CN110066877A - Y染色体str荧光标记复合扩增系统及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒，其中，Y染色体STR荧光标记复合扩增系统包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物，27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点。由于结合了低突变位点和高突变位点的各种优势，在维持低突变率的前提下增加了对男性个体的识别率，具有较高的分辨率及灵敏度，对低浓度的DNA模板能够进行完整准确的分型；另外，27个位点参考炎黄基因组和人类基因组数据，选择了黄种人﹑白种人和黑种人的特征位点，其中包含了公安Y‑STR建库家系排查所有位点，使得本Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒能够用于家谱构建或溯源及基于男性犯罪的建库排查等。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeats,STR)又称微卫星，是由2～6个碱基构成的核心单元串联重复形成，在人类基因组中分布广泛，约占整个基因组的10％，且遗传多态性高，是目前用于个体识别，亲缘鉴定和群体遗传学研究最广泛的遗传标记。与其他遗传标记相较，STR位点片段小，易于扩增，适用于微量和降解检材，此外各位点能同时进行复合扩增，具有信息量大，灵敏，准确，快速及高效等优点。基于上述优点，STR位点在国内外人类遗传学，法医学，医学遗传学等相关领域得到广泛的应用，尤其是在建立人类DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性，且是众多国家的主流技术。
Y染色体STR遗传标记是Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，已发现并以各种形式命名的Y-STR位点可达220多种。与常染色体STR遗传标记不同，Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征。Y-STR检验作为常染色体的一种补充手段，在男性家系排查，父系亲权鉴定及一些男性犯罪案件中男女混合样本中男性成分的鉴定具有重要价值。因此，Y-STR检测在DNA鉴定中也扮演着越来越重要的角色。
然而，不同的Y-STR位点突变速率并不一样，法医上往往将突变率高于1％的Y-STR位点称为快速突变位点，这类位点一般具有较高的多态性，从而具有较高的相关男性区分能力，但位点突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排查，造成同系异型的现象。
为此，结合快速突变位点及低突变率位点各自优势，开发出既能满足Y-STR数据建库又对男性近亲具有较高识别度的试剂盒具有重要意义。
目前国内外的试剂盒如下：
(1)国外:具有代表性的为AB公司的Yfiler Plus，该试剂盒采用6色荧光标记，包含27个位点；Promega公司的Y23，采用5色荧光标记，包含23个位点；QIAGEN的Investigator Argus Y-12QS Kit采用4色荧光标记，包含12个位点。
(2)国内：基点认知的Goldeneye 26Y，采用5色荧光标记，包含26个位点；阅微基因的MicroreaderTM24Y Direct ID System，采用5色荧光标记，包含24个位点；中德美联的AGCU Data Y24，采用5色荧光标记，包含24个位点等。
目前国内外的试剂盒具有如下缺点：
(1)国外：试剂盒成本高且价格昂贵，包含位点数少，可涵盖的遗传信息量少。
(2)国内:包含位点少，灵敏度不高，不适合较低模板量下样本的分析。
发明内容
本申请提供一种位点多，灵敏度高，并适用于低模板量下样本的分析的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒。
根据第一方面，一种实施例中提供一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物，27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点，20个低突变位点分别为：DYS460﹑DYS456﹑DYS385a、DYS385b﹑DYS481﹑DYS390﹑DYS439﹑DYS448﹑DYS438﹑DYS533﹑DYS389I、DYS389II﹑DYS635﹑DYS392﹑DYS391﹑DYS437﹑Y_GATA_H4﹑DYS393﹑DYS458和DYS19，7个高突变位点分别为DYF387S1a、DYF387S1b﹑DYS449﹑DYS627﹑DYS576﹑DYS570和DYS518，其中DYS385a与DYS385b、DYS389I与DYS389II、及DYF387S1a与DYF387S1b对应的引物相同。
进一步地，27个位点对应的引物序列如下：
DYS437位点对应的引物序列：TCATTCACAGATGATAGATGA，GCTGGGACTATGGGCGTGAGTGC；
Y_GATA_H4位点对应的引物序列：TTCCAAATTTAAGATAGATAGATAG，ATCTATGTATCTATCTATCTATCTATTC；
DYS570位点对应的引物序列：GTGGCAACCTAAGCTGAAATGC，CCATTAAACTTCAGTTATGTGAC；
DYS518位点对应的引物序列：ATGGGTGATTTCTTTCTTTTC，GGCAACACAAGTGAAACTGCTTC；
DYS393位点对应的引物序列：GCCTCCCCGACCATGTGGCTG，AATAAAGTCATATCAGCTGCATAAT；
DYS458位点对应的引物序列：GAGTCAAGATTGAGCCATTGCACTGC，TGCAGTGGCAGAATCTCAGC；
DYS19位点对应的引物序列：TAACTCTCAAGCAAAAATTGA，TTTTGATTTCACTATGACTACTGAG；
DYS481位点对应的引物序列：GTGGCTAACGCTGTTCAGCATGCTG，AGACAGCTCACCAGAAGGTTGCAAGAC；
DYS390位点对应的引物序列：GAGAAATGGATGACAGTAAAATG，TGGTACCCCATAATATATTCTATC；
DYS439位点对应的引物序列：CTTCTCGAGTTGTTATGGTTTTAG，TACAGGCATAATCCACCATGCC；
DYS448位点对应的引物序列：GAGATCGCGAGACAGAAAGG，AGGTTATTTCTTGATTCCCTGTG；
DYS627位点对应的引物序列：AACATAATTCAAAAACCATGTGGA，AATGCCACTGCACTCCACCCTAG；
DYS438位点对应的引物序列：GCAAGCCATTAAGGAAATTGTC，GCTTGAACCTGGGAAGTGGAGGTTG；
DYS533位点对应的引物序列：CTTCTACCTATCATCTTTCTAGCTAGC，TAACTCAACCAAACAATAGAAG；
DYS389I与DYS389Ⅱ位点对应的引物序列：CCAACTCTCATCTGTATTATCTATG，CACAATTATCCCTGAGTAGCAG；
DYS635位点对应的引物序列：TGAAGACACTTGCACATACATTG，TTCTCACTTTGCATAGAATCTC；
DYS392位点对应的引物序列：GTAGTCTGGAAATATCTCAAAGAAG，TGATCTTGCAACATCTCCATCCATG；
DYS391位点对应的引物序列：CATTCATTCCTGTATACCTAACCT，AGGGTTTCTTGGCTTCAGTACTAG；
DYS576位点对应的引物序列：TTTTTAATGTATGAGCAAGAATATCCTAG，CCAACACCATGATTCAATTACCTTC；
DYS460位点对应的引物序列：GCCTATCATTTATTATGTATTTGTC，TAGCAAGCACAAGAATACCAGAGG；
DYS456位点对应的引物序列：CTCCTCAGCCTGCAGATGGTC，TTCTTAAACTGATGTATTAGGGTTC；
DYF387S1a与DYF387S1b位点对应的引物序：GACAGAGCTAGATTCCATTTTACC，AAGTGTGAGAAGTGCTACCACAG；
DYS449位点对应的引物序列：GAATATTTTCCCTTAACTTGTGTG，ATTGCACCATTGCACTCTAGGTTG；
DYS385a与DYS385b位点对应的引物序列：AGCATGGGTGACAGAGCTA，AAACTTTATTGGGATGCTAGGTAA；
其中，一个位点对应一对引物，引物序列的前端为5’端，后端为3’端。
进一步地，DYS437至DYS385a与DYS385b位点对应引物的浓度分别为：0.20μM、0.26μM、0.14μM、0.24μM、0.11μM、0.15μM、0.63μM、0.20μM、0.12μM、0.14μM、0.11μM、0.18μM、0.19μM、0.16μM、0.22μM、0.13μM、0.12μM、0.14μM、0.13μM、0.15μM、0.13μM、0.28μM、0.25μM、0.21μM。
进一步地，2 7个位点根据扩增产物片段大小分为四组，第一组位点包括DYS437、Y_GATA_H4、DYS570、DYS518、DYS393、DYS458和DYS19；第二组位点包括DYS481、DYS390、DYS439、DYS448、DYS627和DYS438；第三组位点包括DYS533、DYS389I、DYS389II、DYS635、DYS392、DYS391和DYS576；第四组位点包括DYS460、DYS456、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS449、DYS385a和DYS385b。
进一步地，2 7个位点在一个复合扩增反应体系中同时扩增。
进一步地，与四组位点对应的引物标记用不同颜色的荧光标记，与同组位点对应的引物标记用相同颜色的荧光标记，并且在一对引物中一个引物的5’端用荧光标记。
进一步地，与第一组位点对应的引物标记用蓝色荧光素6’-FAM，与第二组位点对应的引物标记用绿色荧光素HEX，与第三组位点对应的引物标记用黄色荧光素TAMRA，与第四组位点对应的引物标记用红色荧光素ROX。
根据第二方面，一种实施例中提供一种基于上述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统的试剂盒，包括缓冲液、引物混合物、Taq聚合酶、DNA模板和无核酸酶水，其中，引物混合物包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物序列。
进一步的，DNA模板包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和羊水。
根据第三方面，一种实施例中提供一种同时分析DNA模板的方法，采用上述Y染色体STR荧光标记复合扩增系统检测DNA。
依据上述实施例的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒，由于针对Y染色体上27个位点设计引物，27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点，从而结合了低突变位点和高突变位点的各种优势，在维持低突变率的前提下增加了对男性个体的识别率，具有较高的分辨率及灵敏度，对低浓度的DNA模板能够进行完整准确的分型；另外，27个位点结合炎黄基因组和人类基因组数据，选择了黄种人﹑白种人和黑种人的特征位点，其中包含了公安Y-STR建库家系排查所有位点，使得本Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒能够用于家谱构建或溯源及基于男性犯罪的建库排查等。
附图说明
图1为各位点在染色体上的排布示意图；
图2为本发明试剂盒对标准品9948的分型图。
图3a为本发明试剂盒对样本1的Y-STR分型图；
图3b为本发明试剂盒对样本2的Y-STR分型图；
图3c为YfilerPlus试剂盒分别样本1的Y-STR分型图；
图3d为YfilerPlus试剂盒分别样本2的Y-STR分型图；
图4为本发明试剂盒对模板量为0.1ng的DNA样本的Y-STR分型图。
具体实施方式
在本发明实施例中提供了一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统及试剂盒，本荧光标记复合扩增系统能够同时扩增分析27个STR位点的炎黄染色体分型。
在发明的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物。27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点，20个低突变位点分别为：DYS460﹑DYS456﹑DYS385a、DYS385b﹑DYS481﹑DYS390﹑DYS439﹑DYS448﹑DYS438﹑DYS533﹑DYS389I、DYS389II﹑DYS635﹑DYS392﹑DYS391﹑DYS437﹑Y_GATA_H4﹑DYS393﹑DYS458和DYS19，7个高突变位点分别为DYF387S1a、DYF387S1b﹑DYS449﹑DYS627﹑DYS576﹑DYS570和DYS518，其中，上述27个位点在Y染色体上分布如图1所示。
本复合扩增系统能够实现对27个位点同时一次性扩增进行检测分析，在满足了Y-STR数据建库要求的同时，更提高了对男性近亲的辨识度。另外，本发明分型系统灵敏度高，对低浓度的DNA模板量依然能进行完整而准确的分型(最低检测限度为0.1ng)。本复合扩增系统可应用于家谱构建或溯源及基于男性犯罪的建库排查等。
上述27个位点中每个位点对应设计一对引物，各位点被位于该位点两侧的一对引物扩增，其中DYS385a与DYS385b、DYS389I与DYS389II、及DYF387S1a与DYF387S1b对应的引物相同，即总共包括24对引物。
引物为针对上述27个Y-STR位点在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用PrimerPrimier5和Oligo7软件，每条引物退火温度在60℃左右，不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在70-500bp之间。再进行复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。最终设计的引物序列，编号及浓度见下表1：
表1.本发明复合扩增体系各位点引物信息
上表中引物序列的左端为前端(左端)为5’端，后端(右端)为3’端。
为了对检测及标记，将2 7个位点根据扩增产物片段大小分为四组，第一组位点包括DYS437、Y_GATA_H4、DYS570、DYS518、DYS393、DYS458和DYS19；第二组位点包括DYS481、DYS390、DYS439、DYS448、DYS627和DYS438；第三组位点包括DYS533、DYS389I、DYS389II、DYS635、DYS392、DYS391和DYS576；第四组位点包括DYS460、DYS456、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS449、DYS385a和DYS385b。
四组位点对应的引物分别采用四种不同颜色荧光标记，同组位点对应的引物采用同一种颜色的荧光标记。具体的，上述四种位点对应的引物分别采用6’-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)及羧基-X-罗丹明(ROX)进行标记，其中，FAM为蓝色荧光素，HEX为绿色荧光素，TAMRA为黄色荧光素，ROX为红色荧光素，并且标记在每对引物中一个引物的5’端。
设计的引物还需满足下述要求：每组之中各位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个位点不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
本发明中还提供了一种试剂盒，本试剂盒基于上述Y染色体STR荧光标记复合扩增系统。本试剂盒包括缓冲液、引物混合物、Taq聚合酶、DNA模板和无核酸酶水。
其中，引物混合物包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物序列(见表1)。
缓冲液中包括25mM DMSO、125mM KCl、25mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)、50mM MgCl2、0.25mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.5mM的dNTP混合物。dNTP混合物是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
DNA模板是从人类的血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等中提取的DNA，提取方法为各种常规法，例如磁珠法、树脂纯化法，酚氯仿法等。DNA模板量优选在0.2至5ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些位点检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
Taq聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以，本发明的每个扩增体系(25μL)需要1U至2U的Taq聚合酶。
本发明的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统的检测DNA的方法步骤如下：
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)采用以下的温度循环条件可以得到较好的结果：91℃预变性1分钟；95℃变性3秒钟，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒钟，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。
本发明采用荧光标记引物，在上述复合扩增体系按上述程序进行扩增后得到带有荧光标记的各位点扩增产物混合物，该荧光标记物在激光激发下可发出被测序仪或遗传分析仪(ABI 3130、3100、3500等)识别的光信号，因此上述扩增产物可通过测序仪或遗传分析仪进行检测分析。
在利用测序仪或遗传分析仪进行检测时复合扩增产物需要与甲酰胺、分子量内标按一定的比例进行混合变性后再进行毛细管电泳分离，其中分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的DNA片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。
电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析得到STR基因分型图谱和数据。该分型图谱和数据可用于DNA的对比识别，从而可应用于家谱构建或溯源及基于男性犯罪的建库排查等。
本发明的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统具有如下优点：
1、兼容性好：结合了炎黄基因组及人类基因组数据，选择了适合黄种人﹑白种人及黑种人的特征位点。
2、分辨率高：同时包含了20个低突变率及7个高突变率的Y-STR位点，包含了公安Y-STR数据库建立要求的所有位点，因此，该发明不仅满足了多人Y-STR建库家系排查，同时提高了男性个体的识别能力，尤其男性近亲的个体识别，在一些男性犯罪案件中对嫌疑犯的排查具有重要的意义。
3、有较高的检材适应性：能对多种利用chelex100﹑磁珠法或树脂纯化法等提取的人类DNA﹑血液﹑血滤纸﹑精斑及口腔拭子等进行扩增检测。
4、适用范围广：兼容AB Yfiler Plus试剂盒所有位点，并采用四色荧光标记，适用于更多遗传分析仪。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
本实施例提供了一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，本复合扩增系统重点在于包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物，27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点。
引物的设计基于Y染色体上27个位点的筛选，27个位点的筛选原理如下：
通过对市场上常用Y染色体STR分型试剂盒中常用位点DYS19﹑DYS385a/b﹑DYS387S1a/b﹑DYS388﹑DYS389Ⅰ/Ⅱ﹑DYS390﹑DYS391﹑DYS392﹑DY393﹑DYS437﹑DYS438﹑DYS439﹑DYS444﹑DYS447﹑DYS448﹑DYS449﹑DYS456﹑DYS458﹑DYS460﹑DYS481﹑DYS518﹑DYS522﹑DYS527a/b﹑DYS533﹑DYS549﹑DYS570﹑DYS576﹑DYS627﹑DYS635﹑DYS643﹑Y_GATA_H4和Y_GATA_A10共36个Y-STR位点的多态性及突变率的研究，同时考虑到公安建库要求位点：DYS19﹑DYS385a/b﹑DYS387S1a/b﹑DYS389Ⅰ/Ⅱ﹑DYS390﹑DYS391﹑DYS392﹑DY393﹑DYS437﹑DYS438﹑DYS439﹑DYS448﹑DYS449﹑DYS458﹑DYS460﹑DYS481﹑DYS518﹑DYS533﹑DYS576﹑DYS635和Y_GATA_H4。
为了既能满足Y-STR建库家系排查要求，同时提高男性个体的识别能力，尤其男性近亲的个体识别，最终选择了27个Y染色体STR位点：DYS19﹑DYS385a/b﹑DYS387S1a/b﹑DYS389Ⅰ/Ⅱ﹑DYS390﹑DYS391﹑DYS392﹑DY393﹑DYS437﹑DYS438﹑DYS439﹑DYS448﹑DYS449﹑DYS456﹑DYS458﹑DYS460﹑DYS481﹑DYS518﹑DYS533﹑DYS570﹑DYS576﹑DYS627﹑DYS635和Y_GATA_H4，其中包含20个低突变率及7个高突变率的Y-STR位点，且包含公安建库要求的所有位点。
筛选好27个Y染色体STR位点后，再通过软件设计出对应的引物序列，引物序列见表1。
实施例二：
本实施例提供了一种试剂盒，本试剂盒以对标准品9948的基因分型为例进行说明。
试剂盒包括缓冲液、引物混合物、Taq聚合酶和无核酸酶水，在试剂盒中加入标准品9948的基因作为DNA模板。
标准品9948(10ng/ul)购买于新海生物科技股份有限公司，利用本发明试剂盒对上述样本进行扩增，扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用IDx软件，并对两个试剂盒的分型结果进行比较。本发明所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标、等位基因ladder均为本领域技术人员常用的常规材料。
本实施例的试剂盒分型包括如下步骤：
S001：稀释标准品DNA；
标准品DNA原液浓度为10ng/ul，将其稀释至1ng/ul用于后续实验。
S002：荧光标记引物混合物配制；
(1)将引物干粉中加入定量TE缓冲液中，配成100μM母液，然后各位点正反向引物等体积混合；
(2)再将27个位点的正反向引物混合物按表1配制成引物混合物。
S003：聚合酶链式反应(PCR)扩增；
(1)取缓冲液、引物混合物(引物终浓度见表1)、Taq聚合酶，按照表2配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入DNA模板。
表2试剂盒组分
(2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(G1000)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。
表3复合扩增热循环条件
扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测。电泳结果用IDx软件进行分析，本发明试剂盒对标准品9948的基因分型结果见表4，并如图2所示，该分型结果与目前众多试剂盒及资料中公布的一致。
表4本发明试剂盒对标准品9948的Y-STR分型结果
实施例三：
本实施例中通过本发明的试剂盒对随机二联体家系的Y-STR进行基因分型。其中，随机二联体家系样本的DNA由鉴定所提供(鉴定结果为排除)，采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNAProtocol》，Humana Press，1998)，扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用IDx软件。本实施例所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标、等位基因ladder均为本领域技术人员常用的常规材料。
本实施例对上述随机二联体家系的27个Y染色体STR分型过程与上述实施例二相同，结果见表5。
表5本发明试剂盒对随机二联体家系的的分型结果
从上述分型结果可知，其中父子的22个Y-STR位点分型结果并不一致，由此否定了其父子关系，与鉴定所鉴定结果一致，本方法具有较高的准确性。
实施例四：
本实施例中通过本发明的试剂盒对特殊的两个DNA样本的Y染色体STR分型。其中，特殊的两个DNA样本由另一鉴定所提供，利用chelex100法提取该样本的DNA，并利用本发明试剂盒及现有的Yfiler Plus试剂盒同时对上述样本进行分型检测鉴定，鉴定结果见表6，具体分型图谱见图3a至图3d，其中，图3a为本发明试剂盒对样本1的Y-STR分型图，图3c为本发明试剂盒对样本2的Y-STR分型图，图3b为YfilerPlus试剂盒分别样本1的Y-STR分型图，图3d为YfilerPlus试剂盒分别样本2的Y-STR分型图。
表6本发明试剂盒及Yfiler Plus试剂盒分别对2个特殊样本的基因分型
表6中符号“—”表示该位点缺失无分型结果。从表6可得出，样本1中除DYS393，DYS458，DYS19，DYS481，DYS627，DYS456及DYS449共7个位点能得到分型外，其他位点缺失。样本2中位点DYS385a/b出现5等位基因，但总体上本发明试剂盒与Yfiler Plus对上述2个特殊样本的鉴定结果完全一致，进一步验证了本发明试剂盒分型的准确性。
实施例五：
本实施例中对本发明试剂盒的灵敏度进行检测。
本实施例分型的样本由自愿者提供，利用QIAGEN全血基因组DNA上述血液DNA，并利用Qbit对提取DNA浓度进行检测，在本发明的试剂盒中分别加入1ng﹑0.5ng﹑0.25ng﹑0.1ng﹑0.05ng上述DNA模板，并进行扩增检测分析，如图4所示，最终本发明试剂盒在DNA模板量低至0.1ng时仍能对所有位点进行准确分型，具有较高的灵敏度。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物，所述27个位点包括20个低突变位点和7个高突变位点，所述20个低突变位点分别为：DYS460﹑DYS456﹑DYS385a、DYS385b﹑DYS481﹑DYS390﹑DYS439﹑DYS448﹑DYS438﹑DYS533﹑DYS389I、DYS389II﹑DYS635﹑DYS392﹑DYS391﹑DYS437﹑Y_GATA_H4﹑DYS393﹑DYS458和DYS19，所述7个高突变位点分别为DYF387S1a、DYF387S1b﹑DYS449﹑DYS627﹑DYS576﹑DYS570和DYS518，其中DYS385a与DYS385b、DYS389I与DYS389II、及DYF387S1a与DYF387S1b对应的引物相同。
2.如权利要求1所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，所述27个位点对应的引物序列如下：
DYS437位点对应的引物序列：TCATTCACAGATGATAGATGA，GCTGGGACTATGGGCGTGAGTGC；
Y_GATA_H4位点对应的引物序列：TTCCAAATTTAAGATAGATAGATAG，ATCTATGTATCTATCTATCTATCTATTC；
DYS570位点对应的引物序列：GTGGCAACCTAAGCTGAAATGC，CCATTAAACTTCAGTTATGTGAC；
DYS518位点对应的引物序列：ATGGGTGATTTCTTTCTTTTC，GGCAACACAAGTGAAACTGCTTC；
DYS393位点对应的引物序列：GCCTCCCCGACCATGTGGCTG，AATAAAGTCATATCAGCTGCATAAT；
DYS458位点对应的引物序列：GAGTCAAGATTGAGCCATTGCACTGC，TGCAGTGGCAGAATCTCAGC；
DYS19位点对应的引物序列：TAACTCTCAAGCAAAAATTGA，TTTTGATTTCACTATGACTACTGAG；
DYS481位点对应的引物序列：GTGGCTAACGCTGTTCAGCATGCTG，AGACAGCTCACCAGAAGGTTGCAAGAC；
DYS390位点对应的引物序列：GAGAAATGGATGACAGTAAAATG，TGGTACCCCATAATATATTCTATC；
DYS439位点对应的引物序列：CTTCTCGAGTTGTTATGGTTTTAG，TACAGGCATAATCCACCATGCC；
DYS448位点对应的引物序列：GAGATCGCGAGACAGAAAGG，AGGTTATTTCTTGATTCCCTGTG；
DYS627位点对应的引物序列：AACATAATTCAAAAACCATGTGGA，AATGCCACTGCACTCCACCCTAG；
DYS438位点对应的引物序列：GCAAGCCATTAAGGAAATTGTC，GCTTGAACCTGGGAAGTGGAGGTTG；
DYS533位点对应的引物序列：CTTCTACCTATCATCTTTCTAGCTAGC，TAACTCAACCAAACAATAGAAG；
DYS389I与DYS389Ⅱ位点对应的引物序列：CCAACTCTCATCTGTATTATCTATG，CACAATTATCCCTGAGTAGCAG；
DYS635位点对应的引物序列：TGAAGACACTTGCACATACATTG，TTCTCACTTTGCATAGAATCTC；
DYS392位点对应的引物序列：GTAGTCTGGAAATATCTCAAAGAAG，TGATCTTGCAACATCTCCATCCATG；
DYS391位点对应的引物序列：CATTCATTCCTGTATACCTAACCT，AGGGTTTCTTGGCTTCAGTACTAG；
DYS576位点对应的引物序列：TTTTTAATGTATGAGCAAGAATATCCTAG，CCAACACCATGATTCAATTACCTTC；
DYS460位点对应的引物序列：GCCTATCATTTATTATGTATTTGTC，TAGCAAGCACAAGAATACCAGAGG；
DYS456位点对应的引物序列：CTCCTCAGCCTGCAGATGGTC，TTCTTAAACTGATGTATTAGGGTTC；
DYF387S1a与DYF387S1b位点对应的引物序：GACAGAGCTAGATTCCATTTTACC，AAGTGTGAGAAGTGCTACCACAG；
DYS449位点对应的引物序列：GAATATTTTCCCTTAACTTGTGTG，ATTGCACCATTGCACTCTAGGTTG；
DYS385a与DYS385b位点对应的引物序列：AGCATGGGTGACAGAGCTA，AAACTTTATTGGGATGCTAGGTAA；
其中，一个位点对应一对引物，引物序列的前端为5’端，后端为3’端。
3.如权利要求2所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，DYS437至DYS385a与DYS385b位点对应引物的浓度分别为：0.20μM、0.26μM、0.14μM、0.24μM、0.11μM、0.15μM、0.63μM、0.20μM、0.12μM、0.14μM、0.11μM、0.18μM、0.19μM、0.16μM、0.22μM、0.13μM、0.12μM、0.14μM、0.13μM、0.15μM、0.13μM、0.28μM、0.25μM、0.21μM。
4.如权利要求1所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，所述27个位点根据扩增产物片段大小分为四组，第一组位点包括DYS437、Y_GATA_H4、DYS570、DYS518、DYS393、DYS458和DYS19；第二组位点包括DYS481、DYS390、DYS439、DYS448、DYS627和DYS438；第三组位点包括DYS533、DYS389I、DYS389II、DYS635、DYS392、DYS391和DYS576；第四组位点包括DYS460、DYS456、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS449、DYS385a和DYS385b。
5.如权利要求1所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，所述27个位点在一个复合扩增反应体系中同时扩增。
6.如权利要求3所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，与四组位点对应的引物标记用不同颜色的荧光标记，与同组位点对应的引物标记用相同颜色的荧光标记，并且在一对引物中一个引物的5’端用荧光标记。
7.如权利要求6所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统，其特征在于，与第一组位点对应的引物标记用蓝色荧光素6’-FAM，与第二组位点对应的引物标记用绿色荧光素HEX，与第三组位点对应的引物标记用黄色荧光素TAMRA，与第四组位点对应的引物标记用红色荧光素ROX。
8.一种基于权利要求1-7任一项所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统的试剂盒，其特征在于，包括缓冲液、引物混合物、Taq聚合酶、DNA模板和无核酸酶水，其中，所述引物混合物包括针对Y染色体上27个位点设计的荧光标记的引物序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA模板包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和羊水。
10.一种同时分析DNA模板的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的Y染色体STR荧光标记复合扩增系统检测DNA。
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