CN106498038A - 一种快速进行dna末端修复和加接头的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术和应用领域，具体涉及一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法及应用。所述方法其特征在于采用包含高保真DNA聚合酶的混合液进行DNA末端修复、采用T4 DNA连接酶进行接头连接。本发明方法将DNA末端修复和加接头整体所需时间由2个半小时左右减少到40分钟左右，同时省去了中间的DNA纯化步骤，降低了试剂耗材成本，有效提高了DNA文库的制备效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法及应用。
背景技术
以Illumina测序平台为代表的下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS）试验中，在进行上机测序前，需要首先将DNA样本打断至一定长度，然后对打断的DNA样本进行末端修复、加接头等后续操作，完成文库制备。
目前，广泛使用的DNA打断方法包括机械法和酶法。机械法主要是超声波破碎法，如采用Covaris和Bioruptor公司的超声波破碎仪进行超声波打断；酶法打断主要是利用非特异性核酸酶如NEB公司的大片段酶等对DNA进行随机切断。
通过机械法和酶法打断的DNA其两端大多都会带有5’-或3’-凸出的粘性末端。要想对打断的带有粘性末端的DNA片段进行测序，首先必须对其末端进行修复，以满足接头连接的需要。
目前对DNA进行修复主要采用T4 DNA聚合酶或Klenow片段酶及T4多聚核苷酸激酶。T4 DNA聚合酶或Klenow片段酶具有5’-3’ DNA聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性，可以在dNTP存在的情况下，将DNA片段的5’-粘性末端进行补平，同时可以切除凸出的3’-末端。T4多聚核苷酸激酶可在ATP存在的条件下，在DNA的5’-末端加入磷酸基团。通过以上过程，可以完成对打断DNA的末端修复。
修复后的DNA具有平末端，可以进一步利用没有外切酶活性的Klenow片段酶在DNA的3’-末端加A，利用T4 DNA连接酶连接5’末端带有T的接头，进行TA连接。
目前各种DNA测序文库制备试剂盒中的DNA末端补平和加接头都是基于以上原理，多采用TA连接法加接头。不同试剂盒采用不同的反应缓冲液，但共同目的都是使实验步骤更简单，操作时间更短，同时制备高效率的DNA文库。
但是由于DNA 3’-末端加A与DNA的核酸外切酶活性相冲突，目前对打断的DNA进行平末端化和加A需要分开进行，同时中间需要进行纯化，再加上连接接头的过程，大概需要2.5小时左右。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法及应用，所述的方法进行末端修复和加接头仅需40 min左右，有效提高了DNA制备的效率。
为解决上述技术问题，本发明的具体实施方式提供了一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法，本方法采用以下技术方案：
本发明提供一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法，所述方法采用包含高保真DNA聚合酶的混合液进行DNA末端修复、采用T4 DNA连接酶进行接头连接。
本发明采用同样具有5′-3′DNA 聚合酶活性和3′-5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶进行末端补平和修复，该酶在65-75 ℃时才具有活性。
本发明采用平末端连接法进行接头连接，经高保真DNA聚合酶修复后的DNA无需进行加A反应，直接利用T4 DNA连接酶连接一端为平末端的接头。
本发明所采用的平末端连接接头的方法在末端补平后无需进行纯化，可直接利用补平修复后的产物进行连接，高保真DNA聚合酶虽然依然存在于连接反应体系中，但因连接反应的适宜温度为16-22 ℃，而此时高保真DNA聚合酶几乎没有活性，所以不会干扰DNA与接头的连接反应而无需纯化。
本发明选取高保真DNA聚合酶最适合的反应条件，即对反应缓冲液体系、反应温度及反应时间进行控制，已优化DNA末端修复的效果，并缩短实验反应时间。
第二方面，本发明提供一种用于DNA末端补平和修复的包含高保真DNA聚合酶的混合液，所述混合液包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液和去离子水。
优选地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液中高保真DNA聚合酶浓度为0.05-0.2U/μL，例如可以是0.05 U/μL、0.1 U/μL、0.15 U/μL或0.2 U/μL，进一步优选为0.1 U/μL。
优选地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液所包含的dNTPs中的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的浓度比为1:1:1:1，所述dNTPs总浓度为0.4-2 mM，例如可以是0.4 mM、0.8 mM、1.6mM或2 mM，进一步优选为0.8 mM。
优选地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液所包含的反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和MgSO4。
优选地，所述Tris-HCl浓度为5-60 mM，pH值为pH8.0-pH9.0，例如可以浓度是5mM、20 mM、40 mM或60 mM，pH值可以是pH8.0、pH8.5、pH8.8或pH9.0，进一步优选为40 mM，pH8.8。
优选地，所述KCl浓度为10-40 mM，例如可以是10 mM、20 mM、30 mM或40 mM，进一步优选为20 mM。
优选地，诉述(NH4)2SO4浓度为10-50 mM，例如可以是10 mM、20 mM、30 mM、40 mM或50 mM，进一步优选为20 mM。
优选地，所述MgSO4浓度为0-10 mM，例如可以是0 mM、4 mM或10 mM，进一步优选为4 mM。
优选地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液为10 μL，包括如下组分：
加去离子水至10 μL。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液的使用方法，所述方法包括如下步骤：
(1) 取10 μL包含经过随机打断的待修复的DNA样本4-12 ng置于PCR管；
(2) 向步骤(1)中包含DNA样本的PCR管中加入10 μL包含高保真DNA聚合酶的混合液，涡旋混匀；
(3) 将步骤(2)包含DNA样本和混合液的PCR管置于可控温装置，设置反应温度为72 ℃反应10 min。
优选地，步骤(2)所述打断DNA样本与混合液的体积比优选为1:1。
优选地，步骤(3)所述可控温装置，可为烘箱、水浴锅、PCR仪等，进一步优选为PCR仪；所述反应温度为65-75 ℃，例如可以是65 ℃、 68 ℃、72 ℃或75 ℃，进一步优选为72℃；所述反应10 min可为反应5-20 min，例如可以是5 min、10 min或20 min，进一步优选为10 min。
第四方面，本发明提供一种采用T4 DNA连接酶进行接头连接。
优选地，所述T4 DNA连接酶在进行加接头反应的反应体系中含量为100 U-700 U，例如可以是100 U、175 U、350 U、525 U或700 U，进一步优选为350 U。
优选地，所述采用T4 DNA连接酶进行接头连接，其特征在于所述接头为一端为平末端。
优选地，所述采用T4 DNA连接酶进行接头连接，其方法包括如下步骤：
(1) 利用第三方面步骤(3)的PCR反应管继续配置连接反应体系，
连接体系为：
| 末端修复反应产物 | 20 μL |
| T4 DNA连接酶 | 1 μL |
| T4 DNA连接酶缓冲液 | 10 μL |
| 10 μM接头1 | 2 μL |
| 10 μM接头 2 | 2 μL |
| 去离子水 | 65 μL |
总反应体系为100 μL。
(2) 将步骤(1)中的PCR反应管置于反应装置，22 ℃连接30 min。
第五方面，本发明提供一种快速进行DNA末端修复和加接头的试剂盒，所述试剂盒包含如第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液及第四方面所述的T4 DNA连接酶及其缓冲液。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的方法，或第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液，或第五方面所述的试剂盒在DNA片段末端补平修复及接头连接实验如高通量测序文库制备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1) 本发明将DNA末端修复及加接头整体实验所需时间由2.5小时左右减少到40 min左右，省去一步纯化步骤，节约了工作时间，降低了试剂耗材成本，提高了文库制备效率；
(2) 本发明采用高保真DNA聚合酶替代T4 DNA聚合酶Klenow片段酶进行末端补平和修复，前者较后二者相比，可达到相同实验效果，但成本更低廉；
(3) 本发明采用平末端连接接头的方法，省去了加A步骤，无需T4多聚核苷酸激酶，进一步降低了成本，缩短了反应时间；
(4) 本发明方法可用于所有基于Illumina测序平台的DNA文库构建，同时可应用与其他类型的DNA补平修复及连接实验。
具体实施方式
为进一步阐述本发明目的、技术方案和优点，下面结合本发明的优选实施例对本说明进行详细的阐述，但本发明并非局限于本实施例范围内。
实施例中未注明具体技术条件的，按照本领域内的文献或产品说明书所描述的技术条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为本领域常规产品。
实施例1
(1) 将待修复的拟南芥DNA样本打断，取打断样本5 ng置于 PCR管，用去离子水稀释至终体积10 μL。
(2) 配置包含高保真DNA聚合酶的混合液，组成成分如下：
| 组分 | 终含量 |
| Tris-HCl（pH8.8） | 40 mM |
| KCl | 20 mM |
| (NH4)2SO4 | 20 mM |
| MgSO4 | 4 mM |
| dNTP | 0.8 mM |
| 高保真DNA聚合酶 | 1 U |
加去离子水至终体积为10 μL。
(3) 将步骤(2)配置的混合液加入步骤(1)的含有待修复样本的PCR管，在PCR仪上72 ℃反应10 min，完成DNA末端修复。
(4) 向步骤(2)末端修复样品中加入连接体系（总体积80 μL）如下：
| 组分 | 体积 |
| T4 DNA连接酶 | 1 μL |
| T4 DNA连接酶缓冲液 | 10 μL |
| 10 μM接头1 | 2 μL |
| 10 μM接头 2 | 2 μL |
| 去离子水 | 65 μL |
将步骤(4)配置的连接反应体系置于PCR仪，22 ℃连接30 min，完成DNA加接头。
综上所述，本发明利用高保真DNA聚合酶进行DNA末端补平修复，利用T4 DNA连接酶进行平末端加接头反应，整个DNA末端补平修复及加接头实验过程仅需40 min左右，省去中间纯化步骤，节约了工作时间，降低了试剂耗材成本，提高了文库制备效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例对本发明进行具体阐述，但本发明并不局限于上述实施例。本领域技术人员对本发明的任何改进，对产品原料的等效替换及辅助成分的添加，具体实施方式的选择等，都属于本发明的保护范围和公开范围内。
Claims (14)
1.一种快速进行DNA末端修复和加接头的方法其特征在于采用包含高保真DNA聚合酶的混合液进行DNA末端修复、采用T4 DNA连接酶进行接头连接。
2.根据权利要求1所述包含高保真DNA聚合酶的混合液，其特征在于所述混合液包含高保真DNA聚合酶、dNTPs，反应缓冲液和去离子水。
3.根据权利要求2所述包含高保真DNA聚合酶的混合液，其特征在于所包含的高保真DNA聚合酶浓度为0.05-0.2 U/μL，优选为0.1 U/μL。
4.根据权利要求2所述包含高保真DNA聚合酶的混合液，其特征在于所包含的dNTPs中的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的浓度比为1:1:1:1，所述dNTPs总浓度为0.4-2 mM，优选为0.8mM。
5.根据权利要求2所述包含高保真DNA聚合酶的混合液，其特征在于所包含的反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和MgSO4；
所述Tris-HCl浓度为5-60 mM，pH值为pH8.0-pH9.0，优选的，浓度为40 mM，pH8.8；
所述KCl浓度为10-40 mM，优选的为20 mM；
诉述(NH4)2SO4浓度为10-50 mM，优选的为20 mM；
所述MgSO4浓度为0-10 mM，优选的为4 mM。
6.根据权利要求1-5所述包含高保真DNA聚合酶的混合液，其特征在于所述混合液为10μL，包括如下组分：
加去离子水至10 μL。
7.一种权利要求2-6所述的所述包含高保真DNA聚合酶的混合液的使用方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
取10 μL包含经过随机打断的待修复的DNA样本4-12 ng置于0.2 μL PCR管；
向步骤(1)中包含DNA样本的PCR管中加入10 μL包含高保真DNA聚合酶的混合液，涡旋混匀；
将步骤(2)包含DNA样本和混合液的PCR管置于可控温装置，设置反应温度为72 ℃反应10 min。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于步骤(2)所述打断DNA样本与混合液的体积比优选为1:1。
9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于步骤(3)所述可控温装置，可为烘箱、水浴锅、PCR仪等，优选为PCR仪；所述反应温度为65-75 ℃，优选为72 ℃；所述反应10 min可为反应5-20 min，优选为10 min。
10.根据权利要求1所述采用T4 DNA连接酶进行接头连接，其特征在于所述T4 DNA连接酶在进行加接头反应的反应体系中含量为100 U-700 U，优选为350 U。
11.根据权利要求1所述采用T4 DNA连接酶进行接头连接，其特征在于所述接头其中一端为平末端。
12.一种权利要求1、10、11所述的采用T4 DNA连接酶进行接头连接，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 利用权利要求7步骤(3)的PCR反应管继续配置连接反应体系；
连接体系为：
总反应体系为100 μL；
将步骤(1)中的PCR反应管置于反应装置，22 ℃连接30 min。
13.一种快速进行DNA末端修复和加接头的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求2-6所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液，权利要求10-11所述的T4 DNA连接酶及其反应缓冲液。
14.根据权利要求1所述的方法在DNA片段末端补平修复及接头连接实验如高通量测序文库制备中的应用。
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