CN118222705A

CN118222705A - 一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN118222705A
Application number: CN202410017580.9A
Authority: CN
Inventors: 丁琳枫; 胡耀文; 何鹏海; 马旖旎; 余科; 林筱剑
Original assignee: Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd
Current assignee: Nanchang Adicon Medical Inspection Laboratory Co ltd
Priority date: 2024-01-05
Filing date: 2024-01-05
Publication date: 2024-06-21

Abstract

本发明公开了一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合，包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少一种。并公开了包括所述探针组合的试剂盒以及利用所述试剂盒检测卵巢癌遗传易感基因的方法。本发明利用杂交捕获法可以一次性检测卵巢癌遗传易感相关基因ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11。探针覆盖广，测序深度高，能够检出目标基因所有外显子区域的胚系变异。本发明能报告卵巢癌遗传易感相关基因的所有相关疾病，并提供疾病对应的遗传模式。

Description

一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及多基因检测技术领域，尤其涉及一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

卵巢癌目前尚缺乏有效的筛查及早期诊断措施。

大部分卵巢癌是散发的，遗传性卵巢癌约占所有卵巢癌患者的15％。目前，已发现十余种抑癌基因的胚系突变与遗传性卵巢癌发病相关。流行病学统计结果表明普通妇女一生中患卵巢癌的风险仅为1％左右，而BRCA1和BRCA2胚系变异携带者在一生之中发生卵巢癌的风险分别达54％和23％，是卵巢癌的高危人群。此外，携带肿瘤易感基因的致病变异可能会导致遗传性肿瘤综合征(林奇综合征、LI-FRAUMENI综合征等)。对于家族史比较明显但无法判断属于哪种遗传性综合征的情况，可考虑行遗传相关的多基因检测。

对于检出胚系突变的卵巢癌个体，需进一步对其家系进行“逐级检测”，以发现高危个体，从而针对性地开展肿瘤预防与监测工作，降低个体发病、死亡风险及群体发病率。NCCN指南推荐，对于携带BRCA1、BRCA2、BRIP1、PALB2、RAD51C、RAD51D等突变的患者，在相应年龄进行预防性输卵管卵巢切除术(risk reducing salpingo-oophorectomy，RRSO)。RRSO被认为是降低遗传性乳腺癌卵巢癌综合征及相关妇科恶性肿瘤发病风险最有效的方法，可降低卵巢癌患者发病率70％～85％，及该人群乳腺癌的肿瘤死亡率和全因死亡率。

因此，有必要对卵巢癌遗传易感基因进行检测。现有技术对于卵巢癌基因检测的panel囊括的基因不全面，一些针对泛癌种的大panel肿瘤试剂盒，通常包括上百种基因，要求比较高的建库起始量，成本高，测序灵敏度和准确性都比较低。再一类，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，无法应用于临床需求。

由于胚系易感基因无热点，需要检测产品对所有致病位点进行全面高深度覆盖，如果对卵巢癌易感基因的区域覆盖不全或致病位点覆盖不深等，可能导致胚系变异漏检的情况发生。开发一款可以全面深度覆盖所有相关致病位点的卵巢癌易感基因检测panel有着重要的临床应用价值及社会意义。

CN 114410779 A公开了检测卵巢癌分子分型的探针池及制备，应用和使用方法，包括：1)用于I型卵巢癌的探针设计；2)用于II型卵巢癌的探针设计；所述用于I型卵巢癌分型的探针设计包括BRAF、KRAS、NRAS、ARAF、HRAS、PTEN、POLE、POLD基因的多个区域组合；所述用于II型卵巢癌分型的探针设计包括TP53、BRCA1、BRCA2、ATM、ATR、CCND1、CCNE1、ARID1A、CDK4、CDK6、CDK12、PIK3CA基因的多个区域组合，该专利可一次性检测2种常见的卵巢癌分子分型，但该专利主要针对的是卵巢癌的分子分型，与本发明的易感基因不同，且对于卵巢癌易感基因的覆盖不全。

探针捕获测序是常用的目标基因多位点检测方案之一，该方案通过设计合成有效的特异性探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域序列进行捕获并富集后，使用主流的测序平台进行高通量测序。探针杂交捕获效率和基因组区域的覆盖深度受到多种因素影响。开发和验证疾病相关的目标基因panel和关键位点都依赖于对大量样品的目标区域研究，仅有序列准确率高的探针，才能与目标区域序列特异性结合，大大提升探针的捕获效率，达到富集目标片段的目的。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中对于卵巢癌遗传易感基因检测覆盖不全的问题，提供一种检测卵巢癌遗传易感相关基因的多基因panel，可针对14种卵巢癌遗传易感基因进行检测，特异性强，可在同一体系下，一次性检测待测样本中的14个基因全外显子区域的变异情况，覆盖区域广，能够检出所有外显子区域的胚系变异。

本发明采用的技术方案是：

一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少一种。

作为优选，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少200种。

作为优选，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少300种。

作为优选，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少400种。

作为优选，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少600种。

作为优选，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的全部。

所述SEQ ID NO 1～641的探针组合检测的卵巢癌遗传易感基因包括如下14种基因中的至少一种：ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11。

纳入的相关基因来源于多个数据库、相关指南以及专家共识，涵盖了卵巢癌高外显率的遗传易感相关基因。所设计的捕获探针组合覆盖所涉及基因的全编码区序列。

卵巢癌遗传易感基因的相关疾病包含：胆道癌、毛细血管扩张性共济失调、前列腺癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、胰腺癌、范可尼贫血互补群S型、家族性乳腺癌-卵巢癌易感性1型、胰腺癌易感性4型、遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征、卵巢癌、互补群D1型范可尼贫血、家族性乳腺癌-卵巢癌易感性2型、脑胶质瘤易感性3型、肾母细胞瘤1型、髓母细胞瘤、胰腺癌易感性2型、互补群J型范可尼贫血、林奇综合征、林奇综合征8型、先天性腹泻5型伴簇绒肠病、Muir-Torre综合征、错配修复癌症综合征1型、林奇综合征2型、错配修复癌症综合征2型、林奇综合征1型、错配修复癌症综合征3型、林奇综合征5型、子宫内膜癌、范可尼贫血、家族性乳腺癌-卵巢癌易感性5型、葡萄膜卵巢癌、胃癌、胰腺癌易感性3型、错配修复癌症综合征4型、林奇综合征4型、多发性错构瘤综合征、多发性错构瘤综合征1型、家族性脑膜瘤易感性、神经胶质瘤易感性2型、家族性乳腺癌-卵巢癌易感性3型、家族性乳腺癌-卵巢癌易感性4型、Peutz-Jeghers综合征、皮肤恶性卵巢癌易感性1型。

卵巢癌遗传易感基因的检测结果可提供相关疾病的遗传模式：常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传。

依据2015年ACMG指南将胚系变异的临床意义分类，能精准判别变异的致病信息，将胚系变异的临床意义分类为：致病(P)、疑似致病(LP)、临床意义未明(VUS)、良性(B)、疑似良性(LB)变异。

本发明还提供检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒，包括所述探针组合。

所述试剂盒还可以包括基因组DNA提取试剂、DNA文库构建试剂、捕获DNA文库构建试剂等，可采用相应的市售商品试剂盒。如基因组DNA提取试剂可使用天根血液基因组提取试剂盒、DNA文库构建试剂可采用Twist公司的Twist Library Preparation EnzymaticFragmentation Kit 2.0、捕获DNA文库构建试剂可采用Twist公司的液相杂交捕获试剂盒。还可以包括测序所需仪器或试剂(如Illumina高通量测序平台和人类基因组序列)。

本发明还提供检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒在检测卵巢癌遗传易感基因中的应用。进一步，所述应用为，检测卵巢癌遗传易感基因的胚系变异，所述胚系变异分为致病(P)、疑似致病(LP)、临床意义未明(VUS)、良性(B)、疑似良性(LB)变异。

进一步，所述检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒还可以用于提供相关疾病和对应遗传模式。

本发明还提供利用所述试剂盒检测卵巢癌遗传易感基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)构建DNA文库；

构建DNA文库一般包括DNA片段化、末端修复、加A尾，连接通用接头，引物物PCR扩增，最后纯化，得到DNA文库；

(3)使用检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合进行杂交捕获、PCR扩增，得到杂交捕获后的文库；

(4)杂交捕获后的文库进行测序，测序数据进行生物信息学分析检测，得到卵巢癌遗传易感基因的胚系变异情况，并提供相关疾病和对应遗传模式。

与现有技术相比，本发明技术方案具有如下优点：

现有遗传易感检测多基于PCR、第一代测序技术，这类方法只能检测所选基因的部分热点变异，无法检测未知变异。本发明基于二代测序，采用杂交捕获的方法，可以实现同一体系一次性检测待测样本中的14个基因全外显子区域的变异情况，覆盖区域广，能够检出所有外显子区域的胚系变异。

本发明试剂盒设计针对单一癌种，可以一次性检测卵巢癌所有有明确遗传易感性的基因，对卵巢癌患者的特异性较强，相比多肿瘤遗传易感检测可以降本增效。

本发明基因变异判定基于ACMG指南，对于未被clinvar数据库收录的变异有标准的注释流程，有效避免漏检。基因的相关疾病注释来源广泛，不仅仅依赖某单一数据库，人工整理了多个数据库、相关指南以及专家共识，能够对所有相关疾病进行输出，并提供疾病对应的遗传模式。

本发明所设计的捕获探针覆盖所涉及基因的全编码区序列，目标区域覆盖度能达到100％，测序平均深度高达100x。本发明能够检出设计基因所有外显子区域的胚系变异。本发明能报告卵巢癌遗传易感相关基因的所有相关疾病，并提供疾病对应的遗传模式。

附图说明

图1为构建的杂交捕获后的文库池的片段分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：卵巢癌遗传易感相关基因探针设计与合成

一、卵巢癌遗传易感相关基因筛选

通过人工阅读美国国立癌症综合网络(NCCN)指南，对指南中遗传易感相关基因的信息进行整理，筛选，汇总。

通过在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库获取表型与基因的关系。

通过ClinVar数据库筛选相关基因的致病/可能致病的变异，探针设计时需包含这些变异。

表1为与卵巢癌遗传易感相关的14个基因以及相关疾病

二、探针设计与合成

表2为根据表1相关基因设计杂交捕获探针序列，覆盖上诉基因的全基因编码区：

表2

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三、所设计探针的检测方法

1、基因组DNA提取

提取待测者外周血的基因组DNA。

2、构建DNA文库

将上述1得到的基因组DNA采用Twist公司的Twist Library PreparationEnzymatic Fragmentation Kit 2.0进行DNA文库构建，具体建库流程如下：

2.1 DNA片段化、末端修复和dA加尾，反应体系如表3所示。

表3反应体系

名称	用量
		基因组DNA	Xul(200ng)
Frag/AT Buffer	4ul
		Frag/AT Enzymes	6ul
Nuclease-free Water	40-X
		Total	50ul

配好体系后，吹打混匀后放入PCR仪孵育，表4为DNA片段化、末端修复和dA加尾孵育程序

表4

37℃	20min
		65℃	30min
4℃	Hold

2.2连接Twist通用接头，反应体系如表5所示

表5反应体系

名称	用量
		DNA片段化、末端修复和dA加尾产物	50ul
Twist universal Adapters	5ul
		Ligation Master Mix	20ul
Total	75ul

配好体系后吹打混匀，然后放入PCR仪孵育，表6为接头连接孵育程序

表6

20℃	15min
		4℃	Hold

2.3纯化

a.加60ul平衡到室温且充分混匀的DNA Purification Beads(0.8倍样本体积)到上一步骤的样本中，吹打混匀30次，室温孵育5min

b.瞬离，在磁力架上放置5min，弃上清

c.加200μl新鲜配制80％乙醇，室温静置1min，弃上清

d.重复步骤c

e.瞬离将残液收集到管底，放磁力架上，然后弃残液，室温晾干3-5min至酒精挥发干净

f.加入18ul Nuclease-free water，吹打混匀，室温放置5min

g.瞬离，放磁力架上2min至液体澄清。

2.4引物PCR扩增

取15ul上清至新的PCR管中PCR扩增，反应体系如表7所示。

表7反应体系

名称	用量
		Adapter Ligated DNA	15ul
Equinox Library Amp Mix(2X)	25ul
		UDI引物(Twist bioscience)	10ul
Total	50ul

配好体系后吹打混匀，放入PCRA仪孵育，表8为PCR程序

表8

2.5纯化

a.加50ul平衡到室温且充分混匀的DNA Purification Beads到上一步骤的PCR产物中，吹打混匀30次，室温孵育5min

b.瞬离，在磁力架上放置5min，弃上清

c.加200μl新鲜配制80％乙醇，室温静置1min，弃上清

d.重复步骤c

f.加入24ul Nuclease-free water，吹打混匀，室温放置5min

g.瞬离，放磁力架上2min至液体澄清，取22ul上清至新的离心管中，得到DNA文库，震荡混匀取2μl上述DNA文库稀释10倍后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度；取1μl上一步骤稀释10倍的DNA文库使用Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000Kit)进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间。

3、文库Pooling，杂交捕获及PCR扩增、纯化

3.1文库Pooling(1-8个样本)

a.文库池通常包含多个不同样本文库，根据文库DNA浓度计算文库池进入量，混合获得文库池。文库池DNA总量为1.5～4μg，根据各文库浓度计算每个文库的pooling体积。建议同质量样本建立文库池。DNA文库用量参考下表9：

表9

混合样本数量	每个文库的用量	每个反应文库总量
			1	1000ng	1000ng
2	1000ng	2000ng
			3	1000ng	3000ng
4	800ng	3200ng
			8	400ng	3200ng

b.于1.5ml离心管中对各文库进行混合，轻轻震荡，离心

3.2文库杂交与捕获

3.2.1文库浓缩，体系如表10

表10

名称	用量
		Pooling的文库池	X(1-8个样本相加的体积)
Universal Blockers(Twist Bioscience)	8ul
		Blocking Solution(Twist Bioscience)	5ul
探针(探针序列为SEQ ID NO1～641)	4ul

反应管于真空干燥仪中，45℃干燥至完全

3.2.2文库杂交

a.烘干后，将FastHybridization Mix(勿恢复至室温)取20uL加至离心管中，轻弹混匀，室温静置5min后转移至一个新的PCR管中

b.向PCR管内液体表层加入Hyb Enhancer 30uL，瞬离去除气泡后置于PCR仪中，杂交反应程序如表11：

表11杂交反应程序

95℃	5min
		60℃	2h-16h(一般2h)
60℃	Hold

3.2.3文库捕获

a.取100uL Streptavidin Binding Beads至1.5mL管中(已室温放置30min且震荡混匀)

b.加入200uL Fast Binding Buffer，混匀，磁力架上1min，弃上清，重复此洗涤步骤2次，共3次；再加入200uL Fast Binding Buffer，震荡重悬使充分混匀。

c.杂交结束后，在PCR仪上打开PCR管盖，迅速将杂交液全部转移至磁珠液中，立即吹打混匀

d.离心管于旋转仪上，室温，1200rpm，30min。将离心管快速离心，磁力架上1min，去上清

e.加入200uL预热的Fast Wash Buffer 1(勿从金属浴中取出)，轻混后迅速置于66℃孵育5min

f.磁力架上1min，去上清后再次加入200ul预热的Fast Wash Buffer 1，轻混后迅速置于66℃孵育5min

g.转移管内所有液体至一新的1.5ml管，磁力架上放置1min，去上清。

h.加入200uL预热的Wash Buffer2(勿从金属浴中取出)，轻混后迅速置于48℃孵育5min，磁力架上1min，去上清后再重复用Wash Buffer2清洗2次，共三次

I.瞬离后置于磁力架上，用10uL枪头吸尽残液

J.加入45uL H2O，吹打混匀，冰上孵育(注：如暂不PCR，将磁珠混合液暂于-20℃冻存)

3.2.4 PCR扩增,反应体系如表12，反应程序如表13

表12反应体系

名称	用量
		磁珠混合液	22.5ul
KAPA HIFI HotStart ReadyMix	25ul
		Amplification Primers	2.5ul
Total	50ul

配置好反应体系后吹打混匀，放PCR仪上反应

表13 PCR程序

3.2.5纯化

a.加90ul平衡到室温且充分混匀的DNAPurificationBeads到上一步骤的PCR产物中，吹打混匀30次，室温孵育5min

b.瞬离，在磁力架上放置5min，弃上清

c.加200μl新鲜配制80％乙醇，室温静置1min，弃上清

d.重复步骤c

f.加入34ul Nuclease-free water，吹打混匀，室温放置5min

g.瞬离，放磁力架上2min至液体澄清，取32ul上清至新的离心管中，得到杂交捕获后的文库，震荡混匀

取2μl上述扩增后捕获DNA文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-15ng/μl；取1μl上述扩增后捕获DNA文库使用Agilent 2100Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000Kit)进行文库片段长度测定，文库长度约在300-450bp之间。

4、测序

使用Illumina的Nextseq2000对上述3得到的扩增后捕获DNA文库进行测序。

实施例2临床样本检测

取2名卵巢癌患者全血样本各1份，检测这2个样本遗传易感基因的变异信息。先分别提取4名志愿者全血基因组DNA，然后根据实施例1中的所述方法进行建库，成功构建扩增后捕获DNA文库，将扩增后捕获DNA文库于Illumina高通量测序仪上进行测序，测序参数PE：2×150。然后对下机数据进行质控后，再利用BWA/GATK等相关软件对数据进行生物信息学分析，并注释相关数据库如gnomAD/Clinvar/OMIM等，依据ACMG指南将胚系变异的临床意义分类为：致病(P)、疑似致病(LP)、临床意义未明(VUS)、良性(B)、疑似良性(LB)变异。最后通过一代测序对各个位点进行验证，符合率100％。

构建的杂交捕获后的文库池的片段分析结果如图1所示。

测序质量结果如表14所示，样本1的检测结果如表15所示，样本2的检测结果如表16所示：

表14

样本	目标区域覆盖度	目标区域平均深度	是否合格
				患者1	100.0％	121.87	合格
患者2	100.0％	183.98	合格

表15样本1检测结果：

表16样本2检测结果：

从检测结果可以看出，本发明所述试剂盒设计探针覆盖度可达100％，目标区域平均深度均为100x以上，质控合格。对常规样本的检测结果表明本发明所述探针和方法及试剂盒能够准确检测卵巢癌遗传易感相关基因的变异情况，对相关疾病进行提示。

Claims

1.一种检测卵巢癌遗传易感基因的探针组合，所述探针组合包括SEQ ID NO 1～641所示序列中的至少一种。

2.如权利要求1所述的探针组合，其特征在于所述探针组合包括全部SEQ ID NO 1～641所示序列。

3.如权利要求2所述的探针组合，其特征在于所述SEQ ID NO 1～641的探针组合检测的卵巢癌遗传易感基因包括如下14种基因中至少一种：ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11。

4.一种检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒，包括如权利要求1或2所述的探针组合。

5.如权利要求4所述的检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒在检测卵巢癌遗传易感基因中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为检测卵巢癌遗传易感基因的胚系变异，所述胚系变异分为致病、疑似致病、临床意义未明、良性、疑似良性变异。

7.一种检测卵巢癌遗传易感基因的方法，其特征在于利用如权利要求4所述的检测卵巢癌遗传易感基因的试剂盒，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)构建DNA文库；