CN110273004A

CN110273004A - 基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN110273004A
Application number: CN201910732264.9A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 赖炳林; 陈至里; 吴诗扬; 朱蓉; 彭璨璨
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110273004B

Abstract

本发明公开了一种基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明公开的基因甲基化检测的试剂，包括第一核酸分子和第二核酸分子，其中，第一核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，第二核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。该试剂针对septin9基因启动子区第三个CpG岛处的甲基化情况进行检测，采用该试剂进行检测septin9基因的甲基化情况，其特异性更强、灵敏度更高。

Description

基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒。

背景技术

近年来，表观遗传学机制受到研究者们的广泛关注，其中的DNA异常甲基化是肿瘤常见的表观遗传学改变，在众多研究中发现DNA甲基化导致基因表达异常是引发肿瘤发生、发展的重要机制。septin9基因是septin家族中的一员，定位于染色体17q25.3，该染色体区段是散发性卵巢癌和乳腺癌的常见杂合性丢失部位，在子细胞的胞质分裂过程中起着至关重要的作用。研究报道，septin9基因甲基化在CRC早期筛查中的敏感性和特异性总体优势均较其他单一基因高，并且该基因研究比较成熟，作为早期CRC的分子标记物，已提交给FDA(美国食品与药品监督管理局)应用于临床。但是研究发现，单一基因甲基化检测筛查CRC时的敏感性和特异性仍不够理想。

公开号为CN108048566A的中国专利申请公开了一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒，然而经前期论证发现其引物的特异性存在一定缺陷，偶有非特异性扩增的情况出现。同时检测灵敏度相对较低。上述情况产生的主要原因是设计的引物结合位点不佳，导致引物与非甲基化模板也能部分结合。另外还有可能是引物和探针的退火温度并非最佳温度，从而导致非特异性扩增的情况产生。

本发明为避免上述情况发生，前期进行了大量的实验探索，从而使得设计的引物探针具有十分相近的退火温度，而且设计的引物探针结合位点对非甲基化模板没有结合的几率。同时通过对检测试剂的进一步优化，还可以极大地提高检测灵敏度，使其得到的检测结果更准确。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因甲基化检测的试剂。该试剂针对septin9基因启动子区第三个CpG岛处的甲基化情况进行检测，采用该试剂检测septin9基因的甲基化情况，其特异性更强、灵敏度更高。

本发明的另一目的在于提供一种检测基因甲基化检测的方法。该方法可以针对septin9基因启动子区第三个CpG岛处的甲基化情况进行检测，采用该方法检测septin9基因的甲基化情况，其特异性更强、灵敏度更高。

本发明的另一目的在于提供一种基因甲基化检测的试剂盒。该试剂盒可以针对septin9基因启动子区第三个CpG岛处的甲基化情况进行检测，采用该试剂盒检测septin9基因的甲基化情况，其特异性更强、灵敏度更高以及具有更佳的稳定性。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种基因甲基化检测的试剂，上述基因为septin9基因，上述试剂包括第一核酸分子和第二核酸分子，其中，上述第一核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，上述第二核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

第一核酸分子为正向引物，其核苷酸序列(5’-3’)如下：

TTTTTCGCGCGATTCGTTG(SEQ ID NO.10)。

第二核苷酸分子为反向引物，其核苷酸序列(5’-3’)如下：

CGAAATAATCCCATCCAACT(SEQ ID NO.13)。

本发明提供的第一核酸分子和第二核酸分子通过对septin9基因启动子区第三个CpG岛处的序列进行科学设计，有效提高了检测的特异性和灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂还包括第三核酸分子和第四核酸分子，其中，上述第三核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，上述第四核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

第三核酸分子为荧光探针，其核苷酸序列(5’-3’)如下：

GTCGGATTTCGCGGTTAA(SEQ ID NO.16)。

第四核酸分子为保护探针，其核苷酸序列(5’-3’)如下：

CAGCCTAAAGCGCCAATT(SEQ ID NO.22)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第三核酸分子的一端具有荧光报告基团，另一端具有荧光淬灭基团。

利用带有荧光基团的第三核酸分子，可以基于荧光定量PCR平台，通过TaqMan探针法实现对septin9基因甲基化检测，提高其灵敏度和特异性，减少操作步骤，缩短检测时间，提高检测结果的准确性。

保护探针的设计基于荧光置换探针原理，所谓荧光置换探针是两条按照DNA碱基互补配对原则而反向互补的寡核苷酸。当有靶序列与荧光置换探针互补时，可以发生置换杂交反应。在探针与靶序列进行置换杂交反应时，由于荧光置换探针自身两条链之间的互补配对，存在着与靶序列互补的竞争作用，因此不匹配的模板就很难和荧光置换探针发生置换杂交，从而保证了探针置换杂交检测的特异性，有助于提高检测结果准确性。同时由于置换探针与目标靶序列的结合能力强于与置换探针间的结合能力，因而特异性检测信号不会受干扰。

基于以上设计原理，本发明的保护探针可以阻碍septin9基因目的位点甲基化特异探针与非甲基化位点的非特异性结合，提高探针的结合特异性，进而提高检测结果的准确性。保护探针的作用方式不一定是常规的结合非特异性序列以阻碍非特异性结合，也可以是保护特异性探针，在探针设计时，创造性地引入与特异性荧光探针序列(第三核酸分子)完全互补配对的保护探针(第四核酸分子)，与非特异性序列有效竞争与探针序列配对，可有效避免特异性荧光探针与非特异性序列结合激发的非特异性信号，大大降低非特异信号，降低检测结果中出现的假阳性，提高检测准确度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，荧光报告基团为TET、FAM、CY3、ROX、JOE、CY5、HEX或VIC。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，淬灭基团为BHQ-2、ECLIPSE、BHQ-1、DABCYL、BHQ-3或TAMRA。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂还包括第五核酸分子，上述第五核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

第五核酸分子的序列如下：

CCCATCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAAC(SEQ ID NO.19)。

第五核酸分子为Blocker序列，其可以阻碍针对septin9基因目的位点的甲基化特异探针即第三核酸分子与非甲基化位点的非特异性结合，提高探针的结合特异性，进而提高检测结果的准确性。

此外，septin9基因甲基化检测探针和septin9基因甲基化检测引物对都具有甲基化特异性，共覆盖了6个甲基化位点，可以有效防止单点突变而引起的假阳性结果，提高检测结果的准确性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第五核酸分子的5’端具有硫代修饰，第五核酸分子的3’端具有C3间臂修饰。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第五核酸分子的5’端的3个碱基具有硫代修饰。

第五核酸分子的5’端的3个碱基进行硫代修饰，3’端加C3间臂修饰，可以防止Taq酶对第五核酸分子的水解，进而避免septin9基因目的位点甲基化特异性引物由于错配而造成的非特异性扩增，从而有效提高septin9甲基化检测的特异性。

第二方面，本发明提供一种基因甲基化检测的方法，上述基因为septin9基因，其包括：将经亚硫酸盐处理后的核酸样本与上述的试剂混合，进行PCR反应。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应的体系中，第一核酸分子的浓度为：0.35-0.45mM/μl，优选为0.4mM/μl；

优选的，第二核酸分子的浓度为：0.35-0.45mM/μl，优选为0.4mM/μl。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应的体系中，第三核酸分子的浓度为：0.15-0.25mM/μl，优选为0.2mM/μl；

优选的，第四核酸分子的浓度为：0.15-0.25mM/μl，优选为0.2mM/μl；

优选的，第五核酸分子的浓度为：0.6-1.0mM/μl，优选为0.8mM/μl。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。

第三方面，本发明提供一种基因甲基化检测的试剂盒，上述基因为septin9基因，其包括上述的基因甲基化检测的试剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸保护剂含有：6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、四氢呋喃糠醇、聚乙二醇二甲醚、肉桂醛、芸香苷、四氢嘧啶、二硫苏糖醇、咪唑烷基脲、BSA和甘油；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸保护剂包括：1％-10％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(即水溶性维生素E、质量百分比)、60％-80％四氢呋喃糠醇(体积百分比)、1％-10％聚乙二醇二甲醚(体积百分比)、0.5％-5％肉桂醛(体积百分比)、0.05-0.1mg/ml芸香苷、0.1％-1.5％四氢嘧啶(质量百分比)、0.01mM-0.5mM二硫苏糖醇、0.1％～0.5％咪唑烷基脲(质量百分比)、5％-30％BSA(体积百分比)和5％-30％甘油(体积百分比)。

本发明提供的核酸保护剂可以有效保护提取到的核酸的有效生理活性，同时保护剂中添加的有效保护成分，可降低亚硫酸氢盐转化过程中DNA的损耗，并且极大缩短硫化时间，提高效率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒内参基因引物对和内参基因探针，内参基因引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的内参上游引物和SEQ IDNO.4所示的内参下游引物；

内参上游引物的核苷酸序列(5’-3’)如下：

TGGGGAGTTTTTGGTTTGGT(SEQ ID NO.1)。

内参下游引物的核苷酸序列(5’-3’)如下：

ACAAATACCAACCAACCCCAAT(SEQ ID NO.4)。

内参基因探针的核苷酸序列(5’-3’)如下：

TTTGGGGGTGTTTGGTTTAGGTGTTATGTT(SEQ ID NO.7)。

利用内参基因引物和内参基因探针可以通过TaqMan探针法用于对内参基因β-actin检测，内参基因β-actin的检测结果，对样品检测检测结果起到对照作用，有助于提高对样品检测结果判断的准确性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，内参基因探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团，且内参基因探针的5’端标记有荧光报告基团与上述的第三核酸分子的5’端标记的荧光报告基团类别不同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，该阴性质控品包括非甲基化的人类基因组DNA、BSA和Buffer TE；该阳性质控品包括septin9基因甲基化的人基因组DNA、BSA和Buffer TE。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括PCR扩增液和DNA聚合酶。

该试剂盒可直接用于人结直肠癌特异性的septin9基因甲基化分析，用于结直肠癌的早期快速无创筛查，同时具有较高的灵敏度和特异性，而且具有操作方便、检测结果准确可靠等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例5中对照试剂盒(CN108048566A)的绝对灵敏度检测图。

图2为实施例5中本发明试剂盒的绝对灵敏度检测图。

图3为实施例8中的不同试剂盒的检测结果对比；曲线1为本发明实施例3的试剂盒，曲线2和3分别为市售产品1(人septin9基因甲基化检测试剂盒，江苏为真生物医药技术股份有限公司)以及市售试剂盒2(septin9基因甲基化检测试剂盒，博尔诚(北京)科技有限公司)。

图4为实施例10中的不同引物组合的荧光扩增曲线。曲线1、2、3分别代表采用组合1、2、3的引物探针组合进行检测的结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本申请中使用的引物和探针可以采用本领域公知的标准技术制备。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了septin9基因甲基化检测的试剂盒，其包括septin9基因甲基化检测的试剂，该试剂包括第一核酸分子、第二核酸分子、第三核酸分子、第四核酸分子以及第五核酸分子，各核酸分子的序列如下表1所示。

表1试剂盒引物探针序列表：

其中，第三核酸分子的5’端具有荧光报告基团FAM，3’具有荧光淬灭基团BHQ1。

本实施例提供的试剂可基于荧光定量PCR平台，通过TaqMan探针法，实现对septin9基因甲基化的检测，其具有较强的特异性和更好的灵敏度。

实施例2

本实施例提供了采用上述实施例1的试剂盒对septin9基因甲基化检测的方法，其包括如下步骤：

一、提取血浆游离DNA

使用血浆处理试剂盒提取血浆中的游离DNA，然后用亚硫酸盐溶液处理提取的游离DNA，未甲基化的胞嘧啶通过脱氨基反应转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶则不会被亚硫酸转化。

具体如下：

1.冻存的血浆样本(或质控品)室温放置，使其完全冻融。

2.将4mL血浆样本、质控品分别转移至标记好的15mL离心管中。依次加入200μL蛋白酶K(浓度为20mg/ml)和200μL SDS溶液(含20％SDS)，拧紧瓶盖并颠倒混匀。离心管置于60℃温育20分钟。

3.向上述15mL离心管依次加入5mL裂解液(含150mM NaCl、1.0％NP-40、50mMTris-HCl、1.0％SDS、50mM EDTA调pH到7.4、0.01％叠氮钠、85％异丙醇、4％Triton X-100、2％儿茶素(质量百分比))、180μL磁珠1悬液(2MTris-HCl、100mMEDTA-2Na和硅羟基磁珠40mg/ml)、1μL Carrier RNA(0.5μg/μl，糖原、tRNA)，颠倒混匀10分钟。

4.第一次洗涤：将15mL离心管放置于磁力是试管架上吸附3-5分钟，小心倒掉上清。加入1mL洗液1(5.7M胍盐，10mmol/L对苯二酚)(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒，短暂离心，并将磁珠悬液转移至1.5mL离心管。将离心管放置在磁力架上静置1-2分钟，小心吸弃上清。

5.第二次洗涤：向1.5mL离心管中加入1mL洗液2(10mM Tris-HCl、pH7.4)(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒，短暂离心。将离心管放置在磁力架上静置1-2分钟，小心吸弃上清。

6.第三次洗涤：向1.5mL离心管中加入1mL洗液2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒，短暂离心。将离心管放置在磁力架上静置1-2分钟，小心吸弃上清。

7.短暂离心1.5mL离心管，尽量吸干残余液体，开盖室温干燥5-10分钟。

8.加入40μL洗脱液1(10mM Tris-HCl、pH8.5)至各1.5mL离心管，涡旋混匀磁珠，室温振荡混匀10分钟。短暂离心，将离心管转移至磁力架上，静置1-2分钟。转移上清DNA至新的1.5mL离心管。

9.若DNA不立即使用，可将其存储-30℃至-10℃不超过6个月。若需进行亚硫酸盐处理，请按以下步骤进行。

二、亚硫酸盐转化

10.取干净PCR管加入30μL步骤8回收的DNA、10μL核酸保护剂(含：4％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、62％四氢呋喃糠醇、3％聚乙二醇二甲醚、0.8％肉桂醛、0.07mg/ml芸香苷、0.12％四氢嘧啶、0.02mM二硫苏糖醇、0.3％咪唑烷基脲、8％BSA和12％甘油)和90μL亚硫酸盐溶液。

11.上述反应体系配制完成之后，将PCR管放入PCR仪或其他温控设备进行热处理。先95℃加热10分钟，紧接着64℃温育60分钟。热处理完成之后取出PCR管进行下一步处理。

12.将PCR管短暂离心并把反应体系转移至干净1.5mL离心管中。加入1mL结合液和40μL磁珠2(硅氨基磁珠，20mg/ml)，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀10分钟。短暂离心，将离心管转移至磁力架上，静置1-2分钟，小心吸弃上清。

13.向1.5mL离心管中加入800μL洗液3(10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA、pH7.4)(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒，短暂离心。将离心管放置在磁力架上静置1-2分钟，小心吸弃上清。

14.向1.5mL离心管中加入800μL洗液3(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒，短暂离心。将离心管放置在磁力架上静置1-2分钟，小心吸弃上清。

15.短暂离心1.5mL离心管，尽量吸干残余液体，开盖室温干燥5-10分钟。

16.加入40μL洗脱液2(10mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH8.5)至各1.5mL离心管，涡旋混匀磁珠，室温振荡混匀10分钟。短暂离心，将离心管转移至磁力架上，静置1-2分钟。转移上清DNA至新的1.5mL离心管。

17.若DNA不立即使用，可将其存储-30℃至-10℃不超过6个月。若需进行qPCR检测，请按以下步骤进行。

三、qPCR检测

将亚硫酸盐溶液转化的DNA(Bis-DNA)做qPCR检测，qPCR反应体系的引物和探针能专一性地结合到甲基化的septin9基因启动子序列上。内参ACTB基因用于评估检测样本的DNA量是否足够。

具体如下：

18.qPCR检测

1)qPCR检测反应体系配制，如下所示：

组分	PCR扩增液	DNA聚合酶	样本	总体积
					加量(μL)	30	1.5	30	61.5

PCR扩增液含：Buffer(Mg²⁺free)10％、MgCl₂ 2.5mM、dNTP 400nM、引物0.4mM/μl(第一核酸分子和第二核酸分子各0.4mM/μl)、探针0.2mM/μl(第三核酸分子和第四核酸分子各0.2mM/μl)、Blocker(第五核酸分子)0.8mM/μl、NF水3％。

其中，以ACTB基因的检测作为内参对照，所用内参基因引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的内参上游引物和SEQ ID NO.4所示的内参下游引物(加入上述的同一反应体系中)；内参基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(加入上述的至同一反应体系中)。内参基因探针的5’端具有荧光报告基团JOE，3’端具有荧光淬灭基团BHQ1。

2)qPCR检测反应条件，如下所示：

19.结果分析设置

1)Ct值确定：根据扩增曲线，划定合适荧光阈值(一般将阈值划定在扩增对数形式下指数增长期的中间)，得到Ct值。

2)基线确定：ABI7500需将基线设定为10-22个循环；天隆TL988不需要调整基线。

20.检测结果的解释

I)质量控制标准：

1)阳性质控品在FAM、JOE通道均有典型的S型扩增曲线升起，且FAM通道(septin9基因)Ct值≤38、JOE通道(ACTB基因)Ct值≤35。

2)阴性质控品在JOE通道(ACTB基因)有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值≤35。在FAM通道(septin9基因)无Ct值或Ct值＞38。

II)待测样本结果确定：

各待测样本在FAM、JOE通道上至少有一个通道有典型的S型扩增曲线，并与临界值比较确定待测样本的检测结果。

1)阳性检测结果：

FAM通道(septin9基因)Ct值≤38、JOE通道(ACTB基因)Ct值≤35。

2)阴性检测结果：

FAM通道(septin9基因)无Ct值或Ct值＞38、JOE通道(ACTB基因)Ct值≤35。

3)无效检测结果：

JOE通道(ACTB基因)无Ct值或Ct值＞35，对无效结果建议复检。

实施例3

本实施例提供了一种septin9基因甲基化检测的试剂盒，其包括：实施例1的试剂以及核酸保护剂；

该核酸保护剂含有：4％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、62％四氢呋喃糠醇、3％聚乙二醇二甲醚、0.8％肉桂醛、0.07mg/ml芸香苷、0.12％四氢嘧啶、0.02mM二硫苏糖醇、0.3％咪唑烷基脲、8％BSA和12％甘油。

采用本发明实施例的试剂盒进行甲基化检测的方法可参考实施例2的方法。

实施例4

试剂盒的相对灵敏度检测

为考察本发明实施例提供的试剂盒和检测方法在大量的野生型的DNA背景下能够检测的甲基化阳性DNA最低的比例，进行相关灵敏度检测。分析方法是将2ng/μL的阴/阳性细胞株基因组DNA(阴性细胞株为293T，ATCC CRL-11268；阳性细胞株为Hela，ATCC CRL-1958，具体核酸提取步骤参照实施例2中步骤1)按照6个梯度的方式将两种细胞株基因组DNA混匀：1000：0.1、1000：0.2、1000：0.5、1000：1、1000：5、100：1、100：2.5、100：5，即阳性细胞株基因组DNA浓度为0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％。使用试剂盒分别在两种适配的仪器(ABI7500和天隆TL988)上对上述混合例样本进行平行重复检测，采用实施例2方法进行。检测结果如下表2所示，表2的检测结果显示本发明实施例提供的试剂盒和实施例2的检测方法在DNA浓度为2ng/μL的野生型DNA背景下的灵敏度为0.01％，检测灵敏度小于1％，其灵敏度较高。

表2灵敏度检测结果(FAM通道Ct)

实施例5

试剂盒的绝对灵敏度检测对比

检测本发明实施例1提供的试剂盒的绝对灵敏度；以公开号为CN108048566A(申请号CN201711392963.0，名称：一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒)的专利申请中的试剂盒及其检测检测方法作为对照。

实验方法：将甲基化septin9合成质粒分别稀释成10^-2ng/ml-10^-8ng/ml 7个浓度梯度作为DNA样品，各个浓度对应的拷贝数如表3所示。采用实施例1的试剂盒和实施例2的方法检测。结果如图1-图2所示。

表3拷贝数与质粒浓度对应表

浓度(ng/ml)

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

拷贝数/μl

103

102

101

100

10-1

10-2

10-3

根据图1结果可知，采用CN108048566A的试剂盒检测时，仅能检测到样本浓度为10^-3ng/ml(10²拷贝/μl)；而采用本发明实施例1的试剂盒检测时，样本浓度为10^-8ng/ml(10^-3拷贝/μl)时，扩增曲线呈光滑的S型，由此说明，本发明实施例1提供的试剂盒的灵敏度较CN108048566A的试剂盒有明显提升。

实施例6

特异性检测

特异性检测的方法是分别选取4例经二代测序验证为S9非甲基化核酸样本(A1-A4)，选取4例其他基因(BMP3)甲基化的DNA样本(A5-A8)，选取septin9甲基化阳性质控品2例(T1和T2，即生产出两批相同的阳性质控品，含septin 9基因甲基化的人基因组DNA、BSA和Buffer TE)，使用实施例1试剂盒分别在两种适配的仪器(ABI7500和天隆TL988)上进行检测，检测方法参考实施例2。检测结果如下表4所示，检测结果显示，除septin9阳性质控品T1和T2为阳性检测结果外，其他检测A1-A8均为甲基化septin9基因扩增阴性，检测结果与实际结果100％吻合，说明通过使用实施例1的试剂盒和实施例2的检测方法能够实现对甲基化septin9基因的特异性检测，表明本发明提供的试剂盒和检测方法的特异性较高。

表4特异性样本检测结果(FAM通道Ct)

实施例7

试剂盒的稳定性检测

反复冻融即试剂处于冷冻-解冻的循环过程，出现多次冻融现象。反复冷冻-解冻循环波动越剧烈，试剂中重结晶现象越严重，将严重影响试剂整体稳定性，从而极大影响检测结果。因而对本发明实施例1的试剂盒的反复冻融稳定性进行考察：使用三批次试剂盒在规定的储存条件下(即PCR试剂盒保存于-30℃～-10℃)，取出试剂盒反复冻融4次(S1-S5)，检测每次冻融后试剂盒的稳定性；将试剂盒放在冰箱4℃解冻后放回-20℃±5℃冷冻保存12h，反复冻融4次(S6-S10)，每次冻融检测1次。表5结果显示对阴/阳性质控品(T3/T4)检测的实验结果与实际结果基本一致，表明本发明的试剂盒在反复冻融4次的条件下的产品性能良好，测试结果灵敏度、特异性及精密度均能够满足质量的要求(见表5)。

表5稳定性检测结果(FAM通道Ct)

实施例8

试剂盒与市售产品检测对比

通过将本发明实施例1试剂盒与市售产品1(人septin9基因甲基化检测试剂盒，江苏为真生物医药技术股份有限公司)以及市售试剂盒2(septin9基因甲基化检测试剂盒，博尔诚(北京)科技有限公司)进行检测对比，经本发明和市售产品转化核酸样本经紫外分光光度计测量浓度后统一稀释至10ng/μL计，再进行荧光定量PCR检测，具体步骤严格按照产品说明书操作。

采用市场上常用的试剂盒(其说明书进行相应检测操作)和本发明实施例2方法进行对比实验，结果从图3中对比分析可知，对同一样本检测时，本发明试剂盒的检测结果准确度与市售试剂盒检测结果一致，但曲线荧光值更高，检测图S型更标准，说明本发明的试剂盒和检测方法优于市售试剂盒效果；通过对阴性样本检测对比分析可知，本发明试剂盒及对比试剂盒检测均没有S型曲线，综合考虑，说明本发明试剂盒与市售试剂盒检测结果相比，优于市售产品检测结果。

实施例9

环境对检测试剂盒的影响实验

由于本发明试剂盒旨在应用于临床检测，因此为了验证试剂盒的检测结果是否受环境因素的影响，分别在日常办公区(总面积为200平方米，共容纳50人，不限制他们的活动(可随意走动或说话等))，环境温度为27℃，湿度为77％和空气洁净度等级为1，百万级洁净室对200个已知样本(阴性样本100个，阳性样本100个)进行取样，采用实施例1的试剂盒和实施例2的方法在两个区域分别进行3次重复试验，结果见下表6。

表6

以上结果可以看出，采用本发明试剂盒针对办公区和洁净区取样的检测正确率均能达到97％以上，表明本发明提供的试剂盒和方法能够抵抗环境因素的影响。

实施例10

比较不同引物序列和探针序列的扩增效率

设计不同的特异性引物和探针序列，具体如下表7所示。并按表7中引物和探针进行随机组合，用于针对阳性质控品样本进行荧光PCR扩增检测。因随机组合的组数较多(3⁶＝729)，此处仅展示三种组合(见表8)的检测结果。各种组合的检测条件均相同，参考实施例2的检测方法进行。针对上述三种组合，进一步进行灵敏度和特异性验证，具体操作步骤参考实施例5、6。检测结果如下表9和图4所示。

表7引物和探针序列表

表8引物和探针组合

表9特异性样本检测结果(FAM通道Ct)

由上表检测结果可看出，使用组合1进行检测的结果与对应样本一致，表现其良好的检测特异性，而使用组合2的引物和探针进行检测时，会出现假阳性结果(具体为正常样本A3、BMP3甲基化样本A5)，使用组合3的引物和探针进行检测时，会出现假阴性的检测结果，为有效避免检测结果的假阴性及假阳性出现，综合考虑，组合1的引物和探针检测特异性最佳。

检测结果图4显示，组合1的具有更典型“S”型扩增曲线，其Ct值较小，表明其扩增效果更好，组合1包括：内参引物：β-actin-F2(SEQ ID NO.1)和β-actin-R2(SEQ ID NO.4)，内参探针：β-actin-P3(SEQ ID NO.7)；septin9引物：septin9-F1(SEQ ID NO.10)和septin9-R1(SEQ ID NO.13)；septin9探针：septin9-P1(SEQ ID NO.16)；Blocker序列：Blocker-3(SEQ ID NO.19)及保护探针：保护探针-1(SEQ ID NO.22)。该组合即为实施例1的septin9基因甲基化检测的试剂的组合方式。由此说明，本发明实施例1提供的septin9基因甲基化检测的试剂盒中的所用引物和探针序列其相比于其他序列在扩增效果上更佳，结果准确率更高。

实施例11

检测保护探针和Blocker序列对检测结果的影响

1.保护探针和Blocker序列的有效性考察

以实施例10的组合1作为基础，根据保护探针和Blocker序列的有无，设置5个试验组(1-5)，各组差异见表10(表中“√”表示使用了该成分；“-”代表未使用)。其他检测条件完全相同的情况下，同时检测3个样本(样本1为阴性样本，样本2和3为阳性样本)，每个样本检测3次，另为确保结果的准确性，将样本同期进行二代测序验证(试验组6)，实验结果同时记录在表11中。

表10试验组1-5所用的引物和探针

表11不同试验组的检测结果

从上表11的检测结果可看出同时存在保护探针和Blocker序列的试验组5与测序组(试验组6)的检测结果完全一致，仅试验组5检测结果正确率为100％，其他试验组在样本检测中均有假阴性/假阳性结果发生，说明加入保护探针和Blocker序列可有效提高检测特异性、灵敏度及准确性，提高检测结果的准确性。

实施例12

比较本发明Blocker(第五核酸分子，SEQ ID NO.19)对检测结果的影响。

设置对比Blocker序列，如下：

GCGCTAACTAAAACGCCGCGCCCGCG-Spacer C3。

分别使用SEQ ID NO.19的Blocker序列和上述对比Blocker序列，并参考实施例2的方法，检测已知的6个阳性样本(Y1-Y6)及3个阴性样本各(Y7-Y9)3次，试验结果如下表12所示。

表12不同试验组的检测结果

从表12中可以看出，以SEQ ID NO.19的序列作为Blocker序列，其检测结果准确率较高，几乎为100％准确，而对比Blocker序列，在检测Y3样本时出现假阴性结果，在检测Y7和Y9样本时出现假阳性结果。实施例13

本发明中核酸保护剂的使用时为了有效保护提取到的核酸的有效生理活性，同时保护剂中添加的有效保护成分，可降低亚硫酸氢盐转化过程中DNA的损耗，并且极大缩短硫化时间，提高效率。为验证核酸保护剂的使用效果，按如下设置分组：试验组：核酸保护试剂含有：

对照组1：

核酸保护试剂含有：Tris 10mM，EDTA 50mM，NaCl 0.5M，甘油30％(体积百分比)、SDS 0.5％，羟甲基甘氨酸钠2％(质量百分比)。对照组2：核酸保护试剂含有：4％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(水溶性维生素E、质量百分比)、62％四氢呋喃糠醇(体积百分比)、3％聚乙二醇二甲醚(体积百分比)、0.8％肉桂醛(体积百分比)、0.07mg/ml芸香苷(质量百分比)、0.12％四氢嘧啶(质量百分比)，0.02mM二硫苏糖醇，0.3％咪唑烷基脲(质量百分比)，8％BSA(体积百分比)和12％甘油(体积百分比)。

对照组1核酸保护试剂：Tris 10mM，EDTA 50mM，NaCl 0.5M，甘油30％(体积百分比)，SDS 0.5％，羟甲基甘氨酸钠2％(质量百分比)。

对照组2核酸保护试剂：TE缓冲液，0.5mM乙二胺四乙酸，0.5M海藻糖。

空白对照组：以超纯水作为核酸保护试剂。

采用实施例2的方法检测10个样本(样本同实施例6)，重复3次，各组差异仅在于使用的核酸保护试剂不同。试验结果如下表13所示。

表13不同试验组的检测结果

由上表13的检测结果可看出，使用试验组的保护剂进行转化后检测，检测的结果与对应样本一致，表现其良好的检测特异性，而使用对照组1的保护剂进行转化后检测时，会出现假阳性结果(具体为正常样本A1、A2、A4；BMP3甲基化样本A5、A7)及假阴性结果(具体为阳性质控品T1)，对照组2的检测结果也会出现假阴性(具体为正常样本A1、A3；BMP3甲基化样本A6)检测结果，当使用超纯水作为空白对照进行检测对比时，发现检测误差更大。说明，使用本发明实施例3提供的试剂盒和实施例2的方法能够有效避免检测结果的假阴性及假阳性出现。

综上，本发明实施提供的试剂、试剂盒和方法具有如下优点：

1、产品性能指标优异，通过相关试剂的使用，增加了试剂盒使用的便利性和通用性，即使样本中含有未甲基化DNA、甘油三酯、血清白蛋白、胆固醇、尿素、红细胞等，对检测结果无影响。

2、无创便捷，仅需采集5ml外周血(或2mL血浆)，取样方便，创伤微小，人群接受度高，无需指定品牌采血管。

3、可自动化，可配套全自动核酸提取纯化仪使用，轻松实现样本PCR前的自动化处理，节省人力，提高检测通量和速度，同时降低检测误差。

4、经济灵活，自主研发硫化等试剂，添加保护成分，降低亚硫酸氢盐转化过程中DNA的损耗，同时极大缩短硫化时间，开封稳定性强，降低检测成本，提高了DNA的回收率。

5、准确，兼容性强，采用了甲基化特异性引物、探针、保护探针及Blocker，四管齐下，可耐受高浓度的野生背景DNA以及非甲基化基因的干扰，严格控制非特异性条带的扩增，实现高度复杂入组标准情况下仍具出色特异性和灵敏度表现，可兼容多种PCR平台和耗材，PCR试剂可经多次反复冻融。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 益善生物技术股份有限公司

<120> 基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggggagttt ttggtttggt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtagatgtaa gagtaggtgt ga 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattgaggta gtagtgatag tggtg 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acaaatacca accaacccca at 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccacctccct aaactaactc aatatca 27

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atacaaatac caaccaacca cc 22

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttgggggtg tttggtttag gtgttatgtt 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacataacac actaaccaac aacccaacca 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttggtggtg ttgtgttagt gtgtatgttt 30

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttttcgcgc gattcgttg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgaggaggt gggaagggat 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gggtagtggg ggttaatttg ttt 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgaaataatc ccatccaact 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatcccatcc aactacgcgt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

accaacccaa cacccacctt 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtcggatttc gcggttaa 18

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catccaacta cgcgttaacc gcgaa 25

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaataatccc atccaactac gcgttaaccg 30

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cccatccaac tacacattaa ccacaaaatc caac 34

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cacattaacc acaaaatcca acataat 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tccgaaataa tcccatccaa ctacgcg 27

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cagcctaaag cgccaatt 18

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgcgttaacc gcgaaatccg acata 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgcgttaacc gcgaaatccg acata 25

Claims

1.一种基因甲基化检测的试剂，所述基因为septin9基因，其特征在于，所述试剂包括第一核酸分子和第二核酸分子，其中，所述第一核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述第二核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2.根据权利要求1所述的基因甲基化检测的试剂，其特征在于，所述试剂还包括第三核酸分子和第四核酸分子，其中，所述第三核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述第四核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

3.根据权利要求2所述的基因甲基化检测的试剂，其特征在于，所述第三核酸分子的一端具有荧光报告基团，另一端具有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2所述的基因甲基化检测的试剂，其特征在于，所述试剂还包括第五核酸分子，所述第五核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

5.一种基因甲基化检测的方法，所述基因为septin9基因，其特征在于，其包括：将经亚硫酸盐处理后的核酸样本与权利要求1-4任一项所述的试剂混合，进行PCR反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应的体系中，第一核酸分子的浓度为：0.35-0.45mM/μl，优选为0.4mM/μl；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应的体系中，第三核酸分子的浓度为：0.15-0.25mM/μl，优选为0.2mM/μl；

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是以非疾病的诊断为目的。

9.一种基因甲基化检测的试剂盒，所述基因为septin9基因，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的基因甲基化检测的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸保护剂；所述核酸保护剂含有：6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、四氢呋喃糠醇、聚乙二醇二甲醚、肉桂醛、芸香苷、四氢嘧啶、二硫苏糖醇、咪唑烷基脲、BSA和甘油；

优选的，所述核酸保护剂包括：质量百分比为1％-10％的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、质量百分比为60％-80％的四氢呋喃糠醇、体积百分比为1％-10％的聚乙二醇二甲醚、体积百分比为0.5％-5％的肉桂醛、0.05-0.1mg/ml芸香苷、质量百分比为0.1％-1.5％的四氢嘧啶、0.01mM-0.5mM二硫苏糖醇、质量百分比为0.1％～0.5％的咪唑烷基脲、体积百分比为5％-30％的BSA和体积百分比为5％-30％的甘油。