CN108103150B - 一种her2基因扩增检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HER2基因扩增检测试剂盒，涉及分子生物领域。本发明公开的HER2基因扩增检测试剂盒，其含有探针溶液，探针溶液包括有用于稳定探针防止探针降解的探针稳定剂，该探针稳定剂包括如下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris‑HCl以及EDTA。本发明的HER2基因扩增检测试剂盒将柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris‑HCl以及EDTA组合可以较好地保护探针，防止探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性，避免假阴性结果。

Description

一种HER2基因扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种HER2基因扩增检测试剂盒。

背景技术

人类HER-2/neu基因(Her-2基因)基因定位于染色体17q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是EGFR家族成员之一。Her-2/neu蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，由于目前尚未发现能与Her-2/neu蛋白直接结合的配体。其主要通过与家族中其他成员包括EGFR(HERl/erbBI)，HER3/erbB3。HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结合。Her-2/neu蛋白常为异二聚体首选伴侣，且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化从而激活酪氨酸激酶的活性。Her-2/neu蛋白通常只在胎儿时期表达，成年后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌、子宫内膜癌等，并对预后效果具有提示作用。荧光原位杂交的方法检测乳腺癌细胞中Her-2/neu基因的扩增，作为判断预后以及乳腺癌药物治疗，尤其是抗HER-2单克隆抗体(赫赛汀)靶向治疗是一项有效的辅助检测手段。

目前检测HER2基因的方法包括:免疫组织化学(IHC)法检测HER2蛋白过表达、荧光原位杂交(FISH)法检测HER2基因拷贝数、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中人表皮生长因子受体2(HER2)配体结合域(ECD)的表达ECD或肿瘤组织中P185的表达量情况。

但病理常规工作中最实用的方法是IHC和FISH。IHC较FISH节约成本、简单易行，但容易受到组织处理方法、固定时间等影响，其结果判断和解释存在较大的变异，而FISH具有高度的重复性和可靠性。

但目前基于FISH法的检测HER2基因扩增中的探针条数多，混合存放时，易降解，导致检测结果的不稳定性，尤其容易出现假阴性检测结果，大大影响了检测结果的准确率和可信度。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HER2基因扩增检测试剂盒，该试剂盒中的探针溶液中含有探针稳定剂，可以对探针进行保护，使其可以长时间存放，且可以较好地保证检测结果的准确性。

本发明是这样实现的：

一种HER2基因扩增检测试剂盒，其包括：探针溶液；

探针溶液含有：HER-2探针、CEN17探针以及探针稳定剂；

探针稳定剂包括如下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl以及EDTA。

进一步，在本发明的一些实施方案中，探针稳定剂包括：2-10g/L柠檬酸钠、5-15g/L NaCl、80-150g/L硫酸葡聚糖、30％-80％去离子甲酰胺(体积比)、1-8mmol/L Tris-HCl以及0.05-1mmol/L EDTA。

进一步，在本发明的一些实施方案中，探针稳定剂包括：2-8g/L柠檬酸钠、7-12g/LNaCl、90-130g/L硫酸葡聚糖、45％-65％去离子甲酰胺、3-7mmol/L Tris-HCl以及0.1-0.8mmol/L EDTA。

进一步，在本发明的一些实施方案中，探针稳定剂包括：4g/L柠檬酸钠、9g/LNaCl、110g/L硫酸葡聚糖、50％去离子甲酰胺、6mmol/L Tris-HCl以及0.6mmol/L EDTA。

进一步，在本发明的一些实施方案中，HER-2探针包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的探针，CEN17探针包括SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.20所示的探针。

进一步，在本发明的一些实施方案中，HER-2探针中的每条探针在探针溶液中的浓度为10-100μmol/L；CEN17探针中的每条探针在探针溶液中的浓度为10-100μmol/L。

进一步，在本发明的一些实施方案中，HER-2探针标记有第一荧光染料，CEN17探针标记有第二荧光染料；第一荧光染料和第二荧光染料不同。

进一步，在本发明的一些实施方案中，第一荧光染料选自Alexa Fluor 488、AlexaFluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647；

第二荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、AlexaFluor 610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647。

进一步，在本发明的一些实施方案中，试剂盒中还包括复染液、胃蛋白缓冲液、乙醇溶液、洗涤缓冲液I以及洗涤缓冲液II中的任意一种或几种。

进一步，在本发明的一些实施方案中，复染液含有：DAPI和抗淬灭剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的HER2基因扩增检测试剂盒，其含有探针溶液，探针溶液包括有用于稳定探针防止探针降解的探针稳定剂，该探针稳定剂包括如下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl以及EDTA。本发明的研究发现，将柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl以及EDTA组合可以较好地保护探针，防止探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性，避免假阴性结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的红色信号数量和绿色信号数量的计数方式的参考图(其中，黑色点表示红色信号点；白色点表示绿色信号点)；

图2为本发明实验例2中采用实施例1提供的HER2基因扩增检测试剂盒于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图；

图3为本发明实验例2中对照组1于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图；

图4为本发明实验例2中对照组2于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的HER2基因扩增检测试剂盒包括：探针溶液、含有DAPI和抗淬灭剂的复染液(Gold antifade reagent S36939)，胃蛋白缓冲液、乙醇溶液、洗涤缓冲液I以及洗涤缓冲液II。

其中，探针溶液中含有：HER-2探针、CEN17探针以及探针稳定剂。

其中探针稳定剂包括：4g/L柠檬酸钠(即每L探针溶液含有4g柠檬酸钠)、9g/LNaCl、110g/L硫酸葡聚糖、50％去离子甲酰胺(体积比)、6mmol/L Tris-HCl以及0.6mmol/LEDTA。

HER-2探针识别人类17号染色体长臂区域17q11.2-q12，其包括SEQ ID NO.1-SEQID NO.10所示的探针，每条HER-2探针在探针溶液的浓度为10μmol/L；且每条HER-2探针标记有红色荧光染料Alexa Fluor 594NHS ester。

CEN17探针识别人类17号染色体着丝粒区域17q11.2-q11.1，其包括SEQ IDNO.11-SEQ ID NO.20所示的探针，每条CEN17探针在探针溶液的浓度为10μmol/L；且每条CEN17探针标记有绿色荧光染料Alexa Fluor 488NHS ester。

胃蛋白缓冲液通过如下方法配制得到：

10ml的胃蛋白酶缓冲液(0.1N HCl)的配制方法

乙醇溶液通过如下方法配制得到：

1000ml乙醇溶液(70％和85％)的配制方法

洗涤缓冲液I通过如下方法配制得到：

1000ml洗涤缓冲液Ⅰ的配制方法

洗涤缓冲液II通过如下方法配制得到：

1000ml洗涤缓冲液Ⅱ的配制方法

采用本实施例提供的HER2基因扩增检测试剂盒的检测步骤如下：

1样本预处理

1.1准备工作：开启烤片机(45℃-60℃)；开启水浴锅(37±1℃)；胃蛋白酶缓冲液置于37±1℃水浴锅预热，使用胃蛋白酶与预热后的胃蛋白酶缓冲液配制浓度为1.0mg/mL的胃蛋白酶工作液，工作液置于37±1℃水浴锅预热(预热至少1h)。

1.2切片脱蜡：室温下将切片(由样品组织制得的石蜡包埋组织切片)浸没在二甲苯中，脱蜡10min，更换新鲜的二甲苯再重复脱蜡两次(共脱蜡3次)。完成二甲苯处理的切片浸没在无水乙醇中5min，更换新鲜的无水乙醇重复一次。无水乙醇处理后风干切片或置于烤片机上2-5min烘干切片。

1.3切片预处理：将盛有超纯水的烧杯置于微波炉中加热，将切片放入沸腾的超纯水中处理25min，取出晾干。

1.4胃蛋白酶处理：将预处理过的切片置于胃蛋白酶工作液中消化5-60min，期间每5min镜检1次(在明场下使用10×物镜观察)，以大部分组织细胞分散为单个细胞为消化完成标准；消化完成后将切片浸没在超纯水中洗涤3min。置于烤片机上2-5min烘干切片。

2FISH检测

FISH检测包括脱水、杂交、杂交后洗涤与DAPI复染四个步骤。因为探针上的荧光基团见强光容易发生淬灭，所以杂交、杂交后洗涤及DAPI复染三个步骤均需在暗处操作(避光操作)。

2.1准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。

2.2脱水：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水各1min。置于烤片机上2-5min烘干切片。

2.3杂交(避光操作)：在切片样本杂交区域加入10μL上述探针溶液(每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将切片放入已安装湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：85℃变性8min，42℃杂交过夜(14h～18h)。

2.4杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(76±1℃)，将洗涤缓冲液Ⅱ置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于室温的洗涤缓冲液Ⅰ中5min，洗掉盖玻片，再置于76±1℃的洗涤缓冲液Ⅱ中5min，期间可轻轻晃动切片1-3s；

2.5用洗涤缓冲液Ⅰ和洗涤缓冲液Ⅱ分别重复洗涤一次；最后用洗涤冲液Ⅰ再重复洗涤一次，每种洗涤缓冲液重复洗涤时的时间与第一次用该缓冲液洗涤时时间相同。洗涤后将切片直立风干。

2.6DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将切片放至室温后进行观察。

3结果判定

HER2基因扩增检测试剂盒的结果判断标准为：

观察50个计数细胞，统计每个细胞核中的红色信号数量和绿色信号数量，根据以下标准对样本进行阴阳性判断(样本是否存在HER2扩增)：

1、信号比值(红色信号数量/绿色信号数量)≥2.2，该样本判定为阳性(HER-2基因扩增)；

2、观察到具有成簇红色信号的细胞(此时无法对红色信号进行计数，认为信号比值≥2.2)，该样本判定为阳性(HER-2基因扩增)；

3、信号比值≤1.8，该样本判定为阴性(HER-2基因无扩增)；

4、信号比值在1.8至2.2之间，需另一阅片人另外计数50个细胞。汇总统计100个细胞核中的信号比值(比值＝100个细胞核中红色信号总数/100个细胞核中绿色信号总数)。信号比值≥2.0，该样本判定为阳性；信号比值<2.0，该样本判定为阴性。

红色信号数量和绿色信号数量的计数方式可参可图1。

实验例1

以新鲜配制的实施例1提供的试剂盒对20份样品进行检测，以TE缓冲液(含25mMTris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组1，以水稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组2；以安必平公司(LBP)HER2基因扩增检测试剂盒对样品进行检测作为阳性对照，计算本发明实施例1所提供的试剂盒、对照组1和对照组2的检测结果吻合率。检测结果见表1。

表1.实施例1提供的试剂盒对20份样品进行检测的结果(“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果)

样本号	实施例1	对照组1	对照组2	阳性对照
					1	N	N	N	N
2	P	P	P	P
					3	N	N	N	N
4	N	N	N	N
					5	N	N	N	N
6	P	P	P	P
					7	N	N	N	N
8	N	N	N	N
					9	N	N	N	N
10	N	N	N	N
					11	N	N	N	N
12	P	P	N	P
					13	P	P	P	P
14	P	P	P	P
					15	N	N	N	N
16	N	N	N	N
					17	P	P	P	P
18	N	N	N	N
					19	N	N	N	N
20	P	P	P	P
					吻合率	100％	100％	95％	-

由表1可看出，实施例1提供的试剂盒和对照组1的检测结果与阳性对照的吻合率达100％，对照组2在检测12号样品的结果与其他组不一致，其吻合率为95％，表明用水作为稀释液稀释探针容易出现假阴性结果。

实验例2

采用于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月以及36个月的实施例1提供的试剂盒对表1中的2号样品进行检测，以TE缓冲液稀释探针制得的探针溶液作为对照组1，以水稀释探针制得的探针溶液作为对照组2，验证实施例1提供的试剂盒的准确性，结果见图2-图4和表2。

表2.实施例1提供的试剂盒在存放不同时间后对2号样品的检测结果

存放时间

1个月

6个月

12个月

24个月

36个月

准确性(阳性数/5)

实施例1

P

P

P

P

P

100％

对照组1

P

P

N

N

N

40％

对照组2

P

N

N

N

N

20％

由根据图2-图4的结果并结合表2的数据可知，实施例1提供的HER2基因扩增检测试剂盒的在-20℃存放36个月后，其检测结果的准确性可达100％，其准确性明显高于对照组1和对照组2，由此表明，实施例1提供的HER2基因扩增检测试剂盒的稳定剂可以较好地保护碱基序列如SEQ ID NO.1-20所示的混合探针，防止探针降解，避免出现假阴性结果。

实施例2-5

实施例2-5提供的HER2基因扩增检测试剂盒的成分与实施例1基本相同，不同的是稳定剂中的组分含量和探针浓度不同，具体见表3。

表3实施例2-5提供的HER2基因扩增检测试剂盒中的稳定剂成分含量

实验例3

采用于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月以及36个月的实施例2-5提供的试剂盒对表1中的2号样品进行检测，与对比例1和2提供的试剂盒相比较，验证实施例2-5提供的试剂盒的准确性，其结果见表4。

对比例1和2提供的HER2基因扩增检测试剂盒的成分与实施例1基本相同，不同的是稳定剂的成分含量，具体见表5。

表4存放不同时间后实施例2-5提供的试剂盒对2号样品的检测结果

存放时间

1个月

6个月

12个月

24个月

36个月

准确性(阳性数/5)

实施例2

P

P

P

P

P

100％

实施例3

P

P

P

N

P

80％

实施例4

P

P

P

P

N

80％

实施例5

P

P

P

P

P

100％

对比例1

P

P

N

N

N

40％

对比例2

P

P

N

N

P

60％

表5对比例1-2提供的HER2基因扩增检测试剂盒中的稳定剂成分含量

由表4可以看出，本发明实施例提供的HER2基因扩增检测试剂盒可以长时间的存放，其检测结果的准确性达80％以上，尤其是实施例1、实施例2、实施例5提供的HER2基因扩增检测试剂盒在-20℃存放36个月后其检测结果的准确性达100％；此外根据表4结果可看出，对比例1和对比例2中采用了不同配比的探针稳定剂，其准确性最高为60％，与TE缓冲液的效果相当，这进一步表明采用本发明实施例通过合理优化的稳定剂配方可以大大地延长探针的存放时间，提高检测结果的准确性，避免假阴性结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 益善生物技术股份有限公司

<120> 一种HER2基因扩增检测试剂盒

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 245

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacccaccct gcacatccta tccaaaatgc aaataccatg caaacatggt atttgcctac 60

tctggtgcct tccatggctc ccagtgtccc taagatgagg ccatgctctt tagggacacc 120

cctgatttgg ctgctgcttt tatctgtgcc ctcagcagct ccaactattt ctggatttac 180

aagcctcatg cctagtaatc tttgttcagg ctgttctgtc ttcctgaggt gtccagtcca 240

gcttc 245

<210> 2

<211> 223

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agatgcccag tttctgggtg aatgggagca agttggagag gttgggggaa gaaggcagga 60

agggcaggct ggcggctctg agcttctcca tgcagccccc ggggccgggt gcctgggcag 120

gaggacgggg cagagcagct gctggcgatt tattaagcag tcacggaaaa attggtttat 180

aaattaacag ctgttttaac tttagggcct cttcttcagg gaa 223

<210> 3

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctgggcca acaacttatc atccagctgt ttcccaacaa gtatataagt caacaaacat 60

acagggactt gagccaggcc tggggtgggc tgatgtggag ctggatggcc aggacatccc 120

actcctatga gcaacactct ggacctcctg ccaccctttc cctcaccccc agagtgggcc 180

ctgaccccaa ttccagaaga ttcctctggc ctttcactcc a 221

<210> 4

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagaaggtcc cagcctgtca tgggggaagg tcatgttcct ctggggtcgg ctccgctctg 60

cctcttcctg gctaggggac tgtgggcagc tctccttccc atgagtcatc actacagctt 120

ctgggaaggg gtgtgatgca ttaaggagat ggtgtctgca tggtgccacc gcaggccatg 180

gccagctgga tctgtgtctt ctgcacc 207

<210> 5

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacagaggcc tgagcgtaga acagccttga gccctgcctt gtgcctcctg cacagggaat 60

gctggcagga taaggagcgc cagctgcgag ccagggtgaa acgggtcctg cccatcgacg 120

tgcaccagcc ccagcccctg ggtgctggga gcccagctcc cctgcctgct gacgccctgg 180

tctctgcctt ctgcttggag 200

<210> 6

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaccacgc tgcacagaat tcagagcaca gtgtggagtc tgacagccat ggggtcacgt 60

cctgtggcaa cccttcactg gctgggtgcc cctaagcatg tggtccccct gtcgaaggct 120

cagctgcctc atcaggcaag aagagcgaat actcatcccc acctgatgag gctcactgag 180

gatcaagggc accaacaggt tt 202

<210> 7

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctgctctct cctgccagtg tgcaccggca cagacatgaa gctgcggctc cctgccagtc 60

ccgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 120

acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gtgaggcccg 180

tgggcaaccc agccaggccc tgcctccagc tgggctgagc cctctgttta caggtgggtg 240

gcagaa 246

<210> 8

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcccggtat gaaggctgag acggcccctt ccccacccac ccccacctcc tcagtgtgct 60

atggtctggg catggagcac ttgcgagagg tgagggcagt taccagtgcc aatatccagg 120

agtttgctgg ctgcaagaag atctttggga gcctggcatt tctgccggag agctttgatg 180

ggtaagagtg ggcacgatga 200

<210> 9

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggactcct gttcacccac accctctttc tgggtcattc actcaaaata ttaactacaa 60

gagctccact ctcattgtac atgtgaacac actcctactg attcagttga tcttcactga 120

attaaccttg ttttctagtt gataagttag gcaaaggcta gttttcaatt gaagatggca 180

ctcattttct ttcctaaact gctagtcttt tgcctcacac ttgttggat 229

<210> 10

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggttggcct gctactatcg aatgagacaa catgtctctc caacttaatg ttttcatatt 60

cattatattc tcttgaatag ctgtaaggga tttcaggctc ttctgcattt cccatgggtt 120

ctgactttaa aacattctca tctctttcac tgtattcatc tttcactttc attgaatcat 180

ctgcagggaa gaaaatgcaa gaaatgaaca acgactatac ttgaagctat caaagcagct 240

caaacagcag 250

<210> 11

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaggagct cagtagcctg gtattcactg taaaatacta tgtcagaagt ctctttgtgg 60

tctcaaaata gaaaaatcta tcaacttagg cttttttatc tctaataaca tttctaatta 120

tatttcctgg ttctggagct ccagtgaacc agggagagtt catcaagatc taccacatgc 180

tgaaatccaa ccctaaggga a 201

<210> 12

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctgacaaag cccagccatt gctggcacct gctgtagccc ctaagatgga tcagcctggc 60

ccagtcctca acagcccaca ctgaggaagg taaaaccaca ggcacctgtg ataagaggca 120

ggcagatgca agtcacatag tagggacaga ccaggtgctg caggagccca ctcagatggg 180

cactcaatcc aggtaggctt tctagaggcg g 211

<210> 13

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agattgcgtc ccgattcctc actggtgttg atgctgctat ggaaacgtcc ctgatggtcc 60

aggtttatgg tgggagagat tgcaatgctc tgcctcctag aaatctgtgt ttacagccaa 120

cagagttgct gcccgagaca gccccacctg aggaccccag agctgcccca gcatgccagg 180

cttcccctcg tcctgttatc accccatgct gctgagaacc tgcctagcat gc 232

<210> 14

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccaaactca ccttctctgt gaatcctact tcttccccat catgcagcaa attgtctctc 60

tcactagacc tccagcccct aaaaatcagg gacagcttaa tgtatgttgg aaatggctac 120

tcctcactta attaccctaa ttagctagtt atattccctt atatttatgt ttccccattt 180

actgaagctt tccacaggcc 200

<210> 15

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcatgccacc aaggttagag ctgaccaacc ccagaatgct cagcagctct gggaccctgg 60

agtggaggac tcaaggcaga gggtgatgtc taagtcacac acatctgagc tccaatctaa 120

actccactat gcagctgagt gaccacatat tgtgaggctc agcattctct actacaaaat 180

gaaactacag aaggtaccaa aaactcagga tgaggggaga actgcaccct gaatgca 237

<210> 16

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tccaacagtg actgccatcc tacagaggaa agactggtaa ggccagatga aagcctgaca 60

taggtaaaaa tgcagctttc aactgtaatt cacaaataaa agtcccaagc agtaaaacta 120

ctgacaccaa gagtgaaagt cattacaaac gggattccag cagtgatttc aacctagctc 180

ccttttgtca cagtttctag aagaggtggg acatgagtag gtgagtatgc aggaaggttg 240

atggagca 248

<210> 17

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgcctgtga acaagacgga gatgactggg gagccaacat aaatatgtta aacacaggtg 60

atcttggaca tgtaagaagg atctttattc cacaggtgga aaagggtgat agtggttttc 120

ttgcaaatga agctttacgg gaggattata tccatctacc caaagtgata ctttttcact 180

tgccctcaca gtggtatgtg 200

<210> 18

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aagcacctgc tcagctacaa accaaaatcg aggtaaattc aaaaagccct gcgactggac 60

tgcgggggtc tggcccaggg ctggccacag aacaataaag cacggggagt tgtctgtttt 120

ggggtgtggt gtgcttctct tctttttaga aatgtggttt ttttgcaagg ggaggtgatt 180

ttgaccctgg cggttgtcag ccattcttcc 210

<210> 19

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttcctgccaa cgctctctaa aaatcagtcc tttcaggctt ttgtgctggt attagattta 60

agttatagac aagacatata tttctgacct tttcctttcc ctttctacac cctggggtca 120

aagtctccta taaaaggaca tttgcagcaa gtattttcag ctggggtagg aggaaagggc 180

aggaatagga agcagagcag tatgaccacc t 211

<210> 20

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cagcttgcca atgtaacgca gccttatttc atttttattg taaataaaag cacattctaa 60

tatgttttag ctgaatacag caatgtatat attcaactac ttcccaatag ggaaaattta 120

aaaaagttat ttatttagcc cagagcttta gtttcctttt acataaccaa aaaatacttc 180

gtgtgaaata aaaccttttt acaggtaatg agaccccata ga 222

Claims (8)

1.一种HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，其包括：探针溶液；

所述探针溶液含有：HER-2探针、CEN17探针以及探针稳定剂；

所述探针稳定剂由如下组分组成：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl、EDTA以及水；

所述探针稳定剂中各组分的浓度如下：

2-10g/L柠檬酸钠、5-15g/L NaCl、80-150g/L硫酸葡聚糖、30％-80％去离子甲酰胺、1-8mmol/L Tris-HCl以及0.05-1mmol/L EDTA。

2.根据权利要求1所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述探针稳定剂包括：2-8g/L柠檬酸钠、7-12g/L NaCl、90-130g/L硫酸葡聚糖、45％-65％去离子甲酰胺、3-7mmol/L Tris-HCl以及0.1-0.8mmol/L EDTA。

3.根据权利要求2所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述探针稳定剂包括：4g/L柠檬酸钠、9g/L NaCl、110g/L硫酸葡聚糖、50％去离子甲酰胺、6mmol/L Tris-HCl以及0.6mmol/L EDTA。

4.根据权利要求1-3任一项所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述HER-2探针包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的探针，所述CEN17探针包括SEQ ID NO.11-SEQID NO.20所示的探针。

5.根据权利要求4所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述HER-2探针中的每条探针在所述探针溶液中的浓度为10-100μmol/L；所述CEN17探针中的每条探针在所述探针溶液中的浓度为10-100μmol/L。

6.根据权利要求5所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述HER-2探针标记有第一荧光染料，所述CEN17探针标记有第二荧光染料；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料不同。

7.根据权利要求6所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor633以及Alexa Fluor 647；

所述第二荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647。

8.根据权利要求1-3任一项所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括复染液、胃蛋白缓冲液、乙醇溶液、洗涤缓冲液I以及洗涤缓冲液II中的任意一种或几种；

其中，所述复染液含有：DAPI和抗淬灭剂；

10ml所述胃蛋白缓冲液的配制方法如下：

用1ml 1N盐酸与9ml超纯水混合；

1000ml所述洗涤缓冲液I的配制方法如下：用35mL pH5.3的20×SSC和3ml乙基苯基聚乙二醇混合，用超纯水定容至1000ml；

1000ml所述洗涤缓冲液II的配制方法如下：用100mL pH5.3的20×SSC和3ml乙基苯基聚乙二醇混合，用超纯水定容至1000ml。