CN102725422A - Y-染色体str标记的分析 - Google Patents

Y-染色体str标记的分析 Download PDF

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Abstract

本文提供的方法和组合物涉及13种STR的发现，所述13种STR为人Y染色体上存在的标记，当与现今已知的173种其它Y-STR标记相比时，其具有意想不到地高的突变率，所述173种其它Y-STR标记包括法医中常用的那些。除了基于提高的突变率的理论期望外，这13种快速突变(RM)Y-STR被证明适于区分近亲男性，以及更远的男性亲属，并且比法医中最常用的Y-STR更适于所述区分。我们新的RM-Y-STR组由于如本文发现的其不寻常的突变性质，预期将克服当前许多案件的法医应用中Y-染色体分析的困境，所述法医应用涵盖现今男性谱系鉴定乃至男性个体鉴定。本发明实施方案包括用于等位基因确定快速突变Y-STR标记的方法，用于分析快速突变Y-STR标记的扩增引物，用于分析快速突变Y-STR标记的等位基因梯，以及用于分析快速突变Y-STR标记的试剂盒。

Description

Y-染色体STR标记的分析
本申请要求2009年9月11日提交的美国临时申请号61/241,778、2010年7月23日提交的美国临时申请号61/367,346以及2010年9月1日提交的美国临时申请号61/379,340的优先权。申请号、序列号61/241,778、61/367,346以及61/379,340通过引用以其整体为任何目的结合到本文中。
领域
本主题发明的实施方案为DNA的法医分析领域。
背景
在分析犯罪现场发现的DNA中，使用STR标记已成为标准工具。在多数情况下，利用常染色体STR标记的用途，这部分地因为其在大多数群体中的高水平多态性。例如，在美国，用于建立疑犯DNA数据库的标准的13个CODIS基因座为常染色体STR标记。在许多混有男性和女性贡献者血迹的案例中，特别在强奸案中，法医调查人员必须分析Y染色体上存在的遗传标记以鉴别通常属于犯罪者的男性组分。这是因为在这种案件中，常染色体STR标记由于例如女性受害者DNA与男性犯罪者DNA之间的谱重叠而不能提供信息。尽管存在优先获取男性DNA的技术可能(即差异裂解)，但此类技术往往不成功。因为女性DNA缺少Y染色体，Y染色体标记的分析可用于相对样品中的男性DNA含有高水平女性DNA的样品。因此，分析Y染色体DNA排除了由过量女性来源DNA导致的复杂假象。
非重组性质使得能够将Y染色体标记用于男性谱系鉴定，即父性相关并因此共有相同Y-STR单元型的男性组，即基于法医中目前使用的Y-STR标记。男性谱系鉴定已成为法医遗传学中排除男性的极有用的工具。然而，在非-排除(即匹配Y-STR谱)的案例中，基于现有Y-STR标记不能做出基于个人的报告书，因为男性疑犯及其所有男性亲属对犯罪现场样品的贡献具有相同的概率。这显然是其中期望基于个人的结论的法医应用中的局限性。然而，突变事件可出现在Y-STR标记。原则上，Y-STR标记中的这些突变可使调查人员能区分近亲男性亲属，以及还能区分更远亲男性，前提是此类突变在给定男性亲属对中以使其可被观察到的足够高频出现。现有Y-STR标记中的突变为相当罕见事件，以约0.1至0.4% (每一Y-STR基因座每一千世代事件(generational event)有1-4个变化)出现。因此，甚至当使用相对大量的Y-STR标记(即现今用于法医应用的那17种标记)时，区分男性亲属的概率仍极低。然而，若可得到足够的比现今已知Y-STR突变更快的Y-STR标记，则可预期的是，可基于Y-STR突变区分近亲男性以及远亲男性以实现法医应用中期望的男性个体鉴定。
发明人已发现13种Y-STR标记的亚组，其比大多数Y-STR标记(包括被广泛使用的那些)具有显著更高的突变率。该发现预期将彻底改变Y染色体在法医生物学中的应用，这与先前的男性谱系区分方法不同。该发现还为男性个体鉴定指引了方向。因此，通过使用一种或多种，通过使用两种或更多种此类快速突变Y-STR标记(rapidly-mutating Y-STR marker, RM Y-STR)，区分近亲和远亲男性亲属的能力显著增加。
概述
本发明的某些实施方案包括通过确定至少2种选自以下快速突变Y-STR标记的Y-STR标记的等位基因来鉴定个体的方法DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。在本方法的一些实施方案中，等位基因可通过PCR来鉴定。在本方法的一些实施方案中，等位基因可通过质谱来鉴定。PCR可为多重PCR以便共扩增所述至少2种快速突变Y-STR标记。本发明的某些实施方案包括扩增引物对组，其包括用于扩增至少2种选自以下的Y-STR标记的引物：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。引物组可共扩增至少2-13种快速突变Y-STR标记。在某些实施方案中，除快速突变Y-STR标记外，引物组还可共扩增常染色体STR标记。在一些实施方案中，所述常染色体STR可选自D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX和CSF1PO。在一些实施方案中，引物可用荧光染料标记。提供的其它实施方案为用于从至少2种选自以下的Y-STR标记中调取STR的一个或多个等位基因的等位基因梯大小标准品(allelic ladder size stnadard)：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。提供的其它实施方案为用于鉴定至少2种Y染色体STRS标记的等位基因的试剂盒，其中所述标记选自DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627，所述试剂盒包括用于扩增至少2种快速突变Y-STR标记的引物，以及代表所选标记的等位基因梯(allelic ladder)。
附图和附表简述
图1. 根据父子对分析建立的186种Y-STR标记的突变率。通过分析每一标记多达1966个经DNA确认的父子对，依据其基于贝叶斯的突变率(Bayesian-based mutation rate) (具有置信区间)来估计186种Y-STR标记的分布。确定用于进一步家族/系谱分析的13种快速-突变(RM) Y-STR标记用红色突出显示，且常用的17种Yfiler Y-STR用绿色表示。多拷贝Y-STR用黑色插入菱形标出。
图2. 最长同源阵列(homogeneous array)的长度或基因座内重复总数与来自267个Y-STR基因座的等位基因-特异性突变率之间的相关性。尽管基因座内存在的重复数"最长同源阵列可用于预测可突变性，所有存在于基因座内的重复总数具有更高的预测值。
图3. 来自267个Y-STR基因座的重复总数与突变方向以及突变率之间的关系。重复丧失突变(repeat loss mutation) (收缩)展示与在具有更高数目重复的基因座的重复总数、丧失率增加率的指数关系。重复获得突变(repeat gain mutation) (扩展)显示弱的二次函数，获得率在20个总重复具有峰值。
图4. 用13种新鉴定的RM Y-STR以及17种常用的Yfiler Y-STR来区分男性亲属。基于13种RM Y-STR(用红色表示)和17种Yfiler Y-STR(用蓝色表示)，通过分析来自80个男性系谱的103对来区分男性亲属的结果(依据分隔系谱成员的世代数来分类)。误差条代表95%的二项式置信区间。注意到这些样品独立于最初用于建立Y-STR突变率的父子对。
表1. 通过分析多达1966个经DNA确认的父子对，根据186种Y-STR标记的后验分布(posterior distribution) (中值和95%置信区间)的突变率估计。具有超过10-2中值突变率的标记(RM Y-STR组)突出显示。此外还包括的是所观察到的标记重复结构、获得/丧失的数目、总突变以及父子传递总数。包括PCR引物、PCR退火温度和用于基因型分型的基因座分配至54重(multiplex)以及3个RM Y-STR多重。
表2. 根据在186个Y-STR标记筛查总数为352,999个减数分裂转移，在120个Y-STR标记中观察到的924个突变的详情。在可能的情况下，给出在突变Y-STR的父与子两者的等位基因的重复结构。在扩增子内具有多个可变区段(variable segment)的多拷贝标记的情况下，在无序列信息的情况下，给出总重复数或扩增子大小。给出了儿子出生时父亲的年龄，这作为个体对参考。
表3. 根据分开同一系谱成员的世代数，通过分析来自80个男性系谱的103对，对13种快速突变RM Y-STR与17种Yfiler Y-STR通过1个或多个突变来区分男性亲属而进行比较。
定义
Y-STR标记中的"突变"是STR标记的重复区域的长度变化或散布有重复单元的碱基的长度(即数目)变化。例如，添加一个或多个重复单元是导致出现新等位基因的突变。在另一实例中，在单个重复单元内添加单个碱基亦是导致出现新等位基因的突变。此类变化可以是添加或缺失一个或多个重复单元(或其片段)的结果。此类序列变化可容易地通过能够检测核酸序列长度或核酸碱基顺序中变异的分析方法来检测。
本文使用的术语"快速突变Y-STR标记" (RM Y-STR)是指以下11种Y-STR标记：DYF387S1、DYF399S1、DYF404S1、DYS449、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
本文使用的术语"等位基因梯"是指由来自给定STR基因座的扩增等位基因组成的标准大小标记或者是指在大小(或电泳迁移率)方面与来自给定STR基因座的扩增等位基因等同的大小标准品。等位基因梯可包括用于给定STR标记的一个或多个等位基因的大小标准品。等位基因梯可包括来自不同STR标记的等位基因。等位基因梯中的大小标准品可用可检测的标记例如荧光染料来标记。
本文使用的术语"Y-STR标记"是指存在于人Y染色体非重组部分上的STR标记。基于现有知识，存在超过250种此类Y-STR标记。Y-STR标记为本领域普通技术人员熟知。Y-STR标记的数据库可公开得到，例如在网址www.usystrdatabase.org和www.yhrd.org。
本文使用的术语"STR"是指含有短重复序列元件的基因组DNA的区域。重复的序列元件不限于但通常为3至7个碱基对的长度。在STR内每一序列元件至少重复一次并且在本文中称为"重复单元"。术语STR还包括其中以串联或具有间插碱基形式重复多于单个重复单元的基因组DNA的区域，前提是至少一个序列以串联形式重复至少两次。
本文使用的术语"引物"是指以这样的方式与基因座的DNA链杂交的单链寡核苷酸或DNA片段，使得引物的3'端可作为采用DNA聚合酶聚合及延伸的位点。除天然存在的DNA之外，或代替天然存在的DNA，引物亦可为DNA类似物，例如LNA、碱基类似物等。"引物对"是指两个引物，其包括在待扩增DNA序列的一端处与单链杂交的引物1，以及在待扩增DNA序列的互补链上与另一端杂交的引物2。"引物位点"是指与引物杂交的靶DNA区域。
本文使用的不定冠词和"所述"以及本文使用的类似提及对象应理解为涵盖单数和复数，除非上下文另外说明其它用法。因此，在权利要求或说明书中当与术语"包括"一起使用不定冠词时可意指"一个(种)"但也与"一个(种)或多个(种)" "至少一个(种)"以及"一个(种)或多于一个(种)"的含义一致。还应注意的是，权利要求书可经撰写以排除任何任选元素。因此，该陈述意欲充当使用与叙述权利要求元素相关的例如"唯一地"、"仅仅"等排它性术语或使用"否定"限定的先行基础。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。本文上下文提及的所有专利、专利申请、已公布申请、论文和其它出版物均通过引用以其整体结合到本文中。若本文阐述的定义和/或描述与通过引用结合到本文的专利、专利申请、已公布申请和其它出版物中阐述的任何定义相反或在其它方面不一致时，本文阐述的定义和/或描述将优先于通过引用结合的定义。对任何出版物的引用为申请日前的公开内容并且不应理解为承认：由于在先发明，本发明将无资格先于所述出版物。
某些具体实施方案的描述
申请人通过查验以下三个领域已确定众多Y-STR的突变率：i) 基于进化和系谱应用所需的合理地大量基因座，缺乏关于Y-STR可突变性的知识，ii) 关于Y-STR可突变性的分子基础的有限知识，和iii) 缺乏用于法医、系谱和特定群体应用中家族区分的Y-STR。
在约2000个经DNA-确认的父子对中。表1提供186种Y-STR标记的突变率和特性。包括突变率估计，多数为首次测定。亦评价了针对所有基因座产生的多样性和DNA序列数据以探究Y-STR可突变性的潜在原因。测试经鉴定最可突变Y-STR用于区分男性亲属的适用性及其对于Y-染色体在法医科学中的应用的意义，从而鉴定了13种快速突变的Y-STR (RM- Y-STR)标记。
发现与所测试的173种其它Y-STR相比，所述13种Y-STR标记具有显著更高的突变率。这些快速突变的标记为DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。这13种RM-Y-STR的突变率完全超过10-2，而所有其它173种Y-STR (所测试基因座的94%)具有完全低于10-2(通常为10-3及更低)的突变率(图1)。特别地，13种RM Y-STR的基因座-特异性突变率范围为0.0116至0.0744。相比之下，AmpF/STR? YFiler? PCR扩增试剂盒中包括的17种Y-STR (YFiler试剂盒, 由Applied Biosystems / Life Technologies销售, Foster City, California USA, 即DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385 a/b*、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、Y GATA H4、DYS437、DYS438、DYS448)的基因座-特异性突变率范围为0.0002至0.0065，这基于大量>135,000减数分裂转移(meiotic transfer)而最近建立(Goedbloed等. 2009)。因此，申请人意想不到地发现13种RM-Y-STR比最常用于现今法医应用的YFiler试剂盒Y-STR突变更快(为60-11倍)。这些RM-Y-STR标记中意想不到高的突变率使区分相同父本遗传谱系的男性成员间的可能性增加。当采用多个快速突变Y-STR标记时，区分相同男性谱系成员间的可能性甚至更大。本文提供的本发明各种实施方案包括用于确定给定分析样品中一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种等等本发明快速突变Y-STR标记的特定等位基因的方法、试剂和试剂盒。
本文提供了用于确定一种或多种快速突变Y-STR标记的特定等位基因的各种方法。快速突变Y-STR标记的特定等位基因可使用与用于确定其它类型STR标记的等位基因基本相同的方法和技术来确定。本领域技术人员可容易地对所述方法和技术进行改进以适用于快速突变Y-STR标记的等位基因确定。所述技术的实例包括与检测技术例如电泳、质谱等连用的DNA测序和序列特异性扩增技术例如PCR。在一些实施方案中，PCR扩增产物可通过与PCR扩增引物缀合的荧光染料来检测，例如PCT专利申请WO 2009/059049中描述的。PCR扩增产物还可用其它技术检测，包括但不限于对扩增产物染色例如银染等。
给定快速突变Y-STR标记的特定等位基因还可通过各种广泛可用的DNA测序技术中任一种来测定，所述测序技术例如桑格测序法、焦磷酸测序、Maxim和Gilbert测序等。
众多自动化DNA测序技术可市售得到，applied Biosystems 3130, applied Biosystems 3100、lllumina Genome Analyzer、Applied Biosystems SOLiD系统、Roche Genome Sequencer Fix系统等。
用于使用本方法和组合物分析的DNA可通过多种来源获得。DNA可在犯罪现场获得，例如从强奸受害者回收的精液。此外，用于分析的DNA可直接从男性受试者获得以产生等位基因信息数据库(用于后续分析)或可从确定疑犯中获得。
可对用于分析的DNA进行定量，然后进行等位基因分析，从而提供更精确的等位基因调取(calling)。样品中DNA量可用本领域技术人员已知的许多技术来测定，所述技术例如实时PCR。引人关注的是，对分析样品中存在的Y染色体DNA进行定量，然后对Y-染色体STR标记(包括快速突变的Y-染色体STR标记)进行等位基因分析。亦可对样品中常染色体DNA进行定量，从而提供用于测定混合样品中存在的女性DNA的背景量的方法，所述样品例如强奸案中回收的那些样品。
Y染色体单元型可通过确定多种Y-STR标记上存在的特定等位基因来建立。一般而言，Y-STR标记突变越快，能够基于Y-染色体标记分析来区分男性亲属间的可能性就越大。在一些实施方案中，所述快速突变Y-STR标记可通过采用多重PCR的方法来分析。多重PCR可扩增所述快速突变Y-STR标记中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或全部13种。在一些实施方案中，多重PCR可共扩增不是本发明快速突变Y-STR标记组的一部分的另外的Y-STR标记。在一些实施方案中，多重PCR可提供用于共扩增一种或多种常染色体STR标记，例如CODIS STR标记、D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX和CSF1PO。关于开发用于STR分析的多重PCR的详述，除其它地方之外，还可参见PCT专利申请WO 2009/059049 A1。在一些实施方案中，PCR反应不是多重的。可合并非-多重PCR反应中产生的扩增子，然后进行仪器分析，所述仪器例如荧光DNA片段分析仪(例如自动化DNA测序仪)或质谱仪。STR标记的质谱分析除其它之外还可参见美国专利6,090,558。
其它实施方案包括用于共扩增至少两种快速突变Y-STR标记的PCR引物组。实施方案包括用于共扩增本文提供的快速突变Y-STR标记的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或全部13种的PCR引物组。在一些实施方案中，PCR引物组可包括用于共扩增非快速突变Y-STR标记的Y-STR标记的引物。在一些实施方案中，所述PCR引物组可包括用于共扩增常染色体上存在的STR标记的PCR引物。
本发明的实施方案还包括等位基因梯以帮助鉴定快速突变Y-STR标记的等位基因。所述等位基因梯可包括用于快速突变Y-STR标记的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或全部13种的大小标准品组。对于存在于等位基因梯的各标记，等位基因梯可包括一个或多个等位基因的标准品。等位基因梯可包括给定快速突变Y-STR标记的所有已知等位基因的大小标准品，或者已知等位基因的任何亚组。在一些实施方案中，等位基因梯中的大小标准品可用一种或多种荧光染料标记。在一些实施方案中，等位基因梯还可包括用于常染色体STR标记的大小标准品。在一些实施方案中，等位基因梯还可包括用于非快速突变Y-STR标记的Y-STR标记的大小标准品。
本发明的其它实施方案包括用于确定两种或更多种快速突变Y-STR标记的等位基因的试剂盒。所述试剂盒的实施方案可包括本发明扩增引物组。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括用于核酸扩增反应的一种或多种试剂。所述试剂的实例包括但不限于DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、核酸纯化试剂等。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括经设计作为一种或多种快速突变Y-STR标记等位基因的大小标准品的等位基因梯，所述等位基因通过存在于试剂盒中的扩增引物而产生(或可能通过所述引物产生)。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒可包括特异性适用于通过将试剂盒引物用于扩增反应而产生的扩增子的等位基因梯。例如包括用于共扩增快速突变Y-STR标记DYF387S1、DYF399S1和DYF404S1的引物的试剂盒还可包括具有用于快速突变Y-STR标记DYF387S1、DYF399S1和DYF404S1的各种等位基因的大小标准品的等位基因梯。所述试剂盒可包含用于共扩增全部13种RM-Y-STR的引物以及具有如本领域技术人员已知的合适大小标准品的等位基因梯。就给定STR标记而言，等位基因梯的组分大小标准品可用与用于产生分析样品中实际等位基因扩增子的引物相同或不同的可检测标记来标记，所述标记例如荧光染料。
通过参考以下包含实验数据的实施例可更好地理解本发明。所述信息提供为实例且并非旨在限制所要求保护的本发明范围。本文提出的实例和数据在K. Ballantyne等. "Mutability of Y-Chromosomal Microsatellites: Rates, Characteristics, Molecular Bases and Forensic Implications" Am. J. Hum. Genet. 87:341 -353 (2010年9月10日)中公布并且在线公布于2010年9月2日，各通过引用结合到本文中。
实施例
DNA样品
除家族或政府文件之外，用于突变率研究的所有父子对还通过利用常染色体STR、Y-STR、HLA和RFLP基因型分型和血液分型的分子分析来确认其父子关系。将本研究中包括的父子关系的概率阈值设定为99.9%。样品获自德国的柏林、莱比锡和科隆地区以及波兰的华沙和弗罗茨瓦夫。由于DNA量低，使用GenomiPhi DNA扩增试剂盒(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)对莱比锡样品进行全基因组扩增。按照制造商的建议进行WGA反应，并且使用Invisorb 96 Filter Microplates (Invitek GmbH, Berlin, Germany)对产物进行纯化。来自男性亲属的另外的独立样品组(不是用于男性家族或系谱的可突变性初筛，用于验证经鉴定的快速突变Y-STR的值)来自德国的格赖夫斯瓦尔德(Greifswald)、基尔和柏林地区、比利时的鲁汶地区、波兰的华沙地区以及加拿大和德国中部，正如其他地方12所述。所有家族/系谱通过与父子对相同的方法来确认；将对于快速突变(RM) Y-STR和Yfiler Y-STR两者具有完整基因型的对考虑用于分析，或者在部分基因型的情况下，仅包括在一个或多个基因座显示突变的那些。用于本研究目的的所有样品的使用符合制度规章并且在告知许可下进行。
Y-STR标记和基因型分型实验方案
Y-STR标记主要选自先前研究，另外包括项目开始时已知的Y-STR 42，所述先前研究详述了大量(167种)先前未知的Y-STR 29。关注点在单拷贝Y-STR标记上以便在鉴定突变时能够通过DNA序列分析来充分确认基因型差异。然而，鉴于我们的目的是寻找RM Y-STR，我们包括了一些额外的多拷贝Y-STR，特别是具有高多样性的那些(通过独立基因型分型对其进行突变确认)。基因座、引物序列和实验方案的完整列表可参见在线补充数据S1。用市售的试剂盒，AmpF/STR Yfiler PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems)，遵循制造商的说明书，对186种Y-STR中的17种进行基因型分型。实验方案和标记的完整描述可参见(28)。用各包括1至5种标记的54个多重测定对其余169种Y-STR进行基因型分型。用3种不同的实验方案进行PCR，并且在补充数据S1中提供详情。此外，在男性亲属的独立样品组中采用3个多重测定，对研究期间鉴定为快速突变(RM) Y-STR的13种Y-STR进行基因型分型。所有PCR均在Erasmus MC Rotterdam法医分子生物学部门的GeneAmp PCR System 9700仪器(Applied Biosystems)上进行。用Applied Biosystems, Foster City, USA的3130x/ Genetic分析仪(Applied Biosystems)进行片段长度分析。用GeneMapper软件(ID v 3.2, Applied Biosystems)对生成的谱进行基因型分型。采用内部研发的微软Excel 2007宏来鉴定基因型差异。父子两者在Y-STR基因座的全部突变通过鹿特丹的DNA序列分析来确认，如M. Goedbloed等(2009) Int. J. Legal. Med. 123, 471-482中描述的。具有三个或更多个等位基因的多拷贝Y-STR基因座不能够被测序，但通过至少两次独立地片段长度分析扩增来确认突变。
统计数据分析
如Goedbloed中描述的，采用如WinBUGS中实施的Marcov Chain Monte Carlo (MCMC) Gibbs抽样，用二项式分层贝叶斯模型43来估计个体标记的突变率。简言之，认为可将各突变率看作是任何Y-STR潜在的突变率的实现。简言之，我们认为Y-STR i的突变率                                               
Figure 602764DEST_PATH_IMAGE001
为来自由超参数(hyperparameter)定义的共同群体分布(common population distribution)的样品。这样，经估计的Y-STR突变率并入了对该Y-STR所观察到的数据提供的信息(在所有观察的父子对中所观察到的突变数)以及在来自全部Y-STR的超参数中估计的"所述Y-STR"突变率的信息。在实践中，这暗示未观察到突变的Y-STR将显示比其它观察到大量突变的Y-STR更小的突变率(由后验分布估计)，但总不同于0。
各Y-STR的突变率以对元(logit)形式编码，并且认为将遵循正态分布，其具有待估计的参数和
Figure 898113DEST_PATH_IMAGE004
以及各STR的特定突变率。由于在我们的研究前，仅可得到非常有限的关于Y-STR突变率范围的数据，因此我们假定就超参数而言的扩散、无信息先验分布。针对超参数指定无信息先验正态分布(μ=0, =1 x10"6)并且针对参数指定具有参数α=1x10-5和β=1x10-5的先验扩散γ分布。当估计各基因座的突变率时，用Gibbs采样器(sampler)平行产生了3个MCMC链，对各链均运行100,000次。在废弃最初50,000次运行以及进行15的细化(thinning)后，根据3个链对均值、中值和95%可信区间(CI)进行估计以便减少相邻模拟间自相关的量。抽样群体(科隆、柏林、莱比锡、华沙和弗罗茨瓦夫)间突变率的基因座-特异性差异借助排列分析(permutation analysis)来测试。各基因座以及各群体的平均突变率与假定排列群体(permutated population)相比，其中各父子对随机分配至群体，对于各基因座保持原始样品大小。将排列的平均突变率大于观察率的次数记录，并且用于得到100,000次迭代(iteration)内的单尾p值。群体间缺乏显著差异使得能够合并群体间的突变率。
为探究Yfiler和RM Y-STR组的突变率而非组内各标记的突变率，鉴于所分析的Y-STR数目，计算各组的各父子对之间观察到的突变总数。然后根据具有泊松分布(Poisson distribution)的贝叶斯范例来对该参数进行建模。使用具有γ分布的先验，其中扩散形状(diffuse shape)为1并且标度为200，这暗示均值为0.005以及方差为40000的突变率。后验分布遵循共轭γ分布，形状为1 +(突变总数)并且标度为1/(1/(200 + 所使用标记的总数))。为估计各组中观察到至少一个突变的概率，根据各组Y-STR的后验分布的估计形状和标度，用R包装45的γ函数进行100000 Monte Carlo重复。
就RM Y-STR组而言，估计的中值突变率为0.0197 (95%置信区间0.018 - 0.022)，这是由17种标记组成的YFiler组所显示的0.0028的中值率(范围为0.0023至0.0035的95%置信区间)的约7倍。接着，将给定父子对中每Y-STR组观察到至少一个突变的概率(反映区分男性亲属的最低标准)估计为1减去观察到0个突变的概率，这直接根据泊松分布来估计：在任何给定父子对中任一YSTR组内观察到至少一个突变(k)的概率直接根据泊松分布来估计：
Figure 610669DEST_PATH_IMAGE005
，其中N代表标记数，m代表获自后验分布抽样的标记组的平均突变率。假定每组的全部Y-STR已成功进行基因型分型，并且使用各组标记突变率的后验估计，RM Y-STR组观察到至少一个突变的概率为0.1952 (0.177至0.21的95%置信区间)。该值为YFiler组所估计的值(0.047 (0.038至0.057的95%置信区间))的超过4倍，但相对RM Y-STR组，YFiler组中包括额外的6种标记。用内部开发的Matlab脚本(v7.6.0.324, The Mathworks, Inc., Natick, MA, USA)使用泊松回归对决定突变率的分子因素进行建模。将突变率建模为依赖于重复长度、序列基序、基因座复杂度以及碱基对(三-、四-、五-或六核苷酸)中重复长度的函数，为：
其中假定
Figure 88890DEST_PATH_IMAGE007
依赖于上述因子，以下列形式：
Figure 905536DEST_PATH_IMAGE008
其中L代表等位基因的长度(重复数目，最长的同源阵列或总基因座的)，S代表序列基序(由重复序列基序中A、T、C或G核苷酸数目组成)，C代表基因座的复杂度(以二元或定量形式)，V为存在的变量基序数，R为重复长度，且N为基因座的拷贝数。使用逐步回归程序，进入的概率为<0.05，移出的概率为≥0.10。为清楚起见，下文将阐明用于定义和计算基因座内重复数以及基因座复杂度的方法。
根据Kayser等对基因座命名进行建模，其中需要同一基序的至少3个连续重复来将给定重复区段定义为基因座，并且将任何多于一个碱基，但少于一个完整单位的间断分类为终止该基因座。个体Y-STR基因座包含1至5个重复块(repeat block)，例如具有5块(CCT)5(CTT)1(TCT)4(CCT)1(TCT)19的DYS612。若基因座包含多于一个可变区段，并且重复数不能精确分配给全部个体的所有重复区段，则将该基因座从回归分析中移出。若相对群体的其余部分，在任何经测序个体中观察到重复数中的变化，则将区段定义为可变的。
重复数：直接计算最长同源阵列中的重复数，并且计算各基因座的群体均值。此外，还加上最长阵列周围的任何额外重复以计算各基因座的重复总数。在上述DYS612的实例中，最长阵列长度为19，而重复总数为30。
重复长度：重复基序的碱基对中的长度，其范围为3至6(包括三-、四-、五-、六-和七核苷酸重复)。
复杂度：对于每一基因座计算两个复杂度统计。首先，使用二元分类系统，其中将仅具有一个重复区段(例如 (GATA)10)的基因座归为简单的，同时将任何具有两个或更多个重复区段(由多于3个连续重复组成)的基因座(例如(GATA)10(CATA)3)归为复杂的。其次，Kayser等如下的复杂度公式提供了更多的定量信息：，其中n为基因座中的重复总数，s i 为第i个序列基序的重复数，并且
Figure 41300DEST_PATH_IMAGE010
为第i块中的重复数。在SPSS v15.0 (SPSS Inc.)中进行相关和对数线性回归分析，如同所有均值比较测试(利用ANOVA, 曼-惠特尼U和Kruskal Wallis)一样。
重复长度：重复基序的碱基对长度，其范围为3至6(包括三-、四-、五-、六-和七核苷酸重复)。
Y-STR标记的突变率
为定义给定RM Y-STR组区分男性亲属的期望并且将该潜能与常用的YFiler组相比较，应用贝叶斯方法，得到两Y-STR组中每组的平均突变率。就STR组而言，借助泊松分布对在一个父子对中观察到的突变数进行建模。使用扩散形状为1且标度为1/0.005的先验共轭γ分布。得到遵循γ分布的后验分布，形状为1+突变总数及标度为1/(1/0.005 + 所使用的标记总数)并且进行100000次Monte Carlo重复。
此外，为检验独立样品中新RM Y-STR组对于区分男性亲属是否实用且有用，在来自80个男性系谱的107对(其系谱内的1至20个世代之间具有亲戚关系)中的，对两组标记组进行基因型分型并且将结果与从YFiler得到的结果相比较。系谱来自德国的格赖夫斯瓦尔德和基尔(N. von Wurmb-Schwark, V. Malyusz, E. Simeoni, E. Lignitz, M. Poetsch, For. Sci. Int. 159, 92-97 (2006)以及柏林(本研究新出现的)地区，比利时的鲁汶地区(本研究新出现的)，波兰的华沙地区(本研究新出现的)以及来自加拿大C. Moreau, H. Vezina, V. Yotova, R. Hamon, P. de Kniff等., Am. J. Phys. Anthropol. 139, 512-522 (2009), M. Vermeulen, A. Wollstein, K. van der Gaag, O. Lao, Y. Xue等., For. Sci. Int. Genet., 3, 205-213 (2009)以及德国中部M. Kayser, M. Vermeulen, H. Knoblauch, H. Schuster, M. Krawczak, L. Roewer, For. Sci. Int. Genet. 1 , 125-128 (2007))，如其它地方描述的。通过DNA数据(在各种系谱之间包括常染色体STR、HLA和RFLP分型、Y-STR和Y-SNP分型以及mtDNA测序)以及另外通过家族或政府文件记录来确认所有系谱。只有两组均具有完整基因型的对，或在部分基因型的情况下，在一个或多个基因座显示突变的对包括在计算中。图2中提供结果。RM Y-STR组通过至少1个突变区分了超过65%的对，反映男性亲属区分水平是YFiler组(仅13%)的5倍，这与我们对最初父子对分析的统计期望相似。在系谱内，RM Y-STR组区分了60%的父子对，54%的兄弟以及87%的第二代堂兄弟姊妹。若亲属被多于11次的减数分裂而分开，则用 RM Y-STR组通过1个或多个突变来分开100%的个体。相比之下，所述Y-filer组在该数据集中未区分父子对和第二代堂兄弟姊妹，而仅区分该数据集中6%的兄弟。
通过基于多重荧光的片段长度分析，在多达1966种经DNA-确认的父子对中，筛查186种三-、四-、五-、六核苷酸Y-STR标记中每一标记的突变，由此直接观察到352,999个减数分裂转移(技术详情参见表1)。为证实突变，父及其子之间观察到的所有Y-STR基因型差异通过用于单拷贝和双重标记的DNA序列分析，或通过用于多拷贝Y-STR(具有多于2个拷贝)的双重片段长度基因型分型分析(其中序列分析是无信息的)来证实。总的来说，在所研究的186种Y-STR标记的120种(64.5%)中，我们鉴定了924种经证实的突变(所观察各突变的详情可参见补充数据S2)。就66 Y-STR标记而言，所分析的多达1966个父子对不允许我们检测突变，这是由于潜在突变率非常低。所用的大量Y-STR标记确定了基于贝叶斯的突变率范围，根据后验分布中值该范围估计为每标记每世代3.81x10-4 (95% CI 1.38x10-5至2.02x10-3)至7.73x10-2 (6.51x10-2至9.09x10-2)(图1, 表1)。91种Y-STR标记(48.9%)的突变率为约10-3，另外的82种标记(44%)为约10-4，并且13种(6.9%)为约10-2。在全部186种Y-STR标记中，平均突变率为3.35x10-3 (95% CI 1.79x10-3至6.38x10-3)，对于本文包括的作为Y-STR标记的最大重复长度亚组的122个四核苷酸重复的平均率为4.26x10-3 (95% CI 2.38x10-3至7.60x10-3)。值得注意的是，突变率超过1x10-2的13种Y-STR标记仅代表所研究标记的7%，其被称为"快速突变的Y-STR" (RM Y-STR)，涵盖了本研究中观察到的大量突变(924中的462 (50%))。
重复数。对各Y-STR基因座计算平均重复数的2个估值，i) 在最长同源阵列中的平均重复数；和ii) 最长同源阵列的重复数加上最邻近的任何非-可变重复(依据先前针对基序结构29所确定的规则)。我们的回归分析显示尽管最长同源阵列中的重复数显著影响突变率(具有增加突变率的更高的重复数(Wald χ2 = 2.41 x 106, p <0.0001 ))，但包括阵列周围非可变重复数给模型提供了稍微更精确的信息(Wald χ2 = 3.03 x 106, p<0.0001 , 图2)。估计模型内的有效大小，偏
Figure 471144DEST_PATH_IMAGE011
为0.798，这表明基因座之间重复总数的方差占所观察Y-STR突变率中总体(有效 + 误差)方差的约78%。此外，在重复总数与等位基因-特异性突变率之间观察到统计学显著的指数关系(R2= 0.707, p = 6.84x10-9)。此外，在重复总数与突变方向之间存在强的关系(图3)。较长的等位基因展示趋向重复丧失(收缩)的指数和统计显著趋势(R2 = 0.585, p = 8.27x10-7)，而较短的等位基因显著更频繁地获得重复(扩展)(R2 = 0.238, p = 0.011)。扩展突变率具有二次分布，顶点为约19 个重复。
通过RM Y-STR来区分男性亲属
我们鉴定了13种快速突变(RM) Y-STR标记(突变率均为>1x10-2)；DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627 (图1 , 表1)。这13种RM Y-STR标记中的4种为多拷贝系统(DYF387S1为双拷贝, DYF399S1为三拷贝, DYF403S1为四拷贝, DYF404S1为双拷贝以及DYS526为双拷贝)，而9种为单拷贝Y-STR标记(尽管在单个扩增子内，这些标记中的6种包含多个Y-STR基因座，并且仅两种，即DYS570和DYS576为简单重复，其各自仅具有一个Y-STR基因座)。根据以下假设将所述13种RM Y-STR合并到一个组中：若合并RM Y-STR，则近亲男性(甚至是父-子对或兄弟对)可通过Y-STR突变来区分。原则上，在13种RM Y-STR之一的一个突变将足够用于区分个体。
为了定义RM Y-STR组区分男性亲属的统计期望，以及为了将其潜能与常用的Yfiler组比较，我们首先借助贝叶斯方法计算了就两组Y-STR的每一组所观察到的突变率。就各组Y-STR而言，借助泊松分布对各父子对中所观察到的突变数进行建模。对于RM Y-STR，后验分布的中值突变率经估计为1.97x10-2 (95% CI 1 .8x10-2 - 2.2x10-2)，这是经估计的Yfiler Y-STR的中值率(3.0x10-3 (范围为2.39x10-3至3.72x10-3的95% CI))的6.5倍。接着，对于给定父子对，对在两组Y-STR的每组中观察到至少一个突变的概率进行估计，这反映区分男性亲属的最低标准。假定每组的全部Y-STR成功进行基因型分型，并且对每组Y-STR标记采用突变率的后验估计，RM Y-STR组中观察到至少一个突变的概率为0.1952 (0.177至0.21的95% CI)。意想不到的是，该值是Yfiler组所估计的值(0.047 (0.038至0.057的95% CI))的4倍以上。RM Y-STR组中观察到至少一个突变的概率在统计学上显著高于Yfiler组的概率(p<5.0x10-07)。最后，独立于用于确立突变率的那些样品，对样品以实验为依据地进行如下测试：所述新的RM Y-STR组是否可在实践上用于区分男性亲属。为此，对来自80个男性系谱的103个男性亲属对(其系谱内的1至20个世代之间具有亲戚关系)进行基因分型，并且将结果与相同样品中获自Yfiler试剂盒的结果相比。总的说来，RM Y-STR组通过至少1个突变来区分70.9%的男性亲属对，这反映男性亲属区分的水平为Yfiler试剂盒组(仅为13%)的5倍；值得注意的是，显著差异(t = 6.389, p <0.0001)与最初父子对分析的统计期望相似(图4和表3)。在系谱内，RM Y-STR组区分70%的父子对、56%的兄弟以及67%的堂兄弟姊妹(图4和表3)。相比之下，Yfiler组不能够区分数据集中任何的父子对或堂兄弟姊妹，仅能区分6%的兄弟(图4和表3)。此外，用RM Y-STR组，所有被分开多于11个世代的亲属可通过1个或更多个突变来区分，但用Yfiler组仅为33%。
本文公开和要求保护的所有组合物和方法可根据本公开内容在无需过度实验的情况下制备和实施。尽管本发明的组合物和方法可能已通过具体实施例或优选实施方案来描述，这些实例和实施方案绝不以任何方式意欲限制权利要求的范围，并且本领域技术人员将清楚的是，在不违背本发明思想、精神和范围的情况下，可对本文所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体而言，将清楚的是，某些化学和生理学两者相关的试剂可代替本文所述的试剂，同时将得到相同或相似结果。对于本领域技术人员清楚明了的所有此类相似替代和改变将被认为在所附权利要求书所限定的本发明精神、范围和思想内。
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Claims (14)

1. 扩增引物对组，其包括用于扩增至少2种Y-STR标记的引物，所述Y-STR标记选自：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
2. 权利要求1的引物组，其中所述引物可用于共扩增至少3-13个来自所述标记组的基因座。
3. 权利要求1的引物组，其中所述引物可用于扩增所有来自所述标记组的基因座。
4. 鉴定个体的方法，所述方法包括确定至少2种选自以下的Y-STR标记的等位基因：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
5. 权利要求4的方法，其中所述等位基因通过PCR来鉴定。
6. 权利要求5的方法，其中所述PCR为共扩增所述标记中至少3个的多重PCR。
7. 权利要求5的方法，其中所述PCR使用用荧光染料标记的引物。
8. 权利要求4的方法，其中所述等位基因通过质谱、毛细管电泳或凝胶电泳来鉴定。
9. 权利要求4的方法，其中所述PCR共扩增至少一个所述基因座和常染色体STR。
10. 权利要求9的方法，其中所述常染色体STR选自D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX和CSF1PO。
11. 用于鉴定至少2种Y染色体STRS标记的等位基因的试剂盒，其中所述标记选自DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627，所述试剂盒包括用于扩增至少3个基因座的引物，以及代表所选标记的等位基因梯。
12. 用于调取来自至少2种Y-STR标记的STR的一个或多个等位基因的等位基因梯大小标准品，所述Y-STR标记选自DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
13. 扩增引物对组，其包括至少一个选自以下的引物对：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
14. 鉴定男性的扩增引物对组，其包括用于Y-STR标记的引物，所述Y-STR标记由以下组成：DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627。
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