CN102037137B - Rna原位杂交 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种RNA原位杂交法，其特征在于，其是使1种或多种寡聚核酸探针与在组织试样中表达的目标基因mRNA杂交，检测在寡聚核酸探针的至少1个碱基上附加的低分子化合物标记来鉴定目标基因mRNA的存在的方法，在使1种或多种假寡聚核酸对组织试样进行前处理即预杂交后，使寡聚核酸探针与组织试样接触，使其与目标基因mRNA杂交，或者使寡聚核酸探针和上述假寡聚核酸的混合液与试样组织接触，使寡聚核酸探针与目标基因mRNA杂交，其中，上述假寡聚核酸由与寡聚核酸探针大致相同的长度形成，不与目标基因mRNA上的寡聚核酸探针进行杂交的区域发生杂交，而且不与寡聚核酸探针发生杂交。

Description

RNA原位杂交
技术领域
本发明涉及在病理学上和组织化学上对基因表达进行简便检测、定量化、可以用于研究以及诊断的RNA原位杂交。
背景技术
(1)RNA原位杂交
已知有多种病理学性、组织化学性检测基因表达的方法。其中，作为对基因转录而形成的转录产物即信使RNA(mRNA)进行mRNA所存在的即时位置(原位)检测的方法，有原位杂交法。该方法通过将溶解了具有与欲检测的mRNA的序列互补的核酸序列的核酸探针(probe)的原位杂交用的缓冲液(专利文献1)添加在组织试样中，使核酸探针与mRNA杂交。这时，在核酸探针上附加检测用的标记，用适当的方法对标记进行检测，在显微镜下进行观察(专利文献2)。多数情况下，作为标记使用异羟基洋地黄毒甙元(Dig，digoxigenin)，使用在抗异羟基洋地黄毒甙元抗体上结合有碱性磷酸酶的蛋白质，利用抗异羟基洋地黄毒甙元抗体部分检测Dig标记，进一步引发基于碱性磷酸酶-NBT/BCIP的显色反应，进行致敏(专利文献3、4、5、6)。作为核酸探针，可以使用在离体(in vitro)转录体系中转录欲检测的mRNA的全长或者一部分的序列而得的互补RNA、或者基于化学合成的寡聚DNA(专利文献7，8)或者寡聚RNA。
这样的原位杂交法，自从最初的论文由Pardue and Gall(非专利文献1)和Johnet al.(非专利文献2)发表以来，已经过去将近40年。当初的标记使用放射性同位素，使其在胶片上感光而检测mRNA的存在。然后，作为非放射性同位素的方法(专利文献9)，上述的Dig标记法等被开发出来(专利文献3、4、5、6)。另外，作为致敏法，除了上述基于碱性磷酸酶-NBT/BCIP的显色反应之外，开发了酪胺酰胺(Tyramide)致敏法(TSA致敏法)，可以在提高检测灵敏度方面使用(专利文献10、11、12)，还开发了使用荧光色素的检测(非专利文献3，专利文献13、14、15)。
(2)核酸探针
作为与欲检测的mRNA对应的核酸探针，使用利用离体转录体系转录而得的互补RNA时，通过将Dig-UTP混入离体转录体系，在转录合成的互补RNA上插入Dig-UTP而附加Dig标记(专利文献3、4、5、6)，但是各个互补RNA探针分子上会插入多少个的Dig-UTP，另外在探针序列中的哪个位置上插入，不能人为地控制。另外，使用互补RNA作为探针时，为了获得强的信号，在离体转录体系中合成尽可能长的互补RNA，可以利用水解制成长度为从300碱基至500碱基左右的片段化后的探针再使用。这时，不能人为地控制所谓何处被水解的位置，成为各种片段混合存在的探针。为了避免各种片段的混合存在，也有以下情况，即从作为目标的mRNA全长中，利用计算机选择1个特性高且长度为300碱基至500碱基左右的区域作为其他基因，克隆该区域后，利用离体转录体系制成互补RNA探针，利用1种探针进行RNA原位杂交的情况。但是，在区域选择性地进行克隆时，由于作为PCR引物的该区域的两端序列的限制、作为杂交时的重要参数的GC含量的限制等，在每个基因之间，探针的长度变得形形色色。进而存在以下的缺点，除了在离体转录体系中选择的区域以外，还要在互补的RNA的3’末端侧附加所使用的载体(vector)等多余的序列。这样，使用离体转录体系，将互补RNA作为探针使用时，每个探针长度变得多种多样，附加的标记的位置、数量也不能控制，因此存在以下缺点，无法使在用于对表达的mRNA进行定量化的检测中使用的探针具有定量性。特别是在以多个基因间的表达量的比较为目的的情况下，由于所使用的探针间的杂交条件不同，所以以往的互补RNA探针并不合适。另外，使用互补RNA作为核酸探针时，还伴有实验条件不易设定的困难。即，杂交过程是一种平衡反应，因此为了提高检测灵敏度，需要探索核酸探针与尽可能多的mRNA分子杂交的探针的浓度条件和使其杂交时的温度条件，这根据所用的互补RNA探针的长度、GC含量的不同而不同。在检测杂交后的互补RNA探针的工艺中，用于检测标记的抗体反应也是平衡反应，因此将抗体浓度设置为多少，这样的条件也需要探索。进而，基于碱性磷酸酶的显色反应等的致敏也依赖于反应时间而增加发色强度，因此需要控制反应时间。基于以上，当使用在离体转录体系中制成的互补RNA作为核酸探针时，需要探索复杂的工艺和条件，并不简便。
最近，开始尝试将利用DNA合成机等化学合成的寡聚核酸作为探针使用。可以认为，这是因为即使不克隆mRNA，也会以登记在数据库中的核酸序列为基础简单地进行探针制作。进而，由于序列短，与长度为300碱基至500碱基的互补RNA探针相比，具有对组织样品的浸透性更好的优点。另一方面，与互补RNA探针相比，寡聚核酸探针由于长度短，因此每1分子探针上带有的标记的数量更少，所以在检测杂交后的寡聚核酸方面，存在信号强度弱的缺点。
为了克服该缺点，大致从两个方向开始尝试。其一是，作为寡聚核酸探针的标记分子，使用Cy3、荧光素等荧光分子，使用60倍至100倍的高倍率物镜，将从标记的荧光分子发出的微弱荧光作为亮点捕捉，在Z轴方提高使用CCD照相机对多个光学切面(opticalsection)进行摄影，使用计算机算法将图像鲜明化，由此进行观察的方法(专利文献13)。由于进行计算机处理，可以测量1像素中的亮度，mRNA的定量化成为可能。这种情况下，为了使信号强度发挥作用，正在尝试通过从附加标记分子的碱基间解离掉10碱基以上来增加附加于探针的标记分子的数量。进而，发展该方法开发了使用通过多个荧光分子进行了彩色编码的探针在mRNA发生转录的位置对欲检测的mRNA进行检测的方法(专利文献14，15)。
另一个方向是通过在探针分子的和目标mRNA互补的序列的外侧带有尾部(tail)来增加附加的标记分子的数量的方法、称为TSA(酪胺酰胺增敏：Tyramide sensitivityamplification)的致敏法(专利文献10、11、12)等，对信号进行致敏而进行检测、观察的方法。通过基于碱性磷酸酶-NBT/BCIP的发色致敏、TSA致敏法，背景噪声由于致敏而存在增强的趋势，表达的强弱可以被显微镜定性观察，但是还无法达到对mRNA量的定量化。另外，在相同组织样品中，也无法进行对多个基因的mRNA之间的表达量的比较。
专利文献1：美国专利No.5750340
专利文献2：美国专利No.4,888,278
专利文献3：日本专利第1999884号
专利文献4：美国专利No.5344757
专利文献5：美国专利No.5354657
专利文献6：美国专利No.5702888
专利文献7：美国专利No.5597692
专利文献8：美国专利No.6265156
专利文献9：美国专利No.5,985,549
专利文献10：美国专利No.5196306
专利文献11：美国专利No.5,583001
专利文献12：美国专利No.5,731158
专利文献13：美国专利No.5,866,331
专利文献14：美国专利No.6,534,266
专利文献15：日本特表2002-542793
非专利文献1：Pardue ML，andGall JG.(1969)Molecular hybridization ofradioactive DNA to the DNA of cytological preparations(相对于细胞制备DNA的放射性DNA的分子杂交).Proc Natl Acad Sci U S A.1969 Oct；64(2)：600-4
非专利文献2：John et al.(1969)RNA-DNA hybrids at the cytological level(细胞水平的RNA-DNA混合物).Nature.1969 Aug 9；223(5206)：582-7
非专利文献3：Levsky JM，and Singer RH，Fluorescence in situhybridization：past，present and future(原位杂交中的荧光：过去、现在和将来).J.Cell Science，116，2833-2838，2003.
在表达的mRNA的定量化中，使用定量性PCR法。然而，在定量性PCR中，对组织进行匀质化而破坏组织的结构，使用来自在组织中存在的各种细胞的mRNA混合后的试样，因此不能进行在各个细胞中表达的mRNA的定量化。因此，除了局部存在性之外，如果可以对组织化学性表达的mRNA的量进行定量，则由组织中各细胞表达的mRNA的定量化就成为可能，在科学和产业上的应用会很广泛。例如，在癌组织中，癌细胞和正常细胞混合存在，进而在正常细胞中也共存各种物质。另外，在癌组织中，多数情况下有分化度高的癌细胞和分化度低的癌细胞混合存在。在这样的癌组织的癌细胞中，通过对组织化学性地表达的mRNA进行检测并定量化，若能够对抗癌剂的起效程度进行诊断，则从癌的化学治疗的观点出发可以期待更大的效果。
作为用于组织化学性地检测组织试样中的mRNA的局部存在性的方法，有RNA原位杂交法。以往，作为RNA原位杂交法，多数情况下使用在离体转录体系中制成的互补RNA作为探针。然而，互补RNA探针虽然可以病理学性地、组织化学性地检测欲检测的mRNA的存在(局部存在性)，但是不适于究竟多少程度的mRNA量局部存在这样的检测，不适于定量化。另外，使用利用荧光分子标记的寡聚DNA探针时，通过使用计算机测量荧光强度，可以对表达的mRNA进行定量，但是在荧光信号的检测中需要使用60倍至100倍的高倍率物镜。因此，组织试样中的可检测范围非常窄，在采用利用10倍至40倍的物镜对大范围组织试样进行诊断的通常的病理学性的、组织化学性的方法论的情况下，在检测mRNA的存在方面存在困难。而且，需要使用高价的显微镜在Z轴方向的多个光学切面中进行图像摄影，使用特殊的计算机算法将图像鲜明化，因此mRNA的检测并不简便。另一方面，为了使用10倍至40倍的物镜检测组织试样中的mRNA而使用了TSA致敏等致敏法时，不只是目标信号被增强，背景噪声也同时被增强，信号-噪声比(SN比)变差，mRNA的定量化是困难的。
通常，进行RNA原位杂交时，为了降低背景噪声，使用鱼(主要是鲑鱼)精子的DNA、酵母菌tRNA等。由于组织试样为生物体试样，分子特性与生物体高分子同等的、核酸探针非特异性吸附着的部位，多存在于组织试样之中。非特异性吸附于组织试样的核酸探针成为背景噪声的原因。特别是通过致敏法来增强信号时，背景噪声也同时增加，导致SN比的恶化。为了防止该核酸探针对组织试样的非特异性吸附，在使核酸探针杂交前，将利用超声波处理片段化为长度2000碱基左右的单链鱼精子DNA、酵母菌tRNA等用于预杂交，使其非特异性地吸附在吸附部位，则可以降低背景噪声。或者可以将鱼精子DNA、酵母菌tRNA在杂交溶液中与核酸探针混合起来使用。
然而，使用寡聚核酸探针时，若使用片段化为长度2000碱基左右的单链而得到的鱼精子DNA，则有可能在鱼精子DNA中存在寡聚核酸探针发生杂交的部位。该部位与本来的组织试样中的目标mRNA发生竞争，由此变得妨碍寡聚核酸探针在目标mRNA上杂交，有可能成为降低本来的信号的原因。或者与鱼精子DNA杂交后的寡聚核酸探针成为背景噪声的原因，由于致敏而将其噪声放大。另外，即使鱼精子DNA被片段化为长度2000碱基左右，寡聚核酸探针也比鱼精子DNA短，其对组织试样的浸透性高，因此在组织试样中，有可能存在鱼精子DNA不能到达的非特异性吸附部位，这也有可能是提高背景噪声的原因。
发明内容
本发明是鉴于上述问题点而开发的，其课题在于提供以下用于研究以及诊断的方法：通过降低背景噪声增强信号，使用10倍至40倍的物镜，正确且简便地检测与mRNA的表达量对应的信号强度的变化，由此对病理学性地和组织化学性地表达的mRNA进行检测、定量化。
本发明人发现，不使用RNA原位杂交中通常使用的鲑鱼等的鱼精子DNA，而是使用与寡聚核酸探针大致相同长度的假寡聚核酸来防止寡聚核酸探针向组织试样的非特异性吸附，由此在使用致敏法时，在荧光显微镜中使用10倍至20倍的物镜并利用CCD照相机来简便地进行图像摄影，就会有SN比的提高以及信号的增强。于是，以该假寡聚核酸的使用为前提，随着寡聚核酸探针的标记数量的增加，可以看出被观察的信号强度以加和的形式增加。进而，检测一个基因的表达mRNA时，随着带有有相同数量的标记的寡聚核酸探针的序列种类数量增加，可以看出被观察的信号强度以加和的形式增加。进而，随着寡聚核酸探针序列中的GC含量增加，可以看出被观察的信号强度以增函数的形式增加。另外，随着探针的Tm值上升，可看出被观察的信号强度以增函数的形式增加。
本发明基于发明人等的以上的新见解，提供以下技术。
(1)一种RNA原位杂交法，其特征在于，其是使1种或多种寡聚核酸探针与在组织试样中表达的目标基因mRNA杂交，检测在寡聚核酸探针的至少1个碱基上附加的低分子化合物标记来鉴定目标基因mRNA的存在的方法，
使1种或多种假寡聚核酸对组织试样进行前处理(预杂交)后，使寡聚核酸探针与组织试样接触，使其与目标基因mRNA杂交，或者
使寡聚核酸探针和上述假寡聚核酸的混合液与试样组织接触，使寡聚核酸探针与目标基因mRNA杂交，
其中，上述假寡聚核酸：
由与寡聚核酸探针大致相同的长度形成，
不与目标基因mRNA上的寡聚核酸探针进行杂交的区域发生杂交，而且
不与寡聚核酸探针发生杂交。
(2)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，假寡聚核酸量为寡聚核酸探针量的2～10倍。
(3)根据上述(2)所述的RNA原位杂交法，其中，寡聚核酸探针和假寡聚核酸的碱基长度在20bp至70bp的范围内大致相同。
(4)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，寡聚核酸探针分别在其5’末端碱基或/和3’末端碱基上附带有低分子化合物标记。
(5)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，将2种以上的上述(4)中所述的寡聚核酸探针以各自的5’末端和3’末端隔开8碱基以上的方式与mRNA进行杂交。
(6)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，使用抗低分子化合物的抗体、在该抗体上结合的酶、作为该酶的基质的发色化合物或荧光分子化合物来将检测信号致敏，使用10倍至40倍的物镜来检测信号。
(7)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，组织试样为从哺乳动物分离的组织，假寡聚核酸是与逆转录转座子的重复序列的一部分相当的寡聚核酸。
(8)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，组织试样为从哺乳动物分离的组织，假寡聚核酸是与植物基因组的一部分或微生物基因组的一部分相当的寡聚核酸。
(9)根据上述(1)所述的RNA原位杂交法，其中，
假寡聚核酸是如下得到的寡聚核酸，
将寡聚核酸探针的碱基序列中的A置换为T、T置换为A、G置换为C且C置换为G，
相同碱基连续M个(M为4)以上的情况下，将从该连续序列中的M×0.2处(小数点以下四舍五入而得的整数)至M×0.8处(小数点以下四舍五入而得的整数)的碱基利用其互补的碱基来置换，
存在无论从5’侧读取还是从3’侧读取都为相同序列的N碱基(N为5)以上的回文序列时，利用其互补的碱基置换至少N×0.2处(小数点以下四舍五入而得的整数)的碱基，N为偶数时至多为(N/2-1)处的碱基，N为奇数时至多为((N-1)/2-1)处的碱基，由此得到寡聚核酸。
(10)一种上述(7)所述的RNA原位杂交法中使用的假寡聚核酸，其是含有逆转录转座子的重复序列的局部序列的寡聚核酸、或含有与该重复序列各不相同的局部序列多种寡聚核酸的组。
(11)一种上述(8)中所述的RNA原位杂交法中使用的假寡聚核酸，其是含有植物基因组的一部分或微生物基因组的局部序列的寡聚核酸、或者含有与植物基因组或微生物基因组各不相同的局部序列的多种寡聚核酸的组多种寡聚核酸的组。
根据如上所述的本发明，能够对病理学性地和组织化学性地表达的mRNA进行简便且高精度地检测、定量化，可以推进与各种疾患的原因、治疗法等相关的基础研究，或者对各种疾患的诊断精度的提高作出巨大贡献。
附图说明
图1示出在实施例1中求出假寡聚DNA相对于寡聚DNA探针浓度的最适添加比率的RNA原位杂交的结果。
图2示出在实施例1中，为了求出假寡聚DNA相对于寡聚DNA探针浓度的最适添加比率，由RNA原位杂交的结果求出各添加比率中的信号强度的结果。
图3示出在实施例1中，为了求出假寡聚DNA相对于寡聚DNA探针浓度的最适添加比率，求出对于添加比率1倍和8倍而言各探针浓度中的信号强度的结果。
图4示出在实施例2中，求出2种假寡聚DNA、鲑鱼精子DNA和无添加时相对于各寡聚DNA探针浓度的效果的RNA原位杂交的结果。
图5示出在实施例2中，为了求出2种假寡聚DNA、鲑鱼精子DNA和无添加时相对于各寡聚DNA探针浓度的效果，由RNA原位杂交的结果计算出探针浓度为0nM时的信号强度的结果。
图6示出在实施例2中，为了求出2种假寡聚DNA、鲑鱼精子DNA和无添加时相对于各寡聚DNA探针浓度的效果，由RNA原位杂交的结果计算出的各探针浓度中的信号强度。
图7示出在实施例3中，对假寡聚DNA和鲑鱼精子DNA的RNA原位杂交的RNA检测中的效果进行比较的结果。
图8示出在实施例3中，将所得到的SN比设为纵轴，将探针浓度设为横轴，对添加假寡聚DNA后的SN比与添加鲑鱼精子DNA后的SN比进行比较的结果。
图9示出在实施例4中，变更所使用的假寡聚DNA序列的种类和数量后进行的RNA原位杂交的结果。
图10示出在实施例4中，由用于求出各种假寡聚DNA的效果的RNA原位杂交的结果，求出各假寡聚DNA的效果作为信号强度的结果。
图11示出在实施例5中检测中所使用的探针的种类数和检测的信号强度的关系的RNA原位杂交的照片图像。
图12示出实施例5中的信号强度和探针的种类数量的相关关系。
图13示出在实施例6中对随着检测中所使用的探针的浓度上升而信号强度有着怎样的变化进行摄影的照片图像。
图14a示出实施例6中的信号强度与探针浓度之间的相关关系。
图14b示出实施例6中的信号强度与探针浓度之间的相关关系。
图15示出在实施例7中对随着检测中所使用的探针的浓度上升而信号强度有着怎样的变化进行研究的照片图像。
图16示出实施例7中的信号强度与探针浓度的相关关系。
图17示出在实施例8中，对随着昼夜节律而表达发生变动的基因Arntl而言，研究从上午9时开始每隔4小时直至深夜1时为止，利用RNA原位杂交对小鼠肝脏进行研究的照片图像。
图18示出在实施例8中，对内标准基因Actb和随着昼夜节律而表达发生变动的基因Arntl而言，从上午9时开始每隔4小时直至深夜1时，采肝脏，利用定量PCR对表达量的变化进行研究的结果。
图19示出在实施例8中，对于基因Arntl而言，从上午9时开始每隔4小时直至深夜1时，利用RNA原位杂交来研究肝脏中的表达变化，求得信号强度的变化的结果。
图20示出在实施例8中，对于基因Arntl而言，从上午9时开始每隔4小时直至深夜1时，利用定量PCR和RNA原位杂交来研究肝脏中的表达变化，获得定量PCR的结果和信号强度的结果的相关。
图21示出在实施例9中，对于基因Cyp1a2和Alb而言，通过使用多个寡聚DNA探针同时实施RNA原位杂交而得到的肝脏中的表达的照片图像。
图22示出在实施例10中，对酪胺酰胺增敏中的酪胺酰胺-Flu的浓度的影响进行研究的结果。
图23示出在实施例11中计算各寡聚核酸的GC含量(％)的例子。
图24示出在实施例12中，以相对于大鼠肺中的大鼠β-actin基因Actb的原位杂交的信号强度来确认寡聚核酸探针的带有标记的位置(5’末端或3’末端)的效果和数量的效果的结果。
图25示出在实施例13中，在一个基因的mRNA上，要检测使用多个标记进行杂交的产物时，用于确认在mRNA的核酸序列上2个标记到底需要隔开多少的2个寡聚DNA探针的示意图。
图26示出在实施例13中，在一个基因的mRNA上，要检测使用多个标记进行杂交的产物时，用于确认在mRNA的核酸序列上2个标记到底需要隔开多少而实施的RNA原位杂交的结果。
图27示出在实施例14中，利用改变了GC含量的寡聚核酸探针进行原位杂交后的结果。
具体实施方式
发明(1)的特征在于，使用与目标基因mRNA上寡聚核酸探针发生杂交的区域不进行杂交、并且也不与寡聚核酸探针杂交的1种或多种假寡聚核酸。具体而言，使单链的假寡聚核酸对组织试样进行前处理(预杂交)之后，使单链的寡聚核酸探针与组织试样接触并与目标基因mRNA发生杂交，或者使单链的寡聚核酸探针与单链的假寡聚核酸的混合液与组织试样发生接触，并使单链的寡聚核酸探针与目标基因mRNA发生杂交。此外，目标基因是在组织试样中表达的1种～10种左右的基因mRNA。
假寡聚核酸可以将不与目标基因mRNA上寡聚核酸探针发生杂交的区域进行杂交且不与寡聚核酸探针杂交作为条件，通过化学合成来制成。化学合成也可以使用市售的自动DNA合成机。另外，也可以委托DNA合成服务公司。所谓假寡聚核酸不与目标基因mRNA上寡聚核酸探针发生杂交的区域进行杂交的条件，是指其具有不同于与目标基因mRNA发生杂交的寡聚核酸探针的碱基序列的意思。这时的所谓不同的碱基序列，可以按照以下基准：例如在Blast等碱基序列比对中的一致率为30％以下、优选为20％以下、进一步优选10％以下。或者可以按照以下基准：是与相当于寡聚核酸探针的全长的70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上的连续碱基序列不同的序列。所述假寡聚核酸不与寡聚核酸探针杂交的条件，可以按照以下基准：与寡聚核酸探针的互补序列、例如Blast等碱基序列比对中的一致率为30％以下、优选20％以下、进一步优选10％以下。或者可以按照以下基准：是与相当于寡聚核酸探针的互补序列的全长的70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上的连续碱基序列不同的序列。
假寡聚核酸的种类可以为1种，或者可以为多种(2～5种)。另外，使用多种假寡聚核酸时，其中的2种可以为具有互补序列的假寡聚核酸。
该假寡聚核酸量、即后述的预杂交溶液或者杂交溶液中的浓度，可以设为寡聚核酸探针量、即杂交溶液中寡聚核酸探针的浓度的2～10倍，优选设为6～8倍。使用多种寡聚核酸探针时，将它们的浓度的合计值作为寡聚核酸探针量。使用多种假寡聚核酸时，将它们的浓度的合计值作为假寡聚核酸量。
进而，假寡聚核酸的长度与寡聚核酸探针的长度大致相同。这时的所谓大致相同，是指两者的长度差异为±10％、优选为±5％、进一步优选为±3％、特别优选为±0％(完全相同)的范围。寡聚核酸探针的碱基长度可以设为从20bp到70bp的范围，因此，假寡聚核酸的碱基长也在该范围内与寡聚核酸探针大致相同。
作为这样的假寡聚核酸，可以选择不与目标基因mRNA杂交但与其他基因的mRNA杂交的核酸序列。另外，也可以从来自在哺乳类的基因组中反复出现的逆转录转座子的重复序列之中，选择与寡聚核酸探针的长度大致相同的序列。进而，也可以从在植物、微生物中从不存在于哺乳类的基因序列中选择长度大致相同的序列。
就假寡聚核酸的选择而言，可以对欲选择假寡聚核酸的基因组中的重复序列、植物或微生物的基因的序列，可以利用简单的计算机程序一边从5’侧开始一个碱基一个碱基地错开一边计算所需的长度的部分序列中的GC含量，对具有所需GC含量的寡聚核酸序列进行列表。接着将被列表的寡聚序列施以blast检索，由此确认与寡聚核酸探针的一致度，选择与寡聚核酸探针一致度低的序列。在进行Blast检索时，同时对互补链进行检索，同时选择与寡聚核酸探针的互补链一致度低的序列。
另外，作为假寡聚核酸也可以使用如下得到的寡聚核酸：将寡聚核酸探针的碱基序列的例如从5’侧依次将A置换为T，将T置换为A，将G置换为C且将C置换为G，相同碱基连续M个(M为4)以上时，将从该连续序列中的M×0.2处(小数点以下四舍五入而得的整数)至M×0.8处(小数点以下舍弃而得的整数)的碱基利用其互补碱基进行置换；具有从5’侧读取或从3’侧读取为相同序列的N碱基(N为5)以上的回文序列时，利用其互补的碱基置换至少N×0.2处(小数点以下四舍五入而得的整数)的碱基，在N为偶数的情况下至多为(N/2-1)处、N为奇数的情况下至多为((N-1)/2-1)处的碱基，由此得到寡聚核酸。这时的假寡聚核酸的GC含量、长度都与寡聚核酸探针相同。
寡聚核酸探针可以在其至少1个碱基上附加低分子化合物标记。另外，也可以附加2种以上不同种类的低分子化合物标记。该低分子化合物标记可以使用例如与以往方法一样的异羟基洋地黄毒甙元(Dig，digoxigenin)、FITC(异硫氰酸荧光素：fluoresceinisothiocyanate)等荧光色素(非专利文献3)。使用例如Dig时，使用在抗异羟基洋地黄毒甙元抗体上连接有碱性磷酸酶的蛋白质，利用抗异羟基洋地黄毒甙元抗体部分来检测Dig标记，进而引发基于碱性磷酸酶-NBT/BCIP的显色反应，进行致敏(专利文献3、4、5、6)。另外，作为致敏法，除了基于上述碱性磷酸酶-NBT/BCIP的显色反应之外，也可以使用使酪胺酰胺-荧光色素分子与在抗异羟基洋地黄毒甙元抗体上连接有过氧化酶的蛋白质或者在抗FITC抗体上连接有过氧化酶的蛋白质发生反应而进行致敏的酪胺酰胺致敏法(TSA致敏法)等(专利文献10、11、12)。
对于低分子化合物标记的附加而言，作为一个优选方式为寡聚核酸探针的5’末端碱基和3’末端碱基这2处。这样的附加了标记的寡聚核酸，可以从寡聚DNA合成服务公司订货，可以容易地合成。
就寡聚核酸探针而言，对于一个目标基因mRNA，使1或多种、即1～20种、优选1～10种、进一步优选1～5种寡聚核酸探针与mRNA的不同区域发生杂交。通过使用这样的多种寡聚核酸探针，可以缩短杂交工序时间。进而，寡聚核酸探针的浓度可以设为0.01nM～10nM的范围，通过使浓度在上述范围内上升，可以将杂交工序时间特别地缩短。另外，使用多个寡聚核酸探针时，优选寡聚核酸探针间的GC含量大致相同。这时的所谓大致相同，是指两者的GC含量的差异为±10％、优选为±5％、进一步优选为±3％、特别优选为±0％(完全相同)的范围。
此外，使多种在两端具有标记的寡聚核酸探针与目标基因mRNA发生杂交时，使探针的5’末端和3’末端相互之间隔开8碱基以上。作为一个优选方式，将探针的5’末端和3’末端相互之间的距离设成所使用的寡聚核酸探针的长度以上。
所谓相对于目标基因mRNA设计多个这样的寡聚核酸探针的方法，首先使用简单的计算机程序，利用所需的寡聚核酸探针的长度窗口，一边从目标基因mRNA的5’末端开始1个碱基1个碱基地错开，一边利用其窗口计算GC含量，直到窗口到达3’末端为止通过实行计算可以容易地对具有所需的GC含量的探针序列的候选序列进行列表，对经列表的候选序列使用NCBI(美国国立生物技术信息中心：National Center for BiotechnologyInformation，美国)的blast检索，确认作为探针序列的特异性，可以容易地选择特异性高的序列的互补链作为寡聚核酸探针的序列。
杂交时使用的缓冲液(杂交溶液)基本上可以采用在专利文献1中记载的溶液。在本发明中，在最终溶液中，使用了甲酰胺12.5％～25％、3×SSPE(Invitrogen公司)、1×Denhardt(和光纯药)，葡聚糖(Dextran)10％(V/V)(Sigma公司)，0.2％CHAPS(Sigma-Aldrich公司))。通常在其中添加酵母菌或大肠杆菌的tRNA。另外，杂交的温度依赖于所使用的寡聚DNA探针的长度和GC含量，但可以在从30摄氏度至45摄氏度的范围实施。例如寡聚DNA探针的长度为40碱基、GC含量为50％的情况下，优选在40摄氏度至42摄氏度进行实施。杂交的时间是实施12小时至24小时，优选实施16小时。
基于如以上所述的RNA原位杂交法，可以定量检测目标基因mRNA。例如，使用异羟基洋地黄毒甙元(Dig)作为标记时，使用连结有过氧化酶(POD)的抗异羟基洋地黄毒甙元抗体实施基于酪胺酰胺-荧光色素的TSA致敏法，通过10倍至40倍的物镜的荧光显微镜利用CCD照相机对组织试样进行摄影，使用Image J(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)等图像处理软件，对得到的显微镜图像进行计算机处理，求出荧光色素的信号强度，由此就能够简便且定量地对目标基因的mRNA的表达量进行检测。
酪胺酰胺致敏用的试剂类和酪胺酰胺-荧光分子，由Perkin Elmer公司、Invitrogen公司销售，可以使用这些产品。另外，相对于结合有POD的标记分子的抗体，由Dako公司、Roche公司等销售，可以使用这些产品。
进而，使用附加有2种以上的标记i作为低分子化合物标记的寡聚核酸探针时，利用相对于附加有POD的各标记i的抗体，使用酪胺酰胺-荧光色素i来多阶段地进行酪胺酰胺增敏致敏，使用荧光显微镜对荧光色素i的信号进行多重检测，由此能够对2种以上的目标基因的mRNA进行局部存在性检测和定量检测。目标基因的表达量低时，通过增加与目标基因的mRNA发生杂交的寡聚核酸探针的数量、或寡聚核酸探针的浓度，可以扩大检测范围的宽度。相应地，目标基因的表达量高时，可以通过降低与目标基因的mRNA杂交的寡聚核酸探针中的标记的数量、探针的数量、寡聚核酸探针的浓度或所使用的酪胺酰胺-荧光色素的浓度，使检测范围的宽度与表达量低的基因mRNA为同等程度。由此，对表达量不同的多个基因的mRNA而言，可以以同等程度的信号的强度和范围宽度来进行局部存在性检测和定量检测，可以在病理组织诊断等中利用。
以下，示出实施例对本发明进行进一步详细且具体的说明，但是本发明不限于以下的例子。
此外，在实施例中，使用包含以下的碱基序列的合成寡聚核酸。
序列编号1：5’-catccagaacactaaacagaagatggcagtggccagtagc-3’
序列编号2：5’-gaagaagtccactgcattccctgaggtgacattctccaca-3’
序列编号3：5’-tcattgaaggtcttaaacctcttgagggccgggttgggca-3’
序列编号4：5’-cgctgtgcttgaacagggcacttgtgatgtcttggatact-3’
序列编号5：5’-tagtcccagctactcaggaagctgaggtgggaggatggct-3’
序列编号6：5’-gctcccggcgatacgagggtccgatcttagctcgttgaca-3’
序列编号7：5’-cttataagtgggagctgaacaatgagaacacatggacaca-3’
序列编号8：5’-gggaggggaacattgcacaccagggcctgttgtgggggag-3’
序列编号9：5’-agccatcctcccacctcagcttcctgagtagctgggacta-3’
序列编号10：5’-tgtgtccatgtgttctcattgttcagctcccacttataag-3’
序列编号11：5’-ctcccccacaacaggccctggtgtgcaatgttcccctccc-3’
序列编号12：5’-ctggagatactgggaaaaggcaatcaggactaggcctttg-3’
序列编号13：5’-cgcagtgtccgaggaagatagctgttccttaactttggca-3’
序列编号14：5’-caggggttatatccgttttaaccggaagtccagtcttggc-3’
序列编号15：5’-gaacagctatcttcctcggacactgcg-3’
序列编号16：5’-ggtagaggcgaagtccttatcttccac-3’
序列编号17：5’-attgatgccaagactggacttccggtta-3’
序列编号18：5’-tgtccttccaaatgagctggcaagtg-3’
序列编号19：5’-ggagtttcccaaacactcagtgaaacaaag-3’
序列编号20：5’-acttcaacaagaacagtatccaagacatcac-3’
序列编号21：5’-gggtgcatcgctggtaacatcc-3’
序列编号22：5’-ctcaagatcgcattcatgcgtcttcac-3’
序列编号23：5’-aaatcccttcacactctttttggagata-3’
序列编号24：5’-aagcacatggcaccaatgacgttagccaccgattccacca-3’
序列编号25：5’-gtcttggtagtgctcctggacagttttctgcagaaacagc-3’
序列编号26：5’-atgttgacaatcttctcctcggggatgagaccgccattgt-3’
序列编号27：5’-ctcatggatcttcctctgcacgttaggccatgtcacaagt-3’
序列编号28：5’-cggcaacacacgtctttgcaaagtctgttacttcctgcac-3’
序列编号29：5’-ctttaatgtcacgcacgatttccctctcagctgtggtggt-3’
序列编号30：5’-atttctcgtggttcacacccatcacaaacatgggggcatc-3’
序列编号31：5’-gtggtgcaggatgcattgctgacaatcttgagggagttgt-3’
序列编号32：5’-tggtggtgcaggatgcattgctgacaatcttgagggagtt-3’
序列编号33：5’-agttggtggtgcaggatgcattgctgacaatcttgaggga-3’
序列编号34：5’-agcagttggtggtgcaggatgcattgctgacaatcttgag-3’
序列编号35：5’-aattgaatgtagtttcatggatgccacaggattccatacc-3’
序列编号36：5’-ggatgcggcagtggccatctcttgctcgaagtctagggca-3’
序列编号37：5’-ctgtcaggtcccggccagccaggtccagacgcaggatggc-3’
序列编号38：5’-cagaaccatcacgaggacctgtcataagacgtctttgtcg-3’
序列编号1～4分别是与小鼠Cyp1a2基因mRNA发生杂交的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号5、7、8是包含人转座子重复序列的局部序列的寡聚核酸的碱基序列。序列编号9-11分别是包含序列编号5、7、8的互补序列的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号6是包含拟南芥POD基因的局部序列的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号12是与小鼠alb基因mRNA杂交的寡聚核酸的碱基序列，序列编号13、14是与小鼠Arntl基因mRNA杂交的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号15、16是小鼠Arntl基因的PCR引物组的碱基序列，序列编号17是与小鼠Arntl基因对应的TaqMan Probe的碱基序列。
序列编号18、19是小鼠Cyp1a2基因的引物组的碱基序列，序列编号20是与小鼠Cyp1a2基因对应的TaqMan Probe的碱基序列。
序列编号21、22是小鼠Alb基因的引物组的碱基序列，序列编号23是与小鼠Alb基因对应的TaqMan Probe的碱基序列。
序列编号24-27分别是与小鼠Cyp1a2基因mRNA杂交的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号28是与小鼠Alb基因mRNA杂交的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号29是大鼠Actb基因mRNA，序列编号30-34分别是大鼠Gapdh基因mRNA，序列编号35-37分别是与大鼠Actb基因mRNA杂交的寡聚核酸的碱基序列。
序列编号38是从序列编号27的寡聚核酸的5’侧依次将A置换为T、T置换为A、G置换为C并且将C置换为G、将TTTT的连续序列与ATAA置换而合成的寡聚核酸的碱基序列。
实施例1(假寡聚核酸添加比率的实验)
求出与假寡聚DNA的探针浓度相对应的最适添加比率。对象组织使用小鼠肝脏，将检测对象的基因设为Cyp1a2。将8周龄雄小鼠的肝脏利用通常的福尔马林固定、石蜡包埋制成石蜡块，制成厚度5微米的连续切片，进行脱石蜡处理，再利用蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)处理，然后实施RNA原位杂交。作为检测基因Cyp1a2的mRNA的探针，使用两端被FITC标记了的4种单链寡聚DNA探针(序列编号1～4)。在Cyp1a2基因的mRNA上，序列编号1～4按照编号顺序沿着从5’末端至3’末端的方向排列，对于到相邻的寡聚DNA探针为止的距离，序列编号1和2为594碱基，序列编号2和3为16碱基，序列编号3和4为61碱基。另外，使用序列编号5所示的假寡聚DNA(单链)。FITC标记的检测使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的TSA致敏。图1示出相对于4种探针浓度分别为1nM(纳摩尔)、2nM、3nM、4nM、5nM，即分别合计4nM、8nM、12nM、16nM、20nM的情况，使用假寡聚DNA的浓度是以1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍的浓度进行添加的杂交溶液进行定量性RNA原位杂交的结果。此外，作为对照实验的0nM时，添加200nM的假寡聚DNA。图像是以10倍物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam对连续切片的相同区域进行摄影。利用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)对这些图像数据进行计算机处理，将从各图像的信号强度中减去探针浓度为0nM时的信号强度而得到的值作为各图像的信号强度，从而求得。图2是将这些结果作为假寡聚DNA的添加比率与检测Cyp1a2基因mRNA而得到的信号强度的关系，将横轴设为假寡聚DNA的添加比率，将纵轴设为信号强度(IntDen)而进行图示。由图2可知，假寡聚DNA的添加比率为8倍时，寡聚DNA探针的浓度与信号强度的顺序关系得到维持，与信号强度的范围也维持相同顺序关系的1倍相比，较宽。另外，由图2可知，一般而言随着探针浓度的升高信号强度也增强。进而，算出了对于在寡聚DNA探针的浓度和信号强度的顺序关系得到维持的添加比率为8倍时和1倍时的各图像来说，表示其荧光强度相对于寡聚DNA探针的浓度为0nM时的图像的荧光强度增强了多少倍的比率(图3)。探针浓度低的情况下，例如如1nM时那样，在RNA原位杂交的信号弱时，该比率显示出背景噪声的增强。即，假寡聚DNA的添加比率为1倍时，与添加比率为8倍时相比该比率大，背景噪声高的现象可以从图3得知。另一方面，寡聚DNA探针的浓度高时，该比率显示出基于RNA原位杂交的信号强度的增加。添加比率为8倍时，添加比率与1倍时相比，背景噪声少的部分，图像整体的信号强度降低。然而，随着寡聚DNA探针的浓度提高，对于该比率的上升度而言，添加比率为8倍时比添加比率为1倍时大，这表示添加比率为8倍时动态范围宽。由图3可知，添加比率为8倍时与添加比率为1倍时相比，动态范围变宽1.375倍。
实施例2(假寡聚DNA、鲑鱼精子DNA和无添加的比较)
对假寡聚DNA和鲑鱼精子DNA、及不添加的情况下的定量性RNA原位杂交的RNA检测中的效果进行比较。在实验中，与实施例1同样地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，在实验中使用。检测基因与实施例1相同，使用为Cyp1a2且两端进行了FITC标记的由序列编号1～4所示的4种单链寡聚DNA探针，与4种探针各自的浓度为0nM(纳摩尔)、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM的各种探针浓度相对应，以添加比率为8倍的浓度使用序列编号5(记为L1C1)和序列编号6(记为arbp)所示的2种假寡聚DNA(单链)。另外，相对于同样的寡聚DNA探针浓度，使用Invitrogen公司(分类编号15632-011，Salmon Sperm DNAsolution)的鲑鱼精子DNA，添加至终浓度为100ug/ml(微克/毫升)(相当于80nM)。另外，作为对照，进行了不添加假寡聚DNA或者鲑鱼精子DNA(记为无添加)的实验。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的TSA致敏。在图4中，示出对于在连续切片的相同区域所得到的原位杂交图像。从上段按顺序示出无添加的图像、添加了鲑鱼精子DNA时的图像、添加了假寡聚DNA的L1C1时的图像、添加了假寡聚DNA的arbp时的图像。另外，从左按顺序4种寡聚DNA探针各自的浓度为0nM(纳摩尔)、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM。图像为以10倍物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，对连续切片的相同区域进行摄影而得到的。使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)对这些图像进行计算机处理，求得各浓度下的信号强度。寡聚DNA探针的浓度为0nM时，图像的信号强度为背景的荧光强度(IntDen)，将无添加、添加了鲑鱼精子DNA时、添加了假寡聚DNA的L1C1和arbp时的荧光强度示于图5。添加了鲑鱼精子DNA时，背景的荧光强度比其他情况更强。接着，通过从各浓度下的信号强度减去该背景的荧光强度，求出各浓度下的真实信号强度。将其示于图6。在寡聚DNA探针浓度为1nM浓度而添加了假寡聚DNA的arbp时，真实信号强度比其他情况小，但是可以对比度良好地看到信号，显示出了伴随寡聚DNA探针的添加而背景噪声的上升小。由图6可知，对于真实信号而言，在添加了假寡聚DNA的L1C1或者arbp时，与添加了鲑鱼精子DNA时或者无添加时相比可以得到强1.4倍至2.5倍左右的信号(特别是探针浓度为2nM以上时)。进而可知，添加了假寡聚DNA的L1C1时以及添加了arbp时，探针浓度与信号强度之间的线性非常好。
实施例3(假寡聚DNA和鲑鱼精子DNA的比较)
对假寡聚DNA、鲑鱼精子DNA的定量性RNA原位杂交的RNA检测中的效果进行比较。在实验中，与实施例1相同地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，在实验中使用。检测基因与实施例1相同，使用为Cyp1a2且两端进行了FITC标记的由序列编号1～4所示的4种单链寡聚DNA探针，与4种探针各自的浓度为0nM(纳摩尔)、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM的各种探针浓度相对应，以添加比率为8倍的浓度使用序列编号5所示的假寡聚DNA(单链)。另外，相对于同样的探针浓度，使用Invitrogen公司(分类编号15632-011，Salmon Sperm DNA solution)的鲑鱼精子DNA，添加至终浓度为100ug/ml(微克/毫升)(相当于80nM)。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的致敏。图7中，示出对于在连续切片的相同区域所得到的原位杂交图像。上段示出添加了假寡聚DNA的图像，下段示出添加了鲑鱼精子DNA的图像。另外，从左按顺序4种寡聚DNA探针各自的浓度为0nM(纳摩尔)、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM。图像为以10倍物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，对连续切片的相同区域进行摄影而得到的。在这些图像中，如图7所示，设定信号存在的信号区域S和信号不存在的噪声区域N，使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)求出各区域中的信号强度，再求出区域S、N中的信号强度的比率作为SN比(signal-to-noise ratio)。图8中，将所得到的SN比定为纵轴，将探针浓度定为横轴，示出添加了假寡聚DNA的情况的SN比和添加了鲑鱼精子DNA的情况的SN比的比较。如图8所示，寡聚DNA探针浓度和SN比的关系呈现吊钟状，但也可以看出寡聚DNA探针浓度为2nM以上时假寡聚DNA与鲑鱼精子DNA相比SN比更优良。
实施例4(假寡聚DNA序列的种类)
实施对所使用的假寡聚DNA序列的种类和数量进行测试的实施例。在实验中，与实施例1相同地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，进行脱石蜡处理，利用蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理，然后实施RNA原位杂交实验。检测基因与实施例1相同，使用为Cyp1a2且两端进行了FITC标记的序列编号1～4的4种单链寡聚DNA探针，根据实施例2的结果，以4种探针各自浓度为2nM(纳摩尔)的条件进行实验。对于在实验中使用的假寡聚DNA(单链)而言，使序列L1W1、L1W2、L1W3(序列编号5、7、8)和序列L1W1、L1W2、L1W3(序列编号9～11)为1种(L1C1、L1C2、L1C3各1种、组ID＝1)、1种(L1W1、L1W2、L1W3各1种、组ID＝2)、2种混合(L1C1和L1W1的混合、L1C2和L1W2的混合、L1C3和L1W3的混合、组ID＝5)、3种混合(L1C1、L1C2和L1C3的混合、组ID＝3)、3种混合(L1W1、L1W2、L1W3的混合、组ID＝4)、和6种混合(组ID＝6)来进行。此外，L1W1、L1W2、L1W3的序列分别为与L1W1、L1W2、L1W3互补的序列。以假寡聚DNA的浓度合计分别为64nM(各寡聚DNA探针的浓度2nM的合计8nM的8倍)的方式实施。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的致敏。图像是以10倍物镜并利用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam对连续切片(各图像右上的数字表示连续切片的顺序)的相同区域进行摄影而得到的。在图9中示出该RNA原位杂交的结果。如图9所示，混合6种上述假寡聚DNA时，对比度比其他情况差，但是在任何假寡聚DNA组合中都得到良好的图像。接着使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)求出各图像的信号强度，在图10和表1中示出。如图10所示，根据所使用的假寡聚DNA的种类和组，在信号强度上没有大的差别，可以得到良好的结果。
【表1】
实施例5(探针数和信号强度)
实施例示出在检测中使用的探针的种类数和所检测的信号强度的关系。理论上，在杂交溶液中，发生杂交的各寡聚核酸探针的浓度均匀且GC含量为50％并均匀时，杂交过程中的平衡常数K在各寡聚核酸探针间是相同的，相对于寡聚核酸探针i，下式是成立的，
K＝[Hi]/[fR]·[fPi] (式1)
游离的寡聚核酸探针浓度[fPi]相对于各寡聚核酸探针是相同的。进而，寡聚核酸探针i发生杂交的量(浓度)Hi用下式表示，
[Hi]＝K·[fR]·[fPi] (式2)
其中，
[H1]＝[H2]＝…＝[HN] (式3)
因此，所观察的信号强度I以来加和计算，
I＝S([H1])+….+S([HN]) (式4)
依赖于杂交溶液中的寡聚核酸探针的种类数N以增函数的方式(理论上成比例)增加。
在实验中，与实施例1相同地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，进行脱石蜡处理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理，然后实施RNA原位杂交实验。检测基因与实施例1相同，使用为Cyp1a2且两端进行了FITC标记的序列编号1～4的4种单链寡聚DNA探针，以4种寡聚DNA探针各自的浓度为2nM(纳摩尔)、寡聚DNA探针为1种、2种、3种、4种的条件以及不插入寡聚DNA探针的条件来进行。在假寡聚DNA(单链)中，使用序列编号5的假寡聚DNA(L1C1)，以浓度为所使用的寡聚DNA探针浓度的合计的8倍来实施。即，1种寡聚DNA探针时，为16nM，2种寡聚DNA探针时为32nM，3种寡聚DNA探针时为48nM，4种寡聚DNA探针时为64nM。此外，在没有寡聚DNA探针的条件下，将假寡聚DNA的浓度设为64nM。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的致敏。图像是以10倍物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，对连续切片的相同区域进行摄影而得到的。在图11示出图像。接着使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)临时求出各图像的信号强度，并求出从这些数值中减去没有加入寡聚DNA探针的条件下的图像的信号强度，将所得值作为在各探针种类数的图像中的信号强度。将结果在图12中示出，其中将纵轴定为信号强度，横轴定为寡聚DNA探针的种类数来绘图。如图所示，添加假寡聚DNA时，寡聚DNA探针的种类数和信号强度落在清晰的右上直线上，存在线形的关系。
实施例6(探针浓度)
本实施例示出了随着在检测中使用的寡聚DNA探针的浓度上升，信号强度发生怎样的变化。
杂交是一种平衡反应，理论上成为下式的平衡常数与杂交产物的浓度[H]、游离mRNA浓度[fR]和游离寡聚DNA探针的浓度[fP]之间的关系式是成立的。
K＝[H]/[fR]·[fP]
由于下述2式成立，因此杂交的寡聚DNA探针的浓度越高，杂交了的产物越增加。在本实施例中，随着寡聚DNA探针的浓度的升高，信号强度也显示出线性增强。
杂交的寡聚DNA探针的浓度P0＝[H]+[fP]
组织样品中存在的mRNA浓度R0＝[H]+[fR](在组织试样中恒定)
在实验中，与实施例1相同地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，进行脱石蜡处理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理，然后实施RNA原位杂交实验。检测基因使用为白蛋白Alb且两端进行了FITC标记的序列编号12的单链寡聚DNA探针，以0nM(无探针)、0.1nM、0.25nM、0.5nM、1nM、1.5nM的6种浓度来实施。在假寡聚DNA中，使用序列编号5的假寡聚DNA(单链)，以浓度为所使用的寡聚DNA探针的浓度的8倍来实施。在没加入寡聚DNA探针的杂交溶液中，使用了12nM的假寡聚DNA。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的致敏。图像是以10倍和20倍的物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，对连续切片的相同区域进行摄影而得到的。在图13中示出图像(上段为10倍物镜，下段为20倍物镜的图像)。另外，使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)，利用计算机求得各浓度下的图像的信号强度，再求出减去寡聚DNA探针的浓度为0nM的图像中的信号强度所得的值，作为真实信号强度。将其结果示于图14，其中纵轴定为信号强度，横轴定为探针浓度，从而画图(图14a为与图13的10倍物镜的图像相对应的信号强度，图14b为与图13的20倍物镜的图像相对应的信号强度)。如图所示，随着探针浓度上升，信号强度也线性地增强，但是从某些浓度(如图14所示，为Alb基因时是1nM)开始以上，信号强度达到饱和。这反映出，如实施例9中定量PCR的结果所示那样，Alb基因在肝脏中的表达量非常高。
实施例7(探针浓度)
该实施例示出了随着检测中使用的探针的浓度上升，信号强度有着怎样的变化。在实验中，与实施例1相同地使用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肝脏组织试样，制成连续切片，进行脱石蜡处理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理，然后实施RNA原位杂交实验。检测基因与实施例1、2相同，使用为Cyp1a2且两端进行了FITC标记的序列编号1～4的4种单链寡聚DNA探针，相对于4种寡聚DNA探针各自的浓度为0nM(纳摩尔)、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM的各种寡聚DNA探针的浓度，以添加比率为8倍的浓度使用序列编号5所示的假寡聚DNA(单链)。在未加入寡聚DNA探针的杂交溶液中，使用64nM的假寡聚DNA。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，实施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的致敏。图像是以10倍物镜使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，对连续切片的相同区域3处进行摄影而得到的。在图15中示出图像。另外，使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)，利用计算机求出各浓度下的各区域的图像的信号强度，再计算减去探针浓度为0nM的图像中的信号强度所得的值，作为真实信号强度，并求出3处的平均值。将其结果示于图16，其中将纵轴定为信号强度，将横轴定为探针浓度，从而画图。如图所示，由于假寡聚DNA的添加，随着探针浓度上升，信号强度也直线性地增强。
实施例8(表达量和信号强度)
本实施例是示出基于表达量和信号强度的关系呈线性的原理，通过利用本发明的RNA原位杂交可以对目标基因mRNA进行定量检测的实施例。本实施例中的检测基因为随着昼夜节律而表达量发生变动的Arntl，使用8周龄的雄小鼠，在上午9时至深夜1时(25时)为止每隔4小时一个取样点的5点之中，每2个个体采对象组织的肝脏(外侧左叶)，切成两半之后，将从切断面分别向两侧2mm的范围制成用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织试样和用于提供给定量PCR的RNA提取用组织试样。
与实施例1相同地通过福尔马林固定、石蜡包埋制成组织试样，制成连续切片，进行脱石蜡处理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase KSOL.RNA，25530049)进行处理，然后实施RNA原位杂交实验。对于检测基因Arntl的寡聚核酸探针而言，使用浓度分别为2nM(纳摩尔)的两端进行了Dig标记的序列编号13和14(在Arntl基因的mRNA上的距离为21碱基)的单链寡聚DNA探针。假寡聚DNA(单链)以相比于序列编号5所示的L1C1为8倍的添加比率的浓度使用。在Dig标记的检测中，使用抗Dig抗体(罗氏公司，抗异羟基洋地黄毒甙元-POD，1207733)，在TSA致敏中，使用了酪胺酰胺-Cy3(Perkin-Elmer公司，TSA Plus花青素3系统，NEL744B001KT)。图像是利用10倍物镜，使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam摄影而得到的。图17中示出了各时间点的1个个体的肝脏中的2区域的图像。另外，使用Image J软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)，利用计算机求出各时刻的图像的信号强度，与基于定量PCR的表达量进行了比较。在Arntl基因mRNA的定量PCR中的表达量的定量中，使用序列编号15和16所示的正向和反向引物，利用TaqMan法实施定量PCR。此外，TaqMan探针的序列由序列编号17示出。另外，同时进行了作为内标准基因的Actb的定量PCR(Actb的PCR引物和TaqMan探针由Applied Biosystems购买)。此外，定量PCR使用AppliedBiosystems 7500 Reat-time PCR System，按照其带有的操作流程实施。图18以对每4小时采取的组织试样进行定量PCR而求得的Ct值的变化的形式示出了目标基因Arntl和Actb的表达量的变化。图19中示出基于目标基因Arntl的RNA原位杂交而求得的信号强度的变化。另外，在图20中，对通过各个体所采取的肝脏中的目标基因Arntl的定量PCR而求得的Ct值和通过RNA原位杂交求得的信号强度的各时刻组的平均值绘图，示出了基于定量PCR的Ct值和基于RNA原位杂交的信号强度之间的关系。如图20所示，由于假寡聚DNA的添加，定量PCR的Ct值和信号强度显示了良好的相关(mRNA的表达量多时Ct值变小，因此将Ct值定为纵轴，将信号强度定为横轴时，为如该图所示的朝向右下的相关)。
实施例9(表达量和信号强度，2色)
在该实施例中，作为组织试样，使用实施例8中使用的午后1时的8周龄的雄小鼠1个个体的肝脏，与目标基因Cyp1a2相对应使用两端利用Dig标记了的寡聚DNA探针，与目标基因Alb相对应使用两端利用FITC标记了的寡聚DNA探针，实施多阶段的TSA致敏，利用2色的荧光色素对2个目标基因进行定量检测，与这些基因的基于定量PCR的Ct值进行比较。
在Cyp1a2基因mRNA的基于定量PCR的表达量的定量中，使用序列编号18和19所示的正向和反向引物，实施基于TaqMan法的定量PCR。此外，TaqMan探针的序列如序列编号20所示。在Alb基因mRNA的基于定量PCR的表达量的定量中，使用序列编号21和22所示的正向和反向引物，实施基于TaqMan法的定量PCR。此外，TaqMan探针的序列如序列编号23所示。此外，定量PCR使用Applied Biosystems 7500 Reat-time PCR System，按照其带有的流程实施。Alb基因的Ct值为22.135(扩增效率1.0178)，Cyp1a2基因的Ct值为27.053(扩增效率1.0008)，约2的5次方即128倍左右，显示出Alb基因的表达量多。
对于所使用的寡聚DNA探针而言，与Cyp1a2基因相对应使用5种两端Dig标记的寡聚DNA探针(序列编号2和24～27所示的探针组)或者1种序列编号2所示的探针，与Alb基因相对应使用了2种两端FITC标记的序列编号12和28所示的寡聚DNA探针。另外，假寡聚DNA使用序列编号5中示出的L1C1。在实验中，将小鼠肝脏进行通常的福尔马林固定、石蜡包埋后，制成连续切片，进行脱石蜡处理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理后，使用上述探针的混合物，实施RNA原位杂交。Dig标记的检测使用抗Dig抗体(罗氏公司，抗异羟基洋地黄毒甙元-POD，1207733)，在TSA致敏中使用酪胺酰胺-Cy3(Perkin-Elmer公司，TSA Plus花青素3系统，NEL744B001KT)。另外，在FITC标记的检测中使用抗FITC抗体(Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体，P5100)，TSA致敏中使用酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)。此外，显微镜摄影利用10倍的物镜，使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam。
由定量PCR的结果可知，Cyp1a2基因仅表达了Alb基因的大约128分之一。图19中示出了使用2枚连续切片，在相同切片中利用Cy3检测Cyp1a2基因mRNA，利用FLU检测Alb基因mRNA的例子。图21的上段示出在Cyp1a2基因的检测中仅使用1个探针时(切片1)的结果，下段表示使用了5种探针的组时(切片2)的原位杂交图像。如图所示，二个基因的表达的局部存在性不同，Alb基因在PV(门静脉)区域表达，Cyp1a2基因在CV(中央静脉)区域表达。进而，对于Cyp1a2基因mRNA的检测，在探针数为1时，信号非常弱，但是将探针数设为5时，信号强度与Alb基因mRNA的FLU的信号强度接近。即，如上述所述，定量PCR的结果虽然是Cyp1a2基因仅表达了Alb基因大约128分之一，但是通过增加探针的种类数，掩盖了10的2次方倍的表达量的差距，成功地提高了信号强度。图21的图像中，使用Image J分别对切片1、切片2在PV区域、CV区域中分别设定8个图21所示尺寸的圆形小区域，测定FLU的信号强度和Cy3的信号强度，将该情况在表2中汇总。如表2的范围评价的CV区域的项中所记载那样，Cy3的最大信号强度从与Cyp1a2对应的1种寡聚DNA探针时的39.75增强至5种寡聚DNA探针时的151.00，可以与Alb的PV区域中的最大信号强度(切片1中137.88，切片2中142.38)相匹敌。
如该实施例这样，由于假寡聚DNA的添加，通过相对于多个目标基因，调整所使用的寡聚DNA探针的数和浓度，即使在目标基因的表达量存在102～103倍差距的情况下，也可以将信号强度调整为相同程度。
[表2]
对比度评价
范围评价
实施例10(酪胺酰胺浓度)
该实施例在小鼠肝脏中，使用与白蛋白(Alb)基因相对应的寡聚DNA探针(序列编号12，两端FITC标记，浓度1nM)，观察到了酪胺酰胺增敏中的酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer公司，TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)的浓度的影响。实验中，将小鼠肝脏进行通常的福尔马林固定、石蜡包埋后，制成连续切片，利用蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase KSOL.RNA，25530049)进行处理，使用上述寡聚DNA探针和浓度8nM的作为假寡聚DNA的序列编号29的未附加标记的大鼠Actb基因的寡聚DNA，进行RNA原位杂交。在FITC标记的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100。将其结果示于图22。图中的稀释倍率1为制造厂商推荐的流程中的酪胺酰胺-FLU的浓度，以2倍稀释、5倍稀释、10倍稀释进行实验。如图22所示，随着酪胺酰胺-FLU的浓度减少，信号强度也减少。此外，在显微镜摄影中利用10倍的物镜并使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam，使用Image J处理所得到的各图像，求出信号强度。
实施例11(也可以是不同的基因)
图23示出了一边从大鼠GAPDH基因的mRNA序列的5’末端开始，以欲作为寡聚核酸探针而使用的长度的窗口(该例中为40碱基)一个碱基一个碱基地错开，一边计算各寡聚核酸的GC含量(％)的例子。
实施例12(使用了鲑鱼精子DNA)
该实施例中，在为寡聚核酸探针时，在探针上附加标记，通过相对于大鼠肺中的大鼠β-actin基因Actb的原位杂交的信号强度，确认了附加标记的位置和标记数会对杂交产生怎样的影响(图24)。即，将大鼠肺进行通常的福尔马林固定、石蜡包埋后，制成连续切片，进行脱石蜡处理和蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)处理后，使用FITC标记附加在5’末端的寡聚DNA探针(探针1)、FITC标记附加在3’末端寡聚DNA探针(探针2)、在5’末端和3’末端的两端附加有FITC标记的寡聚DNA探针(探针3)，实施RNA原位杂交，比较得到的荧光强度。此外，在该实施例中，未使用假寡聚DNA，而是使用了鲑鱼精子DNA。在此使用的附加有FITC标记的3种寡聚DNA探针的序列是相同的，长度为40碱基，如序列编号29所示。在实验中，使用在用于检测FITC标记的抗FITC抗体上连接有POD的蛋白质(Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体，P5100)来检测FITC，再添加酪胺酰胺-FLU，实施TSA致敏。在TSA致敏中使用Perkin-Elmer公司的试剂盒(TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)，TSA致敏的流程按照该试剂盒的附带文件进行。杂交的探针的浓度都设为5nM。在摄影中，利用10倍的物镜并使用了Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam。图24a、b、c分别是利用探针1、探针2、探针3检测大鼠肺的Actb基因的mRNA的结果。利用仅在5’末端带有标记的探针1进行检测而得的Actb基因的mRNA的信号强度以及利用仅在3’末端带有标记的探针2进行检测而得的Actb基因的mRNA的信号强度是大致相同的。另外，利用在两端附加有标记的探针3进行检测的Actb基因的mRNA的信号强度为它们的倍数的程度。即，信号强度依赖于标记的数量，通过使用在两端附加有标记的探针，可以提高检测灵敏度。此外，图24d所示的Actb的有义探针的序列为序列编号29的互补链。
实施例13(不将信号强度数值化，使用鲑鱼精子DNA)
在本实施例中，在一个基因的mRNA上，欲检测使用了多个标记进行杂交的产物时，确认了在mRNA的核酸序列上2个标记到底需要多大的距离。这些情况也依赖标记的致敏方法、所使用的显微镜、CCD照相机的光学系统的析像度。在本实施例中，相对于基因GAPDH的mRNA的核酸序列，准备2个寡聚核酸探针A1和A2，将A1的5’末端和A2的3’末端利用FITC进行标记(图25)。附加有标记的A1和A2的长度为40碱基，以A2的3’末端与序列编号30所示的A1的5’末端相距3碱基、5碱基、8碱基、11碱基的方式使用4种探针A21、A22、A23、A24(序列编号分别为31、32、33、34)。此外，使用的试样组织为大鼠肺，将其进行通常的福尔马林固定、石蜡包埋后，制成连续切片，利用蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL.RNA，25530049)进行处理后，使用上述探针的组(A1和A21、A1和A22、A1和A23、A1和A24)、和鲑鱼精子DNA，实施RNA原位杂交。在FITC的检测中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100，为了致敏而使用Perkin-Elmer公司的试剂盒(TSA Plus荧光素系统，NEL741B001KT)进行TSA致敏。显微镜摄影中利用10倍的物镜，使用Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam。如图26所示，A1的3’末端和A2的5’末端的距离为8碱基以上时，可以观察到信号的加和性增强。即，标记间的距离为8碱基的情况作为条件。
实施例14(不将信号强度数值化，使用鲑鱼精子DNA)
相对于大鼠ACTB基因的mRNA，在两端利用FITC标记了的长度40碱基的寡聚核酸探针中，使用GC含量为40％(序列编号35)、50％(序列编号29)、60％(序列编号36)、70％(序列编号37)的4种探针，分别单独地作为探针使用，利用大鼠肺进行RNA原位杂交，进而使用抗FITC抗体(Dako公司的抗FITC兔多克隆抗体P5100)进行TSA致敏(Perkin-Elmer公司，TSAPlus荧光素系统，NEL741B001KT)。在显微镜摄影中，利用10倍的物镜并使用了Zeiss荧光显微镜Axioplan2和CCD照相机AxioCam(图27)。可知，随着探针的GC含量的增加，信号增强，检测灵敏度上升。换言之，由于杂交的平衡常数K和融解温度Tm为GC含量的增函数，随着融解温度Tm的增大，信号强度会提高，检测灵敏度提高。此外，图27的Actb有义探针的序列为序列编号29的互补链。
实施例15(假寡聚DNA)
实施例1至实施例10中使用的假寡聚DNA为序列编号5～11、序列编号29。序列编号5和序列编号7～11是从来自人基因组上的转座子的重复序列中选择的。序列编号6是从植物拟南芥的过氧化酶基因的序列中选择的。另外，序列编号29是从大鼠Actb基因中选择的，不与实施例10中的目标基因Alb的mRNA发生杂交。另外，相对于序列编号27的寡聚DNA探针：
5’-gtcttggtagtgctcctggacagttttctgcagaaacagc-3’，
从5’侧依次将A置换为T、T置换为A、G置换为C且C置换为G，将TTTT的连续序列置换为ATAA而合成如下的寡聚DNA：
5’-cagaaccatcacgaggacctgtcataagacgtctttgtcg-3’(序列编号38)，
该寡聚DNA也可以作为假寡聚DNA使用。在该序列编号38的假寡聚核酸的例子中，长度和GC含量与寡聚DNA探针(序列编号27)相同。

Claims (7)

1.一种RNA原位杂交法，其特征在于，其是使1种或多种寡聚核酸探针与在组织试样中表达的目标基因mRNA杂交，检测在寡聚核酸探针的至少1个碱基上附加的低分子化合物标记来鉴定目标基因mRNA的存在的方法，
使寡聚核酸探针和假寡聚核酸的混合液与试样组织接触，使寡聚核酸探针与目标基因mRNA杂交，由此来防止寡聚核酸探针向组织试样的非特异性吸附，
其中，所述假寡聚核酸：
由寡聚核酸探针的长度±10％的长度形成，
不与目标基因mRNA上的寡聚核酸探针进行杂交的区域发生杂交，而且
不与寡聚核酸探针发生杂交，
假寡聚核酸是如下得到的寡聚核酸，
将寡聚核酸探针的碱基序列中的A置换为T、T置换为A、G置换为C且C置换为G，
相同碱基连续M个以上的情况下，将从该连续序列中的M×0.2处至M×0.8处的碱基利用其互补的碱基来置换，其中所述M为4，所述M×0.2和所述M×0.8分别取小数点以下四舍五入而得的整数，
存在无论从5’侧读取还是从3’侧读取都为相同序列的N碱基以上的回文序列时，利用其互补的碱基置换至少N×0.2处的碱基，N为偶数时至多为(N/2-1)处的碱基，N为奇数时至多为((N-1)/2-1)处的碱基，其中所述N为5，所述N×0.2取小数点以下四舍五入而得的整数，由此得到寡聚核酸，
所述假寡聚核酸量为寡聚核酸探针量的8倍。
2.根据权利要求1所述的RNA原位杂交法，其中，寡聚核酸探针和假寡聚核酸的碱基长度在20bp至70bp的范围内相同。
3.根据权利要求1所述的RNA原位杂交法，其中，寡聚核酸探针分别在其5’末端碱基或/和3’末端碱基上附带有低分子化合物标记。
4.根据权利要求3所述的RNA原位杂交法，其中，将2种以上的权利要求3所述的寡聚核酸探针以各自的5’末端和3’末端隔开8碱基以上的方式与mRNA进行杂交。
5.根据权利要求1所述的RNA原位杂交法，其中，使用抗低分子化合物的抗体、在该抗体上结合的酶、作为该酶的基质的发色化合物或荧光分子化合物来将检测信号致敏，使用10倍至40倍的物镜来检测信号。
6.根据权利要求1所述的RNA原位杂交法，其中，组织试样为从哺乳动物分离的组织，假寡聚核酸是含有逆转录转座子的重复序列的局部序列的寡聚核酸。
7.根据权利要求1所述的RNA原位杂交法，其中，组织试样为从哺乳动物分离的组织，假寡聚核酸是含有植物基因组的一部分或微生物基因组的局部序列的寡聚核酸。
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