mRNA，获得活性的gRNA1和gRNA2；

获得有活性的Cas9 mRNA；

获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体；

将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和打靶供体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；

选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得SQSTM1/p62基因敲入模式小鼠。

2.根据权利要求1所述的一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的一种SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和打靶供体的添加浓度比为1：1：(2-3)：(4-6)。

4.一种采用权利要求1-3任一所述的方法获得的SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型。

5.权利要求4所述的SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型在SQSTM1/p62突变蛋白机制研究或者筛选药物中的应用。

6.用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的打靶供体，其特征在于，所述打靶供体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的gRNA，其特征在于，所述gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2。

8.一种用于构建SQSTM1/p62基因新致病突变c.1143delC的敲入小鼠模型的成套核酸分子，其特征在于，所述成套核酸分子包括：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA1和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的gRNA2；

(b)编码Cas9的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示；

(c)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体。