ES2929033T3 - Un método para la detección de Legionella - Google Patents
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Abstract
Esta invención se refiere a la detección de Legionella, más específicamente Legionella pneumophila, más específicamente Legionella pneumophila serogrupo 1, en una muestra. También se describen métodos de detección y ensayos y kits útiles para la detección. La invención proporciona un método para identificar la presencia, ausencia o cantidad de Legionella pneumophila serogrupo 1 en una muestra, comprendiendo el método los pasos de detectar la presencia, ausencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen lpg0768. o un producto de expresión del mismo, y correlacionar la presencia, ausencia o cantidad de al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico del gen lpg0768 o un producto de expresión del mismo, con la presencia, ausencia o cantidad de Legionella pneumophila serogrupo 1 en el muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para la detección de Legionella
Campo de la invención
Esta invención se refiere a la detección de Legionella, más específicamente Legionella pneumophila, más específicamente del serogrupo 1 de la Legionella pneumophila, en una muestra. También se describen métodos de detección y ensayos y kits útiles para la detección.
Antecedentes de la invención
Las infecciones adquiridas en edificios, hospitales e instituciones de atención médica afectan aproximadamente a 2 millones de personas, provocan aproximadamente 98.000 muertes y cuestan 29 billones USD solo en los Estados Unidos cada año. La carga económica de las infecciones adquiridas en los hospitales de Europa se estima en 7 billones € al año.
El agua, la distribución de agua y los sistemas de fontanería de las instalaciones se han identificado como una fuente de muchas de estas infecciones y pueden representar una amenaza significativa para la salud humana, especialmente en pacientes con sistemas inmunológicos debilitados y pacientes con alta dependencia en unidades de cuidados intensivos. A medida que los equipos de control y prevención de infecciones dentro de los entornos clínicos reconocen cada vez más los riesgos para la salud del paciente, se están empleando una variedad de tecnologías de prueba y tratamiento para intentar erradicar los microorganismos patógenos del agua. A pesar de la gama de tecnologías que se aplican, el problema de las infecciones transmitidas por el agua, en particular de la especie Legionella, en el entorno sanitario sigue persistiendo.
La enfermedad de la legionelosis se reconoció por primera vez en 1976 durante un brote de neumonía en una convención de la Legión Americana en Filadelfia. Legionella spp., el agente causante de la enfermedad de la legionelosis, es responsable de los brotes tanto de neumonía adquirida en el hospital como adquirida en la comunidad. En los entornos de atención médica, hay proporciones cada vez mayores de pacientes inmunológicamente comprometidos, lo que aumenta el potencial de infección de los pacientes por dichos microorganismos patógenos oportunistas. El microorganismo más común asociado con la enfermedad de la legionelosis es Legionella pneumophila. El serogrupo 1 de L. pneumophila es el más relevante clínicamente. Actualmente, las pruebas de rutina para el serogrupo 1 de L. pneumophila se realizan utilizando técnicas microbiológicas tradicionales. Este método está limitado por la naturaleza fastidiosa y los largos períodos de incubación requeridos por Legionella spp. y también por la presencia de Legionelas viables pero no cultivables.
Las metodologías estándar basadas en cultivos de la técnica anterior tienen siglos de antigüedad y son lentas para ofrecer un resultado para Legionella, tardando hasta 2 semanas. Además, las metodologías basadas en cultivos de la técnica anterior por sí solas no pueden identificar específicamente si el serogrupo 1 de L. pneumophila está presente en una muestra. El serogrupo 1 es el serogrupo más importante desde la perspectiva de la salud humana, ya que causa ~95 % de infecciones También hay una serie de kits basados en inmunodetección y bioquímicos de la técnica anterior para estos microorganismos. Sin embargo, no son muy sensibles y no son realmente cuantitativos.
El documento WO2013187958 describe métodos para detectar Legionella (tal como Legionella spp., Legionella pneumophila, el serogrupo 1 de Legionella pneumophila, Legionella bozemanii, Legionella dumoffii, Legionella feeleii, Legionella longbeachae, y/o Legionella micdadei). También se divulgan sondas y cebadores para la detección de Legionella y kits que contienen las sondas y/o cebadores descritos.
El documento WO2011133433 describe métodos para detectar Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae y Legionella spp. También se describen sondas y cebadores para la detección de M. pneumoniae, C. pneumoniae y Legionella spp., y kits que contienen las sondas y/o cebadores descritos.
Compendio de la invención
Según la presente invención, se proporciona un método para identificar la presencia o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1 o un producto de expresión del mismo; y
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo a la presencia, o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en la muestra.
Opcionalmente, el método comprende además las etapas de: (ai) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB, o un producto de expresión del mismo; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad de Legionella pneumophila en la muestra.
Opcionalmente, el método comprende además las etapas de: (aii) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA, o un producto de expresión del mismo; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad del género Legionella en la muestra.
Opcionalmente, el método comprende las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1 o un producto de expresión del mismo;(ai) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o un producto de expresión del mismo;
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo a la presencia, o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en la muestra; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad de Legionella pneumophila en la muestra.
Opcionalmente, el método comprende las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1 o un producto de expresión del mismo;(aii) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o un producto de expresión del mismo;
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo a la presencia, o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en la muestra; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad del género Legionella en la muestra.
Opcionalmente, el método comprende las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1 o un producto de expresión del mismo;
(ai) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB, o un producto de expresión del mismo;
(aii) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA, o un producto de expresión del mismo;
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo a la presencia o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en la muestra; correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad de Legionella pneumophila en la muestra; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad del género Legionella en la muestra.
Opcionalmente, la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo indica la presencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila . Opcionalmente, la cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo indica la cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila.
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas (neuB).
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por el Número de Acceso de Genbank AE017354; pares de bases 839972 a 840171.
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 y 21 -48.
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85 %, 87,5 %, 88 %, 88,5 %, 94 %, 94,5 %, 95 %, o 100 % de identidad de secuencia con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 y 21-48.
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 comprende una secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 y 21-48.
Opcionalmente, la etapa de detección (a) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador capaz de hibridarse con al menos parte de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1, opcionalmente al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 y 21-48; bajo condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación del círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tecnología de amplificación de ARN mediada por señal (SMART), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento múltiple isotérmico (IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica de cebador único (SIPA), circular Amplificación dependiente de helicasa (cHDA) y Secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, la etapa de detección (a) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, y el inverso complementa cada uno de ellos; en condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación del círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tecnología de amplificación de ARN mediada por señal (SMART), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento múltiple isotérmico (IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica de cebador único (SIPA), circular Amplificación dependiente de helicasa (cHDA) y Secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, el al menos un cebador tiene una concentración final de aproximadamente 0,05-0,5 pM, opcionalmente 0,05 pM, opcionalmente 0,5 pM.
Opcionalmente, la etapa de detección (a) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda capaz de hibridarse con al menos parte de al menos parte de SEQ ID NO. 1, opcionalmente al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1 y 21-48, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la etapa de detección (a) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 4 y su complemento inverso, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente hexaclorofluoresceína.
Opcional o adicionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia.
Opcionalmente, los parámetros de ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR en tiempo real, o PCR cuantitativa en tiempo real, comprenden unos 10 minutos de incubación a unos 95 °C, opcionalmente o adicionalmente unos 50 ciclos de aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 30 segundos, seguido opcional o adicionalmente de una etapa de enfriamiento a aproximadamente 40 °C durante aproximadamente 10 segundos.
Opcionalmente, la al menos una sonda tiene una concentración final de aproximadamente 0,02-0,8 j M, opcionalmente 0,02 j M, opcionalmente 0,08 j M, opcionalmente 0,2 j M, opcionalmente 0,8 j M.
Opcionalmente, la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo indica la presencia de Legionella pneumophila. Opcionalmente, la presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, indica la presencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila y Legionella pneumophila.
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia de Legionella pneumophila y la ausencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila .
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia de al menos un organismo seleccionado de los serogrupos 2 16 de Legionella pneumophila.
La ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de SEQ ID NO. 1 o el producto de expresión del mismo, puede indicar al menos un resultado falso seleccionado entre: un resultado falso negativo en la etapa de detección (ai) y un resultado falso positivo en la etapa de detección (a).
La ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o del producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la ausencia de cada uno del serogrupo 1 de Legionella pneumophila y Legionella pneumophila.
Opcionalmente, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína B pequeña (smpB).
Opcionalmente, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por el número de acceso de Genbank AE017354; pares de bases 3213961 a 3214076.
Opcionalmente, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO. 6.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador capaz de hibridarse con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB, opcionalmente con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO. 6, bajo condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación del círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), tecnología de amplificación de ARN mediada por señal (SMART), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación de desplazamiento múltiple isotérmico (IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica de cebador único (SIPA), amplificación dependiente de helicasa circular (cHDA) y secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 13, y el complemento inverso de cada uno de ellos, bajo condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación de círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), tecnología de amplificación de ARN mediada por señales (SMART), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento múltiple isotérmico (IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), Amplificación isotérmica de cebador único (SIPA), Amplificación dependiente de helicasa circular (cHDA) y Secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, y el complemento inverso de cada uno de ellos, bajo condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación de círculo rodante (RCA ), reacción en cadena de la ligasa (LCR), tecnología de amplificación de ARN mediada por señales (SMART), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento múltiple isotérmico (IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), Amplificación isotérmica de cebador único (SIPA), Amplificación dependiente de helicasa circular (cHDA) y Secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, el al menos un cebador tiene una concentración final de aproximadamente 0,05-0,5 pM, opcionalmente 0,05 pM, opcionalmente 0,5 pM.
Opcionalmente, los parámetros de ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR en tiempo real, o PCR cuantitativa en tiempo real, comprenden aproximadamente 5 minutos de incubación a aproximadamente 95 °C, opcionalmente o adicionalmente aproximadamente 50 ciclos de aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 30 segundos, seguido opcional o adicionalmente de una etapa de enfriamiento a aproximadamente 40 °C durante aproximadamente 10 segundos.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda capaz de hibridarse con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB, opcionalmente con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO. 6, bajo condiciones adecuadas para la hibridación. Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 9 y su complemento inverso, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO. 52, y su complemento inverso, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente hexaclorofluoresceína.
Opcional o adicionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia.
Opcionalmente, la al menos una sonda tiene una concentración final de aproximadamente 0,02-0,8 pM, opcionalmente 0,02 pM, opcionalmente 0,08 pM, opcionalmente 0,2 pM, opcionalmente 0,8 pM.
Opcionalmente, la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo indica la presencia del género Legionella. Opcionalmente, la presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, indica la presencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila y Legionella pneumophila.
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia del género Legionella y la ausencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila.
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, indica la presencia de al menos un organismo seleccionado de los serogrupos 2-16 de Legionella pneumophila, Legionella anisa, L. birminghamensis, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. bozemanii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. dumoffii, L. erythra, L. feeleii-1, L. feelii-2, L. gormanii, L. gormanii, L. hackeliae-1, L. hackeliae-2, L. jordanis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae-1, L. maceachemii, L. miodadei, L. oakridgensis, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. wadworthii, L. cherrii, L. jamestowniensis, L. londoniensis, L. taurinsis, L. moravica, L. adelaidensis, L. donaldsonii, L. gratiana, L. gresilensis, L. fairfieldensis, L. israelensis, L. fallonii, L. brunensis, L. busanensis, L. quinlivanii y L. rubrilicens u otras no especies de legionella pneumophila.
La ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o del producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o el producto de expresión del mismo, puede indicar al menos un resultado falso seleccionado entre: un resultado falso negativo en la etapa de detección (aii) y un resultado falso positivo en la etapa de detección (a).
La ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o del producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la ausencia de cada uno de los del género Legionella y del serogrupo 1 de Legionella pneumophila.
Opcionalmente, la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia del al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, indica la presencia de cada uno de los géneros Legionella, Legionella pneumophila y el serogrupo 1 de Legionella pneumophila.
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia del género Legionella y Legionella pneumophila, y la ausencia del serogrupo 1 de Legionella pneumophila .
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia del género Legionella y al menos un organismo seleccionado del serogrupo 2-16 de Legionella pneumophila .
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia del género Legionella, y también indica al menos un resultado falso seleccionado de: un resultado falso negativo en la etapa de detección (ai), un resultado falso positivo en la etapa de detección (a).
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia de al menos un organismo seleccionado de Legionella anisa, L. birminghamensis, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. bozemanii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. dumoffii, L erythra, L. feeleii-1, L. feelii-2, L. gormanii, L. gormanii, L. hackeliae-1, L. hackeliae-2, L. jordanis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae-1, L. maceachemii, L. miodadei, L. oakridgensis, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. wadworthii, L. cherrii, L. jamestowniensis, L. londoniensis, L. taurinsis, L. moravica, L. adelaidensis, L. donaldsonii, L. gratiana, L. gresilensis, L. fairfieldensis, L. israelensis, L. fallonii, L. brunensis, L. busanensis, L. quinlivanii, L. rubrilicens, u otros no-especies de legionella pneumophila, y también puede indicar al menos un resultado falso seleccionado de: un resultado falso negativo en la etapa de detección (ai), un resultado falso positivo en la etapa de detección (a).
La presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia de al menos un organismo seleccionado del género Legionella, y la ausencia de cada una de las especies de Legionella pneumophila y del serogrupo 1 de Legionella pneumophila .
La presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, y la ausencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la ausencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, puede indicar la presencia de al menos un organismo seleccionado entre Legionella anisa, L. birminghamensis, L.. birminghamensis, L. bozemanii, L. bozemanii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. dumoffii, L. erythra, L. feeleii-1, L. feelii-2, L. gormanii, L. gormanii, L. hackeliae-1, L. hackeliae-2, L. jordanis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae-1, L. maceachemii, L. miodadei, L. oakridgensis, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. wadworthii, L. cherrii, L. jamestowniensis, L. londoniensis, L. taurinsis, L. moravica, L. adelaidensis, L. donaldsonii, L. gratiana, L. gresilensis, L. fairfieldensis, L. israelensis, L. fallonii, L. brunensis, L. busanensis, L. quinlivanii, L. rubrilicens, u otras especies que no sean Legionella pneumophila, y la ausencia de especies de Legionella pneumophila o el serogrupo 1 de Legionella pneumophila .
La ausencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo, la presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo, y la presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO.
1 o producto de expresión del mismo, pueden indicar al menos un resultado falso seleccionado de entre: un resultado falso negativo en la etapa de detección (aii), un resultado falso positivo en la etapa de detección (ai), y un resultado falso positivo en la etapa de detección (a).
La ausencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o del producto de expresión del mismo, la presencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o del producto de expresión del mismo, y la ausencia de la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1 o del producto de expresión del mismo, pueden indicar al menos un resultado falso seleccionado entre: un resultado falso negativo en la etapa de detección (aii), un resultado falso positivo en la etapa de detección (ai), y un resultado falso negativo en la etapa de detección (a).
La ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o del producto de expresión del mismo, la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o del producto de expresión del mismo, y la ausencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o del producto de expresión del mismo, pueden indicar la ausencia de cada uno de los géneros Legionella, de la especie Legionella pneumophila y del serogrupo 1 de Legionella pneumophila .
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por el número de acceso del Genbank AE017354; pares de bases 172917 a 173144.
Opcionalmente, la al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por la SEQ ID NO. 5.
Opcionalmente, la etapa de detección (aii) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador capaz de hibridar con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA, opcionalmente con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO. 5, en condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), Amplificación en círculo rodante (RCA), Reacción en cadena de la ligasa (LCR), Amplificación mediada por señales de la tecnología del ARN (SMART), Amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación isotérmica por desplazamiento múltiple (IMDA), amplificación dependiente de la helicasa (HDA), amplificación isotérmica con cebador único (SIPA), amplificación circular dependiente de la helicasa (cHDA) y secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, la etapa de detección (aii) comprende: poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tenga una secuencia de ácido nucleico definida por al menos una de las SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, y el complemento inverso de cada uno de ellos, en condiciones adecuadas para una amplificación in vitro, opcionalmente una amplificación in vitro seleccionada del grupo que comprende: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), Amplificación en círculo rodante (RCA), Reacción en cadena de la ligasa (LCR), Amplificación mediada por señales de la tecnología del ARN (SMART), Amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación isotérmica por desplazamiento múltiple (IMDA), amplificación dependiente de la helicasa (HDA), amplificación isotérmica con cebador único (SIPA), amplificación circular dependiente de la helicasa (cHDA) y secuenciación de próxima generación (NGS).
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se selecciona entre PCR en tiempo real y PCR cuantitativa en tiempo real.
Opcionalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente la PCR en tiempo real, opcionalmente la PCR cuantitativa en tiempo real, comprende además la pirosecuenciación.
Opcionalmente, el al menos un cebador tiene una concentración final de aproximadamente 0,05-0,5 j M, opcionalmente 0,05 j M, opcionalmente 0,5 j M.
Opcionalmente la reacción en cadena de la polimerasa, o la PCR en tiempo real, o la PCR cuantitativa en tiempo real, los parámetros de ciclado comprenden unos 10 minutos de incubación a unos 95°C, opcional o adicionalmente 50 ciclos a unos 95°C durante unos 10 segundos y a unos 63°C durante unos 30 segundos, opcional o adicionalmente seguidos de una etapa de enfriamiento a unos 40°C durante unos 10 segundos.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con una sonda capaz de hibridar con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA, opcionalmente con al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por la SEQ ID NO. 5, en condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la etapa de detección (ai) comprende: poner en contacto la muestra con al menos una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 12 y su complemento inverso, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
Opcionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente fluoresceína.
Opcional o adicionalmente, la al menos una sonda comprende al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia.
Opcionalmente, la al menos una sonda tiene una concentración final de aproximadamente 0,02-0,8 j M, opcionalmente 0,02 j M, opcionalmente 0,08 j M, opcionalmente 0,2 j M, opcionalmente 0,8 j M.
Opcionalmente, el método es un método múltiplex.
Opcionalmente, el método es un método de reacción en cadena de polimerasa múltiplex.
Esta invención proporciona un método de amplificación de ácido nucleico in vitro múltiplex para identificar un serogrupo de Legionella pneumophila presente en una muestra, en donde el método comprende detectar la presencia de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico dianas en la muestra en una reacción, en donde al menos uno de la molécula de ácido nucleico diana está presente en el genoma de uno o más, pero no todos, de los serogrupos de Legionella pneumophila.
Los métodos anteriores para la detección de Legionella pneumophila no han sido capaces de identificar específicamente el serogrupo 1 de Legionella pneumophila de una manera que sea útil en la práctica. Esto significa que la provisión de diagnóstico y tratamiento no se adapta al serogrupo específico presente a menos que se lleve a cabo una experimentación extensa. Esto requiere mucho tiempo y esfuerzo que es incompatible con un diagnóstico y tratamiento rápidos y efectivos. Esta invención, por primera vez, proporciona un método que es capaz de identificar miembros del serogrupo 1 de Legionella pneumophila de una manera rápida y fácilmente interpretable. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que existe suficiente variación entre los serogrupos pero suficiente conservación entre los aislados del mismo serogrupo para identificar específicamente el serogrupo 1 de Legionella pneumophila en un ensayo de amplificación de ácido nucleico múltiplex de una sola reacción. Al identificar y caracterizar una serie de secuencias compartidas o no entre los diferentes miembros de Legionella, la presente invención permite el uso de métodos de amplificación de ácidos nucleicos múltiplex para detectar específicamente el serogrupo 1 de Legionella pneumophila.
Los serogrupos que componen Legionella pneumophila están estrechamente relacionados pero difieren significativamente en su patología y susceptibilidad a ciertos tratamientos. Por lo tanto, aunque es importante poder distinguir entre los diferentes serogrupos, anteriormente no ha sido posible hacerlo de una manera sencilla que sea susceptible de uso en el diagnóstico rápido. Los diferentes miembros de Legionella pneumophila comparten una proporción importante de su material genético. La presente invención ha identificado con éxito suficientes diferencias entre los genomas de los miembros de Legionella pneumophila para ser capaz de distinguirlos en ensayos múltiplex de amplificación de ácidos nucleicos in vitro. En contraste con los métodos de la técnica anterior, los métodos de la presente invención permiten realizar una sola reacción múltiplex que proporciona señales claras para identificar qué serogrupo está presente en la muestra probada. No es necesario ejecutar geles ni realizar una interpretación compleja de los resultados.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que es posible identificar el serogrupo 1 de Legionella pneumophila, a pesar de la alta homología de secuencia que existe entre los serogrupos de Legionella pneumophila. En particular, la presente invención proporciona un ensayo múltiple de amplificación de ácidos nucleicos in vitro que es capaz de identificar serogrupos de Legionella pneumophila, tal como el serogrupo 1 de Legionella pneumophila en una única reacción. Los inventores también han descubierto que la presencia de al menos un organismo seleccionado de los otros serogrupos en la especie Legionella pneumophila, incluyendo cualquiera de los serogrupos 1-16, también puede identificarse en la misma reacción única. Además, los inventores han ideado un método para detectar la presencia de otros miembros del género Legionella, incluyendo Legionella anisa, L. birminghamensis, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. bozemanii, L. cincinnatiensis, L. dumoffii, L. dumoffii, L. erythra, L. feeleii-1, L. feelii-2, L. gormanii, L. gormanii, L. hackeliae-1, L. hackeliae-2, L. jordanis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae-1, L. maceachemii, L. miodadei, L. oakridgensis, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. wadworthii, L. cherrii, L. jamestowniensis, L. londoniensis, L. taurinsis, L. moravica, L. adelaidensis, L. donaldsonii, L. gratiana, L. gresilensis, L. fairfieldensis, L. israelensis, L. fallonii, L. brunensis, L. busanensis, L. quinlivanii y L. rubrilicens.
La presente invención contempla el uso de cualquier método apropiado para la amplificación de regiones diana. El método de amplificación será en general PCR. La PCR en tiempo real (RT-PCR) es un ejemplo de esto. En ciertas realizaciones, se EE. UU. RT-PCR usando sondas indicadoras fluorescentes. El uso de sondas indicadoras aumenta significativamente la especificidad y permite la cuantificación incluso en presencia de amplificación de ADN no específica. Las sondas fluorescentes son especialmente adecuadas para ensayos múltiplex, ya que se pueden utilizar sondas específicas con etiquetas de diferentes colores. La RT-PCR se basa en una sonda basada en ADN con un indicador fluorescente en un extremo y un desactivador de fluorescencia en el extremo opuesto de la sonda. La proximidad del reportero al desactivador impide la detección de su fluorescencia; la ruptura de la sonda por la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa de ADN (por ejemplo, la polimerasa Taq) rompe la proximidad informador-desactivador y da como resultado la emisión de fluorescencia. Por lo tanto, un aumento en el producto objetivo de la sonda indicadora en cada ciclo de PCR causa un aumento proporcional en la fluorescencia debido a la ruptura de la sonda y la liberación del indicador.
Además, los métodos de la invención por lo tanto pueden configurarse para permitir la cuantificación, es decir, el método comprende determinar la cantidad de un miembro de un grupo de organismos bacterianos en una muestra. Esto se puede lograr, p. ej., seleccionando parámetros apropiados para la amplificación (p. ej., el número de ciclos de amplificación).
A continuación se hace referencia a otros métodos apropiados de amplificación.
También se contempla para su uso en la presente invención la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) es una técnica de amplificación isotérmica que utiliza tres enzimas (RNasa H, AMV transcripvelocidad inversa y T7 ARN polimerasa) que trabajan en conjunto a una temperatura isotérmica baja (generalmente 41 °C). El producto de una reacción NASBA es principalmente ARN monocatenario, que puede detectarse mediante electroforesis en gel, ensayo en gel ligado a enzimas (ELGA) o detección electroquimioluminiscente (ECL). Alternativamente, los productos NASBA pueden detectarse en tiempo real utilizando balizas moleculares incluidas en la reacción. En el diagnóstico microbiano, NASBA se ha combinado con éxito con métodos electroquimioluminiscentes (ECL), dendrímeros marcados con ELISA y métodos basados en balizas moleculares para detectar e identificar patógenos virales y bacterianos (Scheler et al., 2009).
También se contempla para su uso en la presente invención la amplificación de círculo rodante (RCA). RCA describe un proceso de replicación de ácido nucleico unidireccional que puede sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN. RCA es una tecnología que se adapta a un formato de amplificación de señal en chip. RCA se adapta bien a los formatos de fase sólida, tales como micromatrices, para generar señales localizadas en ubicaciones específicas de micromatrices. Esta propiedad distintiva de RCA debería permitir que muchos ensayos se realicen simultáneamente (múltiplexación) sin interferencias.
También se contempla para su uso en la presente invención la Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR). LCR utiliza dos pares complementarios de sondas que, cuando se dispone de la plantilla correcta, se hibridan una al lado de la otra y después se ligan entre sí. Estas sondas ligadas más la plantilla original sirven como plantilla para el siguiente ciclo de hibridación y ligadura. A medida que se realizan los ciclos posteriores, la amplificación avanza exponencialmente. Un kit comercialmente disponible que EE. UU. esta tecnología es el kit específico del complejo LCx M. tuberculosis disponible de Abbott Diagnostics.
Otras tecnologías de amplificación isotérmica que se contemplan para su uso con la presente invención se proporcionan e incluyen tecnología de amplificación de ARN mediada por señal (SMART), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento múltiple isotérmico ( IMDA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica de cebador único (SIPA) y amplificación dependiente de helicasa circular (cHDA). Como ejemplifica
SMART, el método de amplificación utilizado con la invención puede comprender la amplificación de la señal en lugar de la amplificación de la diana.
También se contempla para su uso en la presente invención la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de próxima generación es un campo de secuenciación relativamente nuevo que permite un proceso rápido de alto rendimiento. NGS tiene la capacidad de generar gigabases de secuencia de nucleótidos, dependiendo del instrumento utilizado, en una sola ejecución. Un ensayo descrito recientemente combina el uso de PCR en tiempo real en combinación con pirosecuenciación que permite la detección rápida de ADN de MTC además de la secuenciación de una región central de 81 pb del gen rpoB asociado con la resistencia a la rifampicina (Halse et al., 2010).
Opcionalmente, la muestra comprende sustancialmente una muestra de agua.
Opcionalmente, la muestra comprende sustancialmente una muestra de agua ambiental.
Opcionalmente, la muestra comprende sustancialmente una muestra de un sistema de distribución de agua.
Opcionalmente, la muestra comprende sustancialmente una muestra de un sistema de plomería.
Opcionalmente, la muestra comprende sustancialmente una muestra de un sistema de agua de un centro sanitario.
También se describe un kit de detección de Legionella que comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridarse con al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen Ipg0768 o un producto de expresión del mismo, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o un producto de expresión del mismo, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o un producto de expresión del mismo; e instrucciones de uso.
Opcionalmente, el kit comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridar con al menos una secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1, 5, 6 y 21 -48, o cualquier producto de expresión de cada una de ellas; e instrucciones de uso.
Opcionalmente, el kit comprende al menos un cebador o sonda que tiene la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 3, 4, 7, 8, 9 y 13; e instrucciones de uso.
También se describe un kit de detección de Legionella que comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridarse con al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen Ipg0768 o un producto de expresión del mismo, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o un producto de expresión del mismo, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o un producto de expresión del mismo; e instrucciones de uso.
Opcionalmente, el kit comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridar con al menos una secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1, 5, 6 y 21 -48, o cualquier producto de expresión de cada una de ellas.
Opcionalmente, el ensayo comprende un soporte sólido y al menos un cebador o sonda que tiene la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 3, 4, 7, 8, 9 y 13.
Opcionalmente, el ensayo de micromatriz que comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridarse con al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen Ipg0768 o un producto de expresión del mismo, al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o un producto de expresión del mismo, el al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o un producto de expresión del mismo.
Opcionalmente, la micromatriz comprende al menos un cebador o sonda capaz de hibridar con al menos una secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 1, 5, 6 y 21-48, o cualquier producto de expresión de cada una de ellas.
Opcionalmente, la micromatriz revela al menos un cebador o sonda que tiene la secuencia de ácido nucleico definida por cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 3, 4, 7, 8, 9 y 13.
También se proporciona un método para detectar la enfermedad de la legionelosis que comprende un método según la invención, en donde la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo indica la presencia de la enfermedad de la legionelosis.
Opcionalmente, el método para la detección de la legionelosis comprende las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.
1 o un producto de expresión del mismo; y
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo, a la presencia o cantidad de la enfermedad de la legionelosis. Opcionalmente, el método es un método in vitro.
Opcionalmente, cualquier sonda utilizada en el método para detectar la enfermedad de la legionelosis puede comprender además al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente hexaclorofluoresceína, opcionalmente rodamina, opcionalmente fluoresceína.
Opcional o adicionalmente, la sonda puede comprender además al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia.
El término "producto de expresión" se refiere a cualquier molécula que pueda obtenerse a partir de una secuencia de ácido nucleico mediante transcripción, traducción, modificación postraduccional o transcripción inversa; incluyendo pero no limitado a ARN, polipéptido de aminoácido, proteína y ADN complementario. El término "sg1" es sinónimo del término "serogrupo 1".
El término "desactivador terminal" se refiere a un colorante que apaga la fluorescencia, que puede estar ubicado en o junto a al menos un extremo, opcionalmente ubicado en o junto a al menos un extremo terminal, de una sonda; por ejemplo, ubicado en o adyacente al menos al extremo 3' de una sonda de oligonucleótidos. El término "desactivador interno" se refiere a un colorante que apaga la fluorescencia, que se puede ubicar entre los extremos, opcionalmente ubicado entre los extremos terminales de una sonda; por ejemplo, ubicado entre los extremos 3' y 5' de una sonda de oligonucleótidos.
Breve descripción de los dibujos
A continuación se describirán realizaciones de la invención en relación con los dibujos adjuntos en los que: La Figura 1(a) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la prueba de inclusión del ensayo del serogrupo 1 L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768 para la detección de cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila;
La Figura 1(b) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran las pruebas de exclusividad del ensayo del serogrupo 1 de L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768. No se observaron reacciones cruzadas con cepas estrechamente relacionadas con el serogrupo 1 de L. pneumophila;
La Figura 2(a) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la prueba de inclusión del ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB para la detección de cepas de L. pneumophila;
La Figura 2(b) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran las pruebas de exclusividad del ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB. No se observaron reacciones cruzadas con especies y cepas distintas de Legionella pneumophila probadas. La Figura 3(a) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran pruebas de inclusión de especies del género Legionella en el ensayo dirigido a una región del gen ssrA para la detección de cepas de Legionella, usando el ensayo múltiplex;
La Figura 3(b) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la especificidad del ensayo del serogrupo 1 L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768 para la detección del aislamiento del serogrupo 1 de L. pneumophila;
La Figura 3(c) ilustra curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la especificidad del ensayo de especies L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB para la detección de todas las cepas de L. pneumophila y la no detección de otras especies de Legionella; y
La figura 3(d) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la detección del ensayo de control de amplificación interna (IAC) en cada muestra probada.
La Figura 4(a) ilustra las curvas de amplificación de PCR cuantitativas en tiempo real, que muestran pruebas de inclusión de especies del género Legionella en el ensayo dirigido a una región del gen ssrA para la detección de cepas de Legionella, utilizando el ensayo multiplex;
La Figura 4(b) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la especificidad del ensayo del serogrupo 1 L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768 para la detección del aislamiento del serogrupo 1 de L. pneumophila;
La Figura 4(c) ilustra curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la especificidad del ensayo de especies L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB para la detección de todas las cepas de L. pneumophila y la no detección de otras especies de Legionella; y
La figura 4(d) ilustra las curvas de amplificación de PCR en tiempo real cuantitativas, que muestran la detección del ensayo de control de amplificación interna (IAC) en cada muestra probada.
Ejemplos
Las realizaciones de la presente invención se describirán ahora en detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 - ensayo de PCR en tiempo real para la detección del serogrupo 1 de Legionella pneumophila Identificación de objetivos in silico
La información de la secuencia del genoma completo disponible públicamente se recuperó del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov /) para el serogrupo 1 de Legionella pneumophila y el serogrupo 6 y serogrupo 12 de Legionella pneumophila. Las regiones potencialmente exclusivas del serogrupo 1 de L. pneumophila se identificaron usando WEBACT (www.webact.org/). Esto resultó en una serie de regiones de diferencia en el serogrupo 1 de L. pneumophila. Cada supuesta secuencia de nucleótidos diana identificada se analizó mediante BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar si estaban presentes en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila y estaban ausentes en todos los demás serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Una región estaba presente en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila analizados con una similitud de secuencia muy baja o nula con otros serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Esta región era el gen Ipg0768(SEQ ID NOs 1 y 21-48) que codifica la proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas, NeuB. Las secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas se alinearon utilizando ClustalW( www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
En este ejemplo, se usaron los siguientes cebadores y sonda de ensayo de PCR en tiempo real de ejemplo para el gen Ipg0768 (SEQ ID NOs 1 y 21-48): cebador directo de proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas (SEQ ID NO. 2), recubrimiento de esporas cebador inverso de proteína E de biosíntesis de polisacáridos (SEQ ID NO. 3), sonda de proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas (SEQ ID NO. 4). La sonda de cubierta de esporas (SEQ ID NO. 4) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente hexaclorofluoresceína (5' HEX, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda de proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas (SEQ ID NO. 4) comprende al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia, opcionalmente un inhibidor interno, tal como el inhibidor ZEN™, Integrated DNA Technologies; y/o un desactivador terminal, tal como 3' IowaBlack®FQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 1®, LGC Biosearch.
Cepas bacterianas, medio de cultivo y condiciones de crecimiento
En este estudio se utilizó un panel de 26 cepas de Legionella pneumophila y otras 41 especies de Legionella (Tabla 1(a) y 1(b)). Estas especies y cepas se adquirieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ. Braunschweig, Alemania), la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC, Public Health England, Salisbury, Reino Unido), la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, proporcionada por los estándares LGC, Middlesex, Reino Unido). Todas las especies y cepas de Legionella se cultivaron en medio de extracto de levadura de carbón tamponado (BCYE) a 37 °C durante 18-24 horas o hasta que se observó un crecimiento suficiente.
Tabla 1 a Panel de inclusión
Tabla 1b Panel de exclusividad
Aislam iento y cuantificación de ADN
El ADN genómico de cultivos de Legionella se aisló mediante un procedimiento modificado que combina lisis mecánica (kit de lisis IDI; Becton Dickenson, Canadá) y purificación mediante un kit de purificación de ADN (kit rápido de gDNA; Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Brevemente, se resuspendió un bucle de cultivo en 250 ul de tampón de lisis (tampón de lisis IDI). La suspensión se transfirió a un tubo de lisis celular (GeneOhm) y se batió con perlas (Mini-Bead-Beater-16; Stratech, Reino Unido) durante 3 minutos. Después de batir las perlas, se transfirieron 200 pl a una columna de centrifugación de purificación de ácido nucleico (columna Zymo-Spin™) en un tubo de recolección y se siguieron las etapas 2 a 5 del procedimiento para la purificación de ADN total a partir de suspensiones celulares, según las instrucciones del fabricante.
Diseño del ensayo
Todos los cebadores y sondas de oligonucleótidos utilizados en este estudio se diseñaron según las pautas publicadas.
PCR en tiempo real
Este ensayo específico del serogrupo 1 de Legionella pneumophila se probó después en un formato de PCR en tiempo real contra un panel de especies de Legionella bien caracterizadas para determinar la especificidad del ensayo (pruebas de inclusión y exclusividad) y la idoneidad de la secuencia de nucleótidos objetivo como marcador de diagnóstico.
La PCR en tiempo real se realizó en un dispositivo de amplificación de PCR en tiempo real (LightCycler® 480 Instrument, Roche Diagnostics) utilizando un kit de sondas de PCR en tiempo real (LightCycler® 480 Probes Master kit, Roche Diagnostics). La mezcla de reacción comprendía: mezcla maestra (LightCycler® 480 Probes Master; MgCh 6,4 mM), cebador directo e inverso (0,5 pM de concentración final), sonda marcada con
carboxifluoresceína (FAM) (0,2 jM de concentración final), ADN molde (5 |jl ) y dH2O libre de nucleasas hasta un volumen final de 20 jl. Los parámetros de ciclado consistieron en 10 minutos de incubación a 95°C para activar la polimerasa (Taq), 50 ciclos de 95°C por 10 segundos y 60°C por 30 s, seguido de una etapa de enfriamiento a 40°C por 10 s. La velocidad de transición de temperatura (velocidad de rampa en el instrumento LightCycler®480) fue 4,4°C/s mientras se calienta y 2,2°C/s mientras se enfría.
Como se demostró (Figura 1(a)), el ensayo dirigido a una región del gen Ipg0768 detectó las 12 cepas del serogrupo 1 de Legionella pneumophila probadas (Tabla 1(a)); pero el ensayo no detectó las cepas del serogrupo 2-16 de Legionella pneumophila ni el control sin plantilla. Las especies restantes de Legionella probadas (Tabla 1(b)) no fueron detectadas por el ensayo dirigido a una región del gen Ipg0768 (Figura 1(b)).
Ejemplo 2 - ensayo para la detección de Legionella pneumophila
Análisis in silico
La información de la secuencia de nucleótidos del gen smpB disponible públicamente se recuperó del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/) para Legionella pneumophila y alineado usando ClustalW (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). También se generó una secuencia génica parcial para varias cepas de colección de cultivo utilizando cebadores de secuenciación y después se alineó. Todas las secuencias de nucleótidos generadas y disponibles públicamente para las secuencias de Legionella pneumophila se alinearon posteriormente, lo que demostró suficiente similitud de nucleótidos para diseñar cebadores y sondas de oligonucleótidos.
En este ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores y sondas de ensayo de PCR en tiempo real de ejemplo para la secuencia de nucleótidos del gen smpB (SEQ ID NO. 6): cebador directo de smpB (SEQ ID No . 7), cebador inverso de smpB (SEQ ID NO. 8), sonda smpB (SEQ ID NO. 9). Opcionalmente, podría utilizarse un cebador inverso smpB alternativo (SEQ ID No. 13). La sonda smpB (SEQ ID NO. 9) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente rodamina (5' ROX, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda smpB (SEQ ID NO. 9) comprendía al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia, opcionalmente un desactivador terminal (3' IowaBlack®RQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 2®, LGC Biosearch).
Secuencia de nucleótidos
Para generar una secuencia de nucleótidos del gen smpB parcial para L. pneumophila, se realizó una PCR convencional utilizando cebadores de secuenciación en un ciclador térmico (ciclador térmico iCycler iQ; Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU.). Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 jl, que contenía 5 j l de tampón 10x (MgCh 15 mM), 1 j l de cebadores directo e inverso (conc. final 0,2 jM ), 2 j l de ADN polimerasa (Taq; 1 U/jl, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), 1 j l de mezcla de dNTP (conjunto de trifosfato de desoxinucleósido 10 mM; Roche Diagnostics), 5 j l de ADN molde y 35 j l de agua libre de nucleasas (aplicado Biosystems/Ambion, Texas, EE. UU.). Los parámetros del ciclo consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C (1 minuto), hibridación a 50 °C (1 minuto) y extensión a 72 °C (1 minuto)., con una etapa final de elongación a 72°C durante 10 minutos.
Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5 % y posteriormente se purificaron con un kit de purificación de productos de PCR (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics). Los productos de PCR purificados se enviaron para su secuenciación externamente (Sequiserve, Vaterstetten, Alemania).
Aislamiento y cuantificación de ADN
El ADN genómico de cultivos de Legionella se aisló mediante un procedimiento modificado que combina lisis mecánica (kit de lisis IDI; Becton Dickenson, Canadá) y purificación mediante un kit de purificación de ADN (kit rápido de gDNA, Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Brevemente, se resuspendió un bucle de cultivo en 250 ul de tampón de lisis (tampón de lisis IDI). La suspensión se transfirió a un tubo de lisis celular (GeneOhm) y se batió con perlas (Mini-Bead-Beater-16; Stratech, Reino Unido) durante 3 minutos. Después de batir las perlas, se transfirieron 200 j l a una columna de centrifugación de purificación de ácido nucleico (columna Zymo-Spin™) en un tubo de recolección y se siguieron las etapas 2 a 5 del procedimiento para la purificación de ADN total a partir de suspensiones celulares, según las instrucciones del fabricante.
Cepas bacterianas, medio de cultivo y condiciones de crecimiento
En este estudio se utilizó un panel de 26 cepas de Legionella pneumophila y otras 41 especies de Legionella y otras 14 bacterias (Tabla 2(a) y Tabla 2(b)). Estas especies y cepas se adquirieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
DSMZ. Braunschweig, Alemania), la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC, Public Health England, Salisbury, Reino Unido), la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, proporcionada por los estándares LGC, Middlesex, Reino Unido) y la Colección de Cultivos, Universidad de Goteborg, (CCUG, Suecia). Todas las especies y cepas de Legionella se cultivaron en medio BCYE a 37 °C durante 18-24 horas o hasta que se observó un crecimiento suficiente.
Tabla 2 a : Cepas de Le ionella pneumophila utilizadas en este estudio
Tabla 2 b : Otras especies de Le ionella probadas en este estudio
PCR en tiempo real
El ensayo específico de Legionella pneumophila se probó después en un formato de PCR en tiempo real contra un panel de especies de Legionella bien caracterizadas para determinar la especificidad del ensayo (pruebas de inclusión y exclusividad) y la idoneidad de la secuencia de nucleótidos del gen smpB como marcador de diagnóstico.
La PCR en tiempo real se realizó en un dispositivo de amplificación de PCR en tiempo real (LightCycler® 480 Instrument, Roche Diagnostics) utilizando un kit de sondas de PCR en tiempo real (LightCycler® 480 Probes Master kit, Roche Diagnostics). La mezcla de reacción comprendía: mezcla maestra (LightCycler® 480 Probes Master) en 6,4 mM MgCh, cebador directo e inverso (0,5 pM de concentración final), sonda marcada con carboxifluoresceína (FAM) (0,2 pM de concentración final), ADN molde (5 pl ) y dH2O libre de nucleasas hasta un volumen final de 20 pl. Los parámetros de ciclado consistieron en 10 minutos de incubación a 95°C para activar la polimerasa (Taq), 50 ciclos de 95°C por 10 segundos y 60°C por 30 s, seguido de una etapa de enfriamiento a 40°C por 10 s. La velocidad de transición de temperatura (velocidad de rampa en el instrumento LightCycler®480) fue 4,4°C/s mientras se calienta y 2,2°C/s mientras se enfría.
Como se demuestra en la Figura 2(a), las 26 cepas de Legionella pneumophila probadas (Tabla 2(a)) fueron detectadas por el ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB y el control sin plantilla no fue detectado por el ensayo. Como se muestra en la Figura 2(b), el ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB detectó el único aislado de L. pneumophila probado y no detectó las otras 41 especies de Legionella y otras bacterias que se probaron (Tabla 2 (b)).
Ejemplo 3: Una PCR múltiplex en tiempo real controlada internamente para la detección e identificación de especies de Legionella, Legionella pneumophila (serogrupo 1-16) y serogrupo 1 de Legionella pneumophila
Identificación de dianas de diagnóstico
Se evaluaron una serie de genes domésticos que están altamente conservados en todo el género Legionella para identificar, in silico, un posible objetivo de diagnóstico que podría usarse para detectar todos los miembros de este género y para la detección de cepas de Legionella pneumophila. El objetivo de diagnóstico óptimo elegido en este estudio para la detección del género Legionella fue el gen ssrA. El gen ssrA codifica para tmARN y se ha identificado en todas las especies bacterianas. La función del tmARN en las bacterias es rescatar los ribosomas estancados y limpiar la célula de polipéptidos incompletos. La alineación in silico de secuencias de nucleótidos disponibles públicamente indicó que, si bien existe suficiente heterogeneidad de secuencias de nucleótidos entre diferentes especies de Legionella, existía suficiente similitud de secuencias de nucleótidos para diseñar cebadores y sondas de oligonucleótidos de género.
En este ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores y sondas de ensayo de PCR en tiempo real ejemplares lo para la secuencia de nucleótidos del gen ssrA (SEQ ID NO. 5): cebador directo de ssrA (SEQ ID NO. 10), cebador inverso de ssrA (SEQ ID NO. 11), sonda ssrA (SEQ iD NO. 12). La sonda ssrA (SEQ ID NO. 12) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente fluoresceína (5' 6-FAM, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda ssrA (SEQ ID NO. 12) comprendía al menos un colorante inhibidor de la fluorescencia, opcionalmente un inhibidor interno (desactivador ZEN™, Integrated DNA Technologies), opcionalmente un desactivador terminal (3' IowaBlack®FQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 1®, LGC Biosearch).
Mediante alineación in silico, se demostró que existe una conservación perfecta, o casi perfecta, de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador directo ssrA ejemplar (SEQ ID NO. 10), el cebador inverso ssrA ejemplar (SEQ ID NO. 11), y la sonda ssrA ejemplar (SEQ ID NO. 12); entre las secuencias de nucleótidos del gen ssrA de las siguientes especies de Legionella :
L. pneumophilaATCC43290, L. pneumophila_ThunderBay, L. pneumopnila_HL06041035,
L. pneumophila_str. Philadelphia, L. pneumophila_Lens, L. pneumophila_Paris,
L. pneumophila_Corby, L. pneumophila_2300/99Alcoy, L. pneumophila_Lorraine, L. longbeachaeD-4968, L. longbeachaeNSW150, L. fallonii_LLAP-10, L. hackeliae_LHA, L. oakridgensis_ATCC33761 L. micdadei_LMI, L. sainthelensi_ATCC35248, L. wadsworthitDSM21896, L. cherrii_DSM19213, L. moravicaDSM19234, L. norrlandica, L. shakespeareiDSM23087, L. drancourtiiLLAP12
L. lansingensis_DSM19556, L. fairfieldensis_AjCC_49588, L. massiliensis_PRJEB110, and L. geestianaDSM21217.
La diana de diagnóstico óptimo elegido en este estudio para la detección de Legionella pneumophila fue el gen smpB. El gen smpB codifica la proteína de unión al ARN Small Protein B (SmpB) y se ha identificado en todas las especies bacterianas hasta la fecha. Se considera un componente esencial del control de calidad en las bacterias, ya que facilita la unión del tmARN a los ribosomas estancados, lo que a su vez permite la eliminación de polipéptidos incompletos de la célula. La alineación in silico de secuencias de nucleótidos disponibles públicamente indicó que existe suficiente similitud de secuencia de nucleótidos entre diferentes serogrupos de Legionella pneumophila para permitir el diseño de cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos de especie.
En este ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores y sondas de ensayo de PCR en tiempo real de ejemplo para la secuencia de nucleótidos del gen smpB (SEQ ID NO. 6): cebador directo de smpB (SEQ ID No . 7), cebador inverso de smpB (SEQ ID NO. 8), sonda smpB (SEQ ID NO. 9). Opcionalmente, podría usarse un cebador inverso smpB alternativo (SEQ ID No. 13). La sonda smpB (SEQ ID NO. 9) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente rodamina (5' ROX, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda smpB (SEQ ID NO. 9) comprendía al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia, opcionalmente un desactivador terminal (3' Iowa Black®RQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 2®, LGC Biosearch).
Mediante la alineación in silico, se demostró que existe una conservación perfecta, o casi perfecta, de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador de secuenciación directa de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 14), el cebador directo de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 7), el cebador de secuenciación inversa de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 15), el cebador inverso de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 8) y la sonda de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 9); entre las secuencias de nucleótidos smpB de los siguientes
Legionella species: L. pneumophila_Paris, L. pneumophila_Corby, L. pneumophila_Pneu,
L. pneumophila_Lens, L. pneumophila_Alcoy, L. pneumophila_2868, L. pneumophila_3140, L. pneumophila_3194, L. pneumophila_00189, L. pneumophila_2829, L. pneumophila_NCTC11986, L. pneumophila_NCTC12000, L. pneumophila_NCTC12179, L. pneumophila_DSM7513,
L. pneumophilaDSM7514, L. pneumophilaDSM7515, L. pneumophila_NCTC11191,
L. pneumophila_NCTC11230, L. pneumophila_NCTC11232, L. pneumophila_NCTC11287, L. pneumophila_NCTC11984, L. pneumophila_NCTC11985.
Según la evaluación de los genes domésticos realizada en este estudio, no fue posible identificar una diana específica del serogrupo 1 de Legionella pneumophila. Como tal, se realizaron comparaciones del genoma completo para identificar una nueva diana de diagnóstico in silico. La información de la secuencia del genoma completo disponible públicamente se recuperó del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/) para el serogrupo 1 de Legionella pneumophila y el serogrupo 6 y serogrupo 12 de Legionella pneumophila . Las regiones potencialmente exclusivas del serogrupo 1 de L. pneumophila se identificaron usando WEBACT (www.webact.org/). Esto resultó en una serie de regiones de diferencia en el serogrupo 1 de L. pneumophila. Cada supuesta secuencia de nucleótidos diana identificada se analizó mediante BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar si estaban presentes en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila y estaban ausentes en todos los demás serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Una región estaba presente en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila analizados con una similitud de secuencia muy baja o nula con otros serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Esta región era el gen Ipg0768 (SEQ ID NOs 1 y 21-48) que codifica la proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas, NeuB. Las secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas de las cepas del serogrupo 1 de Legionella pneumophila se alinearon utilizando ClustalW ( www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Mediante la alineación in silico, se demostró que existe una conservación parcial, perfecta o casi perfecta de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador de secuenciación directa Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 16), el cebador directo Ipg0768 ejemplar ( SEQ ID NO. 2), el cebador de secuenciación inversa Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 17), el cebador inverso Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 3) y la sonda Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 4); entre las secuencias de nucleótidos Ipg0768 de las siguientes cepas del serogrupo 1 de Legionella pneumophila: gi|395129037 L. pneumophila_ extendido,
L. pneumophila_str.Philadelphia1(sg1), L. pneumophila_str.Paris(sg1),
L. pneumophila_LPE509(SG1), gi|6688579 L. pneumophila(sgl), L. pneumophila_str.Lens(sg1), gi|410173912 L. pneumophila(sgl), L. pneumophila_str.Camperdown1(sg1),
L. pneumophila_str.Heysham1(sg1), L. pneumophila_str.Uppsala3(sg1),
L. pneumophila2300/99Alcoy(sg1), L. pneumophila_str.Corby(sg1),
L. pneumophila_str.uppsala3.b(sg1), L. pneumophila_str.Lorraine(sg1),
L. pneumophila_str.Goerlitz6543(sg1), L. pneumophila_str.HL06041035(sg1),
L. pneumophila_str.Hextuple_3a(sg1), L. pneumophila_str.Hextuple_2q(sg1),
L. pneumophila(sg1)_DSM7513, L. pneumophila(sg1)_NCTC11191,
L. pneumophila(sg1)_NCTC11231, L. pneumophila(sg1)_NCTC11378,
L. pneumophila(sg1)_NCTC11404, L. pneumophila(sg1)_DSM25019,
L. pneumophila(sg1)_DSM25021, L. pneumophila(sg1)_DSM25199,
L. pneumophila(sg1)_DSM25200, L. pneumophila(sg1)_DSM25213, and
L. pneumophila(sg1)_DSM37564.
Cepas bacterianas, medios de cultivo y condiciones de crecimiento
En este estudio se utilizó un panel de 26 cepas de Legionella pneumophila y otras 41 especies de Legionella (Tablas 2.1 y 2.2). Estas especies y cepas se adquirieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ. Braunschweig, Alemania), la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC, Public Health England, Salisbury, Reino Unido), la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, proporcionada por los estándares LGC, Middlesex, Reino Unido) y la Colección de Cultivos , Universidad de Goteborg (CCUG, Suecia). Todas las especies y cepas de Legionella se cultivaron en medio de BCYE a 37 °C durante 18-24 horas o hasta que se observó un crecimiento suficiente.
Aislamiento y cuantificación de ADN genómico.
El ADN genómico de cultivos de Legionella se aisló mediante un procedimiento modificado que combina lisis mecánica (kit de lisis IDI; Becton Dickenson, Canadá) y purificación mediante un kit de purificación de ADN (kit rápido de gDNA; Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Brevemente, se resuspendió un bucle de cultivo en 250 ul de tampón de lisis (tampón de lisis IDI). La suspensión se transfirió a un tubo de lisis celular (GeneOhm) y se batió con perlas (Mini-Bead-Beater-16; Stratech, Reino Unido) durante 3 minutos. Después de batir las perlas, se transfirieron 200 pl a una columna de centrifugación de purificación de ácido nucleico (columna Zymo-Spin™) en un tubo de recolección y se siguieron las etapas 2 a 5 del procedimiento para la purificación de ADN total a partir de suspensiones celulares, según las instrucciones del fabricante.
Secuencia de nucleótidos
Para generar una secuencia parcial de nucleótidos smpB para L. pneumophila, se realizó una PCR convencional utilizando los cebadores de secuenciación indicados en la Tabla 3(a) en un termociclador (iCycler iQ thermal cycler; Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU). Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 pl, que contenía 5 pl de tampón 10x (15 mM MgCh), 1 pl de cebadores directo e inverso (conc. final 0,2 pM), 2 pl de ADN polimerasa (Taq; 1 U/pl, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), 1 pl de mezcla de dNTP (conjunto de trifosfato de desoxinucleósido 10 mM; Roche Diagnostics), 5 pl de ADN molde y 35 pl de agua libre de nucleasas (aplicado Biosystems/Ambion, Texas, EE. UU.). Los parámetros del ciclo consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C (1 minuto), hibridación a 50 °C (1 minuto) y extensión a 72 °C (1 minuto), con una etapa final de elongación a 72°C durante 10 minutos.
Tabla 3 a : Oli onucleótidos utilizados en este estudio
/56-FAM/ = fluoróforo 5' 6-FAM (fluoresceína); /ZEN/ = desactivador interno ZEN™, fabricado por Integrated DNA Technologies; /3IABkFQ/ = desactivador terminal Iowa Black®FQ de 3', fabricado por Integrated DNA Technologies; /56-ROXN/ = 5' ROX (carboxi-X-rodamina) fluoróforo de éster de n-hidroxisuccinimida; /5HEX/ = fluoróforo 5' HEX (hexaclorofluoresceína); /5Cy5/ = fluoróforo 5' Cy5 (cianina); /TAO/ = desactivador interno TAO™, fabricado por Integrated DNA Technologies; /3IAbRQSp/ = desactivador terminal Iowa Black®RQ de 3', fabricado por Integrated DNA Technologies.
Para generar la secuencia de nucleótidos del gen Ipg0768 para las cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila, se realizó una PCR convencional utilizando los cebadores de secuenciación indicados en la Tabla 3(a) en el termociclador (iCycler iQ thermal cycler; Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU.). Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 pl, conteniendo 5 pl de tampón 10* (15 mM de MgCh ), 1 pl de cebadores directos e inversos (0,2 pM de conc. final). ), 2 pl de ADN polimerasa (Taq; 1 U/pl, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), 1 pl de mezcla de dNTP (conjunto de desoxinucleósidos trifosfato 10 mM; Roche Diagnostics), 5 pl de ADN molde y 35 pl de agua libre de nucleasas (Applied Biosystems/Ambion, Texas, EE. UU.). Los parámetros del ciclo consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C (1 minuto), hibridación a 50 °C (1 minuto) y extensión a 72 °C (1 minuto)., con una etapa final de elongación a 72°C durante 10 minutos.
Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5 % y posteriormente se purificaron utilizando un kit de purificación de productos de la PCR (High Pure Product Purification Kit; Roche Diagnostics). Los productos de PCR purificados se enviaron para su secuenciación externamente (Sequiserve, Vaterstetten, Alemania).
Diseño del ensayo
Todos los cebadores y sondas de oligonucleótidos se adquirieron de Integrated DNA Technologies (Leuven, Bélgica).
Desarrollo de un Control de Amplificación Interna (IAC) para PCR en tiempo real
Se diseñó un control interno de amplificación (IAC) y se incorporó al ensayo múltiplex diseñado para controlar la inhibición de la PCR, el mal funcionamiento del termociclador, la degradación de los componentes del ensayo, etc. Como este ensayo multiplex está diseñado para su uso en muestras ambientales, se identificó una construcción sintética de secuencia aleatoria como el IAC más adecuado. La secuencia de construcción sintética no se encuentra en la naturaleza y, como tal, los cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos no serán absorbidos por microorganismos competidores que se encuentran comúnmente en el medio ambiente.
En este ejemplo, se usaron los siguientes cebadores y sonda de ensayo de PCR en tiempo real de ejemplo para IAC: cebador directo de construcción sintética iAc (SEQ ID NO. 18), cebador inverso de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 19), sonda de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 20). La sonda de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 20) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente cianina (5' Cy5™, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda de construcción sintética (SEQ ID NO. 20) comprendía al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia, opcionalmente un desactivador interno (TAO™quencher, Integrated DNA Technologies), opcionalmente un desactivador terminal (3' IowaBlack®RQ, Integrated DNA Technologies ).
Se realizaron titulaciones de ADN sintético para determinar la concentración óptima del objetivo de IAC por reacción, de modo que el IAC siempre se detecte sin afectar la detección de las dianas primarios de Legionella en el múltiplex. Una concentración de control interno de 1000 equivalentes de genoma por reacción permitió la detección del IAC en todos los experimentos de PCR en tiempo real realizados.
Se produjo un ensayo de PCR múltiple usando una combinación de cebadores y sondas de oligonucleótidos seleccionados de: los cebadores y sondas de oligonucleótidos enumerados en la Tabla 3(a), y los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos en el ejemplo 1, los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos en el ejemplo 2, y los cebadores y sondas de oligonucleótidos para la construcción sintética IAC descrita en este ejemplo.
PCR en tiempo real
Para determinar la especificidad de cada uno de los objetivos de diagnóstico utilizados en este estudio, se realizó PCR Monoplex en tiempo real en un termociclador (LightCycler 480; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) utilizando un kit de sondas (LightCycler ® Probes Master kit; Roche Diagnostics ). Se usó un volumen final de 20 |jl en cada reacción, que contenía mezcla maestra de reacción de PCR 2X (mezcla maestra) [LightCycler 480 sondas maestras (6,4 mM MgCh)], cebador directo e inverso (conc. final 0,5 mM), sonda marcada con FAM, HEX, ROX o CY5 (conc. final 0,2 mM), plantilla de ADN (2 j l ) y el volumen ajustado a 20 j l con la adición de dH2O libre de nucleasas. Los parámetros de ciclado consistieron en una incubación de 10 minutos a 95 °C para activar las enzimas y la desnaturalización del ADN, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 30 s, seguido de una etapa de enfriamiento a 40 °C durante 10 segundos La velocidad de transición de temperatura para todos las etapas del ciclo fue 4,4°C/s mientras se calienta y 2,2°C/s mientras se enfría.
Las reacciones de PCR múltiplex en tiempo real se llevaron a cabo en un termociclador (LightCycler 480; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) utilizando un kit de sondas (LightCycler ® Probes Master kit; Roche Diagnostics). Se utilizó un volumen final de 20 j l para cada experimento múltiplex. La mezcla maestra optimizada contenía una mezcla maestra de reacción de PCR 2X [LightCycler 480 Probes Master (6,4 mM MgCb)], cebador directo e inverso (conc. final de 0,125-0,25 mM), colorantes marcados con FAM, HEX, ROX y CY5 (conc. final de 0,2-0,4 jM ), plantilla de ADN (5 jl), ADN iAc 1 j l y el volumen ajustado a 20 j l con la adición de dH2O libre de nucleasas. El ADN de control interno se diluyó para contener 1000 equivalentes de genoma por j l y todos los demás ADN se analizaron en un intervalo de 10*3-10*4 equivalentes de genoma por 5 j l. Los parámetros de ciclado usados fueron los mismos que los usados en un formato monoplex descrito anteriormente. Se generó un archivo de compensación de color utilizando la nota técnica descrita en las Funcionalidades avanzadas del software del manual del operador.
Sensibilidad y especificidad de los ensayos de PCR en tiempo real
La especificidad de cada ensayo de PCR en tiempo real se confirmó tanto en formato monoplex como múltiplex utilizando el panel de especificidad que se muestra en la Tabla 3(b) y la Tabla 3(c). Utilizando el ensayo múltiplex, todas las cepas de Legionella se detectaron en el ensayo del género Legionella dirigido a una región del gen ssrA. Una representación de esto se puede ver en la Figura 3(a), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. El ensayo específico del serogrupo 1 de L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768 fue específico para la detección de aislamientos del serogrupo 1 L. pneumophila. Una representación de esto se puede ver en la Figura 3(b), en la que las 12 cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila analizadas están representadas por líneas marcadas con círculos. El ensayo detectó las 12 cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila. El ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB fue específico para la detección de las 26 cepas de L. pneumophila analizadas y las otras 41 especies de Legionella no fueron detectadas por este ensayo. Una representación de esto se puede ver en la Figura 3(c), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. La especificidad del ensayo IAC se probó usando el panel de especificidad completo (Tabla 3(b) y Tabla 3(c)) y fue específica para la construcción sintética. Dado que el ensayo IAC está diseñado con un enfoque no competitivo, cuando se añade a la mezcla maestra siempre se debe observar una señal positiva en el canal Cy5. Una representación de esto se puede ver en la Figura 3(d), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. La especificidad analítica de este ensayo de PCR múltiplex en tiempo real es 100 %.
Para determinar la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex en tiempo real desarrollado, diluciones en serie que van desde 10*4-1 equivalente celular de L. pneumophila se ensayaron por triplicado. El límite de detección del ensayo múltiplex está entre 1~10 equivalentes del genoma.
Tabla 3 b : Cepas de Le ionella pneumophila utilizadas en este estudio
Tabla 3c: Otras especies de Le ionella probadas en este estudio
Ejemplo 5 - A lgortim o de Diagnósticos
Para determinar qué especies de
Legionella
y/o cepas están presentes en una muestra, el usuario debe tener en cuenta la combinación de resultados observados para cada canal del instrumento de amplificación
in vitro
en tiempo real. Esto se establece en la Tabla 4 a continuación, y se explica a continuación.
Tabla
Ejemplo 6: Una PCR múltiplex en tiempo real controlada internamente para la detección e identificación de especies de Legionella, Legionella pneumophila (serogrupo 1-16) y el serogrupo 1 Legionella pneumophila
Identificación de dianas de diagnóstico
Se evaluaron una serie de genes domésticos que están altamente conservados en todo el género Legionella para identificar, in silico, un posible objetivo de diagnóstico que podría usarse para detectar todos los miembros de este género y para la detección de cepas de Legionella pneumophila. El objetivo de diagnóstico óptimo elegido en este estudio para la detección del género Legionella fue el gen ssrA. El gen ssrA codifica para tmARN y se ha identificado en todas las especies bacterianas. La función del tmARN en las bacterias es rescatar los ribosomas estancados y limpiar la célula de polipéptidos incompletos. La alineación in silico de secuencias de nucleótidos disponibles públicamente indicó que, si bien existe suficiente heterogeneidad de secuencias de nucleótidos entre diferentes especies de Legionella, existía suficiente similitud de secuencias de nucleótidos para diseñar cebadores y sondas de oligonucleótidos de género.
En este ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores de ensayo de PCR en tiempo real y la sonda para la secuencia de nucleótidos del gen ssrA (SEQ ID NO. 5): cebador directo de ssrA (SEQ ID NO. 10), cebador inverso de ssrA (SEQ ID NO. 11), sonda de ssrA (SEQ iD NO. 12). La sonda ssrA (SEQ ID NO. 12) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente fluoresceína (5' 6-FAM, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda ssrA (SEQ ID NO. 12) comprendía al menos un colorante de apagado de fluorescencia, opcionalmente un inhibidor interno (desactivador ZEN™, Integrated DNA Technologies), opcionalmente un inhibidor terminal (3' lowa Black® FQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 1®, LGC Biosearch).
Mediante alineación in silico, se demostró que existe una conservación perfecta, o casi perfecta, de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador ejemplar de ssrA hacia adelante (SEQ ID NO. 10), el cebador ejemplar de ssrA hacia atrás (SEQ ID NO. 11), y la sonda ejemplar de ssrA (SEQ ID NO. 12); entre las secuencias de nucleótidos del gen ssrA de las siguientes especies de Legionella :
L. pneumophilaATCC43290, L. pneumophila_ThunderBay, L. pneumophila_HL06041035,
L. pneumophila_str.Philadelphia, L. pneumophila_Lens, L. pneumophila_Paris,
L. pneumophila_Corby, L. pneumophila_2300/99Alcoy, L. pneumophila_Lorraine, L. longbeachaeD-4968, L. longbeachaeNSW150, L. fallonii_LLAP-10, L. hackeliae_LHA, L. oakridgensis_ATCC33761 L. micdadei_LMI, L. sainthelensi_ATCC35248, L. wadsworthiiDSM21896, L. cherri_DSM19213, L. moravicaDSM19234, L. norrlandica, L. shakespeareiDSM23087, L. drancourtiiLLAP12
L. lansingensis_DSM19556, L. fairfieldensis_ATCC_49588, L. massiliensis_PRJEB110, y
L. geestianaDSM21217.
La diana de diagnóstico óptima elegida en este estudio para la detección de la Legionella pneumophila fue el gen smpB . El gen smpB codifica la proteína de unión al ARN Small Protein B (SmpB) y se ha identificado en todas las especies bacterianas hasta la fecha. Se considera un componente esencial del control de calidad en las bacterias, ya que facilita la unión del tmARN a los ribosomas estancados, lo que a su vez permite la eliminación de polipéptidos incompletos de la célula. La alineación in silico de secuencias de nucleótidos disponibles públicamente indicó que existe suficiente similitud de secuencia de nucleótidos entre diferentes serogrupos de Legionella pneumophila para permitir el diseño de cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos de especie.
En este ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores de ensayo de PCR en tiempo real y la sonda para la secuencia de nucleótidos del gen smpB (SEQ ID NO. 6): cebador directo de smpB (SEQ ID NO. 49), cebador inverso de smpB (SEQ ID NO. 50), sondas de smpB (Se Q ID NO. 51 y SEQ ID NO. 52). Las sondas smpB (SEQ ID NO. 51 y SEQ ID NO. 52) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente cianina (5' r Ox , Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, las sondas smpB (SEQ ID NO. 51 y SEQ ID NO. 52) comprendían al menos un colorante de apagado de fluorescencia, opcionalmente un inhibidor terminal (3' lowa Black® RQ, Integrated DNA Technologies; o Black Hole Quencher 2®, LGC Biosearch).
Mediante alineación in silico, se demostró que existe una conservación perfecta, o casi perfecta, de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador de secuenciación directa de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 14), el cebador de secuenciación directa de smpB ejemplar (SEQ ID NO. 49), el cebador de secuenciación inversa smpB ejemplar (SEQ ID NO. 15), el cebador inverso smpB ejemplar (SEQ ID NO. 50), y las sondas smpB ejemplares (SEQ ID NO. 51 y SEQ ID NO. 52); entre las secuencias de nucleótidos smpB de las siguientes especies de Legionella L. pneumophila_Paris, L. pneumophila_Corby,
L. pneumophila_Pneu, L. pneumophila_Lens, L. pneumophila_Alcoy, L. pneumophila_2868, L. pneumophila_3140, L. pneumophila_3194, L. pneumophila_00189, L. pneumophila_2829, L. pneumophila_NCTC11986, L. pneumophila_NCTC12000, L. pneumophila_NCTC12179, L. pneumophila_DSM7513, L. pneumophilaDSM7514, L. pneumophilaDSM7515,
L. pneumophila_NCTC11191, L. pneumophila_NCTC11230, L. pneumophila_NCTC11232, L. pneumophila_NCTC11287, L. pneumophila_NCTC11984, L. pneumophila_NCTC11985.
Según la evaluación de los genes domésticos realizada en este estudio, no fue posible identificar una diana específica del serogrupo 1 de Legionella pneumophila. Como tal, se realizaron comparaciones del genoma completo para identificar una nueva diana de diagnóstico in silico. La información de la secuencia del genoma completo disponible públicamente se recuperó del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov /) para el serogrupo 1 de Legionella pneumophila y el serogrupo 6 y serogrupo 12 de Legionella pneumophila . Las regiones potencialmente exclusivas del serogrupo 1 de L. pneumophila se identificaron usando WEBACT (www.webact.org/). Esto resultó en una serie de regiones de diferencia en el serogrupo 1 de L. pneumophila. Cada supuesta secuencia de nucleótidos diana identificada se analizó mediante BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar si estaban presentes en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila y estaban ausentes en todos los demás serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Una región estaba presente en todos los serogrupos 1 de L. pneumophila analizados con una similitud de secuencia muy baja o nula con otros serogrupos de L. pneumophila o especies de Legionella estrechamente relacionadas. Esta región era el gen Ipg0768 (SEQ ID NO 1, 21-49) que codifica la proteína E de biosíntesis de polisacáridos de cubierta de esporas, NeuB. Las secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas de las cepas del serogrupo 1 de Legionella pneumophila se alinearon utilizando ClustalW ( www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Mediante alineación in silico, se demostró que existe una conservación parcial, perfecta o casi perfecta de cada una de las siguientes secuencias de nucleótidos: el cebador de secuenciación directa Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 16), el cebador de secuenciación directa Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO.2), el cebador de secuenciación inversa Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 17), el cebador inverso Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 3), y la sonda Ipg0768 ejemplar (SEQ ID NO. 4); entre las secuencias de nucleótidos Ipg0768 de las siguientes cepas del serogrupo 1 de Legionella pneumophila : gi|395129037 L. pneumophila_extended,
L. pneumophila_str.Philadelphia1(sg1), L. pneumophila_str.Paris(sg1),
L. pneumophila_LPE509(SG1), gi|6688579 L. pneumophila(sg1), L. pneumophila_str.Lens(sg1), gi|410173912 L. pneumophila(sg1), L. pneumophila_str.Camperdown1(sg1),
L. pneumophila_str.Heysham1(sg1), L. pneumophila_str.Uppsala3(sg1),
L. pneumophila2300/99Alcoy(sg1), L. pneumophila_str.Corby(sg1),
L. pneumophila_str.uppsala3.b(sg1), L. pneumophila_str.Lorraine(sg1),
L. pneumophila_str.Goerlitz6543(sg1), L. pneumophila_str.HL06041035(sg1),
L. pneumophila_str.Hextuple_3a(sg1), L. pneumophila_str.Hextuple_2q(sg1),
L. pneumophila(sg1)_DSM7513, L. pneumophila(sg1)_NCTC11191,
L. pneumophila(sg1)_NCTC11231, L. pneumophila(sg1)_NCTC11378,
L. pneumophila(sg1)_NCTC11404, L. pneumophila(sg1)_DSM25019,
L. pneumophila(sg1)_DSM25021, L. pneumophila(sg1)_DSM25199,
L. pneumophila(sg1)_DSM25200, L. pneumophila(sg1)_DSM25213, y
L. pneumophila(sg1)_DSM37564.
Cepas bacterianas, medios de cultivo y condiciones de crecimiento
En este estudio se utilizó un panel de 26 cepas de Legionella pneumophila y otras 41 especies de Legionella (tablas 2.1 y 2.2). Estas especies y cepas se adquirieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ. Braunschweig, Alemania), la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC, Public Health England, Salisbury, Reino Unido), la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, proporcionada por los estándares LGC, Middlesex, Reino Unido) y la Colección de Cultivos, Universidad de Goteborg, (CCUG, Suecia). Todas las especies y cepas de Legionella se cultivaron en medio de BCYE a 37 °C durante 18-24 horas o hasta que se observó un crecimiento suficiente.
Aislamiento y cuantificación de ADN genómico.
El ADN genómico de los cultivos de Legionella se aisló mediante un procedimiento modificado que combinaba la lisis mecánica (kit de lisis IDI; Becton Dickenson, Canadá) y la purificación mediante un kit de purificación de ADN (kit quick gDNA; Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Brevemente, se resuspendió un bucle de cultivo en 250 ul de tampón de lisis (tampón de lisis IDI). La suspensión se transfirió a un tubo de lisis celular (GeneOhm) y se batió con perlas (Mini-Bead-Beater-16; Stratech, Reino Unido) durante 3 minutos. Tras el batido de cuentas, se transfirieron 200 pl a una columna de centrifugado de purificación de ácidos nucleicos (Columna Zymo-Spin™) en un tubo de recogida y se siguieron las etapas 2 a 5 del procedimiento de purificación del ADN total a partir de suspensiones celulares, según las instrucciones del fabricante.
Secuencia de nucleótidos
Para generar una secuencia parcial de nucleótidos smpB para L. pneumophila, se realizó una PCR convencional utilizando los cebadores de secuenciación indicados en la Tabla 5(a) en un termociclador (iCycler iQ thermal cycler; Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU.). Todas las reacciones se llevaron a cabo en
un volumen final de 50 jl, conteniendo 5 |jl de tampón 10x (15 mM MgCl2 ), 1 j l de cebadores directos e inversos (0,2 jM de conc. final). ), 2 j l de ADN polimerasa (Taq; 1 U /jl, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), 1 j l de mezcla de dNTP (conjunto de desoxinucleósidos trifosfato 10 mM; Roche Diagnostics), 5 j l de ADN molde y 35 j l de agua libre de nucleasas (Applied Biosystems/Ambion, Texas, EE. UU.). Los parámetros del ciclo consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C (1 minuto), hibridación a 50 °C (1 minuto) y extensión a 72 °C (1 minuto)., con una etapa final de elongación a 72°C durante 10 minutos.
Tabla 5(a): Oligonucleótidos utilizados en este estudio
/56-FAM/ = fluoróforo 5' 6-FAM (fluoresceína); /ZEN/ = desactivador interno ZEN™, fabricado por Integrated DNA Technologies; /3IABkFQ/ = desactivador terminal Iowa Black®FQ de 3', fabricado por Integrated DNA Technologies; /56-ROXN/ = 5' ROX (carboxi-X-rodamina) fluoróforo de éster de n-hidroxisuccinimida; /5HEX/ = fluoróforo 5' HEX (hexaclorofluoresceína); /5Cy5/ = fluoróforo 5' Cy5 (cianina); /TAO/ = desactivador interno TAO™, fabricado por Integrated DNA Technologies; /3IAbRQSp/ = desactivador terminal Iowa Black®RQ de 3', fabricado por Integrated DNA Technologies.
Para generar la secuencia de nucleótidos del gen Ipg0768 para las cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila, se realizó una PCR convencional utilizando los cebadores de secuenciación indicados en la Tabla 5(a) en el termociclador (iCycler iQ thermal cycler; Bio-Rad Laboratories Inc., California, EE. UU.). Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 pl, que contenía 5 pl de tampón 10* (MgCb 15 mM), 1 pl de cebadores directo e inverso (0,2 pM de conc. final. ), 2 pl de ADN polimerasa (Taq; 1 U/pl, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), 1 pl de mezcla de dNTP (conjunto de desoxinucleósidos trifosfato 10 mM; Roche Diagnostics), 5 pl de ADN molde y 35 pl de agua libre de nucleasas (Applied Biosystems/Ambion, Texas, EE. UU.). Los parámetros del ciclo consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C (1 minuto), hibridación a 50 °C (1 minuto) y extensión a 72 °C (1 minuto), con una etapa final de elongación a 72°C durante 10 minutos.
Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5 % y posteriormente se purificaron utilizando un kit de purificación de productos de la PCR (High Pure Product Purification Kit; Roche Diagnostics). Los productos de PCR purificados se enviaron para su secuenciación externamente (Sequiserve, Vaterstetten, Alemania).
Diseño del ensayo
Todos los cebadores y sondas de oligonucleótidos se adquirieron de Integrated DNA Technologies (Leuven, Bélgica).
Desarrollo de un Control de Amplificación Interna (IAC) para PCR en tiempo real
Se diseñó e incorporó un control de amplificación interno (IAC) en el ensayo múltiplex diseñado para controlar la inhibición de la PCR, el mal funcionamiento del termociclador, la degradación de los componentes del ensayo, etc. Como este ensayo múltiplex está diseñado para su uso en muestras ambientales, se creó una construcción sintética de secuencia aleatoria. identificado como el IAC más adecuado. La secuencia de construcción sintética no se encuentra en la naturaleza y, como tal, los cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos no serán absorbidos por microorganismos competidores que se encuentran comúnmente en el medio ambiente.
En este ejemplo, se usaron los siguientes cebadores y sonda de ensayo de PCR en tiempo real de ejemplo para IAC: cebador directo de construcción sintética iAc (SEQ ID NO. 18), cebador inverso de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 19), sonda de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 20). La sonda de construcción sintética IAC (SEQ ID NO. 20) comprendía al menos un marcador, opcionalmente al menos un colorante, opcionalmente al menos un fluoróforo, opcionalmente cianina (5' Cy5™, Integrated DNA Technologies). Opcionalmente, la sonda de construcción sintética (SEQ ID NO. 20) comprendía al menos un colorante de desactivación de la fluorescencia, opcionalmente un desactivador interno (TAO™quencher, Integrated DNA Technologies), opcionalmente un desactivador terminal (3' Iowa Black®RQ, Integrated DNA Technologies ).
Se realizaron titulaciones de ADN sintético para determinar la concentración óptima de diana IAC por reacción, de modo que la IAC siempre se detecte sin afectar la detección de las dianas primarias de Legionella en el múltiplex. Una concentración de control interno de 1000 equivalentes de genoma por reacción permitió la detección del IAC en todos los experimentos de PCR en tiempo real realizados.
Un ensayo de PCR múltiplex se produjo utilizando una combinación de cebadores y sondas de oligonucleótidos seleccionados de: los cebadores y sondas de oligonucleótidos enumerados en la Tabla 5(a), y los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos en el ejemplo 1, los cebadores y sondas de oligonucleótidos descritos en el ejemplo 2, y los cebadores y sondas de oligonucleótidos para la construcción sintética IAC descrita en este ejemplo.
PCR en tiempo real
Para determinar la especificidad de cada uno de los objetivos de diagnóstico utilizados en este estudio, se realizó PCR Monoplex en tiempo real en un termociclador (LightCycler 480; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) utilizando un kit de sondas (LightCycler ® Probes Master kit; Roche Diagnostics ). Se usó un volumen final de 20 |jl en cada reacción, que contenía mezcla maestra de reacción de PCR 2X (mezcla maestra) [LightCycler 480 Probes Master (MgCh 6,4 mM)], cebador directo e inverso (0,25 mM de concentración final para ensayos del género Legionella y L. pneumophila sg1-16; 0,50 mM de concentración final para el ensayo de L. pneumophila sg1; 0,3 mM de concentración final para el ensayo IAC), FAM (0,6 mM de concentración final conc.), HEX (conc. final 0,2 mM), ROX (conc. final 0,2 mM) o sonda marcada con CY5 (conc. final 0,6 mM), plantilla de ADN (2 j l ) y el volumen ajustado a 20 j l con la adición de dH2O libre de nucleasas. Los parámetros del ciclo consistieron en incubación durante 10 minutos a 95 °C para activar las enzimas y la desnaturalización del ADN, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 30 s, seguido de una etapa de enfriamiento a 40°C durante 10 s. La velocidad de transición de temperatura para todos las etapas del ciclo fue 4,4°C/s mientras se calienta y 2,2°C/s mientras se enfría.
Las reacciones de PCR multiplex en tiempo real se llevaron a cabo en un termociclador (LightCycler 480; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) utilizando un kit de sondas (LightCycler® Probes Master kit; Roche Diagnostics) Se utilizó un volumen final de 20 j l para cada experimento múltiplex. La mezcla maestra optimizada contenía una mezcla maestra de reacción de PCR 2X [LightCycler 480 Probes Master (MgCh 6,4 mM)], cebadores directos e inversos (0,25-0,5 mM de concentración final), colorantes marcados FAM, HEX, Ro X y CY5 (0,2-0,6 jM de concentración final), ADN molde (5 jl), ADN IAC 1 jl, y el volumen se ajustó a 20 j l con la adición de dH2O libre de nucleasas. El ADN de control interno se diluyó para que contuviera 1.000 equivalentes de genoma por j l y todos los demás ADN se probaron en un rango de 10*3-10*4 equivalentes de genoma por 5 j l. Los parámetros de ciclado usados fueron los mismos que los usados en un formato monoplex descrito anteriormente. Se generó un archivo de compensación de color utilizando la nota técnica descrita en las Funcionalidades avanzadas del software del manual del operador.
Sensibilidad y especificidad de los ensayos de PCR en tiempo real
La especificidad de cada ensayo de PCR en tiempo real se confirmó tanto en formato monoplex como en formato múltiplex utilizando el panel de especificidad enumerado en la Tabla 5(b) y la Tabla 5(c). Utilizando el ensayo múltiplex, todas las cepas de Legionella se detectaron en el ensayo del género Legionella dirigido a una región del gen ssrA. Una representación de esto se puede ver en la Figura 4(a), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. El ensayo específico del serogrupo 1 de L. pneumophila dirigido a una región del gen Ipg0768 fue específico para la detección de aislamientos del serogrupo 1 de L. pneumophila. Una representación de esto se puede ver en la Figura 4(b), en la que las 12 cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila analizadas están representadas por líneas marcadas con círculos. El ensayo detectó las 12 cepas del serogrupo 1 de L. pneumophila. El ensayo de especies de L. pneumophila dirigido a una región del gen smpB fue específico para la detección de las 26 cepas de L. pneumophila analizadas y las otras 41 especies de Legionella no fueron detectadas por este ensayo. Una representación de esto se puede ver en la Figura 4(c), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. La especificidad del ensayo IAC se probó usando el panel de especificidad completo (Tabla 5(b) y Tabla 5(c)) y fue específica para la construcción sintética. Dado que el ensayo IAC está diseñado con un enfoque no competitivo, cuando se añade a la mezcla maestra siempre se debe observar una señal positiva en el canal Cy5. Una representación de esto se puede ver en la Figura 4(d), en la que el control negativo está representado por una línea marcada con estrellas. La especificidad analítica de este ensayo de PCR múltiplex en tiempo real es 100 %.
Para determinar la sensibilidad del ensayo de PCR multiplex en tiempo real desarrollado, se analizaron por triplicado diluciones seriadas que oscilaban entre 10*4-1 equivalentes de células de L. pneumophila. El límite de detección del ensayo múltiplex está entre 1~10 equivalentes del genoma.
Tabla 5 b : Cepas de Le ionella pneumophila utilizadas en este estudio
Tabla 5c: Otras especies de Le ionella probadas en este estudio
múltiplex 1
Escenario de resultados para la identificación del serogrupo 1 de L. pneumophila
Usando múltiplex 1; si el ensayo del género ssrA, el ensayo Ipg0768, el ensayo smpB y los ensayos de diagnóstico iAc generan una señal positiva, un organismo seleccionado de: serogrupo 1 de L. pneumophila, está presente en la muestra.
Escenario de resultados para la identificación del serogrupo 2-16 de L. pneumophila
Utilizando el multiplex 1; si el ensayo del género ssrA, el ensayo smpB y el ensayo de diagnóstico IAC generan cada uno una señal positiva, pero el ensayo Ipg0768 genera una señal negativa, un organismo seleccionado de: serogrupo 2-16 de L. pneumophila, está presente en la muestra.
Escenario de resultados para la identificación de Legionella distinta de L. pneumophila Utilizando el multiplex 1; si el ensayo del género ssrA y el ensayo de diagnóstico IAC generan una señal positiva, pero el ensayo smpB y el ensayo Ipg0768 generan una señal negativa, un organismo seleccionado de entre: especies de Legionella distintas de L. pneumophila, está presente en la muestra.
Claims (12)
1. Un método para identificar la presencia o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:
(a) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo; y
(b) correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o producto de expresión del mismo a la presencia, o cantidad del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en la muestra.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde el método comprende además las etapas de:
(ai) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o un producto de expresión del mismo; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad de Legionella pneumophila en la muestra.
3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende además las etapas de:
(aii) detectar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o un producto de expresión del mismo; y correlacionar la presencia o cantidad de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA o producto de expresión del mismo con la presencia o cantidad del género Legionella en la muestra.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de detección (a) comprende:
poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 y el inverso complementan cada uno de ellos, bajo condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de detección (a) comprende:
poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 4, y el inverso complementan cada uno de ellos, bajo condiciones adecuadas para la hibridación.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen smpB comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO.
6.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde la etapa de detección (ai) comprende:
poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, y el complemento inverso de cada uno de ellos, bajo condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa; y/o
poner en contacto la muestra con una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52 y el inverso complementan cada uno de ellos.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en donde al menos parte de la secuencia de ácido nucleico del gen ssrA comprende al menos parte de la secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO.
5.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en donde la etapa de detección (aii) comprende:
poner en contacto la muestra con al menos un cebador que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por al menos uno de SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, y el complemento inverso de cada uno de ellos, en condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa; y/o
poner en contacto la muestra con una sonda que tiene una secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO. 12 o el complemento inverso del mismo.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde el método es un método de reacción en cadena de la polimerasa múltiplex.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra comprende sustancialmente una muestra de agua o agua ambiental.
12. Un método in vitro para detectar la enfermedad de la legionelosis que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la presencia de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 o un producto de expresión del mismo, indica la presencia de la enfermedad de la legionelosis.
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