CN113026113B - 缓冲液组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了缓冲液组合物及其应用，其中，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5‑25mMol通用Tris缓冲液、5‑20mMol通用二价阳离子、75‑150mMol通用一价阳离子、0.05‑2质量％表面活性剂和0.5‑2mMol二硫苏糖醇(DTT)，pH8‑10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33‑66mM连接Tris缓冲液，0.5‑5mM连接二价阳离子、0.5‑10mM二硫苏糖醇(DTT)、5‑15％PEG4000‑8000和0.5‑2mM ATP，pH值为7‑9。由此，该缓冲液组合物能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

Description

缓冲液组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及缓冲液组合物及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液组合物、一种试剂盒，以及一种构建核酸文库的方法。

背景技术

对基因组DNA进行二代测序及相应的生物信息学分析，已经在医学健康领域和科技服务领域广泛应用。

二代测序文库的构建的一般流程如下：对目的DNA片段化；对片段化DNA进行末端平齐化处理；在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。现有的缓冲液体系样本兼容性差、也难以兼容不同的建库步骤，需要频繁更换缓冲液，延长了文库构建的时间，并且，转化效率低。而文库构建的目的即为在片段化DNA片段两段加上接头。而文库转化率(即双端加上接头的分子数与投入分子数的比值)为测得产量与理论最高产量质检的比值，即有多少起始样本被最终转化为两段接有接头的片段。转化率很大程度上受连接效率的影响，连接反应效率与酶反应效率、DNA链末端开放性、供体和受体的碰撞效率等多个因素相关，同时在连接反应体系中的接头还会产生自连消耗反应中的有效接头数量，是文库构建过程中的一个效率瓶颈。目前市场上通用的快速连接缓冲液其连接反应平台期高度有限，存在增大酶投入量以克服缓冲体系不匹配等情况，提高了实际应用的成本；另外在现有的连接缓冲液下连接时间无法向前推动酶反应平衡；且在预混过程中会产生大量错配降低了文库产量，限制了高通量工作流程的搭建。

由此，现有的建库中的通用缓冲液和连接缓冲液有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种缓冲液组合物，其中，通用缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，而连接缓冲液有利于提高连接反应效率，降低错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种缓冲液组合物。根据本发明的实施例，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5-25mM通用Tris缓冲液、5-20mM通用二价阳离子、25-150mM通用一价阳离子、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-5mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15％ PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。

根据本发明实施例的缓冲液组合物，通用缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。而连接缓冲液增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。由此，本发明实施例的通用缓冲液和连接缓冲液组成的缓冲液组合物，能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

另外，根据本发明上述实施例的缓冲液组合物还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述通用二价阳离子和所述连接二价阳离子均为Mg²⁺或Ca^{2 +}。

根据本发明的实施例，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，为Tris-醋酸缓冲液。

根据本发明的实施例，所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-x-100)。

根据本发明的实施例，所述通用缓冲液包括5-25mMol通用Tris缓冲液、8-14mMMg²⁺、40-60mM Na⁺和40-60mM K⁺、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。

根据本发明的实施例，所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-3mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15％ PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7.5-8.5。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的缓冲液组合物。由此，本发明实施例的试剂盒包含前述的通用缓冲液和连接缓冲液，具有前述通用缓冲液和连接缓冲液的全部技术特征和技术效果，进而，本发明实施例的试剂盒能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发明的实施例，该构建核酸文库的方法包括：将核酸样本在前述的通用缓冲液中进行所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理，以便得到连接腺苷酸的核酸；以及将诉讼连接腺苷酸的核酸在前述的通用缓冲液中进行接头连接反应，以便得到接头连接产物。由此，本发明实施例的构建核酸文库的方法是利用前述的通用缓冲液和连接缓冲液，具有前述通用缓冲液和连接缓冲液的全部技术特征和技术效果，进而，本发明实施例的试剂盒能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

根据本发明的实施例，所述末端修复前，进一步包括片段化处理，且所述片段化处理是在本发明任一项所述的缓冲液中进行的。

根据本发明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的。

根据本发明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。

根据本发明的实施例，所述接头连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为16-37摄氏度。

根据本发明的实施例，所述接头连接反应的连接酶为T4 DNA连接酶。

根据本发明的实施例，所述T4 DNA连接酶的浓度为4-6U。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种缓冲液组合物。根据本发明的实施例，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5-25mM通用Tris缓冲液、5-20mM通用二价阳离子、75-150mM通用一价阳离子、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-5mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15％ PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。

根据本发明实施例的缓冲液组合物包括通用缓冲液和连接缓冲液，其中，通用缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。而连接缓冲液增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。由此，本发明实施例的通用缓冲液和连接缓冲液组成的缓冲液组合物，能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低，在连接短接头，加入片段筛选的时候会提高筛选的分辨率和均一性，进而提高最后产出文库的片段大小集中度和文库产量均一性。

在文库构建过程中，发明人研究发现，T4 DNA连接酶介导的连接反应依赖于二价阳离子的存在，尤其是Mg²⁺或Ca²⁺，其中，以Mg²⁺的效果更佳，同时，二价阳离子的浓度能够调节酶与底物的结合强度，从而调节连接反应的保真度。根据本发明的实施例，该通用二价阳离子和连接二价阳离子均为Mg²⁺或Ca²⁺。

根据本发明的实施例，该Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，该Tris缓冲液为Tris-醋酸缓冲液。由此，这两种缓冲液的样本兼容性和稳定性好，并且缓冲液在pH值7-9的范围内，缓冲能力强，维持体系pH值稳定。根据本发明的优选实施例，该缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。

根据本发明的实施例，该表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-x-100)。由此，有利于去除样本表明的蛋白等。根据本发明的实施例，所述通用缓冲液包括5-25mM通用Tris缓冲液、8-14mM Mg²⁺、40-60mM Na⁺和40-60mM K⁺、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。

此外，由于DNA文库所有腺苷酸化酶均显示出一定的偏好性，3’末端为嘧啶(dT或dC)比3’末端为嘌呤(dA或dG)的DNA片段更易被腺苷酸化，不完全腺苷酸化将导致DNA片段间的平末端连接反应，影响测序数据的基因组序列组装。

进一步地，本发明实施例缓冲液是构建DNA文库的方法使用相同流程兼容更多种类的样本和应用方向，可以实现在一台液体处理工作站上完成更多样本的文库构建，减少了处理过程中对机器、环境和人工操作精度的要求。

同时，根据本发明的一些实施例，该缓冲液对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用，在这些体系用酶量的1/5以下，能达到更高的连接效率，有利于关注底物转化效率的应用项目。并且，该缓冲液使该构建DNA文库的方法对投入的DNA纯度容忍度提高，在同样的操作条件能获得纯度更高的满足下游NGS文库构建的产物，降低了样本准入的纯度标准，适于用于高通量样本处理。

根据本发明的实施例，该连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-3mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15％ PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7.5-8.5。由此，该连接缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率；并且兼容性好，在一些实施例中，与通用缓冲体系配合使用，可以兼容打断、末端修复和加腺嘌呤(A)的过程，显著缩短了文库构建所需的时间，在一些具体的实施例中，仅需2小时就可以完成建库过程；并且，该缓冲液对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的一些实施例，连接缓冲液中，在PEG4000-8000的存在下，单价阳离子会促进连接反应，并且单价阳离子的存在能够提高T4 DNA连接酶的保真性，Mg²⁺或Ca²⁺抑制错配连接。发明人通过实验研究，在PEG存在的情况下优化缓冲液的成分，提高文库产量。

根据本发明的实施例，二硫苏糖醇的浓度为0.5-10mM，优选地，浓度为0.5-5mM，在该浓度下，二硫苏糖醇对酶的保护作用好，使酶的活性保持稳定。

进一步地，T4 DNA连接酶介导的连接反应分3步进行，其中第二步为单链末端反应，依赖单链末端的开放性。而PEG作为一种分子拥挤剂，能促进末端的物理分离，从而促进连接效率，同时也能促进接头间的连接。另外，Na⁺等一价阳离子会抑制T4 DNA连接酶的活性，而在建库过程的连接反应上游步骤中必不可免的需要Na+的存在且该体系中的Na+会进入连接反应一步，这与释放酶活，解除酶活抑制相矛盾。发明人研究发现，当连接反应中的PEG4000-8000，尤其是PEG6000，当浓度到达某个点时，在高浓度一价盐离子(150-200mMNaCl，200-250mM KCl)存在的情况下仍然能有效进行连接反应。发明人近一些对PEG4000-8000的浓度进行了摸索，根据本发明的实施例，PEG4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％时，在解除Na⁺等一价阳离子对酶活的抑制作用的同时，促进接头连接，提高连接效率。并且，根据本发明的实施例，PEG4000-8000为PEG4000和/或PEG6000时，尤其是PEG6000，对酶活抑制的解除作用更佳，接头连接效率显著提高。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的缓冲液组合物。由此，本发明实施例的试剂盒包含前述的通用缓冲液和连接缓冲液，具有前述通用缓冲液和连接缓冲液的全部技术特征和技术效果，进而，本发明实施例的试剂盒能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发明的实施例，该构建核酸文库的方法包括：将核酸样本在前述的通用缓冲液中进行所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理，以便得到连接腺苷酸的核酸；以及将诉讼连接腺苷酸的核酸在前述的通用缓冲液中进行接头连接反应，以便得到接头连接产物。由此，本发明实施例的构建核酸文库的方法是利用前述的通用缓冲液和连接缓冲液，具有前述通用缓冲液和连接缓冲液的全部技术特征和技术效果，进而，本发明实施例的试剂盒能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

由于核酸样本通常长度比较长，并且，通常在末端修复前需要进行片段化处理，也就是说，如根据本发明的一些实施例，该方法在末端修复前进一步包括片段化处理，且该片段化处理是在前述的缓冲液中进行的。由于前述的通用缓冲液具有良好的兼容性和稳定性，可以兼容多种片段化处理的核酸样本，例如，该片段化预处理可以为酶切或机械打断。需要说明的是，该片段化预处理与后续的末端修复和加腺苷酸尾可以是连续进行的。

根据本发明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的。

发明人研究发现，通过采用耐高温聚合酶，使聚和反应在较高的温度下即可进行，并且，发明人对该末端修复和加腺苷酸尾处理的反应条件进行了反复的摸索，发现当末端修复和加腺苷酸尾处理的条件是27-37摄氏度，5-30分钟，具体地，可以是该温度和时间条件下的任意组合，末端修复的温度还可以是28、29、31、33、36、37、38和39摄氏度，时间还可以是7、9、10、11、13、17、19、23、26、28和29分钟；70-75摄氏度，10-20分钟，具体地，可以是该温度和时间条件下的任意组合，加腺苷酸尾的温度还可以是71、73和74摄氏度，时间还可以是9、10、11、13、16、17和19分钟，该条件下DNA片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好，并且，该条件不仅适用于非打断DNA，还适用于打断DNA，对打断DNA的末端修复效果也很好，可以对多种样本兼容处理；进一步地，根据本发明的优选实施例，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件：32-37℃，时间为8-14分钟；温度为72-75℃，时间为10-12分钟更优地，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件可以是：温度为37℃，时间为10分钟；温度为75℃，时间为10分钟。由此，末端修复和加腺苷酸尾效率进一步提高，偏好性更低，稳定性更佳，样本兼容性更好。

根据本发明的实施例，该接头连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为16-37摄氏度。由此，连接效率和文库产量高。

根据本发明的实施例，该接头连接反应的连接酶为T4 DNA连接酶。根据本发明的实施例，所述T4 DNA连接酶的浓度为4-6U。由此，在保证连接效率的基础上，酶的浓度低，使反应的成本更低。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

构建DNA文库的一般流程和条件：

(1)打断末端修复和加腺苷酸尾

其中，通用缓冲液包括5-25mM通用Tris缓冲液、5-20mMol通用二价阳离子、25-150mM通用一价阳离子、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mMol二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。

(2)加接头

连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-5mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15体积％PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。

(3)纯化：1×磁珠纯化，适量洗脱液洗脱后进行PCR。

*DNaseI为可选择成分，在做转录组测序建库或机械打断时以5U T4PNK和2.5Uklenow片段代替DNaseI。

该构建DNA文库的一般流程和条件均适用于下述实施例中。

实施例1

本实施例中，采用本发明实施例的连接缓冲液体系，配方为：45mM Tris缓冲液，3mM二价阳离子、50mM一价阳离子、5mM二硫苏糖醇(DTT)、10％ PEG4000-8000和1.5mM ATP，pH值为8，研究反应条件的变化对建库结果的产量的影响，结果如下：

不同连接时间的连接效率统计

如上表所示，本发明实施例的连接体系在6摄氏度过夜连接时连接效率达到77.29％，到达了平台期。在固定连接时间十分钟时，优先连接温度为20摄氏度。并且该缓冲液体系表现为随时间延长，连接效率升高。该连接反应温度为16-37摄氏度，优先为16摄氏度至30摄氏度，更优选为20摄氏度。该连接反应时间为10min-过夜连接，连接效率随时间的延长而升高，综合考虑反应的效率问题，连接时间为10分钟至16小时，更优先地，连接时间为10min、30min或1h。

实施例2

本实施例中，分别采用本发明实施例的缓冲液组合(通用缓冲液和连接缓冲液)，及其与市售的blue通用缓冲液和quick new连接缓冲液为通用缓冲液构建DNA文库不同体系下的连接效率统计

其中，Blue缓冲液和quick new缓冲液均由安诺伦生物公司提供。

其中，通用缓冲液的配方为10mM Tris-HCl缓冲液、10mM MgCl₂、50mM KCl、50mMNaCl、1％ Triton-x-100和1mM DTT；连接缓冲液的配方为33-66mM Tris-醋酸缓冲液，6mMMg²⁺、5mM二硫苏糖醇(DTT)、8％ PEG6000和1mM ATP，pH值为8。

如上表所示，当连接反应进行10min时，其连接效率为0.5×blue+1×rapidligation buffer体系的2倍。当连接反应6摄氏度过夜进行时，其连接效率为0.5×blue+1×rapid ligation buffer体系的2.6倍。

实施例3

将实施例2的本发明实施例的缓冲液用于肿瘤用药NGS测序建库环节，采用真实ctDNA样本，将本发明实施例的缓冲液与KAPA hyper试剂进行比较。

分别利用本发明实施例2的缓冲液与KAPA hyper试剂对两组ctDNA样本按照前述文库构建的方法进行文库构建，各组均以10ng样本起始，8个PCR循环数。从图中明显看出，采用本发明实施例2的缓冲液的6组建库浓度高。实施例2的缓冲液表现出相比于KAPAhyper试剂更高的文库产量，说明实施例2的缓冲液在降低反应时间的同时提高了片段转化率，有利于ctDNA样本低频突变的检测。

将上述文库分别取250ng，4杂1方式进行杂交捕获目的片段，next-seq550ARPE150测序策略进行测序，产出数据约8G/样本，利用本发明实施例的缓冲液进行建库得到的测序深度约2000X，能满足ctDNA 0.5％低频突变的分析，并且略高于KAPA hyper。

实施例4

将本发明实施例2的缓冲液用于血液病用药检测测序建库环节，采用标准品NA12878基因组DNA作为样本，将本发明实施例的缓冲液与KAPA hyper建库试剂进行比较。

分别利用本发明实施例的缓冲液与KAPA hyper试剂按照前述文库构建的方法进行文库构建，各组起始样本均为200ng，6个PCR循环数，采用本发明实施例的缓冲液的组表现出较高的文库产量，说明本发明实施例的缓冲液有利于提高了转化效率，有利于血液病基因检测。

将获得的文库，采用血液病基因芯片杂交捕获，并且使用next-seq550AR PE75测序手段测序，每个样本2G。相同数据量需求，获得本发明实施例的测序深度达到1400X，能满足1％突变位点检测需求，且该深度与KAPA hyper plus相当。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种构建核酸文库的方法，其特征在于，包括：

将核酸样本在下述通用缓冲液中进行末端修复和加腺苷酸尾处理，以便得到连接腺苷酸的核酸；以及将连接腺苷酸的核酸在下述通用缓冲液中进行接头连接反应，以便得到接头连接产物；

所述末端修复前，进一步包括片段化处理，且所述片段化处理是在下述任一缓冲液中进行的；其中，

所述通用缓冲液包括5-25mMol通用Tris缓冲液、8-14mMolMg²⁺、40-60mMolNa⁺和40-60mMolK⁺、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mMol二硫苏糖醇，pH8-10；

所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚；

所述通用缓冲液同时兼容打断和/或末端修复、加腺嘌呤(A)的连续过程；

所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-3mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7.5-8.5；

所述连接二价阳离子为Mg²⁺或Ca²⁺；

所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris缓冲液为Tris-醋酸缓冲液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为16-37摄氏度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头连接反应的连接酶为T4DNA连接酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T4DNA连接酶的浓度为4-6U。

8.一种缓冲液组合物用于权利要求1所述的构建核酸文库方法的用途，其特征在于：

所述缓冲液组合物中的通用缓冲液，应用于该核酸样本的末端修复和加腺苷酸尾处理中；

所述缓冲液组合物中的连接缓冲液，应用于该连接腺苷酸的核酸的接头连接反应中；

所述缓冲液组合物中的任一缓冲液，应用于所述末端修复前，进一步包括片段化处理中使用；

其中，

所述通用缓冲液包括5-25mMol通用Tris缓冲液、8-14mMolMg²⁺、40-60mMolNa⁺和40-60mMolK⁺、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mMol二硫苏糖醇，pH8-10；

所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚；

所述通用缓冲液同时兼容打断和/或末端修复、加腺嘌呤(A)的连续过程；

所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-3mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7.5-8.5；

所述连接二价阳离子为Mg²⁺或Ca²⁺；

所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液。

9.一种缓冲液组合物用于权利要求8所述的构建核酸文库方法的用途，其特征在于：所述Tris缓冲液为Tris-醋酸缓冲液。