CN103865986B - Cdkn1a基因突变检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents

Cdkn1a基因突变检测特异性引物和液相芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CDKN1A基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对A7358T位点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16，针对C98A位点的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18，针对G70A位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20，针对C258T位点的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22，针对T3745C位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24，针对G2763A位点的SEQIDNO.25及SEQIDNO.26，和/或针对C4008T位点的SEQIDNO.27及SEQIDNO.28；有不同anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。

Description

CDKN1A基因突变检测特异性引物和液相芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CDKN1A基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
周期蛋白依赖激酶抑制因子1A(cyclindependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)，又称p21，Cip1，位于6号染色体6p21.2上，CDKN1A基因所编码的蛋白控制着细胞内大部分肿瘤抑制子的通路。同时，该蛋白阻碍了癌症细胞新DNA链的合成，这些DNA新链是癌症细胞生长及分裂所必需的。p21基因是Clp家族中的一员，它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，因DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用。研究表明：p21与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关，具有判断预后的价值。p21既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinases CDKs)复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。p21基因的发现、克隆及其在细胞周期控制与肿瘤发生中有重要作用。研究发现，P21基因的多态性与慢性苯中毒、头颈部鳞状细胞癌、先天肺纤维化、消化道癌和系统性红斑狼疮等疾病呈现相关性。
目前，CDKN1A基因突变检测方法主要有：Illumina光纤微珠芯片技术、PCR-RFLP技术、荧光定量PCR技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。荧光定量PCR技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的之一是提供CDKN1A基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测CDKN1A基因七种常见基因型A7358T、C98A、G70A、C258T、T3745C、G2763A和C4008T的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下。
一种CDKN1A基因突变检测液相芯片，包括有：
(A).针对CDKN1A基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对A7358T位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16，针对C98A位点的SEQ IDNO.17及SEQ ID NO.18，针对G70A位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对C258T位点的SEQID NO.21及SEQ ID NO.22，针对T3745C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24，针对G2763A位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26，和/或针对C4008T位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14；
(B).有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.42，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
在其中一个实施例中，所述扩增引物为：针对A7358T位点的SEQ ID NO.43及SEQ IDNO.44，针对C98A位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46，针对G70A位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48，针对C258T、C4008T位点的SEQ ID NO.49及SEQ ID NO.50，针对T3745C位点的SEQ ID NO.51及SEQ ID NO.52，和/或针对G2763A位点的SEQ ID NO.53及SEQ ID NO.54。
在其中一个实施例中，所述ASPE引物为：针对A7358T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.15组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.16组成的序列，针对C98A位点的由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列，针对G70A位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20组成的序列，针对C258T位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列，针对T3745C位点的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列，针对G2763A位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列，和/或针对C4008T位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.28组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于CDKN1A基因突变检测的特异性引物。
具体技术方案如下。用于CDKN1A基因突变检测的特异性引物，特异性引物为针对A7358T位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16，针对C98A位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18，针对G70A位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对C258T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，针对T3745C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24，针对G2763A位点的SEQ ID NO.25及SEQ IDNO.26，和/或针对C4008T位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的CDKN1A基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的CDKN1A基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，7种突变位点检测可通过一步PCR即可完成6条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1CDKN1A基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CDKN1A基因七种常见基因型A7358T、C98A、G70A、C258T、T3745C、G2763A和C4008T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 CDKN1A基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的14种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的14种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对CDKN1A基因七种常见基因型A7358T、C98A、G70A、C258T、T3745C、G2763A和C4008T，设计扩增引物对(见表3)，扩增出6条含有7个突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述的CDKN1A基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
2×Tm杂交缓冲液
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计6对引物，多重PCR一步扩增出6条分别含CDKN1A基因七种常见基因型A7358T、C98A、G70A、C258T和C4008T、T3745C、G2763A的目标序列，产物大小分别为309bp、244bp、282bp、489bp、259bp、245bp，引物序列(SEQ ID NO.43-54)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.43-54的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的14种包被的微球(如实施例1所述)，每种微球浓度均为2.5×105个/ml；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CDKN1A基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CDKN1A基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CDKN1A基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CDKN1A的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)之一
表5样本检测结果(MFI)之二
表6样本CDKN1A基因突变比值(％)
表7样本CDKN1A基因突变类型分析结果
  样本号   液相芯片检测结果   测序结果
  1   野生型   野生型
  2   野生型   野生型
  3   野生型   野生型
  4   野生型   野生型
  5   野生型   野生型
  6   3745CC   3745CC
  7   野生型   野生型
  8   野生型   野生型
  9   野生型   野生型
  10   野生型   野生型
  11   野生型   野生型
  12   7358TT   7358TT
  13   野生型   野生型
  14   野生型   野生型
  15   野生型   野生型
  16   野生型   野生型
  17   70GA   70GA
  18   野生型   野生型
  19   野生型   野生型
  20   2763AA   2763AA
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CDKN1A基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CDKN1A基因A7358T、C98A、C258T和G2763A位点突变检测液相芯片为例，分别针对A7358T、C98A、C258T和G2763A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.42。具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8液相芯片制备的设计
一、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表9样本CDKN1A基因A7358T检测结果与基因多态性分析
表10样本CDKN1A基因C98A检测结果与基因多态性分析
表11样本CDKN1A基因C258T检测结果与基因多态性分析
表12样本CDKN1A基因G2763A检测结果与基因多态性分析
从上述实施例可见，其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1、试验组5、试验组8和试验组12。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
实施例4CDKN1A基因突变检测特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
以CDKN1A基因G70A和T3745C的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对G70A和T3745C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表13所示。其中，内碱基为多态性位点。
表13特异性引物序列
以CDKN1A基因G70A和T3745C的多态性位点检测液相芯片为例，针对G70A和T3745C选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表(表14)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表14液相芯片制备的设计之二
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表15样本CDKN1A基因G70A检测结果与基因多态性分析
表16样本CDKN1A基因T3745C检测结果与基因多态性分析
由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组13和试验组16。其它来源于目标检测位点所在序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具体数据省略。
其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具体数据省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种CDKN1A基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：
(A).针对CDKN1A基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对A7358T位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16，针对C98A位点的SEQ IDNO.17及SEQ ID NO.18，针对G70A位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20，针对C258T位点的SEQID NO.21及SEQ ID NO.22，针对T3745C位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24，针对G2763A位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26，和/或针对C4008T位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14；
(B).有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.42，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物；
所述扩增引物为：针对A7358T位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44，针对C98A位点的SEQ IDNO.45及SEQ ID NO.46，针对G70A位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48，针对C258T、C4008T位点的SEQ ID NO.49及SEQ ID NO.50，针对T3745C位点的SEQ ID NO.51及SEQ ID NO.52，和/或针对G2763A位点的SEQ ID NO.53及SEQ ID NO.54。
2.根据权利要求1所述的CDKN1A基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：针对A7358T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.16组成的序列，针对C98A位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列，针对G70A位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20组成的序列，针对C258T位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列，针对T3745C位点的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列，针对G2763A位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列，和/或针对C4008T位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.28组成的序列。
3.根据权利要求1或2所述的CDKN1A基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5－10个T。
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