CN111621560B - 一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物 - Google Patents

一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物。本发明发现MT‑CO1基因甲基化与职业性慢性苯中毒的发生有关，MT‑CO1基因甲基化可作为职业性慢性苯中毒的效应生物标志物：病例组MT‑CO1位点1甲基化水平(2.21±0.81％)小于对照组(3.0±1.63％)，差异有统计学意义(P<0.05)；病例组MT‑CO1位点2甲基化水平(2.31±0.96％)小于对照组(3.22±1.59％)，差异有统计学意义(P<0.05)；病例组MT‑CO1位点平均甲基化水平(2.26±0.75％)小于对照组(3.10±1.57％)，差异有统计学意义(P<0.05)。

Description

一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物。
背景技术
苯是国际上公认的致血液毒性和癌症的物质。苯中毒的主要作用机理是苯的代谢物在体内引起线粒体产生自由基增多造成氧化损伤，一些研究证明苯的血液毒性可能是受基因组DNA甲基化水平调节的。由于线粒体DNA缺乏组蛋白保护，其DNA损伤修复系统薄弱，对于氧化损伤的敏感性更高。
近5年来，据全国职业病报告显示职业性慢性苯中毒(CBP)发病呈波浪式上升趋势，苯及其苯系物主要经呼吸道吸入对机体血液系统造成损害，严重者会出现再生障碍性贫血、白血病，并有学者发现苯暴露与肺癌发病相关。线粒体氧化损伤是苯暴露引起血液毒性的重要机制之一。最近研究提示，苯暴露可通过表观遗传学机制调控某些靶基因表达影响造血微环境，从而引发血液损害和肿瘤。表观遗传修饰的主要方式是DNA甲基化。线粒体DNA的甲基化修饰可能引起所编码基因的异常表达,从而参与调节生理和病理过程。有研究发现与ATP合成相关的线粒体细胞色素c氧化酶亚单位I(mitochondrial cytochrome coxidase subunit I,MT-CO1)甲基化与衰老、妊娠疾病及心脏病有关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测苯中毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测MT-CO1基因甲基化的物质在制备预测或辅助预测苯中毒产品中的应用。
所述检测MT-CO1基因甲基化的物质为能特异检测检测MT-CO1基因甲基化的物质。
上述应用中，所述MT-CO1基因甲基化可为位点1和/或位点2的甲基化，所述位点1为线粒体标准序列NC_012920.1(NCBI，2014年10月31日更新)的6797核苷酸，所述位点2为线粒体标准序列NC_012920.1的6807核苷酸。
上述应用中，所述检测MT-CO1基因甲基化的物质包括试剂1和/或试剂2，所述试剂1为由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成的引物对，所述试剂2为利用亚硫酸氢盐处理DNA使DNA中非甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U的试剂(如亚硫酸氢盐)。
上述应用中，所述检测MT-CO1基因甲基化的物质还可包括测序所需的仪器和/或试剂。所述试剂可为序列表中序列3所示的用于测序的单链DNA。
上述应用中，所述检测MT-CO1基因甲基化的物质还可包括数据处理装置，所述数据处理装置用于依据MT-CO1基因甲基化情况预测苯中毒风险。
上述应用中，所述检测MT-CO1基因甲基化的物质可以由所述试剂1、所述试剂2、所述测序所需的仪器和/或试剂与所述数据处理装置组成，也可由其中至少一种组成。
所述检测MT-CO1基因甲基化的物质，也属于本发明的保护范围。
MT-CO1基因甲基化在作为苯中毒标志物中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了预测或辅助预测苯中毒产品，所述产品为所述检测MT-CO1基因甲基化的物质。
所述苯中毒可为慢性苯中毒，如职业性慢性苯中毒。
实验证明，MT-CO1基因甲基化与职业性慢性苯中毒的发生有关，MT-CO1基因甲基化可作为职业性慢性苯中毒的效应生物标志物：病例组MT-CO1位点1甲基化水平(2.21±0.81％)小于对照组(3.0±1.63％)，差异有统计学意义(P<0.05)；病例组MT-CO1位点2甲基化水平(2.31±0.96％)小于对照组(3.22±1.59％)，差异有统计学意义(P<0.05)；病例组MT-CO1位点平均甲基化水平(2.26±0.75％)小于对照组(3.10±1.57％)，差异有统计学意义(P<0.05)；MT-CO1平均甲基化水平与白细胞呈相关性(P<0.05)；MT-CO1平均甲基化水平与血小板呈相关性(P<0.05)。
附图说明
图1为PCR扩增产物电泳检测。1-7为测序目的序列为MT-CO1基因的样本，N为以双蒸水为模板的阴性对照，M为电泳Marker,S为电泳Marker标准大小，单位为bp)。
图2为一例病人MT-CO1基因甲基化测序结果。1％为第1个甲基化位点(位于线粒体标准序列NC_012920.1的6797核苷酸处)，2％为第2个甲基化位点(位于线粒体标准序列NC_012920.1的6807核苷酸处)。
图3为病例和对照甲基化水平比较。a为病例和对照组位点1甲基化水平对比结果，b为病例和对照组位点2甲基化水平对比结果，c为病例和对照组位点1和位点2平均甲基化水平对比结果，Methylation level代表甲基化水平。
图4为甲基化水平与血常规主要指标的相关性分析。a甲基化水平与WBC的相关性分析，b为甲基化水平与PLT的相关性分析，WBC代表白细胞，PLT代表血小板。
图5为甲基化水平预测苯中毒危险度分析。Sensitivity％为敏感性，Specificity％为特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、
1研究对象与方法
1.1研究对象：病例组选择38名轻度苯中毒患者,男性12人，女性26人，平均年龄42.5岁。病例全部来源于深圳市职业病防治院就诊的患者，从事苯暴露平均工龄为6.8年。纳入标准：依据《职业性苯中毒的诊断》(GBZ 68-2013)确诊为职业性慢性苯中毒患者。排除标准：1)无线粒体相关疾病；2)无吸烟、饮酒史；3)无遗传疾病或家族史；4)无长期X射线或其他放射线接触史。对照组选择46名健康体检者,男性19人，女性27人，平均年龄39.6岁。纳入标准：体检结果健康者。排除标准：1)无苯接触史和线粒体相关疾病；2)无吸烟、饮酒史；3)无遗传疾病或家族史；4)无长期X射线或其他放射线接触史。两组受试者均抽取肘部血液样本5mL，EDTA抗凝。
1.2仪器和试剂
1.2.1仪器设备：ABI Step one plus荧光PCR扩增仪(美国应用生物公司)、可调定量加液器(德国赛默科学公司)、分光光度计(日本日立科学仪器公司)、XE-5000血液分析仪(日本SYSMEX公司)、电动离心机(美国西格玛公司)、PyroMark Q96 ID型焦磷酸测序仪(德国QIAGEN公司)。
1.2.2主要配套试剂：人类基因组柱式血液DNA提取试剂[生工生物工程(上海)股份有限公司]，双蒸水[生工生物工程(上海)股份有限公司]，DNA引物合成物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。EZ DNA Methylation-GoldTM甲基化检测试剂(北京天漠科技开发有限公司)。
1.2.3DNA的提取：提取各研究对象的基因组DNA(浓度大于20ng/μl)，提取的DNA立即进行亚硫酸氢盐处理，以使基因组中非甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，作为DNA模板。
1.2.4PCR反应
对步骤1.2.3所得DNA模板进行PCR扩增，所用引物为MT-CO1基因引物，具体如下：
MT-CO1上游引物：5′-ATATTAATTGGTTTTTTAGGGTTTAT-3′(序列1)，MT-CO1下游引物：5′-CAACAAATCATTTCATATTACTTCC-3′(序列2)，MT-CO1下游引物5′端进行生物素标记。
所检测序列为线粒体标准序列NC_012920.1(NCBI，2014年10月31日更新)的6797-6814位置的MT-CO1基因核酸序列。
反应体系：反应体系采用上游和下游引物(10μM)各2μL，dNTP(mix)2μL，TaqBuffer(with MgCl210×)5μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，ddH2O 26.5μL，DNA模板2μL。其中，TaqBuffer与Taq酶：生工生物工程(上海)股份有限公司,货号B532491。
反应条件：95℃10s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，用于分析评估扩增产物的大小(178bp)。然后对PCR产物进行纯化和焦磷酸测序分析[生工生物工程(上海)股份有限公司]。测序列引物5′-TATATTTATAGTAGGAATAGA-3′(序列3)。获得的序列通过PyroMark CpG Software1.0.11.14软件检测线粒体基因该区域基因甲基化情况(图1和图2)。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率，测序反应时在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例，计算出甲基化的百分比。
1.3统计学分析：实验数据采用SPSS16.0统计软件处理，组间性别分布差异比较采用χ2检验分析，年龄差异采用t检验分析，未达到近似正态分布条件两组间数据对比以及相关性分析采用非参数检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1一般特征：病例组与对照组年龄分布经T检验分析(T＝1.848,P＝0.068),差异无统计学意义(P<0.05)。病例组与对照组性别分布经卡方检验分析(Pearson Chi-Square＝0.845,P＝0.358),差异无统计学意义(P<0.05)。结果见表1。
2.2PCR扩增电泳和焦磷酸测序检测：结果见图1-2。PCR扩增呈单一条带，未见引物二聚体和其他非特异性扩增条带，与预期目的片段大小一致。焦磷酸测序图波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀，每个峰都是单一顶针状，底部没有杂峰干扰。
2.3血常规水平：病例组白细胞计数小于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。病例组血小板计数小于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。病例组血红蛋白浓度小于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。病例组红细胞计数小于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。检测和统计分析结果见表1。
表1病例组与对照组血常规水平
Figure BDA0002538981150000041
Figure BDA0002538981150000051
表1中，*P<0.05，▲为Pearson卡方值
2.4甲基化水平：病例组MT-CO1基因位点1(位于线粒体标准序列NC_012920.1的6797核苷酸处)甲基化水平(即该位点发生甲基化的百分数)小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。病例组MT-CO1基因位点2(位于线粒体标准序列NC_012920.1的6807核苷酸处)甲基化水平小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。病例组MT-CO1基因位点1和2平均甲基化水平小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。检测和统计分析结果见图3。
2.5甲基化水平与血常规主要指标的相关性分析：检测和统计分析结果见图4，平均甲基化水平(即位点1和2平均甲基化水平)与白细胞非参数相关性发现呈相关性(r＝0.254，P＝0.019)。平均甲基化水平(即位点1和2平均甲基化水平)与血小板非参数相关性发现呈相关性(r＝0.280，P＝0.009)。
2.6甲基化水平预测苯中毒危险度分析：ROC曲线面积＝0.682(95％CI:0.569-0.795)，P<0.05，MT-CO1平均甲基化水平(即位点1和2平均甲基化水平)阈值为0.75时，敏感性为97.8％，特异性为97.3％，阳性似然比为1.005(见图5)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 深圳市职业病防治院
<120> 一种职业性慢性苯中毒的甲基化标志物
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atattaattg gttttttagg gtttat 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
caacaaatca tttcatatta cttcc 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tatatttata gtaggaatag a 21

Claims (2)

1.检测MT-CO1基因甲基化水平的试剂在制备辅助预测轻度苯中毒产品中的应用；
所述轻度苯中毒为职业性慢性苯中毒；
所述MT-CO1基因甲基化水平为位点1和位点2的甲基化水平，所述位点1位于线粒体标准序列NC_012920.1的6797核苷酸处，所述位点2位于线粒体标准序列NC_012920.1的6807核苷酸处。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测MT-CO1基因甲基化水平的试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，所述试剂2为利用亚硫酸氢盐处理DNA使DNA中非甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U的试剂。
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