CN112210597B - 基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法,属于生物技术和分子生物学领域。该方法包括将提取的DNA片段化至10kb左右,通过连接扩增接头对其进行扩增,然后利用磁珠捕获得到HLA目标捕获,再然后通过在捕获的DNA上连接测序接头,利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA直接测序。本发明提供的测序方法可以根据需求对不同的HLA基因组合进行测序,同时可以将不同的样品进行混合测序,最多可将24个样品进行混合测序,可大大节约测序成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和分子生物学领域,尤其涉及一种基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因位于人体第6号染色体的短臂,受控于人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的基因簇,其全长约3.6Mb,是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统。
研究表明,HLA基因的变异与传染病、药物过敏反应、自身免疫疾病、器官移植反应以及恶性肿瘤等均有关联。因此,准确的HLA分型技术对于组织配型以及研究HLA与疾病相关性具有重要意义。但是由于MHC区域存在高度的多态性,因此研究人员对该区域所涉及到的分子机制的研究受到一定的限制。虽然第二代测序平台NGS已经取代了传统基于聚合酶链式反应以及Sanger测序技术成为HLA分型的金标准(Lind C等,Next-generationsequencing:the solution for high-resolution,unambiguous human leukocyteantigen typing Hum Immunol,2010,71(10):1033-1042),但是NGS对单倍体型的判定的解析依然存在困难,而对单倍体分型能更好解读基因与表型(包括疾病)之间的关系,尤其是对于HLA-DP等较大的HLA基因,NGS因其读长短而很难准确获得单倍体型结果。
第三代测序仪能产生平均长度在10kb以上的数据,这不但有利于基因精确分型,还能实现对基因组复杂区域的组装以及对某个基因内及等位基因间差异的细致解析。相比二代测序技术,三代测序技术在对同一样品的HLA分型测定时具有不出现明显“断层”现象、可直接跨越整个扩增子、不但能实现对MHC区域的更好组装,还可对整个MHC共计3.6Mb区域进行判定(陈佳等,三代测序与靶向捕获技术联用进行高分辨HLA基因分型及MHC区域单倍体型精细鉴定,《遗传》,2019,41(4):337-348,doi:10.16288/j.yczz.18-282)的技术优势。因此,如何利用长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行有效测序这对于本领域技术的发展而言具有重要意义。
发明内容
本发明提出一种基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法,该方法可以根据需求将不同的HLA目标基因制作成探针文库进行测序,且最终的测序结果不受文库大小的影响。此外,该方法可以将不同的样品进行混合测序,可大大节约测序成本。
为了达到上述目的,本发明提供了一种基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法,包括以下步骤:
获取样本系的基因组DNA,对所得基因组DNA进行片段化,并对所得片段化的DNA进行末端修复;
将末端修复的DNA片段进行扩增,将得到的扩增的末端修复的片段化的DNA与HLA探针文库进行杂交,获得杂交混合物;
利用磁珠捕获所得杂交混合物中杂交的DNA片段,并洗涤去除未捕获的DNA片段;
对磁珠捕获的杂交的DNA片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行纯化,得到探针文库的扩增产物;
对所得到探针文库的扩增产物进行末端修复并连接条码,得到条码-末端修复的探针文库;
将所得条码-末端修复的探针文库连接测序接头,并利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA测序。
作为优选,所得片段化的DNA长度为4kb-33kb,平均长度约为9.85kb。
作为优选,对所得片段化的DNA进行末端修复具体为:
向PCR试管中依次添加50μl的片段化的DNA、7μl反应缓冲液、3μl末端修复酶,共计60μl,混匀并离心后,放入PCR仪中于20℃反应30min、65℃反应30min后,得到末端修复的片段化的DNA。
作为优选,所述末端修复的片段化的DNA的片段大小为4.9kb-31.9kb,平均大小约为12kb。
作为优选,将末端修复的DNA片段进行扩增具体为:
向试管中加入100μl末端修复的片段化的DNA、200μl多聚酶链反应混合液、40μl多聚酶链反应引物,并用水将体积填补到400μl,混匀离心后,通过PCR反应,然后纯化,得到扩增的末端修复的片段化的DNA;
其中,PCR反应条件为:94℃、30s;94℃、30s,65℃、10分钟,重复10个循环;65℃,10分钟。
作为优选,所述扩增的末端修复的片段化的DNA的片段大小为2.9kb-58.3kb,平均大小约为12.5kb。
作为优选,将得到的扩增的末端修复的片段化的DNA与HLA探针文库进行杂交,获得杂交混合物具体为:
向试管中加入6000ng扩增的末端修复的片段化的DNA、5μl lmg/ml的Cotl DNA和2μl的接头封闭序列,于60℃下蒸干后,再加入8.5μl 2X杂交缓冲液、2.7μl杂交缓冲液增强剂和1.8μl水,震荡混匀离心后将混合物转移至95℃的PCR仪中孵育10分钟,使其DNA变性;
取出变性后的DNA样品,震荡混匀后室温下全速离心10秒,然后加入HLA探针文库,震荡混匀后再全速离心10秒,并将反应体系于热盖温度为75℃的PCR仪上在65℃下杂交4h-24h。
作为优选,所述HLA探针文库中的相关基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1,其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示。
作为优选,对磁珠所捕获的杂交的DNA片段进行PCR扩增具体为:
向磁珠捕获的杂交的DNA片段中加入水,混合均匀后加入25μl多聚酶链反应混合液和5μl多聚酶链反应引物,通过PCR反应,得到探针文库的扩增产物;
其中,PCR反应条件为:94℃、30秒;94℃、30秒,65℃、10分钟,重复15个循环;65℃,10分钟。
作为优选,对所得到探针文库的扩增产物进行末端修复并连接条码具体为:
向试管中加入探针文库的扩增产物、7μl反应缓冲液和3μl末端修复酶,并用水填补到60μl,混匀离心后,放入PCR仪中于20℃反应30min、65℃反应30min后,得到探针文库的扩增产物末端修复DNA;
将试管从PCR仪中取出,置于冰上,并向其中加入30μl连接预混液、2.5μl条码、1μl连接增强剂和6.5μl无酶水,共计100μl,混匀离心后,放入PCR仪中于20℃下反应1h,得到条码-末端修复DNA。
作为优选,所述条码选自NB06或NB12,其中NB06具有如SEQ ID NO.10所示序列,NB12具有如SEQ ID NO.9所示序列。
作为优选,将所得条码-末端修复的探针文库连接测序接头,并利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA测序具体为:
向试管中加入条码-末端修复的探针文库,并加水至65μl,然后加入5μl测序接头预混液、20μl连接反应缓冲液和10μl DNA连接酶,共计100μl,混匀离心后,将其放入PCR仪中于20℃反应1h;
反应结束后,利用磁珠纯化,得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复DNA,检测其回收量≥100ng时,利用MinlON纳米孔测序仪对其进行DNA测序。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
本发明提供的测序方法可以根据需求将不同的HLA目标基因制作成探针文库进行测序,且文库的大小不会影响最终的测序结果。同时,本发明提供的方法可以将不同的样品进行混合测序,最多可将24个样品进行混合测序,可大大节约测序成本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的片段化的DNA大小示意图;
图2为本发明实施例提供的末端修复(连接了扩增接头)的片段化的DNA大小示意图;
图3为本发明实施例提供的扩增的末端修复的片段化的DNA大小示意图;
图4为本发明实施例提供的探针文库的杂交PCR产物,其中A为探针文库1的杂交PCR产物(30PCR循环);B为探针文库2的杂交PCR产物(15PCR循环);
图5为本发明实施例提供的以HLA-A为例的测序覆盖度示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1目标基因和参考序列设计及合成
本发明实施例中无特别说明外,所用试剂及耗材均为市售商品。
本实施例中,选取了两个目标区域:目标区域1和目标区域2,其中:
目标区域1包括:HLA-A、B、C、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRA、DRB1基因的所有外显子,其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示,并选择了IDT平台进行探针的设计和合成过程(可以理解的是,该设计和合成方法为本领域所公知,此处不再赘述),最终的芯片区域大小为7.92kb,此为探针文库1。由于目标区域1太小,可能无法得到足够的捕获DNA进行测序,进而又设计了目标区域2。
目标区域2包括:目标区域1+226个癌症相关基因,亦选择了IDT平台进行探针的设计和合成过程,最终的芯片区域大小约为700kb,此为探针文库2。需要说明的是,目标区域2中引入226个癌症相关基因的目的在于扩大目标区域2,以便获得足够可测量的目标区域1。引入的226个癌症相关基因是已知的相关基因库,当然,为了获得足够可测量的目标区域1,并不局限于上述已知的相关基因库,还可选用其它的相关基因库。
实施例2基因组DNA的片段化
本实施例选用的样本系为肠癌细胞系HCT116,基因组DNA的浓度是360ng/μl,使用10μl的DNA,总计是3600ng;加入140μl TE buffer使总体积达到150μl,然后将150μl的溶液加入到g-TUBE中,在确保没有气泡的情况下,拧紧g-TUBE的盖子。
经Ampure PB Beads(0.4x,Agencourt)进一步片段筛选纯化,将DNA片段回溶到55μl水中。
取出1μl的DNA利用Agilent Genomic DNA Tapestation chip检测DNA片段的大小,结果如图1所示,片段化的DNA的大小从3.9kb-33kb,平均片段大小约为9.85kb。
实施例3片段化DNA的末端修复:
向0.2ml的PCR试管中依次添加50μl的10kb DNA、7μl反应缓冲液、3μl末端修复酶,共计60μl,混匀并离心后,将盛有上述样品和试剂的PCR试管放入PCR仪中20℃反应30min后,65℃反应30min,得到末端修复的DNA片段;
向上述步骤的PCR试管中加入5μl扩增接头(100μM)、30μl DNA连接酶和1μl连接酶增强剂,混匀离心后,放入预设为20℃的PCR仪中,反应1-2h;
反应完后用Ampure PB Beads(0.4x,Agencourt)进行纯化,最后将样品溶于200μl水中。
取出1μl的DNA利用Agilent Genomic DNATapestation chip检测DNA片段的大小,结果如图2所示,末端修复的片段化的DNA的片段大小为4kb-31kb,平均大小为12.3kb。
实施例4 DNA片段扩增
将100μl DNA转移至一个洁净的1.5ml试管中,并在试管中加入200μl的多聚酶链反应混合液(2x PCR master mix)和40μl多聚酶链反应引物,并用水将体积填补到400μl,混匀离心后,分装到4个PCR试管中,放入PCR仪中进行以下反应:
94℃,30seconds;
94℃,30seconds;65℃,10mins;重复10个循环;
65℃,10min
反应结束后,用Ampure PB Beads(0.4x,Agencourt)进行纯化,最后将样品溶于50μl水中。取出1μl的DNA利用Agilent Genomic DNA Tapestation chip检测扩增的DNA片段的大小,结果如图3所示,扩增的末端修复的片段化的DNA的平均大小为2.9kb-58.3kb,平均约为12.5kb。本次共得到了6000ng扩增的DNA。
实施例5目标区域与探针的杂交
将6000ng的扩增DNA平均分装到两个新的1.5ml的试管中,并在每个试管中加入5μl 1mg/ml的Cotl DNA(Invitrogen)和2μl的接头封闭序列(Blockers,IDT),混合物置于SpeedVac中蒸干,温度设置为60℃。
在蒸干的试管中分别加入8.5μl 2X Hybridiation Buffe,2.7μl HybridiationBuffer Enhancer和1.8μl的水,将样品震荡混勾后置于离心机上全速离心5-10秒。离心后将样品转移至PCR时光中,并放在95℃的PCR仪中孵育10分钟,使DNA变性。
取出变性后的DNA样品,震荡混匀后室温全速离心10秒,并在两个试管中分别加入4μl的探针文库1和探针文库2。震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒,将反应体系放于PCR仪上,65℃杂交4h-24h,PCR仪的热盖温度设置为75℃。
实施例6杂交序列的捕获和洗涤洗脱
(1)准备洗液:
a)稀释以下四种Wash buffer(10X Wash Buffer I、10X Wash Buffer II、10XWash Buffer III,10X Stringent Wash Buffer和2X Bead Wash Buffer,IDT)到IX溶液。
b)于65℃预热配制好400μl Stringent Wash Buffer和100μl Wash Buffer I两种溶液。
(2)准备磁珠
a)从冰箱中取出M270 Streptavidin(Invitrogen)磁珠,充分混勾后取100μl加入到一个新的1.5ml的试管中,每个杂交反应用100μl;
b)将试管置于磁力架上至澄清,用移液器小心的去除上清,加入200μl的1x BeadWash Buffer;
c)混匀10s后,将试管重新放回磁力架至液体澄清,用移液器小心的去除上清;
d)重复步骤a)-c),总共洗两次;
e)用100μl的1x Bead Wash Buffer重悬磁珠,并将其转入0.2ml的PCR试管中;
f)用磁力架结合磁珠(将小管靠到磁力架上),直到液体澄清,用移液器小心的去除上清。
(3)磁珠捕获杂交的DNA片段
将杂交混合物用移液枪从PCR试管中取出并加入到准备好的磁珠中,吹打混匀10次后将小管放在PCR仪上,65℃孵育45min(PCR仪热盖温度应设为75℃)。
(4)洗涤磁珠,将未捕获的DNA洗掉
a)孵育45min后,将混合物从0.2mL的小管转入1.5mL的试管中,将试管置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
b)加入100μl预热到65℃的1X Wash Buffer I,震荡混匀10s,将试管置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
c)从磁力架上取下试管,加入200μl预热到65℃的1X Stringent Wash Buffer,移液器吹打混匀10次(该操作应迅速以便管中的液体不低于65℃);
d)65℃孵育5min后,将置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
e)重复步骤c)-d),共用1X Stringent Wash Buffer洗两次;
f)加200μl室温放置的1X Wash Buffer I,震荡混勾2min,将试管置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
g)加200μl室温放置的1X Wash Buffer II,震荡混勾1min,将试管置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
h)加200μl室温放置的lX Wash Buffer III,震荡混匀30s,将试管置于磁力架上至液体澄清,小心的去除上清;
i)在捕获的磁珠中加入20μl的水,混合均匀。
实施例7捕获磁珠模板的PCR扩增及文库选择纯化
将全部的磁珠和水用移液枪转入0.2ml的PCR试管中,并在试管中加入25μl的多聚酶链反应混合液(2x PCR master mix)和5μl多聚酶链反应引物,放入PCR仪中进行以下反应:
94℃,30s;
94℃,30s;65℃,10mins;(探针文库1重复30个循环,探针文库2重复15个循环);
65℃,10min;
将所得PCR产物用Agencourt AMPure PB磁珠(0.4X)进行纯化,并将纯化的PCR产物重悬于15μl水中。取出1μl的DNA利用Agilent Genomic DNA Tapestation chip检测扩增的DNA片段的大小,结果如图4所示,本次实验中,对于探针文库1得到了200ng PCR产物,对于探针文库2得到了2400ng PCR产物。
实施例8测序库的建立和测序
取200ng的探针文库1的PCR产物以及1200ng的探针文库2分别加入两个0.2ml的PCR试管中,然后依次添加7μl反应缓冲液和3μl末端修复酶,并用水填补到60μl l,混匀并离心后,将盛有上述样品和试剂的PCR试管放入PCR仪中20℃反应30min后,65℃反应30min,得到末端修复DNA;
待上述反应结束后,将PCR试管从PCR仪中取出,置于冰上,并向其中加入30μl连接预混液、2.5μl条码(探针文库1用的条码是NB06(序列如SEQ ID NO.10所示),探针文库2用的条码是NB12(序列如SEQ ID NO.11所示))、1μl连接增强剂和6.5μl无酶水,共计100μl,混匀并离心后,放入PCR仪中20℃条件下反应1h,得到条码-末端修复DNA;
反应完后用Ampure PB Beads(0.4x,Agencourt)进行纯化,最后将样品溶于10μl水中。
将一半的条码-末端修复的探针文库1和探针文库2的DNA分别转入新的0.2ml PCR试管中,用水添加到65μl,并加入5μl测序接头预混液、20μl连接反应缓冲液和10μl的DNA连接酶,共计100μl,混匀并离心后,将其放入PCR仪中20℃反应1h;
反应结束后,将PCR试管中共计100μl的样品和试剂转入1.5ml试管中,并加入50μl的预热在室温的磁珠溶液,吹打10次以混匀溶液,然后于室温静置5min,然后将试管放置于磁力架上分离磁珠,静置5min,直至上清完全澄清,并移弃上清;
再向上述移弃上清后的试管中加入250μl的L Fragment Buffer,吹打10次混匀溶液后,放置于磁力架上分离磁珠,然后重复该步骤一次,然后将试管离心后放置于磁力架上,移除残留的L Fragment Buffer,室温下静置30s;
静置结束后,从磁力架上移走试管,加入15μl的Elution Buffer(EB)重悬吹打或振荡混匀磁珠,室温放置10min,然后将试管转至磁力架上,待溶液澄清后,将试管中的样品和试剂转移至另一1.5ml试管中,得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复DNA,并取出1μl的DNA利用Qubit DNA HS Assay检测DNA的回收量,本次实验共回收了140ng的DNA。
利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA测序,并对测序结果进行数据分析,结果如表1所示。
表1测序结果
表2比对到不同HLA基因的读数
如图5所示,以HLA-A为例,文库1和文库2的数据可以很好地覆盖整个基因。由此可见,虽然两个探针文库的大小相差迥异(7.9kb vs.700kb),但最后对比到每个HLA基因上的读数几乎没有差别,这充分地说明了使用本方法可以根据需求将不同的HLA目标基因制作成探针文库,且文库的大小不会影响最终的测序结果。另外使用本方法,还可以将最多24个样品进行混合测序,从而减少了测序成本。当然我们也看到,由于HLA基因序列的高度相似性,还是有大约20-25%的读数会覆盖到非目标的HLA基因,但这是目前任何方法都无法避免的问题,也有待于进一步的研究。
Claims (9)
1.基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的非诊断目的的方法,其特征在于,包括以下步骤:
获取样本系的基因组DNA,对所得基因组DNA进行片段化,并对所得片段化的DNA进行末端修复;
将末端修复的DNA片段进行PCR扩增,其中,PCR扩增反应条件为:94℃、30秒,94℃、30秒,65℃、10分钟,重复 10 个循环;65℃,10分钟;
将得到的扩增的末端修复的片段化的DNA与HLA探针文库进行杂交,获得杂交混合物,其中,所述扩增的末端修复的片段化的DNA的片段大小为2.9kb-58.3 kb,平均大小为12.5kb;所述HLA探针文库由不同的HLA基因制作而成,所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1,其核苷酸序列依次为SEQID NO.1- SEQ ID NO.9所示;
利用磁珠捕获所得杂交混合物中杂交的DNA片段,并洗涤去除未捕获的DNA片段;
对磁珠捕获的杂交的DNA片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行纯化,得到探针文库的扩增产物,其中,PCR反应条件为:94℃、30秒,94℃、30秒,65℃、10分钟,重复12-15个循环;65℃,10分钟;
对所得到探针文库的扩增产物进行末端修复并连接条码,得到条码-末端修复的探针文库,其中所述条码选自NB06或NB12,NB06的序列为SEQ ID NO.10所示,NB12的序列为SEQID NO.11所示;
将所得条码-末端修复的探针文库连接测序接头,利用磁珠纯化,得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复DNA,检测其回收量≥100ng时,利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA测序。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所得片段化的DNA长度为4 kb-33 kb,平均为9.85 kb。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,对所得片段化的DNA进行末端修复具体为:
向PCR试管中依次添加50 µl的片段化的DNA、7 µl反应缓冲液、3 µl末端修复酶,共计60 µl,混匀并离心后,放入PCR仪中于20℃反应30 min、65℃反应30 min后,得到末端修复的片段化的DNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述末端修复的片段化的DNA的片段大小为4.9kb-31.9 kb,平均大小为12 kb。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将末端修复的DNA片段进行扩增具体为:
向试管中加入100 µl末端修复的片段化的DNA、200 µl多聚酶链反应混合液、40 µl多聚酶链反应引物,并用水将体积填补到400 µl,混匀离心后,通过PCR反应,然后纯化,得到扩增的末端修复的片段化的DNA。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将得到的扩增的末端修复的片段化的DNA与HLA探针文库进行杂交,获得杂交混合物具体为:
向试管中加入6000 ng扩增的末端修复的片段化的DNA、5 µl 1 mg/ml的Cotl DNA和2µl的接头封闭序列,于60℃下蒸干后,再加入8.5 µl 2 X杂交缓冲液、2.7 µl杂交缓冲液增强剂和1.8 µl水,震荡混匀离心后将混合物转移至95℃的PCR仪中孵育10分钟,使其DNA变性;
取出变性后的DNA样品,震荡混匀后室温下全速离心10秒,然后加入HLA探针文库,震荡混匀后再全速离心10秒,并将反应体系于热盖温度为75℃的PCR仪上在65℃下杂交4h-24h。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,对磁珠所捕获的杂交的DNA片段进行PCR扩增具体为:
向磁珠捕获的杂交的DNA片段中加入水,混合均匀后加入25 µl多聚酶链反应混合液和5 µl多聚酶链反应引物,通过PCR反应,得到探针文库的扩增产物。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,对所得到探针文库的扩增产物进行末端修复并连接条码具体为:
向试管中加入探针文库的扩增产物、7µl反应缓冲液和3 µl末端修复酶,并用水填补到60 µl,混匀离心后,放入PCR仪中于20℃反应30min、65℃反应30 min后,得到探针文库的扩增产物末端修复DNA;
将试管从PCR仪中取出,置于冰上,并向其中加入30 µl连接预混液、2.5 µl条码、1 µl连接增强剂和6.5 µl无酶水,共计100 µl,混匀离心后,放入PCR仪中于20℃下反应1h,得到条码-末端修复DNA。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将所得条码-末端修复的探针文库连接测序接头,并利用MinlON纳米孔测序仪进行DNA测序具体为:
向试管中加入条码-末端修复的探针文库,并加水至65 µl,然后加入5 µl测序接头预混液、20 µl连接反应缓冲液和10 µl DNA连接酶,共计100 µl,混匀离心后,将其放入PCR仪中于20 ℃反应1 h;
反应结束后,利用磁珠纯化,得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复DNA,检测其回收量≥100ng时,利用MinlON纳米孔测序仪对其进行DNA测序。
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三代测序与靶向捕获技术联用进行高分辨HLA基因分型及MHC区域单倍体型精细鉴定;陈佳等;《遗传》;20190430;第41卷(第4期);摘要、1.2 HLA基因的测序分型、1.3 MHC 区域捕获测序以及数据分析、表2 * |
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