CN116411051A

CN116411051A - 一种检测包含snp位点的靶核酸的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN116411051A
Application number: CN202111639604.7A
Authority: CN
Inventors: 倪润芳; 莫莎; 戴丽丽; 石文志; 宋娜杰
Original assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种检测样品中的一种或多种靶核酸的方法，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点。本申请还涉及一种试剂盒，所述试剂盒用于检测样品中的一种或多种靶核酸。与现有技术相比，本申请的检测结果对于同一种靶核酸不进行区分，这使得对不同种靶核酸能够更好的进行区分，不容易因同一种靶核酸的多种检测结果而造成混淆和误读。

Description

一种检测包含SNP位点的靶核酸的方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种检测样品中的一种或多种靶核酸的方法，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点。本申请还涉及一种试剂盒，所述试剂盒用于检测样品中的一种或多种靶核酸。

背景技术

SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)是目前为止人类基因组中分布最广泛、存在数量最多的DNA遗传多态性，占所有已知多态性的90％以上，平均500～1000个碱基对中就有1个。由于人或动物的基因组中存在着单核苷酸多态性，导致同一靶核酸/靶基因中可能存在着多个SNP位点，即同一靶核酸/靶基因可能存在着多种碱基序列。而目前针对上述含有SNP位点的靶核酸/靶基因的检测方法，大多集中于对同一靶核酸/靶基因的不同碱基序列进行区分。

目前针对核酸变异或多态性的情况，有两种常用的检测策略：1.在探针对应的多态性位点处加入简并碱基，简并碱基是根据密码子的兼并性，用一个符号代替某两个或者更多碱基，简并碱基是碱基混合物，所以含有简并碱基的探针与其对应的多态性位点均可结合。2.在探针对应的多态性位点处加入次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以与任意一种碱基结合，其结合能力比完全匹配的碱基对更弱。以上检测策略中，不同的SNP位点与探针结合时的T_m值可能不同，在熔解曲线分析中若同一个检测对象产生多个T_m值的熔解峰会不利于结果的判读，同样不利于检测通量的增加。

而在分子生物学的研究中，经常需要同时对多种靶核酸/靶基因进行检测与区分，而并不需要对同一靶核酸/靶基因的不同碱基序列进行区分。如果在检测过程中，对同一靶核酸/靶基因的不同碱基序列进行区分，反而会干扰不同靶核酸/靶基因的检测。

因此，需要提供一种能够同时对多种靶核酸/靶基因进行检测与区分，而又能够对同一靶核酸/靶基因的不同碱基序列不进行区分的检测方法。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提供了一种检测样品中的一种或多种靶核酸的方法，其包括以下步骤:

(a)提供含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点，并且，

提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种靶核酸，提供至少一个靶特异性引物对以及至少一条检测探针；其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；

所述检测探针包含特异于所述靶核酸的探针核苷酸序列，并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，所述探针核苷酸序列能够与所述靶核酸中SNP位点上下游的核苷酸序列互补，且不与所述靶核酸中SNP位点的核苷酸序列互补；并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，分别扩增样品中的靶核酸，从而获得分别与所述靶核酸对应的扩增产物；

(c)在允许核酸杂交或退火的条件下，使用检测探针对步骤(b)获得的与靶核酸对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；

(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定所述靶核酸是否存在于样品中。

在某些实施方案中，SNP(单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。因此，在某些实施方案中，第一靶核酸含有1个SNP位点，所述第一靶核酸含有第一核苷酸序列以及第二核苷酸序列。

在某些实施方案中，针对所述第一靶核酸，提供第一检测探针。

在某些实施方案中，所述第一检测探针中的探针核苷酸序列能够与第一核苷酸序列以及第二核苷酸序列中SNP位点上下游的核苷酸序列互补，且不与第一核苷酸序列以及第二核苷酸序列中SNP位点的核苷酸序列互补。

在此类实施方案中，因所述第一检测探针不与第一靶核酸的SNP位点的核苷酸序列互补，在与第一靶核酸杂交或退火后，所述第一靶核酸的SNP位点处的核苷酸序列呈“拱形”。在某些实施方案中，探针还符合常规探针的通用设计要求，如T_m值需要符合预期，探针长度在10-50bp。在某些实施方案中，跳跃探针的T_m值无法精准预测，可能会有正负1℃的误差，所以需要用T_m Utility2.0软件预测后用靶序列实验验证实际的T_m值。

在某些实施方案中，具有相同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有相同的熔解峰(熔点)，具有不同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有不同的熔解峰(熔点)。

在某些实施方案中，不同熔解峰(熔点)的温度差为6℃至0.5℃(例如，0.5℃，1℃，1.5℃，2℃，2.5℃，3℃，3.5℃，4℃，4.5℃，5℃，5.5℃，6℃)。

在某些实施方案中，所述探针核苷酸序列的长度为10nt-50nt(例如，10nt-30nt，30nt-50nt)。

在某些实施方案中，所述探针核苷酸序列位于靠近检测探针的5’端区域或靠近检测探针的3’端区域。在某些实施方案中，所述探针核苷酸序列位于检测探针的5’或3’端。

在某些实施方案中，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(2)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。

在某些实施方案中，所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL FluorRed 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。

在某些实施方案中，在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线。

在某些实施方案中，根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于该熔解峰(熔点)的靶核酸的存在。

在某些实施方案中，所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸。

在某些实施方案中，所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个SNP位点。

在某些实施方案中，在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。

在某些实施方案中，所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在某些实施方案中，所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt。

在某些实施方案中，在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸。

在某些实施方案中，所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分。

在某些实施方案中，所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

在某些实施方案中，所述样品选自全血，血清，血浆，核酸疫苗，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述靶核酸选自DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述靶核酸获自原核生物，真核生物或病毒。在某些实施方案中，所述靶核酸获自哺乳动物(例如，猪)。

在某些实施方案中，所述靶核酸选自ATP8基因，M基因，NSP2基因，MGF360-14L基因，I177L基因，CD2v基因，NSP2(Lineage8.7)基因，NS5A基因，NSP2(Lineage5)基因，B646L基因，5UTR基因，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述检测探针具有选自下列的核苷酸序列或其任意组合：SEQID NO:5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35。

在某些实施方案中，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任意组合：SEQ ID NO:3和4；6和7；9和10；12和13；15和16；18和19；21和22；24和25；27和28；30和31；33和34。

在某些实施方案中，所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:1所示。

在某些实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一方面，本申请提供了一种检测含有一种或多种SNP位点的靶核酸的探针组，针对每一种靶核酸，所述探针组包含至少一条检测探针；

所述检测探针包含特异于所述靶核酸的探针核苷酸序列，并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，所述探针核苷酸序列能够与所述靶核酸中SNP位点上下游的核苷酸序列互补，且不与所述靶核酸中SNP位点的核苷酸序列互补；

并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些实施方案中，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任意组合：SEQ ID NO:5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35。

在另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含如前所述的探针组，以及鉴定引物组，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测样品中的一种或多种靶核酸。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。基因组中具有单核苷酸多态性的位点即称为“SNP位点”。在本文中，SNP位点通过其参考号(例如rs ID)命名。可以利用rs ID在公共数据库中查询SNP位点及其型别，例如，通过NCBI的dbSNP数据库，ChinaMAP数据库，JSNP数据库等。

如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics2009,11(2):93-101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并且可互换使用。

在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，检测探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的检测探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的检测探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有的检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含检测探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到检测探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔点(T_m)。通常而言，检测探针与互补序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的T_m就越高。因此，通过检测双链体的T_m，可确定双链体中与检测探针互补的序列的存在和身份。在本文中，术语“熔解峰”、“熔点”和“T_m”具有相同的含义，并且可互换使用。

发明的有益效果

与现有技术相比，本申请的检测探针以及检测方法可以对包含一种或多种SNP位点的多种靶核酸进行同时检测。与现有技术相比：(1)本申请的检测结果对于同一种靶核酸不进行区分，这使得对不同种靶核酸能够更好的进行区分，不容易因同一种靶核酸的多种检测结果而造成混淆和误读；(2)本申请的检测探针与靶核酸结合力强，检测结果的信号值高。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了三种探针组(10-P，即本申请设计的探针；10-P-Y，含有简并碱基的探针；10-P-I，含有次黄嘌呤核苷酸的探针)对含有1种SNP位点的靶核酸(10-Target1和10-Target2)的扩增与检测结果。

图2显示了三种探针组(3-P，即本申请设计的探针；3-P-YW，含有简并碱基的探针；3-P-I，含有次黄嘌呤核苷酸的探针)对含有2种SNP位点的靶核酸(3-Target1、3-Target2、3-Target3和3-Target4)的扩增与检测结果。

图3显示了模拟混合阳性样本(含有11种靶基因)的熔解曲线分析结果。

图4显示了ATP8基因的熔解曲线分析结果。

图5显示了M基因的熔解曲线分析结果。

图6显示了NSP2(Lineage1)基因的熔解曲线分析结果。

图7显示了MGF360-14L基因的熔解曲线分析结果。

图8显示了I177L基因的熔解曲线分析结果。

图9显示了CD2v基因的熔解曲线分析结果。

图10显示了NSP2(Lineage8.7)基因的熔解曲线分析结果。

图11显示了NS5A基因的熔解曲线分析结果。

图12显示了NSP2(Lineage5)基因的熔解曲线分析结果。

图13显示了B646L基因的熔解曲线分析结果。

图14显示了5UTR基因的熔解曲线分析结果。

图15显示了含有NS5A基因的第一种疫苗的熔解曲线分析结果。

图16显示了含有M基因基因的第二种疫苗的熔解曲线分析结果。

图17显示了含有M基因、NSP2(Lineage8.7)基因的第三种疫苗的熔解曲线分析结果。

图18显示了含有MGF360-14L基因、I177L基因、CD2v基因和B646L基因的第四种疫苗的熔解曲线分析结果。

图19显示了猪的全血样本的熔解曲线分析结果。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.

在本实施例中，为了验证本申请方法以及本申请所设计的探针的效果，通过三组不同检测策略的探针对含有SNP位点的靶核酸进行扩增与检测，并探究三组探针的检测差异。

本实施例供试的两种靶核酸的序列中存在SNP位点，即序列中的第五位碱基不同，其序列分别为命名为10-Target1和10-Target2，具体如表1所示。

本实施例供试的三种探针组分别为：(1)10-P，即本申请设计的探针，其中不包含与上述SNP位点互补的碱基序列，且包含与该SNP位点上、下游互补的碱基序列。当本申请设计的探针(10-P)与两种靶核酸(10-Target1和10-Target2)互补配对时，两种靶核酸上的该SNP位点会形成“拱形”结构，即该位点不与探针互补配对；(2)10-P-Y，含有简并碱基的探针，其包含能够同时结合该SNP位点的碱基，10-P-Y购自生工生物工程(上海)股份有限公司，依据提供的序列合成相应探针；(3)10-P-I，含有次黄嘌呤核苷酸的探针，其在与SNP位点互补的位点上含有次黄嘌呤核苷酸，而次黄嘌呤核苷酸可以与任意一种碱基结合。具体如表1所示。

表1.本实施例的探针与靶核酸

实验结果如图1所示，10-P，即本申请设计的探针的所获得的信号最好，信号值最高，且两种靶核酸所检出的熔解峰相同。10-P-Y，含有简并碱基的探针的信号较低，因为简并碱基探针是探针混合物，当加入一定浓度的探针时，实际与对应模板有效结合的探针浓度会更低，所以信号值较低；而若增加探针浓度，则会提高探针的本底信号，也不利于检测。10-P-I，含有次黄嘌呤核苷酸的探针的信号也较低，因为次黄嘌呤核苷酸的结合能力较弱，并且两种靶核酸所检出的熔解峰差异较大。

实施例2.

与实施例1的类似的，在本实施例中，选取了含有两个SNP位点的靶核酸(其序列分别命名为3-Target1、3-Target2、3-Target3和3-Target4)，同样比较了三种设计策略的探针(3-P即本申请设计的探针；3-P-YW含有简并碱基的探针；3-P-I含有次黄嘌呤核苷酸的探针)的检测效果。具体如表2所示。

表2.本实施例的探针与靶核酸

实验结果如图2所示，3-P，即本申请设计的探针的信号良好，且四个靶序列的T_m值均在预期温度。3-P-YW含有简并碱基的探针由于与不同靶序列间结合力有差异，所以不同靶的T_m值不在同一温度，而需检测的样本可能存在混合的情况，若多靶同时存在时，与简并碱基探针结合会产生融合峰，融合峰的峰值最高处会比单峰更宽，不利于熔解曲线的结果判读；3-P-I含有次黄嘌呤的探针因为结合能力较弱，所以探针T_m值下降明显，其熔解峰所处的T_m值不符合预期，不利于该位点与其他位点间T_m值的灵活排布。

综合以上实验结果，本发明的设计策略最适宜用于含有多个SNP位点的多个靶核酸同时进行熔解曲线分析。

实施例3.

在上述两个实施例的基础上，本实施例使用本申请的检测方法与探针同时检测11种样品，11个样品中含有各自的11个待测基因，分为1个内参基因(ATP8基因)与10个含有SNP位点的靶基因，检测的靶核酸如表3所示。

表3.本实施例的靶核酸

(1)引物和探针的设计

经多重筛选及优化，通过本申请方法设计了所使用的具体引物和探针，序列具体如表4所示(其中，F为上游引物，R为下游引物，P为探针)：

表4.引物及探针的序列

/>

/>

(2)反应液配制

使用商用一步法试剂

V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCRKit(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，13117ES60)，加入对应靶核酸的引物和探针，按表5的配比配制试剂。

表5.试剂的配比

/>

(3)反应液冻干

向反应液中加入冻干保护剂，混匀后分装至PCR八联管中，每个反应管的装量按25μL反应液计量，冻干程序参考中国专利CN108913758A“一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法及其应用”。冻干后加盖PCR八联管管盖，放入有防潮剂的密封袋保存。冻干试剂保存条件为常温或4℃至-20℃保存，在1年内使用。

(4)对照品

阳性对照品：含有各个靶基因的质粒，含有内参基因的质粒。质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

阴性对照品：去离子水

(5)检测及分析

核酸提取：使用Lab-Aid病毒型提取试剂(厦门致善生物科技股份有限公司，606004)，配合Lab-Aid 824s核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司)按产品操作说明书提取样本中的DNA与RNA。

加样：向含有干粉试剂的PCR管中加入25μL的模板，模板包括阳性对照品、阴性对照品和待测核酸。盖紧PCR管盖，使用涡旋振荡器混匀试剂，将试剂短暂离心至PCR管底。

反应：将配好的反应体系置于荧光定量PCR仪(宏石荧光PCR仪SLAN-96S)中进行反应，反应程序如表6所示。实验结果用配套的分析软件SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2进行分析。

表6.反应程序

上述对照品用于结果判断。在加入对应的内参基因或相应病原体核酸时，会在对应反应管的相应通道产生熔解曲线，而在非待测位置，没有信号产生。结果判读参见表7(此参考值仅适用于当前检测方案，因为T_m值由仪器计算生成，若换用其他荧光PCR仪器，或试剂组成改变时，T_m值会有所变化，需要匹配相应条件重新测试对照品获得参考值)。在实际样本检测时，若无目的熔解信号的升起，而内参、阳性对照品及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的熔解信号的升起，而内参、阳性对照品及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若有内参、阳性对照及阴性对照的检测结果出现异常，需查明原因后做出调整后重新检测。

表7.熔解峰的T_m值

在上述步骤的基础上，模拟混合阳性样本的检测。

模拟混合阳性样本的制备：取各靶基因(同实施例3)的弱阳性浓度的质粒(1*10²拷贝/μL)以等比例混合，得到模拟混合感染的阳性样本。模拟混合感染阳性样本的预期检测结果：在11个检测对象(靶基因)对应检测通道的相应T_m值处均有熔解峰。实验步骤与使用的引物、探针均如实施例3所述。

检测结果如图3所示，样本检测结果出现11个相应的熔解峰，结果符合预期，说明体系可以用于混合样本的检测，且能够同时检测出11个含有SNP位点的靶核酸。

实施例4.

在实施例3的基础上，本实施例检测下述三方面性能：

(1)试剂的最低检测限分析：将11个阳性对照品测定浓度计算拷贝数，从2*10⁵拷贝/μL十倍稀释至2*10⁰拷贝/μL，将以上梯度的阳性对照品加入冻干试剂中检测，每个梯度设置四个复孔。结果显示，11个对象在各浓度梯度下，四个平行孔均能稳定升起，所以检测体系中每个检测对象的最低检测限均为2*10⁰拷贝/μL。

(2)试剂的特异性分析：将11个阳性对照品的2*10⁶拷贝/μL(该浓度超过文献中所述的强阳性样本的浓度)，加入冻干试剂中检测，每个对照品设置四个复孔。结果如图4-14显示，11个对象均仅在自身对应的位置产生熔解峰，在非检测位置没有信号产生，所以检测体系的特异性良好。

(3)试剂的检测稳定性分析：进行三个批次试剂的分别检测，分别检测11个阳性对照品的最低检测限浓度(2*10⁰拷贝/μL)，每个对照品设置8个复孔，统计其熔解峰对应T_m值，并计算其SD值与CV值(SD:Standard Deviation，标准差是方差的算术平方根，标准差能反映一个数据集的离散程度。对本申请而言，因为T_m值是软件计算后生成的，所以在不同批次实验时T_m会有波动，需要统计不同批次间T_m值的波动并确认不会影响结果的判读。CV:coefficient of variation，定义为标准差与平均值之比，变异系数是不需要参照数据的平均值。与标准差相比，变异系数的好处是不需要参照数据的平均值，因此在比较两组量纲不同或均值不同的数据时，应该用变异系数而不是标准差来作为比较的参考。所以我们用CV值表征所有检测对象的稳定性)。结果如表8所示，各熔解峰在其所在位置的正负SD的T_m范围内，都不存在彼此交叉的情况，且CV值均小于1％，说明试剂的检测稳定性良好。

表8.试剂的检测稳定性分析

实施例5.

从厂家购入核酸疫苗4种，依据疫苗说明书，已知第一种疫苗含有NS5A基因，第二种疫苗含有M基因，第三种疫苗含有M基因、NSP2(Lineage8.7)基因，第四种疫苗含有MGF360-14L基因、I177L基因、CD2v基因和B646L基因，由此可以知道预期的检测结果。第一种疫苗预计在FAM通道的72.5±2℃和CY5通道的72.8±2℃的检测位置出熔解峰，第二种疫苗预计在ROX通道的61.3±2℃的检测位置出熔解峰，第三种疫苗预计在ROX通道的61.3±2和FAM通道的65.0±2的检测位置出熔解峰。第四种疫苗预计在ROX通道的77.0±2℃，HEX通道的58.53±2℃,HEX通道的68.0±2℃,CY5通道的60.3±2℃的检测位置出熔解峰。

检测结果见图15至18，检测结果完全符合预期，说明本方法可以准确检出并区分出含有SNP位点的各个疫苗。

实施例6.

本实施例收集猪的全血样本，已知该样本含有ATP8基因、M基因、MGF360-14L基因、I177L基因和CD2v基因，由此可以知道预期的检测结果。用如上实施例所述的提取步骤提取总核酸并检测。根据已知的结果，样本预计在1(即ROX通道的51.8±2℃)、2(即ROX通道的61.3±2℃)、4(即ROX通道的77.0±2℃)和5(即HEX通道的58.5±2℃)、6(即HEX通道的68.0±2℃)的检测位置出熔解峰。

检测结果如图19所示，样本在ROX通道的51.0℃、61.0℃、75.5℃和HEX通道的57.5℃、68.3℃有熔解峰升起，检测结果符合预期，说明本方法的检测结果准确，可以用于实际样本的检测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门致善生物科技股份有限公司

<120> 一种检测包含SNP位点的靶核酸的方法和试剂盒

<130> IDC210411

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 第一通用引物F0

<400> 1

cacatggact ctcgaagac 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 第二通用引物R0

<400> 2

cacatggact ctcgaagact g 21

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 1-F

<400> 3

cacatggact ctcgaagact ttgtgcatga ctgcgtcaac 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 1-R

<400> 4

cacatggact ctcgaagact gcttggtggt cgtggtcact gt 42

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 1-P

<400> 5

caccgtcaag cag 13

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 2-F

<400> 6

cacatggact ctcgaagact tgctaggccg caagtac 37

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 2-R

<400> 7

cacatggact ctcgaagact gacgccggac gacaaatgc 39

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 2-P

<400> 8

ctggcccctg ccc 13

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-F

<400> 9

cacatggact ctcgaagacc gtattggaca cctcttttga ctg 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-R

<400> 10

cacatggact ctcgaagact gaactggacc taatcttcct gcg 43

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-P

<400> 11

agcccaaggt cttcgcggat tccag 25

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 4-F

<400> 12

cacatggact ctcgaagacg ggttcggata caggcgtta 39

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 4-R

<400> 13

cacatggact ctcgaagact gcgtgttcct gccgtgtatc taa 43

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 4-P

<400> 14

acctcccagt tccgcacaca gccg 24

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 5-F

<400> 15

cacatggact ctcgaagacg aactggaaaa aactttaacg gca 43

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 5-R

<400> 16

cacatggact ctcgaagact ggtggaaagt taatgatcag ggct 44

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 5-P

<400> 17

atcctagctt gccggta 17

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 6-F

<400> 18

cacatggact ctcgaagaca acgcgttcgc ttttcg 36

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 6-R

<400> 19

cacatggact ctcgaagact gcatcgtggt ggttattgtt ggt 43

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 6-P

<400> 20

acgtgtccat aaaacgcagg tgaccc 26

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 7-F

<400> 21

cacatggact ctcgaagacg acgtgccccc aagctgat 38

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 7-R

<400> 22

cacatggact ctcgaagact gggatgccca tgttctgcga 40

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 7-P

<400> 23

cgtagaactg tgacaacaac gct 23

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 8-F

<400> 24

cacatggact ctcgaagacg cggcagttta ctccaggac 39

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 8-R

<400> 25

cacatggact ctcgaagact gccaacctct cttcccgcag tg 42

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 8-P

<400> 26

tgcctcccga gccaagatgt cac 23

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 9-F

<400> 27

cacatggact ctcgaagacc gcttccrgat gcmgwttgtg 40

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 9-R

<400> 28

cacatggact ctcgaagact gcgccactcc yygtttaaca gc 42

<210> 29

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 9-P

<400> 29

ttctggccct gcc 13

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-F

<400> 30

cacatggact ctcgaagacg atgatgatta ccttygcytt g 41

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-R

<400> 31

cacatggact ctcgaagact gcaactaata taaaaytctc ttgctct 47

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-P

<400> 32

ccacgggagg aatacaac 18

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 11-F

<400> 33

cacatggact ctcgaagact acaggacagt cgtcagtagt tcga 44

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 11-R

<400> 34

cacatggact ctcgaagact gccgctaggg ttaaggtgtg tct 43

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 11-P

<400> 35

cccacctcga gatgctatgt ggacga 26

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-P

<400> 36

ccacgggagg aatacaac 18

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-P-Y

<400> 37

ccacgggagg aataycaac 19

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-P-I

<400> 38

ccacgggagg aataycaac 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-Target1

<400> 39

gttggtattc ctcccgtgg 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 10-Target2

<400> 40

gttgatattc ctcccgtgg 19

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-P

<400> 41

agcccaaagg tcttcgcgga ttccag 26

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-P-YW

<400> 42

agcccaaagg tcttcgycgg wattccag 28

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-P-I

<400> 43

agcccaaagg tcttcgycgg yattccag 28

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-Target1

<400> 44

ctggaatacc gacgaagacc tttgggct 28

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-Target2

<400> 45

ctggaattcc gacgaagacc tttgggct 28

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-Target3

<400> 46

ctggaatacc ggcgaagacc tttgggct 28

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 3-Target4

<400> 47

ctggaattcc ggcgaagacc tttgggct 28

Claims

1.一种检测样品中的一种或多种靶核酸的方法，其包括以下步骤:

所述第一通用引物包含第一通用序列；

2.权利要求1的方法，其中，具有相同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有相同的熔解峰(熔点)，具有不同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有不同的熔解峰(熔点)；

优选地，不同熔解峰(熔点)的温度差为6℃至0.5℃(例如，0.5℃，1℃，1.5℃，2℃，2.5℃，3℃，3.5℃，4℃，4.5℃，5℃，5.5℃，6℃)。

3.权利要求1或2的方法，其中，所述探针核苷酸序列的长度为10nt-50nt(例如，10nt-30nt，30nt-50nt)；

优选地，所述探针核苷酸序列位于靠近检测探针的5’端区域或靠近检测探针的3’端区域；优选地，所述探针核苷酸序列位于检测探针的5’或3’端。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述检测探针具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(2)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；

(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；

(3)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；

(4)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(5)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(6)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；

(7)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；

(8)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于该熔解峰(熔点)的靶核酸的存在；

(9)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述样品包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸；

(2)所述靶核酸包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个SNP位点；

(3)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermusscotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶；

(4)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(5)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；

(6)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；

(7)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(8)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；

(9)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(10)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和

(11)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(12)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(13)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；

(14)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；

(15)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(16)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(17)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(18)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；

(19)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；

(20)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述样品选自全血，血清，血浆，核酸疫苗，或其任意组合；

(2)所述靶核酸选自DNA(例如基因组DNA或cDNA)，RNA(例如mRNA)或者其任何组合；

(3)所述靶核酸获自原核生物，真核生物或病毒；优选地，所述靶核酸获自哺乳动物(例如，猪)；

(4)所述靶核酸选自M基因，NSP2基因，MGF360-14L基因，I177L基因，CD2v基因，NSP2基因，NS5A基因，NSP2基因，B646L基因，5UTR基因，或其任意组合；

(5)所述检测探针具有选自下列的核苷酸序列或其任意组合：SEQ ID NO:8，11，14，17，20，23，26，29，32，35；

(6)所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任意组合：6和7；9和10；12和13；15和16；18和19；21和22；24和25；27和28；30和31；33和34；

(7)所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:1所示；

(8)所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

7.一种检测含有一种或多种SNP位点的靶核酸的探针组，针对每一种靶核酸，所述探针组包含至少一条检测探针；

8.权利要求7的探针组，其中，所述探针组具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述探针核苷酸序列的长度为10nt-50nt(例如，10nt-30nt，30nt-50nt)；

(2)具有相同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有相同的熔解峰(熔点)，具有不同探针核苷酸序列的检测探针与其特异的靶核酸杂交或退火具有不同的熔解峰(熔点)；

(3)所述探针核苷酸序列位于靠近检测探针的5’端区域或靠近检测探针的3’端区域；优选地，所述探针核苷酸序列位于检测探针的5’或3’端。

(4)在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(2)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；

(5)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；

(6)所述检测探针具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；

(7)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(8)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；

(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；

(11)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定对应于该熔解峰(熔点)的靶核酸的存在；

(12)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(13)所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任意组合：SEQ IDNO:8，11，14，17，20，23，26，29，32，35。

9.一种试剂盒，其包含权利要求7或8所述的探针组，以及鉴定引物组，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，

所述第一通用引物包含第一通用序列；

优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合；

优选地，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如DNA聚合酶，特别是热稳定的DNA聚合酶；

优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg2+)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；

优选地，所述试剂盒用于检测样品中的一种或多种靶核酸。

10.权利要求9的试剂盒，其中，所述试剂盒具有选自下列的一项或多项：

(1)所述靶核酸选自M基因，NSP2基因，MGF360-14L基因，I177L基因，CD2v基因，NSP2基因，NS5A基因，NSP2基因，B646L基因，5UTR基因，或其任意组合；

(2)所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任意组合：SEQID NO:6和7；9和10；12和13；15和16；18和19；21和22；24和25；27和28；30和31；33和34；

(3)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(4)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；

(5)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；

(6)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(7)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；

(8)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(9)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和

(10)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(11)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(12)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；

(13)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；

(14)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(15)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(16)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；

(17)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；

(18)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；

(19)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；

(20)所述第一通用引物的序列如SEQ ID NO:1所示；

(21)所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:2所示。