KR101940900B1 - 표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되고 하나 이상의 탈아미노화 염기(deaminated base)를 함유하는 제1 인접 서열(flanking sequence) 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제2 인접 서열 영역을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 핵산 분자 및 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제를 인큐베이팅하여 상기 표적 서열 영역의 5' 말단과 가장 근접한 탈아미노화 염기로부터 상기 핵산 분자의 5' 말단까지의 제1 인접 서열 영역을 제거하는 단계를 포함하는, 표적 핵산 분자를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 이중 가닥 핵산 분자 및 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제를 포함하는, 표적 핵산 분자 생성용 조성물을 제공한다.

Description

표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물{Method for producing target nucleic acid molecules and composition therefor}
본 발명은 표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
현재 마이크로어레이 기반 유전자 합성 기술의 경우, 합성물의 농도가 femtomole 수준으로 낮아 PCR을 통해 합성 산물의 농도를 높이는 과정이 요구된다. 이를 위해, 일반적으로 유전자 합성 단계에서 프라이머 결합 영역을 함께 합성하고, 이 영역 내에 제한 효소 인식 서열을 삽입하여 추후 프라이머 결합 영역의 제거에 사용하고 있다.
제한 효소는 특정한 뉴클레오티드 서열을 인식하여 그의 내부 또는 근처에서 DNA를 절단하는 효소로, 통상적으로 4 내지 8개의 염기를 인식한다. 표적 핵산 내부에의 제한 효소 인식 부위의 존재는 표적 핵산을 온전히 분리하는데 장애가 될 수 있다. 온전한 형태의 표적 핵산을 수득하기 위해서 합성 서열에 따른 제한 효소 선택의 번거로움이 존재한다.
또한, 제한 효소의 반응 산물에 대해 특별한 처리 과정이 요구될 경우 시간과 비용의 문제를 야기할 수 있다. 유전자 합성 산물로부터 더 긴 길이의 핵산 분자를 제조하기 위하여 유전자 조립(gene assembly) 과정을 거치는데, 제한 효소의 반응 산물이 sticky end를 가질 경우 blunt end 형태로 만들기 위한 추가적인 과정이 요구된다.
이에, 제한 효소를 이용한 종래의 방법과 달리, 서열 독립적으로 핵산을 절단하여 표적 핵산 분자를 생성하는 방법을 고안하였다.
일 양상은 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되고 하나 이상의 탈아미노화 염기(deaminated base)를 함유하는 제1 인접 서열(flanking sequence) 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제2 인접 서열 영역을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 이용하여 표적 핵산 분자를 생성하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 이중 가닥 핵산 분자 및 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제를 포함하는, 표적 핵산 분자 생성용 조성물을 제공한다.
일 양상은, (a) 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되고 하나 이상의 탈아미노화 염기를 함유하는 제1 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제2 인접 서열 영역을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 핵산 분자 및 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제를 인큐베이팅하여 상기 표적 서열 영역의 5' 말단과 가장 근접한 탈아미노화 염기로부터 상기 핵산 분자의 5' 말단까지의 제1 인접 서열 영역을 제거하는 단계를 포함하는, 표적 핵산 분자를 생성하는 방법을 제공한다.
상기 제1 인접 서열 영역은 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 탈아미노화 염기를 가질 수 있다. 상기 제1 인접 서열 영역에서 상기 하나 이상의 탈아미노화 염기는 1개 이상의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 탈아미노화 염기는 이노신 또는 우라실일 수 있다.
상기 탈아미노화 염기가 이노신일 경우, 하나 이상의 이노신은 서로 3 내지 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 인접 서열 영역에서 3개의 이노신이 서로 5개 및 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 또한, 상기 제1 인접 서열 영역에서 4개의 이노신이 4개, 3개, 및 5개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 탈아미노화 염기가 우라실일 경우, 하나 이상의 우라실은 1개 이상의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다.
상기 탈아미노화 염기 중 적어도 하나는 상기 제1 인접 서열 영역의 3' 말단으로부터 세 번째 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 예를 들면, 상기 탈아미노화 염기 중 적어도 하나는 상기 제1 인접 서열 영역의 3' 말단에 위치한 뉴클레오티드, 상기 제1 인접 서열 영역의 3' 말단으로부터 두 번째에 위치한 뉴클레오티드, 또는 상기 제1 인접 서열 영역의 3' 말단으로부터 세 번째에 위치한 뉴클레오티드 내에 포함될 수 있다.
상기 탈아미노화 염기가 이노신일 경우, 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 V일 수 있다. 엔도뉴클레아제 Ⅴ는 데옥시이노신 3'-엔도뉴클레아제로 명명되기도 하는 효소이다. 엔도뉴클레아제 V는 DNA 단일 또는 이중 가닥에서 데옥시이노신의 염기인 히포크산틴(hypoxanthine)을 인식하여 주로 인식된 염기의 3'-측에 있는 두 번째 또는 세 번째 포스포디에스테르 결합을 가수분해하는 결과 '닉(nick)'을 생성한다. 상기 이노신-특이 엔도뉴클레아제는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 엔도뉴클레아제 V 또는 대장균 유래 엔도뉴클레아제 V일 수 있다.
상기 탈아미노화 염기가 우라실일 경우, 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제는 우라실-특이 절제 시약(Uracil-Specific Excision Reagent: USER)일 수 있다. USER는 우라실이 있는 위치에서 단일 뉴클레오티드 갭(gap)을 생성하는 효소이다. USER는 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)와 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 Ⅷ의 혼합물을 의미한다. UDG는 우라실 염기의 절제를 촉매하여, 어베이직(abasic) 부위를 형성하고 포스포디에스테르 골격 구조를 그대로 남긴다. 엔도뉴클레아제 Ⅷ의 리아제 활성은 이 어베이직 부위의 3' 및 5' 측에서 포스포디에스테르 골격을 깸으로써 염기 없는 데옥시리보오스가 방출되게 한다.
상기 이중 가닥 핵산 분자는 상기 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되는 제3 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제4 인접 서열 영역을 포함하는 주형 핵산 분자를, 하나 이상의 탈아미노화 염기를 함유하고 상기 제4 인접 서열 영역에 결합(anneal)하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 얻은 산물일 수 있다.
상기 주형 핵산 분자는 생물체로부터 분리된 것, 핵산 라이브러리로부터 분리된 것, 또는 분리된 핵산 단편을 유전공학적 방법에 의해 변형하거나 조합하여 수득된 것, 화학적으로 합성된 것, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 주형 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
상기 주형 핵산 분자는 마이크로어레이 기반 합성을 통해 생성된 것일 수 있다. 마이크로어레이 기반 합성은 고체 기판 상에 센티미터 내지 마이크로미터 수준의 합성 스폿(spot) 간격을 두고 고정되어 있는, 동일, 유사, 또는 상이한 종류의 여러 생화학 분자들을 동시에 병렬적으로 합성하는 기술을 의미한다.
상기 주형 핵산 분자를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 상기 주형 핵산 분자 중 제4 인접 서열 영역에 결합하며, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 탈아미노화 염기를 가질 수 있다. 상기 탈아미노화 염기는 이노신 또는 우라실일 수 있다.
상기 프라이머 서열에서 상기 탈아미노화 염기가 이노신일 경우, 하나 이상의 이노신은 서로 3 내지 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 서열에서 3개의 이노신이 서로 5개 및 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 또한, 상기 프라이머 서열에서 4개의 이노신이 4개, 3개, 및 5개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 프라이머 서열에서 상기 탈아미노화 염기가 우라실일 경우, 하나 이상의 우라실은 1개 이상의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다.
상기 프라이머 세트는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드, 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드, 각각 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드, 각각 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드, 또는 각각 서열번호 15 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 방법은, (c) 상기 제1 인접 서열 영역이 제거된 핵산 분자 및 3'→ 5' 엑소뉴클레아제를 인큐베이팅하여 단일 가닥의 제2 인접 서열 영역을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제일 수 있다.
상기 방법 중 상기 (b) 단계 및 (c) 단계는 하나의 단계에서 수행될 수 있다. 상기 (b) 단계 및 (c) 단계는, 상기 이중 가닥 핵산 분자, 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제, 및 상기 엑소뉴클레아제를 포함하는 반응물을 (b) 단계를 위한 인큐베이팅 온도에서 인큐베이팅한 후 뒤이어 (c) 단계를 위한 인큐베이팅 온도까지 낮추어 인큐베이팅함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 이중 가닥 핵산 분자, 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제, 및 상기 엑소뉴클레아제를 포함하는 반응물을 36℃ 내지 65℃, 38℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 58℃, 40℃ 내지 55℃, 또는 40℃ 내지 50℃에서 20분 내지 40분 동안, 25분 내지 35분 동안, 예를 들면, 30분 동안 인큐베이팅하고, 뒤이어 20℃ 내지 30℃, 22℃ 내지 28℃, 또는 23.5℃ 내지 26.5℃에서 15분 내지 25분 동안, 18분 내지 23분 동안, 예를 들면, 20분 동안 인큐베이팅함으로써 하나의 단계로 수행될 수 있다.
다른 양상은, 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되고 하나 이상의 탈아미노화 염기를 함유하는 제1 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제2 인접 서열 영역을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자; 및 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제를 포함하는, 표적 핵산 분자 생성용 조성물을 제공한다.
상기 제1 인접 서열 영역은 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 탈아미노화 염기를 가질 수 있다. 상기 제1 인접 서열 영역에서 상기 하나 이상의 탈아미노화 염기는 1개 이상의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 탈아미노화 염기는 이노신 또는 우라실일 수 있다. 상기 탈아미노화 염기가 이노신일 경우, 하나 이상의 이노신은 서로 3 내지 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 탈아미노화 염기가 우라실일 경우, 하나 이상의 우라실은 1개 이상의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치될 수 있다. 상기 탈아미노화 염기 중 적어도 하나는 상기 제1 인접 서열 영역의 3' 말단으로부터 세 번째 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다.
상기 탈아미노화 염기가 이노신일 경우, 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 V일 수 있다. 엔도뉴클레아제 V에 대해서는 전술된 바와 같다. 상기 탈아미노화 염기가 우라실일 경우, 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제는 우라실-특이 절제 시약 (USER)일 수 있다. 상기 우라실-특이 절제 시약에 대해서는 전술된 바와 같다.
상기 조성물 중 이중 가닥 핵산 분자는, 상기 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되는 제3 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제4 인접 서열 영역을 포함하는 주형 핵산 분자를, 하나 이상의 탈아미노화 염기를 함유하고 상기 제4 인접 서열 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 얻은 산물일 수 있다. 상기 주형 핵산 분자에 대해서는 전술된 바와 같다. 상기 주형 핵산 분자는 마이크로어레이 기반 합성을 통해 생성된 것일 수 있다. 상기 주형 핵산 분자를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 대해서는 전술된 바와 같다.
상기 조성물은 3'→ 5' 엑소뉴클레아제를 더 포함할 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제일 수 있다.
일 양상에 따른 표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물은 합성 생물학 및 분자 생물학 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1a는 일 양상에 따른 표적 핵산 분자를 생성하는 방법에 대한 개략적인 모식도를 나타낸다.
도 1b는 일 양상에 따른 표적 핵산 분자를 생성하는 방법에 있어서 이중 가닥 핵산 분자를 생성하는 과정을 나타낸다.
도 2a는 이노신-함유 프라이머 및 절단 효소를 이용한 단계별 전기영동 결과를 나타낸다.
도 2b는 우라실-함유 프라이머 및 절단 효소를 이용한 단계별 전기영동 결과를 나타낸다.
도 3은 여러 온도 조건에서의 두 효소의 활성을 나타낸다.
도 4는 정제 과정의 생략 및 혼합 완충액의 사용 가능성을 나타내는 실험 결과이다.
도 5a는 일 양상에 따른 One shot 반응의 모식도를 나타낸다.
도 5b는 여러 온도 조건에서 One shot 반응을 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 이노신 -함유 프라이머를 이용한 절단 실험
1.1. DNA 단편 및 프라이머 세트의 제조 및 PCR
마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)의 게놈 DNA로부터 CustomArray의 반도체-기반 전기화학적 산 생성 어레이(semiconductor-based electrochemical acid production array)를 이용하여 140 bp의 단일 가닥 DNA 단편 257개를 제조하였다. 각 단편은 표적 서열의 양 말단에 인접하는, 프라이머 어닐링을 위한 공통 서열(서열번호 9 및 10)을 갖는다. 100 bp 길이의 표적 서열 내에 위치한 80 bp 길이의 중첩 영역에 따라 257개의 단편이 20개 세트의 카세트로 분류되었다.
또한, 공통 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머 세트를 제조하였다. 프라이머 세트는 공통 서열 중 하나 이상의 구아닌이 이노신으로 치환된 것으로 CP 프라이머 세트로 명명하였다. 모든 프라이머가 Integrated DNA Technology (Coralvile, IA, USA)에 의해 주문 제작되었다. 제작된 CP 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112017017086734-pat00001
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, CP 1 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)의 경우, 3' 말단의 티민 바로 앞에 하나의 이노신을 갖는다. CP 2 프라이머 세트(서열번호 3 및 4) 및 CP 3 프라이머 세트(서열번호 5 및 6)의 경우, 3개의 이노신이 순차적으로 5개 및 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 위치한다. CP 3 프라이머 세트는 CP 2 프라이머 세트와 달리 3' 말단에 데옥시이노신을 갖는다. CP 4 프라이머 세트(서열번호 7 및 8)의 경우, 4개의 이노신이 순차적으로 4개, 3개, 및 5개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치되어 있다.
제조된 DNA 단편 및 CP 프라이머 세트를 이용하여 Taq DNA 폴리머라제(Thermo Scientific)에 의한 PCR을 수행하였다. 0.7 ng의 M. genitalium 게놈 DNA 및 1 pM의 각 CP 프라이머 세트를 함유하는 50 ㎕ 용액을 95℃에서 2분간 반응시키고, 뒤이어 95℃에서 30초, 어닐링 온도의 경우 프라이머에 따라 달리하여 20초, 및 72℃에서 30초로 이루어진 10 내지 15 사이클을 수행한 후, 72℃에서 2분간 반응시켰다. QIAGEN MinElute PCR purification kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제한 후 15 ㎕로 용리하였다.
1.2. 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 반응 및 서열 확인
700 ng의 DNA를 함유하는 정제된 PCR 산물과 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima: Tma) 유래의 엔도뉴클레아제 V(Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot Germany, 5 U/㎕)를 65℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 정제하여 15 ㎕로 용리하였다.
그 후, 3'→ 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 T4 DNA 폴리머라제(Thermo Scientific, 5 U/㎕)를 이용하여 11℃에서 20분 또는 실온에서 5분간 반응시켰다. 2.5%의 아가로스 겔에서 120 V로 60 내지 90분간 고해상도 전기영동을 수행하여 DNA 단편의 크기 및 양을 확인하였다.
서열 분석을 위하여, 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal; New England Biolabs)를 처리하여 5' 말단 및 3' 말단의 포스페이트를 제거하였다. All in One PCR 클로닝 키트(Biofact)를 이용하여 제조사의 지시대로 양 말단의 포스페이트가 제거된 20 ng/㎕의 DNA 1 ㎕를 TOPO 클로닝한 후 Sanger 시퀀싱을 수행하였다(Macrogen Inc.). 또한, 낮은 비용으로 다수의 colony에 대한 서열정보를 얻기 위하여 모든 colony를 하나의 튜브에 모아 액체 LB 배지에서 세포를 배양한 후 Geneall Exprep plasmid mini kit를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 플라스미드의 클로닝 부위 주변 서열로부터 프라이머를 설계하여 증폭 산물이 타겟 서열을 포함하도록 하였다. Illumina MiSeq을 통한 시퀀싱 분석을 수행하는 업체에 증폭 산물을 의뢰하여 수만 개의 템플릿에 대한 시퀀싱 결과를 얻었다.
도 1a는 일 양상에 따른 표적 핵산 분자를 생성하는 방법에 대한 개략적인 모식도를 나타낸다.
도 1b는 일 양상에 따른 표적 핵산 분자를 생성하는 방법에 있어서 이중 가닥 핵산 분자를 생성하는 과정을 나타낸다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 주형 핵산 분자는 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되는 제3 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제4 인접 서열 영역을 포함하고, 탈아미노화 염기를 함유하는 프라이머 세트가 상기 제4 인접 서열 영역에 결합하여 상기 주형 핵산 분자의 증폭 반응이 일어날 수 있다.
도 2a는 이노신-함유 프라이머 및 절단 효소를 이용한 단계별 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 4는 각각 공통 프라이머 세트, CP 1 프라이머 세트, CP 2 프라이머 세트, 및 CP 3 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물을 나타낸다. 레인 5 내지 8은 각각 레인 1 내지 4의 PCR 산물과 Tma Endo V와의 반응에 의해 얻어진 산물을 나타낸다. 레인 9 내지 12는 레인 5 내지 8의 산물과 T4 DNA 폴리머라제와의 반응에 의해 얻어진 산물을 나타낸다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, CP 1 프라이머 세트의 경우, 절단된 단편과 절단되지 않은 단편이 혼재하였다 (레인 10). CP 2 및 CP 3 프라이머 세트의 경우, 100 bp의 최종 산물이 생성되었다 (레인 11 및 12). 각 최종 산물을 Sanger 시퀀싱한 결과, 각각 73.7%(CP 2) 및 93.8%(CP 3)가 절단된 것으로 확인되었다.
또한, CP 4 프라이머의 경우, Sanger 시퀀싱 결과 100%가 절단된 것으로 확인되었고, 다음과 같이 Illumina Mi-Seq을 통해 절단 성능을 다시 확인하였다. 하기 표 2에 그 결과를 나타내었다. F, R은 Forward 프라이머, Reverse 프라이머를 의미하고, Cut 또는 Uncut은 각 프라이머의 이노신 염기 부위에서 절단되었거나 절단되지 않은 리드(read) 수를 나타낸다. 샘플 1 및 샘플 2는 동일 조건에서 병렬적으로 수행된 두 실험군을 의미한다. 샘플 1의 일루미나 시퀀싱 결과, 총 리드수 95365개 중 F 및 R 프라이머 부분이 정확하게 절단되고 표적 서열만 남겨진 리드수가 94631개이며, R 프라이머 부분이 잘리지 않은 리드수가 732개이고, F 프라이머 부분이 절단되지 않은 리드수가 2개였다. 샘플 2의 일루미나 시퀀싱 결과, F 및 R 프라이머 부분이 정확하게 절단되고 표적 서열만 남겨진 리드수가 88649개이며, R 프라이머 부분이 잘리지 않은 리드수가 361개이고, F 프라이머 부분이 절단되지 않은 리드수가 815개였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 98.97%의 주형이 성공적으로 절단되었다. 1.03%의 경우, 프라이머 제작시 발생된 오류에 기인한 것으로 추정된다. 이를 통해, 본 발명의 표적 핵산 분자를 생성하는 방법이 대용량 실험에서도 효과적으로 작동한다는 것을 확인하였다.
Figure 112017017086734-pat00002
실시예 2: 우라실 함유 프라이머를 이용한 절단 실험
2.1. 프라이머 세트의 제조 및 PCR
실시예 1에 전술된 바와 같은 마이코플라즈마 제니탈리움 유래 DNA 단편을 주형으로 하고 하기 표 3에 기재된 서열을 갖는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 프라이머 세트는 하나 이상의 우라실을 포함하는 것으로 UP 프라이머 세트로 명명하였다. 제작된 UP 프라이머 세트를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112017017086734-pat00003
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, UP 1 프라이머 세트(서열번호 11 및 12)의 경우, 3' 말단에 하나의 우라실을 갖는다. UP 2 프라이머 세트(서열번호 13 및 14) 의 경우, 3' 말단으로부터 다섯 번째 또는 세 번째 위치에 하나의 우라실을 포함하며, UP 3 프라이머 세트(서열번호 15 및 16)의 경우, 2개의 우라실이 6개 또는 7개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치되어 있다.
10 μM의 M. genitalium 게놈 DNA 1㎕, 25 pmol의 각 UP 프라이머 세트, KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix (2X) 25㎕를 함유하는 50 ㎕ 용액을 95℃에서 2분간 반응시키고, 뒤이어 98℃에서 20초, 58℃에서 15초, 및 72℃에서 30초로 이루어진 11 사이클을 수행한 후, 72℃에서 2분간 반응시켜 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 크기는 140 bp로 일정하였다.
2.2. 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 반응 및 서열 확인
2.1에서 얻은 PCR 산물 50 ㎕, 10X CutSmart buffer 10 ㎕, 및 USER 효소 (NEB) 10 ㎕가 혼합된 반응 용액 100 ㎕을 37℃에서 20분간 인큐베이팅한 후 정제하여 12 ㎕로 용리하였다. 용리액 10 ㎕, 10X End Repair reaction buffer 2㎕, End Repair enzyme mix (NEB) 1㎕를 함유하는 반응 용액 20 ㎕를 20℃에서 30분간 반응시킨 후 정제하여 12 ㎕로 용리하였다. 2.5%의 아가로스 겔에서 120 V로 60 내지 90분간 고해상도 전기영동을 수행하여 DNA 단편의 크기 및 양을 확인하였다.
도 2b는 우라실-함유 프라이머 및 절단 효소를 이용한 단계별 전기영동 결과를 나타낸다. UP3은 우라실-함유 프라이머 세트 UP 3을 이용한 PCR 산물 (140 bp)을 나타낸다. USER는 USER 효소에 의해 절단된 산물을 나타내며, END는 End Repair 효소에 의해 blunt end를 갖게 된 절단 산물 (100 bp)을 나타낸다. 총 83개의 절단 산물에 대한 Sanger 시퀀싱 분석 결과, 99 bp 이하의 산물이 6개 (7.2%)이고 100 bp 산물이 77개 (92.8%)로 나타나, 우라실-함유 프라이머 및 USER 효소에 의해 모든 핵산 단편이 절단된 것을 확인하였다.
실시예 3: 효소 반응 조건의 확장
3.1. 온도 변화에 따른 활성 시험
Tma Endo V 및 T4 DNA 폴리머라제에 대하여 다양한 온도 조건하에 활성을 시험하였다.
도 3은 여러 온도 조건에서의 두 효소의 활성을 나타낸다.
Tma Endo V의 경우, 65℃의 권장 인큐베이션 온도보다 다양한 온도 조건에서 인큐베이션을 시험하였다. 레인 1 내지 4는 각각 25℃, 35℃, 50℃, 및 65℃에서 각각 인큐베이팅하여 얻은 산물에 공통으로 T4 DNA 폴리머라제를 첨가하여 25℃에서 20분간 반응시킨 후 전기영동을 수행한 결과이다. 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, Tma Endo V는 35℃ 이하의 온도에서는 거의 활성을 나타내지 않았고 (레인 1 및 2), 50℃ 및 65℃에서 활성을 나타내었다.
T4 DNA 폴리머라제의 경우, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내기 위한 권장 인큐베이션 조건은 11℃, 20분 또는 실온에서 5분이다. 그러나, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 권장 조건보다 다양한 온도 조건, 즉, 25℃, 35℃, 50℃, 및 65℃에서 T4 DNA 폴리머라제는 활성을 유지하였다 (레인 5 내지 8).
3.2. 정제 과정의 생략 및 혼합 완충액의 사용 가부 시험
PCR 산물의 정제 단계는 염, 뉴클레오티드, 효소 및 프라이머 등 PCR 산물 자체 이외의 성분들을 제거하기 위하여 사용된다. DNA 시료를 세정(clean-up)하는 것은 다음 단계의 효소 처리 과정을 위해서도 요구된다. 대용량 실험에서 정제 단계는 막대한 비용을 소모시키고 완전한 자동화에 어려움을 야기한다. 따라서, 정제 과정을 생략할 수 있다는 것은 소요되는 시간과 비용을 절감시킬 수 있어 사용자에게 유리하다.
도 4는 정제 과정의 생략 및 혼합 완충액의 사용 가능성을 나타내는 실험 결과이다. CP 3 프라이머 세트를 이용하여 140 bp의 증폭 산물을 얻은 후, Tma Endo V를 처리하고(레인 2), 뒤이어 정제 과정을 거치거나(레인 4) 거치지 않은 상태에서(레인 3) T4 DNA 폴리머라제를 처리하였다. 또한, 레인 5 내지 8의 경우, Tma Endo V의 완충 용액 및 T4 DNA 폴리머라제의 완충 용액이 혼합된 혼합 완충액(BM) 중에서 인큐베이팅한 후 반응 산물을 비교하였다. B+는 T4 DNA 폴리머라제의 완충 용액을 한번 더 첨가한다는 것을 의미한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 레인 3과 4를 비교한 결과, T4 DNA 폴리머라제 첨가 전 정제 과정을 생략하는 것이 절단에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 또한, 혼합 완충액의 사용이 두 효소의 활성을 저해하지 않는다는 것을 확인하였다.
3.3. One shot 반응
3.2.에 나타낸 바와 같이, 정제 과정의 생략 또는 혼합 완충액의 사용이 효소 활성에 영향을 미치지 않으므로, 두 효소 및 기질을 함께 넣어 One shot 반응을 수행하는 것을 고려하였다. 이 반응을 위한 최적 온도 및 시간을 알아보았다.
주형 기질 700 ng, 5 unit의 Tma Endo V, 1 ㎕의 T4 DNA 폴리머라제 및 dNTP, 및 완충 혼합액을 섞어 총 100 ㎕의 반응액을 제조하였다.
도 5a는 일 양상에 따른 One shot 반응의 모식도를 나타낸다.
도 5b는 여러 온도 조건에서 One shot 반응을 수행한 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 4는 각각 50℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 25℃에서 20분간 인큐베이션, 40℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 25℃에서 20분간 인큐베이션, 40℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 12℃에서 20분간 인큐베이션, 및 45℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 25℃에서 20분간 인큐베이션을 수행한 결과이다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, One shot 반응을 위한 최적 조건은 40℃에서 30분간 인큐베이팅한 후 25℃에서 20분간 인큐베이션이었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation Celemics, Inc. <120> A method for producing target nucleic acid molecules and a composition therefor <130> SDP2017-1001 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP1_F <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <400> 1 gtgccttggc agtctcant 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP1_R <220> <221> modified_base <222> (21) <223> i <400> 2 cgtggatgag gagccgcagt nt 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP2_F <220> <221> modified_base <222> (3) <223> i <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <400> 3 gtnccttgnc agtctcant 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP2_R <220> <221> modified_base <222> (5) <223> i <220> <221> modified_base <222> (13) <223> i <220> <221> modified_base <222> (21) <223> i <400> 4 cgtgnatgag ganccgcagt nt 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP3_F <220> <221> modified_base <222> (3) <223> i <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <400> 5 gtnccttgnc agtctcan 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP3_R <220> <221> modified_base <222> (5) <223> i <220> <221> modified_base <222> (13) <223> i <220> <221> modified_base <222> (21) <223> i <400> 6 cgtgnatgag ganccgcagt n 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP4_F <220> <221> modified_base <222> (3) <223> i <220> <221> modified_base <222> (8) <223> i <220> <221> modified_base <222> (12) <223> i <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <400> 7 gtnccttngc antctcant 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP4_R <220> <221> modified_base <222> (3) <223> i <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (14) <223> i <220> <221> modified_base <222> (19) <223> i <400> 8 tgnatgagna gccncagtnt 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common_F <400> 9 gtgccttggc agtctcagt 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common_R <400> 10 acactgcggg ctcctcatcc acg 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP1_F <400> 11 gtgccttggc agtctcagu 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP1_R <400> 12 cgtggatgag gagccgcagt gu 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP2_F <400> 13 gtgccttggc agtcucagt 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP2_R <400> 14 cgtggatgag gagccgcagu gt 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP3_F <400> 15 gtgccutggc aguctcag 18 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP3_R <400> 16 cgtggaugag gagcugcagt g 21

Claims (21)

  1. (a) 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되고 하나 이상의 탈아미노화 염기(deaminated base)를 함유하는 제1 인접 서열(flanking sequence) 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제2 인접 서열 영역을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산 분자, 상기 탈아미노화 염기-특이 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 포함하는 반응물을 36℃ 내지 65℃에서 인큐베이팅하고 뒤이어 20℃ 내지 30℃에서 인큐베이팅하여, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단과 가장 근접한 탈아미노화 염기로부터 상기 핵산 분자의 5' 말단까지의 제1 인접 서열 영역을 제거한 후 단일 가닥의 제2 인접 서열 영역을 제거하는 단계를 포함하되,
    상기 이중 가닥 핵산 분자가 상기 표적 서열 영역, 상기 표적 서열 영역의 5' 말단에 연결되는 제3 인접 서열 영역 및 상기 표적 서열 영역의 3' 말단에 연결되는 제4 인접 서열 영역을 포함하는 주형 핵산 분자를, 상기 제4 인접서열 영역에 결합하며 하나 이상의 탈아미노화 염기를 함유하는 제1 인접 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 얻은 산물이고,
    상기 하나 이상의 탈아미노화 염기가 3 내지 8개의 뉴클레오티드 간격을 두고 배치되는 것인 표적 핵산 분자를 생성하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 주형 핵산 분자는 마이크로어레이 기반 합성을 통해 생성된 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 탈아미노화 염기가 이노신 또는 우라실인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 탈아미노화 염기가 이노신이고, 상기 이노신-특이 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제 V인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 이노신-특이 엔도뉴클레아제가 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래 엔도뉴클레아제 V 또는 대장균 유래 엔도뉴클레아제 V인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 탈아미노화 염기가 우라실이고, 상기 우라실-특이 엔도뉴클레아제가 우라실-특이 절제 시약(Uracil-Specific Excision Reagent: USER)인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상의 탈아미노화 염기가 2 또는 3개인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 인접서열과 상기 제2 인접서열은 서열번호 1 내지 14의 서열을 가지는 프라이머 세트에서 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제가 T4 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  11. 삭제
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