JP2004061170A - Dnaチップの測定法 - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子チップを用いた検査法をより簡便に迅速に達成するための手段を提供することを課題とする。
【解決手段】遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップを接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法である。
【解決手段】遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップを接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法である。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子チップを利用した遺伝子の検出方法に関し、その検出に用いられる遺伝子検出用キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
遺伝子チップを用いた遺伝子の検出は、既に確立され広く繁用されている。その構成は、プローブの調製、プローブのスライド上への固定、試料の調製、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションスポットの検出という工程からなる。そして、検出のためには、一般的に蛍光物質が利用され、画像をGenePix Pro解析ソフト等で解析・算出される。この際、蛍光物質の導入には検出対象遺伝子のPCR反応に際しプライマー末端を蛍光物質等で標識化したものを用い、遺伝子の標識化を達成していた。
【0003】
しかし、この方法は、ハイブリダイズの前に、プライマー修飾等の格別の工程を経る必要があり、処理が煩雑、無駄が多いものであった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、遺伝子チップを用いた検査法をより簡便に迅速に達成するための手段を提供するものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
すなわち本発明は、
1.遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップと接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法。
2.前項1の遺伝子検出法に使用される遺伝子チップ及び検出用標識化合物を含む検出試薬を構成の一にする遺伝子検出用キット。
からなる。
【0007】
【発明の実施の態様】
本発明において「遺伝子チップ」とは、DNAマイクロアレイ(DNAチップ)ともいい、スライドガラス等の担体上にオリゴDNAが固定されたものをいう。その製法には限定されず、ガラス表面上でオリゴDNAを合成していくタイプも、或はDNAをスタンプしていくタイプでもよい。これらは、Affymetrix社或はStanford大学の技術が著名である。
通常、DNAマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長cDNAライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、PCR反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのPCR産物のスポット、mRNAの調製及び蛍光標識、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。ここで、スライドガラス上へのPCR産物のスポットはプローブDNAとも呼ばれ、またmRNAの調製及び蛍光標識されたものはターゲットDNA〔サンプルより得られた核酸(RNA)を蛍光標識したcDNA〕とも呼ぶ。
本発明では、この蛍光標識がターゲットDNA(もしくはRNA)にされるのではなく、前記マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション後に蛍光標識がなされる。つまり、本発明において、DNAマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長cDNAライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、PCR反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのPCR産物のスポット、mRNAの調製、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション、蛍光標識及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。
【0008】
ここで蛍光色素は、特に限定されないが、一般的なCy3、Cy5、FITC、SYBR GreenII、POPO−1、BOBO−1、YOYO−1、TOTO−1、JOJO−1、POPO−3、LOLO−1、BOBO−3、YOYO−3、TOTO−3等が使用できる。
所望により、DEPC処理水で蛍光染色剤を希釈する。これはRNAをターゲットにした検出も行うので念のため、RNaseをフリーの状態にするためである。使用時の蛍光色素の濃度は、例えばDEPC処理水で、市販蛍光色素を、0〜10000倍、好ましくは500〜1500倍で希釈したものを使用する。
【0009】
検出は、従来法では、Cy3もしくはCy5で蛍光標識されたmRNA由来のターゲットcDNAを競合的にハイブリダイズさせ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器(スキャナー)で取込み、コンピュータで解析する。一方、本発明では、サンプルより抽出精製したRNA(例えばrRNA)をターゲット遺伝子とし、これをDNAプローブ(既知遺伝子群、例えば各種病原菌特異的遺伝子、例示すれば赤痢菌、ビブリオ菌等)が固定化されたDNAマイクロアレイ上でハイブリダイズさせ、洗浄・風乾後、所定のDNAチップ検出試薬(蛍光物質を含む試薬)で染色させ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器(スキャナー)で取込み、コンピュータで解析する。
本発明において、使用する測定に用いる試薬キットとしては、例えば、(1)DNAプローブが固定化されたDNAチップ、(2)蛍光物質を含むDNAチップ検出試薬、(3)ハイブリダイゼーション用試薬等が例示される。
【0010】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0011】
【実施例1】
1.材料
(1) rRNA
Vibrio parahaemolyticus をSCD培地(10mL)に植菌し、30℃で一晩培養した菌液1.5mLを試料とし、RNeasy Mini kit (キアゲン社)を用い、rRNAを抽出精製した。そのうち、2μg相当をターゲットDNAとした。
(2) DNA chip
終濃度で20μMとなるように調製したDNAプローブをスライドガラスにAffymetrix 417 Arrayerを用いてスポッティングを行い、DNAプローブを固定化後、一晩乾燥させた。
(3)DNA chip 検出試薬
SYBR Green II (Molecular Probes 社)をDEPC処理水で1,000倍希釈したものをDNA chip検出試薬とした。
【0012】
2. 方法
(1) ハイブリダイゼーション溶液の調製
20×SSPE 45μL(終濃度 5×SSPE)
rRNA 4μL(2μg相当)
5% SDS 15μL(終濃度 0.5%SDS)
DEPC H2O 86μL
からなるハイブリダイゼーション溶液を調製した。
(2) ハイブリダイゼーション
上記(1)で調製したハイブリダイゼーション溶液を65℃で10分間加温後、Gene TAC Hybridization Station(Genomic solutions社) にセッティングされたDNA chipにアプライした。45℃で15時間ハイブリダイゼーションを行い、その後、2×SSCを用いて洗浄を行った後、蒸留水で洗浄した後、風乾した。
(3) 検出
ハイブリダイゼーション後のDNA chipに50μLのDNA chip検出試薬を加え、カバーガラスで覆い、室温、暗所下で3分間染色を行った。その後、LSM5 Pascal 共焦点レーザースキャン顕微鏡(Carl Zeiss社)を用いて、Excitation: 488nm,Emission: 543nmで検出を行った。
【0013】
3. 結果
Vibrio parahaemolyticusより、抽出精製したrRNAをDNAチップ上でハイブリダイズさせた結果を図1に示す。図中、矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示し、ハイブリダイズした位置においてのみ、スポットが検出された。
【0014】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により試料を正確に簡易に測定をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】DNAプローブレイアウトと検出結果を示す。矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示す。
【符号の説明】
1:ShSP001(赤痢菌特異的プローブ)
2:VSP001(ビブリオ属特異的プローブ)
3:VF001(Vibrio fluvialis特異的プローブ)
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子チップを利用した遺伝子の検出方法に関し、その検出に用いられる遺伝子検出用キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
遺伝子チップを用いた遺伝子の検出は、既に確立され広く繁用されている。その構成は、プローブの調製、プローブのスライド上への固定、試料の調製、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションスポットの検出という工程からなる。そして、検出のためには、一般的に蛍光物質が利用され、画像をGenePix Pro解析ソフト等で解析・算出される。この際、蛍光物質の導入には検出対象遺伝子のPCR反応に際しプライマー末端を蛍光物質等で標識化したものを用い、遺伝子の標識化を達成していた。
【0003】
しかし、この方法は、ハイブリダイズの前に、プライマー修飾等の格別の工程を経る必要があり、処理が煩雑、無駄が多いものであった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、遺伝子チップを用いた検査法をより簡便に迅速に達成するための手段を提供するものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
すなわち本発明は、
1.遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップと接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法。
2.前項1の遺伝子検出法に使用される遺伝子チップ及び検出用標識化合物を含む検出試薬を構成の一にする遺伝子検出用キット。
からなる。
【0007】
【発明の実施の態様】
本発明において「遺伝子チップ」とは、DNAマイクロアレイ(DNAチップ)ともいい、スライドガラス等の担体上にオリゴDNAが固定されたものをいう。その製法には限定されず、ガラス表面上でオリゴDNAを合成していくタイプも、或はDNAをスタンプしていくタイプでもよい。これらは、Affymetrix社或はStanford大学の技術が著名である。
通常、DNAマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長cDNAライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、PCR反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのPCR産物のスポット、mRNAの調製及び蛍光標識、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。ここで、スライドガラス上へのPCR産物のスポットはプローブDNAとも呼ばれ、またmRNAの調製及び蛍光標識されたものはターゲットDNA〔サンプルより得られた核酸(RNA)を蛍光標識したcDNA〕とも呼ぶ。
本発明では、この蛍光標識がターゲットDNA(もしくはRNA)にされるのではなく、前記マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション後に蛍光標識がなされる。つまり、本発明において、DNAマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長cDNAライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、PCR反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのPCR産物のスポット、mRNAの調製、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション、蛍光標識及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。
【0008】
ここで蛍光色素は、特に限定されないが、一般的なCy3、Cy5、FITC、SYBR GreenII、POPO−1、BOBO−1、YOYO−1、TOTO−1、JOJO−1、POPO−3、LOLO−1、BOBO−3、YOYO−3、TOTO−3等が使用できる。
所望により、DEPC処理水で蛍光染色剤を希釈する。これはRNAをターゲットにした検出も行うので念のため、RNaseをフリーの状態にするためである。使用時の蛍光色素の濃度は、例えばDEPC処理水で、市販蛍光色素を、0〜10000倍、好ましくは500〜1500倍で希釈したものを使用する。
【0009】
検出は、従来法では、Cy3もしくはCy5で蛍光標識されたmRNA由来のターゲットcDNAを競合的にハイブリダイズさせ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器(スキャナー)で取込み、コンピュータで解析する。一方、本発明では、サンプルより抽出精製したRNA(例えばrRNA)をターゲット遺伝子とし、これをDNAプローブ(既知遺伝子群、例えば各種病原菌特異的遺伝子、例示すれば赤痢菌、ビブリオ菌等)が固定化されたDNAマイクロアレイ上でハイブリダイズさせ、洗浄・風乾後、所定のDNAチップ検出試薬(蛍光物質を含む試薬)で染色させ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器(スキャナー)で取込み、コンピュータで解析する。
本発明において、使用する測定に用いる試薬キットとしては、例えば、(1)DNAプローブが固定化されたDNAチップ、(2)蛍光物質を含むDNAチップ検出試薬、(3)ハイブリダイゼーション用試薬等が例示される。
【0010】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0011】
【実施例1】
1.材料
(1) rRNA
Vibrio parahaemolyticus をSCD培地(10mL)に植菌し、30℃で一晩培養した菌液1.5mLを試料とし、RNeasy Mini kit (キアゲン社)を用い、rRNAを抽出精製した。そのうち、2μg相当をターゲットDNAとした。
(2) DNA chip
終濃度で20μMとなるように調製したDNAプローブをスライドガラスにAffymetrix 417 Arrayerを用いてスポッティングを行い、DNAプローブを固定化後、一晩乾燥させた。
(3)DNA chip 検出試薬
SYBR Green II (Molecular Probes 社)をDEPC処理水で1,000倍希釈したものをDNA chip検出試薬とした。
【0012】
2. 方法
(1) ハイブリダイゼーション溶液の調製
20×SSPE 45μL(終濃度 5×SSPE)
rRNA 4μL(2μg相当)
5% SDS 15μL(終濃度 0.5%SDS)
DEPC H2O 86μL
からなるハイブリダイゼーション溶液を調製した。
(2) ハイブリダイゼーション
上記(1)で調製したハイブリダイゼーション溶液を65℃で10分間加温後、Gene TAC Hybridization Station(Genomic solutions社) にセッティングされたDNA chipにアプライした。45℃で15時間ハイブリダイゼーションを行い、その後、2×SSCを用いて洗浄を行った後、蒸留水で洗浄した後、風乾した。
(3) 検出
ハイブリダイゼーション後のDNA chipに50μLのDNA chip検出試薬を加え、カバーガラスで覆い、室温、暗所下で3分間染色を行った。その後、LSM5 Pascal 共焦点レーザースキャン顕微鏡(Carl Zeiss社)を用いて、Excitation: 488nm,Emission: 543nmで検出を行った。
【0013】
3. 結果
Vibrio parahaemolyticusより、抽出精製したrRNAをDNAチップ上でハイブリダイズさせた結果を図1に示す。図中、矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示し、ハイブリダイズした位置においてのみ、スポットが検出された。
【0014】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により試料を正確に簡易に測定をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】DNAプローブレイアウトと検出結果を示す。矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示す。
【符号の説明】
1:ShSP001(赤痢菌特異的プローブ)
2:VSP001(ビブリオ属特異的プローブ)
3:VF001(Vibrio fluvialis特異的プローブ)
Claims (2)
- 遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップを接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法。
- 請求項1の遺伝子検出法に使用される遺伝子チップ及び検出用標識化合物を含む検出試薬を構成の一にする遺伝子検出用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002216783A JP2004061170A (ja) | 2002-07-25 | 2002-07-25 | Dnaチップの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002216783A JP2004061170A (ja) | 2002-07-25 | 2002-07-25 | Dnaチップの測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004061170A true JP2004061170A (ja) | 2004-02-26 |
Family
ID=31938438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002216783A Pending JP2004061170A (ja) | 2002-07-25 | 2002-07-25 | Dnaチップの測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2004061170A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2159290A1 (en) | 2008-08-27 | 2010-03-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of producing microarray having immobilized double-stranded nucleic acid probe including double-stranded region and single-stranded region |
WO2023286723A1 (ja) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | キヤノン株式会社 | 検体の分析方法および検体分析装置 |
-
2002
- 2002-07-25 JP JP2002216783A patent/JP2004061170A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2159290A1 (en) | 2008-08-27 | 2010-03-03 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of producing microarray having immobilized double-stranded nucleic acid probe including double-stranded region and single-stranded region |
WO2023286723A1 (ja) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | キヤノン株式会社 | 検体の分析方法および検体分析装置 |
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