CN111945232A - 构建rrbs文库的y型接头、试剂盒及方法 - Google Patents

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CN111945232A CN202010881059.1A CN202010881059A CN111945232A CN 111945232 A CN111945232 A CN 111945232A CN 202010881059 A CN202010881059 A CN 202010881059A CN 111945232 A CN111945232 A CN 111945232A
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Abstract

本发明提供了一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。该Y型接头包括：甲基化接头1：5'‑acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1‑3'；甲基化接头2：5'‑n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac‑3'；其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。该接头有助于提高测序数据产出，同时提高酶切效率的评估及其准确性。

Description

构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子育种领域，具体而言，涉及一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。
背景技术
RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing)，即简并代表性亚硫酸氢盐测序技术，是一种用于基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析的高效的高通量测序技术。其原理即利用限制性内切酶MspI与片段选择相结合的方式富集基因组中高GC区域，再通过亚硫酸氢盐测序方法，得到基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析结果。
目前的建库方案由以下几个步骤组成：酶切---纯化---末端修复加A尾---连接接头---CT转化---回收目的片段。然而，现有的方法所构建的文库获得测序数据后，通过生物信息学对酶切效率进行评估时，往往出现评估结果偏低的状况。对于此种状况，现有技术中尚无有效的解决方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法，以解决现有技术中酶切效率评估结果偏低的缺陷。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于甲基化文库构建的Y型接头，该Y型接头包括：
甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；
甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；
其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。
进一步地，保护碱基序列为6～8个随机碱基形成的序列。
进一步地，n2的碱基数目为2～4个。
进一步地，酶切位点粘性末端碱基为MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切产生的末端碱基。
进一步地，
甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；
甲基化接头2为：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3',
其中，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种构建RRBS文库的方法，该方法包括：采用内切酶及上述任一种Y型接头，对待测基因组DNA进行边酶切边连接接头，得到带接头片段；对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段；对目标长度片段进行CT转化，得到转化片段；对转化片段进行PCR扩增，得到RRBS文库。
进一步地，采用电泳切胶回收的方法对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段。
进一步地，对转化片段进行PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行纯化，从而得到RRBS文库。
根据本发明的第三个方面，提供了一种构建RRBS文库的试剂盒，该试剂盒包括Y型接头，Y型接头为上述任一种Y型接头。
进一步地，试剂盒还包括核酸内切酶，该核酸内酶产生的粘性末端的碱基与前述Y型接头中n2所示的酶切位点粘性末端碱基相同。
应用本发明的技术方案，一方面通过增加与测序引物的第一个碱基互补配对的碱基T，使得测序引物测得的第一个碱基为N的概率降低，提高测序数据产出，有助于提高酶切效率的评估及其准确性。另一方面通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有的RRBS文库构建的方法通过限制性内切酶，在酶切后通过末端修复加A尾，然后再利用A与接头末端T碱基互补配对的方法加上接头。发明人经分析发现，这种建库方法在末端修复加A的过程中会出现错配，而文库测序产生的测序数据在进行生物信息分析时，会根据酶切位点的碱基序列来评估酶切效率，因而这种末端修复产生的错配会降低酶切效率的评估结果。
针对上述原因，发明人对现有的Y型接头的结构进行了改进，具体思路如下：现有的小Y型接头+T(测序引物最后一个碱基与之互补配对，若去掉容易导致产出降低、测序第一个碱基位点含N，会大大降低酶切效率的评估)+碱基保护序列(通常测序前6个碱基的测序质量低，影响链接效率的评估和比对(mapping)计算，因此可以加上6个碱基的保护序列，但具体数目可以适当调整)+酶切位点粘性末端碱基(可以是3个，也可以根据不同的酶切位点比如，BglII、XmaI、TaqI做出调整)。并经过实验验证，改进后的Y型接头能够大大提高酶切效率的评估结果，从而使得评估结果更接近真实情况。
基于上述研究结果，申请人提出了本申请的改进方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种用于甲基化文库构建的Y型接头，Y型接头包括：
甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'(SEQ ID NO:1)；
甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'(SEQ ID NO:2)；
其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’均为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。
上述甲基化接头1中的前32位碱基和甲基化接头2中的后33位碱基，为现有的Y型接头序列中的一部分。甲基化接头1中的第33位碱基t和甲基化接头2中从3'端数第34位碱基a，是为了便于使测序引物的最后一个碱基与接头互补配对，该碱基的存在有助于提高数据产出，降低测序第一个碱基为N的概率，从而提高酶切效率评估结果的准确性。通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。
上述Y型接头中，保护碱基序列的具体长度虽然优选是6个碱基以上的，比如，优选为6～8个随机碱基形成的随机序列。但本申请也不排除在某些特殊情况下，也可以是少于6个碱基的，比如可以优选为4～8个随机碱基形成的序列。
上述酶切位点的粘性末端的碱基的数目根据内切酶种类及其识别序列和切割位置的不同而有所不同。在本申请一种优选的实施例中，上述n2的碱基数目为2～4个，比如可以是2个、3个、4个、5个或6个等。
根据酶切步骤中所使用的酶切酶种类的不同，上述Y型接头中的酶切位点粘性末端碱基可以选自BglII、XmaI、TaqI中任意一种酶酶切所产生的粘性末端碱基。这里粘性末端的碱基要根据选定的内切酶的种类来修改，不同的内切酶对应不同的粘性末端，比如，MSPI酶的粘性末端CG，BglII粘性末端是GATC。
在一种优选的实施例中，上述Y型接头具有以下序列：
甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'(SEQ IDNO:3)；
甲基化接头2为：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'(SEQ IDNO:4)；
其中，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c。
在本申请第二种典型的实施方式中，还提供了一种构建RRBS文库的方法，该方法包括：采用内切酶及上述任一种Y型接头，对待测基因组DNA进行边酶切边连接接头，得到带接头片段；对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段；对目标长度片段进行CT转化，得到转化片段；对转化片段进行PCR扩增，得到RRBS文库。
该RRBS文库的构建方法，通过采用本申请改进后的Y型接头，一方面通过增加与测序引物的第一个碱基互补配对的碱基T，使得测序引物测得的第一个碱基为N的概率降低，提高测序数据产出，有助于提高酶切效率的评估及其准确性。另一方面通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。
上述接头连接产物中对目标长度的片段进行选择的过程可以采用现有的方法，比如特定质量体积比的磁珠纯化或者电泳切胶回收纯化选择。在本申请中一种优选的实施例中，采用电泳切胶回收的方法对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段。
为尽量减少PCR过程中的酶和其他试剂成分对后续文库上机测序结果的不良影响，提高文库中目的片段的纯度，在一种优选的实施例中，对转化片段进行PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行纯化，从而得到RRBS文库。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种构建RRBS文库的试剂盒，该试剂盒包括Y型接头，Y型接头为上述任一种Y型接头。采用本申请的Y型接头，不仅能够提高数据产出，降低测序第一个碱基为N的概率，从而提高酶切效率评估结果的准确性。而且通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
(一)取样
按照建库任务单认真核对样品的诺禾编号、样品名称和样品状态是否与建库单标注一致，按顺序摆放样品，待样品全部溶化后短暂震荡、离心待取样。
根据建库任务准备200μL的EP管，按顺序添加相应体积的无RNase的H2O，根据建库任务单的取样体积依次取样(每个样品取3μg基因组DNA)，取样时再一次核对样品名称与诺禾编号，确认无误后取样，取完样品的EP管跟样品管一一对应好放在冰盒里，继续取下一个样品，所有样品取完后核对样品管顺序是否与EP管顺序一致，核对无误后拍照留存取样情况以备日后项目排查，将样品放置于-20℃暂保存(待第一天工作完成后归还样品组，并进行记录)。
(二)酶切
2.1酶切体系配置如下表。
表1：
Figure BDA0002654134250000051
2.2酶切反应
将上述反应体系充分混匀，瞬离，至于PCR仪上，反应程序如下表。
表2：
反应温度(℃) 反应时间
37 16h
80 20min
4 ∞
3、片段选择
3.1试剂准备
a、将胶槽、胶托、13孔的宽齿胶梳洗净并用纯水润洗一遍，擦干备用；
b、2％的低分子量琼脂糖凝胶配制(RRBS回收胶)：
13孔胶配制：用天平称取2g低分子量琼脂糖，溶于105mL 1X TAE Buffer中，待完全溶解后稍微冷却后倒胶，凝固1h；回收胶较软需跑胶前拔出梳子。
c、1X TAE提前过夜遇冷。
注意：制备回收胶时不需要加染料。
3.2点样准备
文库：每个样本80uL，加入16uL 6X loading buffer(SYBR染料)，每个胶孔上样量48uL，每个样本点2个点样孔。
分子标记：10uL 50bp标记+2uL 6X Loading Buffer，每个胶孔上样量10uL。
3.3电泳
a、将制好的回收胶放入电泳槽后，按照以下文库顺序开始点样：
b、分子标记—文库1—分子标记—文库1—分子标记—文库2—分子标记—文库2。
c、电压100V，150min。
3.4切胶
切胶范围175bp-400bp，同一个样本回收到同一个15mL的离心管中。注意：(1)每切一个胶孔换一个刀片；(2)防止切到接头自连带。
4、胶回收
(1)胶称重，记录每个回收胶的重量，然后加入3倍凝胶体积buffer QG进行溶胶，50℃水浴15min，每2-3min上下混匀一次。
(2)待胶完全溶解后，加1倍体积的异丙醇和10uL 3M NaAc，然后混匀、离心。
(3)将QIAquick spin column(吸附柱)置于2mL收集管中，每次最多加溶胶液720uL，室温静置5min，4000rpm离心1min。
(4)移液器重新吸取滤液至QIAquick spin column中，4000rpm离心1min，弃掉滤液。
(5)其余溶胶液重复(3)(4)直至所有的溶胶液过柱完成。
(6)加0.5mL Buffer QG到QIAquick spin column中，4000rpm离心1min，弃掉滤液。
(7)重复步骤(6)。
(8)加0.6mL Buffer PE到QIAquick spin column中，静止2min，4000rpm离心1min，弃掉滤液。
(9)重复步骤(8)。
(10)12000rpm空甩2min。
(11)用10uL移液器吸取吸附柱底部胶圈上残留的液体(不要触碰到吸附柱膜)，将QIAquick spin column转移到新的1.5mL EP管中，室温静止5min，加入20uL 50℃预热的NF-Water，金属浴50℃孵育5min，12000rpm离心1min。
(12)将滤液重新转移至QIAquick spin column中，金属浴50℃孵育5min，12000rpm离心1min。
(13)Qubit 3.0检测浓度。
5、CT转化
5.1转化试剂配制：
(1)准备CT转化试剂
EZ DNA Methylation-GoldTMKit中的CT转化Reagent是固体混合物，装在棕色管中，需避光保存。配制之前需要简单离心，配制时需加入900μL Nuclease-free H2O，300μLM-Dilution Buffer和50μL M-Dissolving Buffer，室温漩涡震荡10min，直至固体完全溶解，避光储存。
注意：配制好的CT转化试剂在4℃只能保存7天，在-20℃只能保存30天，建议最好现配现用。每次使用130μL，可做10个反应，每次实验前考虑好构建几个库，降低成本。
(2)按照试剂盒说明加入无水乙醇准备M-Wash Buffer(洗脱液)
(无水乙醇：M-Wash Buffer(洗脱液)＝4：1，比如:24ml M-Wash Buffer(洗脱液)中加入96ml无水乙醇。)
(3)λ-DNA预处理
a、取λ-DNA 1.5μg于0.5mL离心管中，补水至42uL，利用biorupter打断25个循环(on：30s；off：30s)，检测片段大小为200bp左右。
b、末端修复加A尾
在上述打断后的λ-DNA中加入末端修复mix。
表3：
试剂 体积
λ-DNA 42μl
缓冲液1 6.8μL
酶1 1.2μL
总体积 50μl
c、轻柔混匀。瞬时离心，PCR仪上进行反应：
表4：
温度 时间
37℃ 30min
72℃ 30min
4℃ Hold
后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。
d、接头连接
接头添加方法：酶与接头分开加到装有样品的PCR管中！！！(防止接头自连)
表5：
试剂 体积(μL)
λ-DNA 50
Buffer 2-1 8.4
buffer 2-2 15
增强子(Enhancer) 1.6
原始甲基化Y接头(见SEQ ID NO:5+6) 1
ddH<sub>2</sub>O 3
酶2 1
总体积 80
注：样本的接头与λ-DNA加入的接头不同(为普通的小Y接头，其中的C碱基都是甲基化修饰的)。
SEQ ID NO：5：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'；
SEQ ID NO：6：5'-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'。
e、轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上进行反应。
表6：
温度 时间
20℃ 30min
4℃ Hold
f、纯化
1)λ-DNA片断加接头完成后，将反应产物转至1.5mL离心管中，加入96μL AMPureXP Beads(1.2倍体积)，用移液器或涡旋震荡充分混匀，室温温育5min。
2)瞬离，将离心管置于磁力架上吸附磁珠5min，用移液器吸除上清液，不要吸到磁珠。
3)10μL枪头小心弃去残留上清，加入200μL 80％乙醇清洗一次，静置30s，弃去酒精，并用10μL量程的移液器吸干。
4)再次加入200μL80％乙醇，盖上离心管盖颠倒几次，将离心管从磁力架上取出瞬离后，重新放置在磁力架上，小心弃去酒精，并开盖晾干。
5)加入100μL水重悬磁珠，用移液器或涡旋震荡充分混匀，室温温育5min。
6)短暂离心，磁力架上吸附磁珠5min，用移液器转移100μL重悬液到新的EP管中，不要吸到磁珠。
7)取1μL用于Qubit检测。
8)补水至浓度0.1-0.2ng/μL左右。
注意：-20℃保存使用三个月。
5.2CT转化处理
(1)加130μL CT转化试剂到20μL DNA样品中(轻弹管底或用移液器来混匀样品。根据PCR仪的最大反应体系进行分装，保证反应体系不超过PCR仪的最大反应体系(例如，对于最大反应体系为50μL的PCR仪，需要将反应体系分装在2个PCR管里进行反应，每管75μL)。
(注意:每次加入的DNA范围在500pg到2μg之间，一次转化的最佳量为200-500ng，两次转化可以使用不超过1.5μg起始。如果DNA样品的体积小于20μL，则用NF-Water来弥补差量。)
(2)非常重要——经末端修复加A加接头后的λ-DNA加入(过柱后样本质量：λ-DNA＝200:1，严格控制比例)
(3)将样品管放到PCR仪中并按以下步骤操作：
表7：
温度 时间
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ hold
该步反应结束后平衡到室温进行下述操作或者在4℃下存储(最长20小时)
5.3过柱处理
(1)将Zymo-SpinTMIC Column放置在试剂盒提供的收集管中，并添加600μL的M-Binding Buffer(结合缓冲液)到柱子中。
(2)将步骤1中的反应液加入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTMIC Column中，盖上盖子将柱子颠倒数次来混合样品。注意:步骤1和步骤2不能颠倒。
(3)室温孵育3min，离心30秒(<5000rpm)，将管中的液体倒回至柱中再吸附一次，室温孵育2min，离心30秒(<5000rpm)，倒掉液体。
(4)加200μL M-Wash Buffer(洗脱液)到柱中，离心30秒(<5000rpm)，倒掉液体。
(5)加200μL M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20min。温育结束后，离心30秒(<5000rpm)，倒掉液体。
(6)加200μL的M-Wash Buffer(洗脱液)到柱中，8000rpm离心30秒，倒掉液体。重复一次。
(7)空甩1min(10000rpm)。
(8)将柱子放入新的1.5ml管，将盖子敞开放置3min晾干。
(9)加23μL的M-Elution Buffer到柱子中，37℃金属浴孵育5min，12000rpm离心1min洗脱DNA。
(10)将tube中的洗脱液用枪头重新吸回到柱子中，37℃金属浴孵育3min，12000rpm离心1min洗脱DNA。
6、扩增
6.1PCR反应体系，冰上加入以下试剂并充分混匀：
表8：
试剂 体积(μL)
CT转化产物 20
NEB EpiMark reaction buffer(5X) 20
25mM dNTP 0.8
NEBNext Index(X)引物(10μM) 4
NEB EpiMark DNA聚合酶 0.6
NF-水 54.6
总计 100
注意：为了在控制循环数的条件下保证足够的产物总量，PCR过程采取分2管扩增，每管50μL体系，共100μL。此外，该步添加完Index后需拍照留存以备日后项目排查。
2)PCR反应程序:
表9：
Figure BDA0002654134250000111
注意：PCR扩增完成后，每个样品取1μL DNA检测浓度，若浓度小于5ng/μL(即总量不足500ng)，则依据项目情况加扩3-4个循环。
7、纯化
1.0X磁珠纯化两次
(1)将PCR产物全部转移至1.5ml管中，加入100μL AMPure XP Beads(1.0X倍体积，产物体积不足100μL的补水至100μL)，用移液器或涡旋震荡充分混匀，室温温育5min。
(2)瞬离，将1.5mL离心管置于磁力架上吸附磁珠5min，用移液器吸除上清液，不要吸到磁珠。
(3)加入200μL新鲜配制的80％乙醇，磁力架上温育30s，用移液器吸除乙醇，不要吸到磁珠。重复两次。
(4)用10μL移液器将残留的乙醇彻底吸除，将离心管继续保持在磁力架上，室温干燥(磁珠表面不反光即可，无需干裂)。
(5)用51μL水重悬干燥的磁珠，用移液器充分混匀，室温温育5min。
(6)瞬离，磁力架上吸附磁珠5min，用移液器转移50μL重悬液到新的1.5ml EP管中，不要吸到磁珠。
(7)向移出的重悬液中加入50μL AMPure XP Beads(1.0倍体积)，用移液器或涡旋震荡充分混匀，室温温育5min。
(8)瞬离，将1.5mL离心管置于磁力架上吸附磁珠5min，用移液器吸除上清液，不要吸到磁珠。
(9)加入200μL新鲜配制的80％乙醇，磁力架上温育30s，用移液器吸除乙醇，不要吸到磁珠。重复两次。
(10)用10μL移液器将残留的乙醇彻底吸除，将离心管继续保持在磁力架上，室温干燥(磁珠表面不反光即可，无需干裂)。
(11)用22μL水重悬干燥的磁珠，用移液器充分混匀，室温温育5min。
(12)瞬离，磁力架上吸附磁珠5min，用移液器吸取21uL上清到贴好文库编号的1.5mL离心管中(原液管)，不要吸到磁珠。
8、Qubit定量出库
取1μL文库进行Qubit定量，记录文库浓度，准备干净的0.5mL离心管(稀释液管)，粘贴好对应文库编号，将文库稀释至1.2ng/μL(保证稀释液体积大于20μL)，交至上机组做库检。
9、利用下机数据，采用生物信息学的方法对酶切效率进行评估，评估结果见下表。
表10：
方法 建库时长 步骤个数 评估所得酶切效率
现有方法 27h 9 80.3％
本申请的方法 24h 6 98.3％
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的待测样本，按照相同的步骤进行建库，其中，唯一不同的是Y型接头，具体序列信息分别如下：
第一组：甲基化接头1与SEQ ID NO：3相比，仅缺少了与测序引物互补的碱基t，甲基化接头2与SEQ ID NO：4相比，仅缺少了与测序引物中的末尾碱基相同的碱基a。
第二组：甲基化接头1与SEQ ID NO：3相比，保护碱基序列为atg(减少了一半)，甲基化接头2与SEQ ID NO：4相比，保护碱基序列为tac(减少了一半)。
第三组：甲基化接头1与SEQ ID NO：3相比，保护碱基序列在末尾增加了三位tac。
第四组：甲基化接头1为SEQ ID NO：3不变，甲基化接头2与SEQ ID NO：4相比，仅酶切位点粘性末端碱基改为MSPI酶的粘性末端CG。
对上述四组Y型接头构建的文库进行测序，并利用与实施例1相同的生物信息学方法进行酶切效率评估，评估结果见下表。
表11：
Y型接头组 第一个碱基为N的概率 数据产出量 评估所得酶切效率
第一组 50％ 50％ 79.8％
第二组 0.1％ 100％ 80.2％
第三组 0.1％ 99％ 98.2％
第四组 0.1％ 100％ 98.5％
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请改进后的Y型接头，一方面通过增加与测序引物的第一个碱基互补配对的碱基T，使得测序引物测得的第一个碱基为N的概率降低，提高测序数据产出，有助于提高酶切效率的评估及其准确性。另一方面通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种构建RRBS化文库的Y型接头，其特征在于，所述Y型接头包括：
甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；
甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；
其中，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2退火形成所述Y型接头，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。
2.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述保护碱基序列为6～8个随机碱基形成的序列。
3.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述n2的碱基数目为2～4个。
4.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述酶切位点粘性末端碱基为MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切产生的末端碱基。
5.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，
所述甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；
所述甲基化接头2为：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3',
其中，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c。
6.一种构建RRBS文库的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用内切酶及权利要求1-5中任一项所述的Y型接头，对待测基因组DNA进行边酶切边连接接头，得到带接头片段；
对所述带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段；
对所述目标长度片段进行CT转化，得到转化片段；
对所述转化片段进行PCR扩增，得到所述RRBS文库。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用电泳切胶回收的方法对所述带接头片段进行片段长度选择，得到所述目标长度片段。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述转化片段进行PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行纯化，从而得到所述RRBS文库。
9.一种构建RRBS文库的试剂盒，所述试剂盒包括Y型接头，其特征在于，所述Y型接头为权利要求1-5中任一项所述的Y型接头。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸内切酶，所述核酸内切酶产生的粘性末端的碱基与所述Y型接头中n2所示的酶切位点粘性末端碱基相同。
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