CN106029902B - 用于多重分析13个mr y-str的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了允许在单一多重反应中扩增若存在于DNA样品中的在基因座DYF387S1；DYF399S1；DYF403S1a/b；DYF404S1；DYS449；DYS518；DYS526a/b；DYS547；DYS570；DYS576；DYS612；DYS626；和DYS627处的13个快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y‑STR)和确定这些RMY‑STR的等位基因的方法和试剂盒。通过单一多重反应实现此类确定的能力作为本文公开的便利设计的一组引物的结果产生。用于PCR的优化条件也有助于观察到的优势。此类试剂盒和方法可以在法医学背景下是有益的。

Description

用于多重分析13个MR Y-STR的试剂盒和方法
本发明涉及用于在确定位于Y染色体上的快速突变的短串联重复的等位基因中使用的方法和试剂盒。
背景
短串联重复(STR)在法医学应用范围内通常被用于分析DNA，诸如分析在犯罪现场发现的DNA。在Y染色体上发现的STR(Y-STR)用于确定在也可能含有女性DNA的样品诸如在性侵犯案件中获得的那些样品中男性DNA的存在。
许多Y-STR在共有相同的父系血统的相关男性之间是无法区分的。由于在这些Y-STR中的突变是相对罕见的事件，这些Y-STR的大部分在此类男性亲属间将是共有的。
某些Y-STR已经被鉴定为“快速突变的”，为了目前的目的这表明它们具有呈10-2数量级的突变率，而所有其他的Y STR具有呈10-3数量级的突变率。这些标记物用于鉴定的使用允许在甚至密切相关的男性受试者间做出区分。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种确定感兴趣的样品中快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y-STR)的等位基因的方法，所述方法包括：
·提供包含DNA的样品；
·将所述样品与一组引物接触，在所述一组引物中存在表2的SEQ ID NO:1至26中的每个；
·进行聚合酶链式反应(PCR)以共同扩增若存在于所述DNA中的在基因座DYF387S1；DYF399S1；DYF403S1a/b；DYF404S1；DYS449；DYS518；DYS526a/b；DYS547；DYS570；DYS576；DYS612；DYS626和DYS627处的RM Y-STR；和
·将PCR产物与代表所述RM Y-STR的不同等位基因的参考值比较，以确定存在于所述样品中的等位基因。
在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于共同扩增一组快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y-STR)的一组引物，其中所述一组引物包含在表2中列出的SEQ ID NO:1至26中的每个。
在本发明的第二方面的试剂盒的合适的实施方案中，所述一组引物由SEQ ID NO:1至26组成。
在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增一组快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y-STR)的一组引物，其中所述一组引物由在表2中列出的SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22组成。
附图和表格简述
图1图解通过在SEQ ID NO:1至26中列出的引物对扩增的RM Y-STR的PCR产物大小的范围，以及借助于荧光团与引物的缔合被并入这些产物中的荧光团的细节。
图2图解用于在本发明的方法中使用的优化的扩增循环。在表2中列出的RM Y-STR引物对与优化的引物浓度和Platinum PCR Master Mix的并入在这些条件下获得了稳健的基因分型数据。
图3图解使用本发明的方法研究的并且用ABI 3500Genetic Analyser分析的对照男性DNA的分析结果。
图4显示指示本发明的方法的灵敏度，并且图解可被有效使用的低DNA样品大小的一系列结果。
图5图解本发明的方法和试剂盒的特异性，并且证明了当仅仅女性DNA被用作对照样品时，观察到无模板扩增。
图6图解当1ng的男性模板DNA被与多达1μg女性DNA模板混合时，本发明的方法和试剂盒能够共同扩增13个RM Y-STR。
图7表示在典型的阿拉伯联合酋长国(UAE)家庭中的RM Y-STR的突变模式分析。
表1证明了在UAE群体的交叉样品中，使用本发明的方法共同扩增的RM Y-STR的辨别能力。
表2列出在本发明的方法和试剂盒中采用的引物对的细节。
发明详述
RM Y-STR提供在法医学应用中大有裨益的工具。它们使在甚至当密切相关的个体男性间大量区分成为可能，因为几乎完全不存在一个个体与另一个个体共有的单体型。因此，RM Y-STR和允许确定在这些基因座处的等位基因的方法和试剂盒在法医学领域是有很大兴趣和效用的。
本发明基于发明人的发现：SEQ ID NO:1至26的引物惊人地允许在单一多重PCR反应中有效地共同扩增至少13个Y-STR。所述13路(thirteen-way)多重反应比在现有技术中已经成功地实行的那些反应明显更复杂。
尽管其他文件已经鉴定了可使用本发明的试剂盒和方法被扩增的RM Y-STR的有效性，但是实际上，这些文件中没有能够产生这样的试剂：通过这些试剂RM Y-STR中的每个可在单一多重反应中被共同扩增。在本申请中首次公开的试剂盒和方法是第一个已经能够实现这种高的期望目标的试剂盒和方法。
在表2中列出的一组引物组包含13个引物对。每个引物对包含一个正向引物和一个反向引物。每个引物对能够扩增一个RM Y-STR。由于引物对的共同作用，在本发明的第一方面的方法中以及本发明的第二方面的试剂盒中提到的一组引物能够共同扩增在基因座DYF387S1；DYF399S1；DYF403S1a/b；DYF404S1；DYS449；DYS518；DYS526a/b；DYS547；DYS570；DYS576；DYS612；DYS626；和DYS627处发现的RM Y-STR。
如在表2中进一步列出的，由SEQ ID NO:1和2组成的引物对能够扩增位于基因座DYF387S1的RM Y-STR；由SEQ ID NO:3和4组成的引物对能够扩增位于基因座DYF399S1的RMY-STR；由SEQ ID NO:5和6组成的引物对能够扩增位于基因座DYF403S1a/b的RM Y-STR；由SEQ ID NO:7和8组成的引物对能够扩增位于基因座DYF404S1的RM Y-STR；由SEQ ID NO:9和10组成的引物对能够扩增位于基因座DYS449的RM Y-STR；由SEQ ID NO:11和12组成的引物对能够扩增位于基因座DYS518的RM Y-STR；由SEQ ID NO:13和14组成的引物对能够扩增位于基因座DYS526a/b的RM Y-STR；由SEQ ID NO:15和16组成的引物对能够扩增位于基因座DYS547的RM Y-STR；由SEQ ID NO:17和18组成的引物对能够扩增位于基因座DYS570的RMY-STR；由SEQ ID NO:19和20组成的引物对能够扩增位于基因座DYS576的RM Y-STR；由SEQID NO:21和22组成的引物对能够扩增位于基因座DYS612的RM Y-STR；由SEQ ID NO:23和24组成的引物对能够扩增位于基因座DYS626的RM Y-STR；并且由SEQ ID NO:25和26组成的引物对能够扩增位于基因座DYS627的RM Y-STR。
在单一多重反应中共同扩增在DYF387S1；DYF399S1；DYF403S1a/b；DYF404S1；DYS449；DYS518；DYS526a/b；DYS547；DYS570；DYS576；DYS612；DYS626；和DYS627处的RM Y-STR中的每个的能力提供了许多显著益处。仅仅举例而言，本发明的方法或使用本发明的试剂盒的那些方法可以比现有技术中描述的那些方法更快、更简化并且更容易。
因为本发明的方法和试剂盒允许在单一多重反应中共同扩增13个RM Y-STR，其减少如果样品必须从一个反应容器转移至另一个反应容器可能发生的污染的可能性。即使当存在于样品中的男性DNA的量远远少于存在于样品中的女性DNA的量时，本发明的方法和试剂盒也能够高度特异地扩增存在于男性DNA中的RM Y-STR。这在与性侵犯相关的法医样品的情况下是很有益的。
本发明的方法或试剂盒使得能够基于非常小量的男性DNA实现个体男性的区分。如在下面的实施例中展示的，用少到65皮克的男性DNA的起始样品可以实现RM Y-STR的等位基因的确定。因为本发明的方法和试剂盒允许在单一多重反应中共同扩增RM Y-STR，如此小的起始样品无需分开在不同反应混合物中。
本发明的方法和试剂盒可以实现的进行复杂的多重反应的能力是由发明人已经对反应组分(特别是SEQ ID NO:1至26的引物)和条件进行的改变所致。发明人已经鉴定的一个重要参数是使用引物的浓度。这显著地有助于由本发明的方法提供的益处。在合适的实施方案中，各种引物的浓度可选自下面列出的组：
·SEQ ID NO:1和2(能够扩增位于基因座DYF387S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:3和4(能够扩增位于基因座DYF399S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:5和6(能够扩增位于基因座DYF403S1a/b的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:7和8(能够扩增位于基因座DYF404S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:9和10(能够扩增位于基因座DYS449的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:11和12(能够扩增位于基因座DYS518的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:13和14(能够扩增位于基因座DYS526a/b的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:15和16(能够扩增位于基因座DYS547的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:17和18(能够扩增位于基因座DYS570的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:19和20(能够扩增位于基因座DYS576的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:21和22(能够扩增位于基因座DYS612的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
·SEQ ID NO:23和24(能够扩增位于基因座DYS626的RM Y-STR的引物对)每个可被以在约0.01和1μM间的浓度提供；和
·SEQ ID NO:25和26(能够扩增位于基因座DYS627的RM Y-STR的引物对)每个可以以在约0.01和1μM间的浓度提供。
优化使用引物的浓度进一步增强本发明的方法提供的益处。在合适的实施方案中，各种引物的浓度可选自由下面列出的组：
·SEQ ID NO:1和2(能够扩增位于基因座DYF387S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.05μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:3和4(能够扩增位于基因座DYF399S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.07μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:5和6(能够扩增位于基因座DYF403S1a/b的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.20μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:7和8(能够扩增位于基因座DYF404S1的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.10μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:9和10(能够扩增位于基因座DYS449的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.06μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:11和12(能够扩增位于基因座DYS518的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.08μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:13和14(能够扩增位于基因座DYS526a/b的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.40μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:15和16(能够扩增位于基因座DYS547的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.20μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:17和18(能够扩增位于基因座DYS570的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.04μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:19和20(能够扩增位于基因座DYS576的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.03μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:21和22(能够扩增位于基因座DYS612的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.07μM的浓度提供；
·SEQ ID NO:23和24(能够扩增位于基因座DYS626的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.04μM的浓度提供；和
·SEQ ID NO:25和26(能够扩增位于基因座DYS627的RM Y-STR的引物对)每个可以以0.33μM的浓度提供。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法使用上文提到的每个引物，并且每个以上文提到的浓度提供。
控制和优化引物浓度的好处的这种认识也适合于在本发明的试剂盒中使用。在本发明的试剂盒的合适的实施方案中，引物被以足量提供使得当用已知体积的稀释剂稀释以产生PCR反应混合物时，引物的浓度处于上文列出的范围内。
在合适的实施方案中，本发明的试剂盒包含使得当试剂盒被用于产生工作PCR反应混合物时，引物以上文列出的优化浓度值存在的量的引物。
在优选的实施方案中，SEQ ID NO:1至26的所有引物可被以足以提供上文列出的优选的浓度范围或优化的浓度值的量提供。
典型地，PCR会在合适的本领域技术人员熟知的那类PCR缓冲液中进行。合适的缓冲液(诸如与DNA聚合酶Taq一起提供的缓冲液)可组成PCR反应总体积的25％至75％。
PCR需要脱氧核糖核苷酸(dGTP、dATP、dTTP和dCTP)的存在，并且这些在本发明的方法中可以约220μM的浓度被提供。
在本发明的方法中使用的PCR可在氯化镁(MgCl2)的存在下进行，氯化镁任选地可被以约1.65mM的浓度提供。
这些组分的一些或全部可在本发明的试剂盒中被提供。因此，本发明的试剂盒还可包含下列组分的一种或更多种：
·PCR缓冲液。PCR缓冲液可以合适浓度的形式被提供，该浓度随后被稀释以产生工作溶液。
·MgCl2。其可以以当产生工作PCR溶液时，MgCl2以1.65mM的浓度存在的足够量提供。
·脱氧核糖核苷酸。其可以以当产生工作PCR溶液时，脱氧核糖核苷酸以约220μM的浓度存在的足够量提供。
发明人已经研究了可存在于PCR混合物中而不影响本发明的方法共同扩增RM Y-STR的适合度的各种组分的上限。他们发现当本发明的方法包含下列组分的一种或更多种时，本发明的方法是有效的事件：
·浓度最高达2mM的EDTA。
·浓度最高达500μM的正铁血红素。
·浓度最高达100μM的腐殖酸。
·浓度最高达200ng/μl的丹宁酸。
·浓度最高达20mM的MgCl2。
因此，可以期望将存在于反应混合物中的这些组分的一种或全部的量维持在前段列出的值或维持在低于在前段列出的值。
可在本发明的方法中使用的用于PCR的合适的热循环仪方案包括下列步骤：
·一个在95℃约10分钟的循环；
·12个包括以下的循环：在94℃30秒；随后在50℃和60℃间的退火温度45秒；随后在72℃1分钟；
·在18个和20个间的包括以下的的循环：在94℃30秒；随后在50℃和60℃间的退火温度45秒；随后在72℃1分钟；
·一个在60℃约45分钟的循环。
在合适的实施方案中，第一退火温度(用于12个循环)是58℃。该值与改进的PCR效力有关。
在另外的或可选的实施方案中，第二退火温度(用于在18个和20个间的循环)是55℃。该值也与改进的PCR效力有关。
然后，反应混合物可被保持在最高达约15℃的温度下持续无限的时间段。
在本发明的方法或试剂盒中可使用范围广泛的DNA聚合酶。许多可以使用的商用可得的DNA聚合酶在下段中通过举例被提供。
在合适的实施方案中，本发明的方法可使用Taq DNA聚合酶作为聚合酶，为了指导，约0.15单位的TaqDNA聚合酶足够用于在15μl PCR反应混合物中使用。上文通过举例说明的方式提供的PCR循环适合用于在使用Taq的实施方案中使用。
可在本发明的方法或试剂盒中使用的可选的DNA聚合酶包括Amplitaq Gold、Thermoprime Taq、OmniTaq和Fusion Hi Fidelity DNA Polymerase，其可组成优选的聚合酶。这些DNA聚合酶的任一种当与SEQ ID NO:1至26的引物一起使用时能够共同扩增RM Y-STR，并且因此可在本发明的方法或试剂盒中使用。引物和其他PCR反应组分的浓度与诸如PCR循环的温度和时间的细节一起，在此类实施方案可按需要被改变。
本发明的试剂盒和方法允许使用小DNA样品进行关于要实行的Y-STR的等位基因确定。仅通过举例，发明人发现Y-STR的等位基因的准确确定可在包含少至62.5pg DNA的样品中实现。可存在于样品中同时仍允许通过本发明的试剂盒和方法准确确定Y-STR的等位基因的更低水平的DNA可以小于该数字。无疑地，包含至少62.5pg DNA的样品能够被使用。
本发明的试剂盒和方法已被实验性地证明使用最多3ng DNA的样品大小起作用。预期如果需要的话使用高很多的样品大小，本发明的方法和试剂盒将继续有效。
此外，本发明的试剂盒和方法允许在包含男性和女性DNA的样品中进行关于Y-STR的等位基因确定，其中男性DNA(包括Y染色体)仅为总体的非常小的部分。例如，在图6中列出的结果说明本发明的方法和试剂盒能够从以存在的女性DNA的千分之一的量存在的男性DNA共同扩增RM Y-STR。
本发明的第一方面的试剂盒可包含一组引物，在所述一组引物中存在SEQ ID NO:1至26中的每个以及任选地一个或更多个另外的引物。本发明的第一方面的试剂盒可包含一组引物，在所述一组引物中存在SEQ ID NO:1至26中的每个，并且所述引物中的一个、多于一个或全部包含未在表2的序列中列出的另外的核苷酸。
本发明的试剂盒也可包含关于如何实行利用本发明的试剂盒的方法的说明书。本发明的试剂盒可包含关于可以如何确定感兴趣的样品中的RM Y-STR的等位基因的说明书。
本发明的方法和试剂盒可在任何合适的可实现PCR的装置中进行。仅通过实施例，本发明的方法可使用DNAscan快速DNA分析系统(GE)和DNAscan BioChipSet Cassette被实行，或本发明的试剂盒可与DNAscan快速DNA分析系统(GE)和DNAscan BioChipSetCassette结合使用。
本发明的方法涉及将PCR产物与代表RM Y-STR的不同等位基因的参考值比较，以确定存在于样品中的等位基因。代表正被研究的RM Y-STR的不同等位基因的参考值可以许多不同形式被提供。典型地，合适的参考值可以等位基因梯的形式被提供。
PCR产物的比较可用任何合适的与已经选择的参考值的性质兼容的方式实行。例如，在参考值被以等位基因梯的形式提供的情况下(以上文预期的方式)，那么可以平行处理等位基因梯的样品与PCR产物。例如，如果要使用DNA测序仪研究PCR产物，那么也可以相同的方式研究等位基因梯的样品。
在合适的实施方案中，本发明的试剂盒包含关于RM Y-STR的不同等位基因的参考值的信息。在合适的实施方案中，该信息以等位基因梯的形式被提供。
本发明的方法和试剂盒允许确定感兴趣的样品中的RM Y-STR的等位基因。关于Y-STR并且特别是RM Y-STR的等位基因信息在一系列背景下尤其是法医应用中是有用的。
应理解，本发明的方法，其中感兴趣的样品中的Y-STR的等位基因允许鉴定从其中获得样品的个体。在此类实施方案中，本发明的方法不仅可包括将PCR产物与代表RM Y-STR的不同等位基因的参考值比较以确定存在于样品中的等位基因，而且还进一步包括将此信息与关于存在于感兴趣的个体中的等位基因的信息比较(例如将存在于样品中的等位基因与嫌疑人或已知罪犯已知具有的等位基因的特征比较)。
在本发明的方法或试剂盒的合适的实施方案中，每个引物对是荧光标记的。合适地，一对引物中的至少一个是借助于缀合至引物的荧光团被荧光标记。仅通过实例，一对引物中的至少一个可借助于共价结合到引物的荧光团被荧光标记。
可以用于标记引物的合适的荧光团包括选自由FAM；yakima黄；ATTO550和ATTO565组成的组的那些。
用荧光团标记引物对(以及因此标记所述引物对扩增的包含RM Y-STR的PCR产物)的合适的排列在图1中展示。确定了不同基因座的等位基因范围。相同颜色的荧光标记接下来被选择用于相对远离彼此的基因座。这确保在特定的颜色小组中不存在相邻基因座的等位基因范围的重叠。对每个小组重复相同的过程，并且开发四个颜色的小组。基因座在目前的系统中被很好地隔开，并且也提供取代荧光小组的可能性。
实施例
本发明的方法和试剂盒的验证使用所述方法和试剂盒共同扩增600个来自UAE群体的男性样品中的13个RM Y-STR标记物进行。灵敏度、特异性以及在混合样品中发挥功能的能力与辨别能力一起被测试。
简要地说，自在迪拜卫生局和迪拜警察总司令部的供体收集来自UAE的包含三个主要的土著部落(贝都因阿拉伯人、城市阿拉伯人和该山阿拉伯人)的非相关男性个体的600个同意样品作为在FTS卡上的血斑。DNA或被提取和定量，或使用1.2mm FTA冲头被扩增。
对600个样品基因分型，并且如下确定统计数值：
根据等式(n/n–1)(1–fi2)计算单倍型多样性，其中n是样品的数目，f是群体中ith单倍型的频率
辨别能力被计算为(不同单倍型的数目/单倍型的总数)。
结果示于表1中：
法医学参数 贝都因阿拉伯人 城市阿拉伯人 该山阿拉伯人 总数
个体数目 200 200 200 600
单倍型数目 199 200 199 598
单倍型多样性 0.99985 1.00000 0.99985 0.99997
辨别能力(％) 99.5 100 99.5 99.7
将可使用本发明的方法或试剂盒确定的单倍型多样性与可使用商用可得的基因分型产品确定的基因型多样性比较，该商用可得的基因分型产品具体地为从Promega可得的Y23系统和从Life Technologies,Inc.可得的试剂盒。
此比较的结果在表3中列出：
从这些结果可以看到，本发明的方法和试剂盒的性能可与已经商用可得的产品的性能相比比较有利。
图1和2分别显示荧光染料与引物(以及因此包含RM Y-STR的引物的PCR产物)的排列和在本发明的这些示例性方法中使用的优化的PCR循环。在该实施方案中，在上行的那些RM Y-STR(DYS526A、DYS612、DYF399S1、DYS526B和D7S547)的扩增产物被用单一颜色的荧光团(例如蓝色)标记，而在第二行的那些RM Y-STR(DYF404S1、DYS626、DYF403S1A和DYF403S1B)被用不同颜色的荧光团(例如绿色)标记。在第三行的RM Y-STR(DYS576、DYS518和DYS627)的扩增产物被用第三种颜色的荧光团(例如黄色)标记，而在底端行的那些RM Y-STR(DYS570、DYF387S1和DYS449)被用第四种颜色的荧光团(例如红色)标记。
结果显示在图3中，其图解使用ABI 3500Genetic Analyser产生的对照男性DNA的Y-STR特征。
微型验证的结果示于图4至6中。图4图解本发明的方法和试剂盒的灵敏度，当起始DNA样品低至62.5pg时，本发明的方法和试剂盒能够成功地共同扩增13个RM Y-STR。图5图解本发明的方法和试剂盒的特异性，当用于对单独女性DNA进行PCR时，即使高达10ng的输入水平(远高于图4中成功地共同扩增的62.5pg男性DNA样品)，本发明的方法和试剂盒不会引起模板扩增。图6示出了即使当男性DNA:女性DNA的比率是1:1000时，本发明的方法和试剂盒能够从男性和女性DNA的混合物中成功地共同扩增RM Y-STR。
最后，图7代表在典型的UAE家庭中RM Y-STR的突变模式分析。
本发明的方法和试剂盒在法医样品背景下频繁发现的各种因素的存在下，有效地并且具有必要的灵敏度地发挥功能的能力对于其实际应用是非常重要的。
如上文列出的，发明人已经确定，本发明的方法和试剂盒能够成功确定包含少至62.5皮克男性DNA的样品中的RM Y-STR的等位基因。即使在存在高达10纳克女性DNA的情况下，从如此小起始样品中可以实现等位基因的成功确定。实际上，在包含混合的男性和女性DNA的样品中高达3000纳克的女性DNA的存在不阻止存在于男性DNA样品中的RM Y-STR的等位基因的成功确定。
此外，发明人确定，即使在存在法医样品中通常发现的但是已知抑制PCR的多种化合物的情况下，本发明的方法和试剂盒允许男性DNA样品中的RM Y-STR的等位基因的成功确定。特别地，发明人发现，本发明的方法和试剂盒允许包含高铁血红素(以100纳克每微升的浓度)、腐殖酸(以100纳克每微升的浓度)或丹宁酸(以200纳克每微升的浓度)的样品中的RM Y-STR的等位基因的成功确定。这些结果表明，虽然高度灵敏和选择性，本发明的方法和试剂盒在污染物存在时也是稳健的，说明其在法医学领域实际使用的适用性。
表2：序列信息

Claims (19)

1.一种确定感兴趣的样品中快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y-STR)的等位基因的方法，所述方法包括：
·提供包含DNA的样品；
·将所述样品与一组引物接触，在所述一组引物中存在表2的SEQ ID NO:1至26中的每个；
·进行单一多重聚合酶链式反应(PCR)以共同扩增若存在于所述DNA中的在基因座DYF387S1；DYF399S1；DYF403S1a/b；DYF404S1；DYS449；DYS518；DYS526a/b；DYS547；DYS570；DYS576；DYS612；DYS626和DYS627处的RM Y-STR；和
将PCR产物与代表所述RM Y-STR的不同等位基因的参考值比较，以确定存在于所述样品中的等位基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中用于SEQ ID NO:1至26的引物的浓度选自由以下组成的组：
·SEQ ID NO:1和2，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:3和4，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:5和6，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:7和8，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:9和10，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:11和12，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:13和14，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:15和16，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:17和18，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:19和20，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:21和22，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；
·SEQ ID NO:23和24，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供；和
·SEQ ID NO:25和26，每个以在0.01和1μM间的浓度被提供。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用于SEQ ID NO:1至26的引物的浓度选自由以下组成的组：
·SEQ ID NO:1和2，每个以0.05μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:3和4，每个以0.07μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:5和6，每个以0.20μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:7和8，每个以0.10μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:9和10，每个以0.06μM的浓度被提供；
·SEQ ID No:11和12，每个以0.08μM的浓度被提供；
·SEQ ID No:13和14，每个以0.40μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:15和16，每个以0.20μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:17和18，每个以0.04μM的浓度被提供；
·SEQ ID No:19和20，每个以0.03μM的浓度被提供；
·SEQ ID No:21和22，每个以0.07μM的浓度被提供；
·SEQ ID NO:23和24，每个以0.04μM的浓度被提供；和
·SEQ ID NO:25和26，每个以0.33μM的浓度被提供。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述PCR使用包括下列步骤的热循环仪方案进行：
·一个在95℃10分钟的循环；
·12个包括以下的循环：在94℃30秒；随后在50℃和60℃间的退火温度45秒；随后在72℃1分钟；
·在18个和20个间的包括以下的循环：在94℃30秒；随后在50和60℃间的退火温度45秒；随后在72℃1分钟；
·一个在60℃45分钟的循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一退火温度是58℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二退火温度是55℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二退火温度是55℃。
8.根据权利要求1-3和5-7任一项所述的方法，其中使用Taq DNA聚合酶作为聚合酶进行PCR。
9.根据前述权利要求4所述的方法，其中使用Taq DNA聚合酶作为聚合酶进行PCR。
10.根据权利要求1-3和5-7中的任一项所述的方法，其中所述PCR使用选自由AmplitaqGold、Thermoprime Taq、OmniTaq和Fusion Hi Fidelity DNA聚合酶组成的组的聚合酶进行。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述PCR使用选自由Amplitaq Gold、ThermoprimeTaq、OmniTaq和Fusion Hi Fidelity DNA聚合酶组成的组的聚合酶进行。
12.根据权利要求1-3、5-7、9和11任一项所述的方法，其中所述参考值以等位基因梯的形式提供。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考值以等位基因梯的形式提供。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考值以等位基因梯的形式提供。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述参考值以等位基因梯的形式提供。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于共同扩增一组快速突变的Y染色体短串联重复(RM Y-STR)的一组引物，其中所述一组引物包含在表2中列出的SEQ ID NO:1至26中的每个。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述一组引物由SEQ ID NO:1至26组成。
18.根据权利要求16至17中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含以下中的至少一个：
·脱氧核糖核苷酸；
·DNA聚合酶；
·PCR缓冲液；或
·等位基因梯。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述DNA聚合酶包括Taq聚合酶。
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