WO2015089726A1 - 一种染色体非整倍性检测方法及装置 - Google Patents

一种染色体非整倍性检测方法及装置 Download PDF

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WO2015089726A1
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test sample
sequencing
chromosome
dna
dna fragment
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张春雷
郑晶
陈盛培
蒋浩君
谢伟伟
李旭超
陈芳
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深圳华大基因科技有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the invention relates to the technical field of genomics and bioinformatics, and particularly relates to a method and a device for detecting chromosome aneuploidy.
  • Spontaneous abortion is a common complication of clinical pregnancy.
  • embryonic genetic abnormalities are the main causes, such as trisomy, X monomer, tetraploid and other chromosomal abnormalities.
  • understanding the cause of spontaneous abortion and detecting the chromosomal condition of aborted fetuses have important guiding significance for the diagnosis of current abortion and for the next pregnancy.
  • chromosome aneuploidy diagnosis include: karyotype analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), Array CGH (Array Comparative genomic hybridization), multiple-link probe amplification MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), short tandem repeat polymerase chain reaction (STR-PCR).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Array CGH Array Comparative genomic hybridization
  • MLPA multiple-link probe amplification
  • STR-PCR short tandem repeat polymerase chain reaction
  • the most commonly used karyotype analysis can detect most of the abnormal chromosome numbers, but the detection method is easy to be misdiagnosed and missed due to factors such as detection of old specimens, and the diagnosis period is long and the cost is large.
  • the FISH diagnostic technique can only detect abnormalities of chromosomes 13, 16, 18, 21, 22 and X/Y, and is also prone to missed diagnosis.
  • the method for detecting chromosomal aneuploidy comprises: comparing a sequencing sequence obtained by sequencing a test sample with a reference genome, the test sample comprising M target samples and N control samples, obtaining each The number r(j) of the sequencing sequence on which the test sample falls on the reference genome, where M, N, and j are positive integers, j represents the number of the test sample; and the sequencing depth d (i) of each chromosome of each test sample is calculated.
  • (i, j) is compared with a preset deviation statistic threshold to determine the i-th of the test sample Whether the chromosome has aneuploidy.
  • the chromosomal aneuploidy detecting apparatus includes: a data input unit for inputting data; a data output unit for outputting data; a storage unit for storing data, including an executable program; And connecting to the data input unit, the data output unit, and the storage unit for executing the executable program, and the executing of the program includes completing the foregoing method.
  • the embodiments of the present invention have the following advantages:
  • the method and device for detecting chromosomal aneuploidy comprises: comparing a sequencing sequence obtained by sequencing a test sample with a reference genome, obtaining a number of sequencing sequences of the test sample falling on the reference genome, and calculating The sequencing depth of each chromosome of each test sample, and then calculate the relative sequencing depth on each chromosome of each test sample, and finally calculate the deviation statistic of the relative sequencing depth of each chromosome of each test sample, and then each The deviation statistic of the relative sequencing depth of each chromosome of each test sample is compared with a preset deviation statistic threshold to determine whether each chromosome of the test sample is missing or repeated. It can detect whether all the chromosomes of the test sample are abnormal, the detection method is accurate, reduce the missed diagnosis and misdiagnosis, reduce the diagnosis cycle and save resources.
  • FIG. 1 is a flow chart of a method according to a first embodiment of the present invention
  • Embodiment 2 is a flow chart of a method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart of a method in step 202 of Embodiment 2 of the present invention.
  • step 202 of Embodiment 2 of the present invention is a flowchart of another method in step 202 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic structural diagram of a device according to Embodiment 3 of the present invention.
  • a method for detecting chromosome aneuploidy is provided.
  • the method may include the following steps:
  • the test sample contains M target samples and N control samples, and M and N are positive integers.
  • the target sample refers to a sample that needs to be tested to determine information, such as abortion tissue samples of pregnant women, including mutation information of aborted embryos or fetuses, and normal samples refer to samples obtained from predetermined normal individuals.
  • the target sample and the normal sample are derived from the same species, preferably, having an approximate basic state, such as non-invasive prenatal detection of the trisomy 21, and if the target sample is maternal peripheral blood, the control sample may be the fetal chromosome 21 Abnormal pregnant women's peripheral blood samples Ben.
  • the reference genome is preferably the human reference genome hgl 8 or hgl9.
  • the sequencing sequence obtained by sequencing the test sample can be compared with the reference genome, and the number of sequencing sequences (r) of each test sample falling on the reference genome is obtained, j is a positive integer, and j represents a test sample. Numbering.
  • the source of the test sample is not particularly limited.
  • One aspect of the present invention is to perform fetal variation detection, as long as the test sample can contain fetal genetic material.
  • the embryonic tissue of aborted abortion is used to detect the variation of the aborted fetus
  • the target sample is aborted embryonic tissue of the pregnant woman.
  • the test sample (target sample and control sample) may be derived from at least one of the following: pregnant women's peripheral blood, pregnant women's urine, pregnant women's cervical fetal trophoblasts, pregnant women's cervical mucus and fetal nucleated red blood cells.
  • an invasive prenatal test sample may also be derived from fetal cord blood, placental tissue or chorion tissue, uncultured or cultured amniocytes, villous cells, and the like. It is worth noting that in the extraction of test sample nucleic acids, especially in non-invasive detection of embryos or fetuses, since the sample contains pregnant women's own nucleic acids in addition to fetal nucleic acid, in order to avoid interference with the test results, the pregnant women themselves should have no chromosome aneuploidy. Sexual problems, of course, this judgment is usually very obvious.
  • the test sample can be sequenced using a third generation sequencing platform.
  • the third generation sequencing platform (Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan; ll(l): 31-46) includes but is not limited to Helicos's true single molecule sequencing technology (True Single Molecule) DNA sequencing), Pacific Biosciences' single-molecule real-time sequencing (SMRTTM, single molecule real-time), and Life Technologies' semiconductor sequencing technology.
  • the semiconductor sequencing platform of Life Technologies is used in the embodiment of the present invention.
  • the alignment of the sequencing sequence of the test sample with the reference genome can be performed by any of the sequence alignment programs.
  • the Tmap alignment and the BWA alignment (Burrows-Wheeler Aligner) used by those skilled in the art are performed.
  • the alignment software employed is Tmap.
  • Aligning the sequencing sequence with the reference genome can be: Aligning the sequencing sequence with a reference sequence of the reference genome.
  • the reference sequence is a known sequence.
  • the reference sequence of the reference genome is a human genome reference sequence in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database.
  • the human genome reference sequence is the human genome reference sequence of version 37.3 (hgl9; NCBI Build 37.3) in the NCBI database.
  • the fault-tolerant or in fault-tolerant alignment can be used according to the comparison software.
  • the fault-tolerant alignment is used, the average average lOObp is allowed to have 1 to 3 Fault tolerance.
  • One embodiment of the present invention When sequencing with Life Technologies' Ion Proton platform, fault-tolerant alignments are generally used.
  • d (i, j) represents the sequencing depth of chromosome i of the jth test sample
  • i is a positive integer and 24>i> l
  • d (i, j) r(i,j)/g (i)
  • g(i) is the size of chromosome i
  • r(i,j) is the number of sequencing sequences of the j-th sample aligned to the reference genome i-th chromosome.
  • the length ranges from 8 to 300 bp, and the main peak is at 200 bp, resulting in uneven distribution of the number of sequencing sequences in some regions.
  • the coverage depth of the sequencing sequence is more uniform, so the use of sequencing depth for statistics can reduce the uneven coverage depth, effectively eliminate the problem of excessive depth inequality in the whole genome, and make the test results more accurate and reduce the occurrence of false positive signals.
  • the method of the present embodiment is equally applicable when the obtained sequencing sequences are equal in length.
  • the relative sequencing depth is represented by D (i, j).
  • i denotes the number of the chromosome
  • j denotes the number of the test sample.
  • D ( i, j ) d(i,j) I d(j), where d(j) is the total average sequencing depth of the jth test sample.
  • mean (i) and sd (i) are determined using the sequencing data of the control sample. Since the normal individual is pre-selected and determined, any detected or calculated data about the control sample can be pre-generated and saved. In this embodiment, the data of the preset control sample is used to read the data as needed. use. In other embodiments, the manner in which the control sample is simultaneously detected and calculated may also be employed.
  • Mean(i) is the average of the relative sequencing depths on chromosome i of the N control samples.
  • N is not less than 30.
  • Sd (i) is the standard deviation of the relative sequencing depth of chromosome ig of N control samples:
  • the deviation statistic Z(i,j) represents whether the i-th chromosome of the j-th sample has a statistical meaning of deletion or repetition.
  • Z(i,j)>0 tends to repeat.
  • Z(i,j) ⁇ 0 tends to be missing, and Z(i,j) of each chromosome has relatively independent statistical significance.
  • step 104 By comparing Z(i,j) with a preset deviation statistic threshold, it can be determined whether each dye of the test sample is missing or repeated.
  • the deviation statistic of the relative sequencing depth of the i-th chromosome of each test sample is calculated, and the deviation statistic is calculated from the average and standard deviation of the relative sequencing depth of the i-th chromosome of the N normal samples. of. Based on this deviation statistic, the deviation statistic threshold can be obtained by setting the corresponding confidence level.
  • the setting of the step deviation statistic threshold can be selected according to the number of comparison samples and the required detection accuracy, and the corresponding confidence is set.
  • a U-test based on a normal distribution is used, setting the confidence to 99.9%.
  • the deviation statistic threshold value obtained by the above-described setting method is [-3, +3].
  • other test rules such as T test may be selected, and at the same time or optionally, the confidence may be selected from 90% to 99.9%, such as 99%, 99.5%, etc.
  • a different statistical test threshold is obtained, which is the deviation statistic threshold.
  • FIG. 2 is a flowchart of a method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • the chromosomal aneuploidy detection method of the second embodiment of the present invention is the same as that of the first embodiment, and the difference from the first embodiment is that the sequencing sequence obtained by sequencing the test sample in the second embodiment of the present invention is Before the reference genome is aligned, the specific process of obtaining the sequencing sequence of the test sample is added, and the steps can be as follows:
  • test sample DNA (Deoxyribonucleic acid).
  • the DNA may be obtained by extracting a whole genome from a biological sample by a conventional DNA extraction method such as a salting out method, a column method, or a sodium dodecylbenzenesulfonate (SDS) method, and is preferably used in the embodiment of the present invention.
  • a conventional DNA extraction method such as a salting out method, a column method, or a sodium dodecylbenzenesulfonate (SDS) method
  • SDS sodium dodecylbenzenesulfonate
  • Column chromatography In short, the principle of column chromatography is: Or the tissue reveals the exposed DNA molecule through the action of cell lysate and proteinase K. When it passes through a silica gel column that can bind to the negatively charged DNA molecule, the genomic DNA in the system is reversibly adsorbed, and the protein is removed by washing with a rinse solution. After impurities such as lipids are eluted with a purification solution to obtain genomic
  • the method and apparatus for extracting nucleic acid are not limited in this embodiment.
  • the DNA content of the examples of the present invention is not less than 50 ng.
  • the extracted DNA is used for the construction of a subsequent test sample library, and the initial amount of DNA required for constructing the test sample library in the embodiment of the present invention is lower than the requirements in the prior art, and is particularly suitable for low target nucleic acid content or difficult to obtain. sample.
  • FIG. 3 is a flowchart of a method in step 202 of Embodiment 2 of the present invention. As shown in FIG. 3, step 202 may include the following steps:
  • the DNA is disrupted to obtain a DNA fragment of a predetermined size range.
  • it can be randomly interrupted.
  • the random interruption treatment may be performed by using at least one of enzymatic cleavage, atomization, ultrasonication, or Covaris method.
  • the Covaris method is used to break the DNA fragment by the principle of moving ultrasonic focusing, and the DNA molecule is interrupted into a relatively large fragment of a certain concentration.
  • the randomly broken main bands are distributed in the range of 100-400 bp, and preferably, the size range of the DNA fragments ranges from 200 to 300 bp.
  • the DNA fragment is repaired at the end to obtain a DNA fragment which is repaired at the end.
  • the adaptor is ligated to the ends of the DNA fragment repaired at the end to obtain a DNA fragment with a linker.
  • FIG. 4 is a flowchart of another method in step 202 of Embodiment 2 of the present invention. As shown in FIG. 4, step 202 may include the following steps:
  • the DNA is disrupted to obtain a DNA fragment of a predetermined size range.
  • the DNA fragment is repaired at the end to obtain a DNA fragment which is repaired at the end.
  • the adaptor is nicked at both ends of the DNA fragment repaired at the end, and a DNA fragment without a gap with a linker is obtained.
  • linker 5 is non-phosphorylated, such as a hydroxyl group at the both ends of the directly synthesized linker, or a linker 3 having a terminal dedeoxynucleotide or the like, such that the terminal repaired DNA fragment and the At least one joint of the joint has a gap.
  • two of the DNA fragments that are end-repaired in step 2021 can be added to the base of the DNA fragment at the end of the linker. End.
  • the amount of sequencing data of each test sample only needs to reach 4M, and the aneuploidy variation of the chromosome can be detected, thereby reducing the cost of data generation.
  • the method of the present invention is applicable to the examination of all chromosomes, and the detection method is more stable, and the human chromosome test can be more comprehensively tested.
  • An optional embodiment step of constructing a sequencing library of test sample nucleic acid DNA, obtaining a test sample library may further comprise: adding a label sequence for each test sample, the label sequence being used to distinguish test samples.
  • each test sample when multiple test samples need to be detected simultaneously, each test sample can be labeled with a different barcode for use in distinguishing test samples during sequencing (Micah Hamady, Jeffrey J) Walker, J Kirk Harris et al. Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature Methods, 2008, March, Vol. 5 No. 3), thereby enabling simultaneous sequencing of multiple test samples.
  • the tag sequence is used to distinguish between different test samples, but does not affect the other functions of the test sample to which the tag sequence is added.
  • the tag sequence length can be 4-12 bp.
  • the tag sequence can be introduced by the linker ligation step or the amplification step.
  • introduction by a linker ligation step is carried out by ligation of a linker with a tag sequence, and when the linker is ligated to both ends of the end-repaired DNA fragment, the tag sequence is ligated to the DNA fragment.
  • the introduction of the tag sequence by PCR is accomplished by pre-setting the primer with the tag.
  • a chromosome aneuploidy detecting device is provided.
  • the device may include:
  • a data input unit 40 configured to input data
  • a data output unit 41 configured to output data
  • a storage unit 42 for storing data, including an executable program
  • the processor 43 is coupled to the data input unit, the data output unit, and the storage unit data for executing the executable program, and the executing of the program includes completing all or part of the steps of the various methods in the above embodiments. A detailed description of the line. The specific parameters used in the following testing process are set to:
  • Reference sequence Human genome reference sequence of version 37.3 (hgl9; NCBIBuild37.3) in the NCBI database,
  • Target sample 20 pregnant women with peripheral blood plasma samples.
  • the detection process is:
  • DNA extraction and database construction The extracted DNA fragments were screened, and DNA fragments of 200-300 bp in size were selected for end repair.
  • its components include 10X PNK Buffer (Enzymatics), dNTP and enzymes at the end of the repair.
  • Ampure beads are used to make 4 ⁇ pure DNA after 4 ⁇ . Purify with Ampure beads. The purified beads were then subjected to a concentrated fragment selection by agarose gel electrophoresis to recover a 240-260 bp fragment.
  • the recovered rubber blocks were purified by QIAquick Gel Extraction Kit, and the purified fragments were amplified using PFX (PLTINUM PFX DNA POLYMERASE brand) enzyme, and the number of cycles was 8-12 cycles. Gap translation was performed prior to PCR amplification. Immediately after translation, the polymerase chain reaction was PCR-amplified, magnetic beads were purified again, and finally dissolved in TE buffer. The constructed library (approximately 230 bp in the main band) was ligated to the ends using sequencing, and each sample was distinguished by a link with Barcode. The 2100 Bioanalyzer (Agilent) quality-tested library (insert fragment approximately 130 bp) will be PCR-injected into a water-in-oil state to form encapsulated monomolecular particles.
  • PFX PLTINUM PFX DNA POLYMERASE brand
  • the reagents, instruments, and the like involved in the above-mentioned database construction are commercially available, such as from life technologies.
  • Sequencing DNA samples obtained from the above 20 samples were processed according to the Ion Proton instructions published by Life Technologies, and were sequenced on the machine. Each sample was distinguished according to the label sequence. Using the comparison software Tmap (obtained from Life Technologies' home page), the sequencing results were compared with the reference sequence for error-tolerant alignment, and the sequencing results were located on the reference sequence.
  • Results test The results of chromosome aneuploidy analysis of the present invention are compared with CGH/FISH results, and the results are shown in Table 1 below.
  • the standard CGH analysis procedure is as follows: Use the Human Genome CGH Micro Array Kit, (Agilent Technologies Inc.), :3 ⁇ 4 to follow the manufacturer's instructions.
  • the corresponding probe Fluorescence In Situ Hybridization, FISH was designed by fluorescence in situ hybridization (CGH), and the FISHHER2 kit produced by Beijing Jinpujia was used.

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Abstract

一种染色体非整倍性检测方法及装置，其中方法包括：将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行比对，获得每个测试样本落在参考基因组上的测序序列数目，计算每个测试样本的每条染色体的测序深度，进而计算每个测试样本的每条染色体上的相对测序深度，最后计算每个测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量，再将每个测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量与预设的偏差统计量阈值进行比较，判断测试样本的每条染色体是否缺失或重复。

Description

一种染色体非整倍性检测方法及装置 技术领域
本发明涉及基因组学及生物信息学技术领域， 具体涉及一种染色体 非整倍性检测方法及装置。
背景技术
自然流产是临床妊娠的常见并发症。 其中胚胎的遗传物质异常为主 要原因， 如三体、 X单体、 四倍体等染色体异常。 自然， 了解自然流产 的病因， 检测流产胎儿的染色体情况， 对于确诊当次流产原因及对下次 妊娠有重要的指导意义。
目前， 常用的染色体非整倍性诊断的方法有： 染色体核型分析、 荧 光原位杂交 ( FISH, fluorescence in situ hybridization )、 比较基因组杂交 ( Array CGH , array comparative genomic hybridization ), 多重连接探针 扩增技术 ( MLPA , multiplex ligation-dependent probe amplification ), 短 串联重复序列结合聚合酶链反应技术 （ STR-PCR, short tendem repeat polymerase chain reaction ) 等。 目前最常用的染色体核型分析虽然可以 检测出大部分的染色体数目异常， 但是该检测方法容易因为检测标本陈 旧等因素导致误诊、 漏诊， 并且诊断周期长， 耗费的成本较大。 而 FISH 诊断技术仅能检测出染色体 13、 16、 18、 21、 22和 X/Y的异常， 同样 容易出现漏诊的情况。
发明人在对现有技术的研究与实践中发现， 目前对于自然流产的胎 儿染色体数目的检测方法易出现漏诊或误诊的情况， 并且不能适用于全 部的染色体检测， 诊断周期长， 耗费的资源较多。
发明内容
本发明实施例提供的染色体非整倍性检测方法， 包括： 将测试样本 测序后得到的测序序列与参考基因组进行比对 ,所述测试样本包含 M个 目标样本和 N个对照样本， 获得每个测试样本落在参考基因组上的测序 序列的数目 r(j),其中 M、N和 j均为正整数， j表示测试样本的编号； 计 算每个测试样本第 i号染色体的测序深度 d ( i, j ) = r(i,j) I g(i), 其中 i 为正整数且 24> i> l, r(i,j)为比对到参考基因组第 i号染色体的测序序 列数目， g(i)为第 i号染色体的大小； 计算每个测试样本第 i号染色体的 相对测序深度 D ( i, j ) = d(i,j)/ d(j), 其中 d(j)=r(j) / G, G表示基因组 的大小;计算每个测试样本第 i号染色体的相对测序深度的偏差统计量 Z
( i, j ) = ( D ( i, j ) -mean ( i ) ) /sd ( i ); 其中 mean ( i ) 为所述 N个 对照样本的第 i号染色体的相对测序深度的平均值， Sd ( i)为所述 N个 对照样本第 i号染色体的相对测序深度的标准差； 将所述偏差统计量 Z
( i, j ) 与预设的偏差统计量阈值进行比较， 判断所述测试样本的第 i 号染色体是否出现非整倍性。
本发明实施例提供的染色体非整倍性检测装置， 包括： 数据输入单 元， 用于输入数据； 数据输出单元， 用于输出数据； 存储单元， 用于存 储数据， 其中包括可执行的程序； 处理器， 与所述数据输入单元、 数据 输出单元及存储单元数据连接， 用于执行所述可执行的程序， 所述程序 的执行包括完成上述方法。
从以上技术方案可以看出， 本发明实施例具有以下优点：
本发明实施例提供的染色体非整倍性检测方法及装置， 其中方法包 括： 将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行比对， 获得测 试样本落在参考基因组上的测序序列数目， 计算每个测试样本的每条染 色体的测序深度， 进而计算每个测试样本的每条染色体上的相对测序深 度，最后计算每个测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量， 再将每个测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量与预设的 偏差统计量阈值进行比较，判断测试样本的每条染色体是否缺失或重复。 能够检测出测试样本所有染色体是否异常， 检测方法准确， 减少了漏诊 和误诊， 降低诊断周期， 节省资源。
附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式 的描述中将变得明显和容易理解， 其中：
图 1是依据本发明实施例一的方法流程图；
图 2是依据本发明实施例二的方法流程图；
图 3为本发明实施例二步骤 202的方法流程图；
图 4为本发明实施例二步骤 202的另一方法流程图；
图 5为本发明实施例三的装置结构示意图。
具体实施方式 实施例一：
依据本发明的一种实施方式， 提供一种染色体非整倍性检测方法， 参考图 1 , 该方法可以包括以下步骤：
101、将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行比对， 获 得每个测试样本落在参考基因组上的测序序列数目。
其中 , 测试样包含 M个目标样本和 N个对照样本， M和 N为正整 数。
目标样本指需要进行检测判断包含信息的样本， 例如孕妇的流产组 织样本， 包含流产胚胎或胎儿的变异信息， 正常样本指获自预先确定的 正常个体的样本。 通常而言， 目标样本与正常样本来源于同一物种， 优 选地， 具有近似的基本状态， 例如无创产前检测 21三体， 若目标样本为 孕妇外周血，则对照样本可以是胎儿 21号染色体无异常的孕妇外周血样 本。
所述参考基因组优选为人类参考基因组 hgl 8或 hgl9。 本发明的一 个实施例中为人类参考基因组 hgl9
具体的， 可以将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行 比对， 得每个测试样本落在参考基因组上的测序序列的数目 r(j) , j为正 整数， j表示测试样本的编号。
本发明中， 测试样本的来源不受特别的限制。 本发明的一个方面是 进行胎儿变异检测， 测试样本只要能够包含胎儿遗传物质即可。 在本发 明的一个实施例中利用孕妇流产的胚胎组织进行流产胎儿的变异检测， 目标样本为孕妇的流产胚胎组织。 在无创产前检测中， 测试样本（目标 样本和对照样本） 可以来源于以下至少一种： 孕妇外周血、 孕妇尿液、 孕妇宫颈胎儿脱落滋养细胞、 孕妇宫颈粘液和胎儿有核红细胞。 在其他 实施方式中， 比如有创产前检测测试样本也可以来自胎儿的脐带血、 胎 盘组织或绒毛膜组织、 未培养或培养过的羊水细胞、 绒毛组细胞等。 值 得指出的是，在提取测试样本核酸时，特别是在胚胎或胎儿无创检测中， 由于样本中除胎儿核酸外还包含孕妇自身核酸， 因此为避免干扰检测结 果， 孕妇本身应当无染色体非整倍性问题， 当然， 这种判断通常是十分 明显的。. ^ , ^ 、 ， 、 、、、 、 在本发明的实施例中， 可以釆用第三代测序平台对测试样本进行测序。 所述第三代测序平台 ( Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan;l l(l):31-46 ) 包括但不限于 Helicos 公司的真实单分子测序技术（True Single Molecule DNA sequencing ) , Pacific Biosciences 公司单分子实时测序 ( SMRTTM , single molecule real-time ), 以及 Life Technologies公司的半导体测序技术等。 本发明的 实施例中釆用了 Life Technologies公司的半导体测序平台。
在本发明中， 测试样本的测序序列与参考基因组的比对可以通过任 何一种序列比对程序进行。 例如本领域技术人员使用的 Tmap 比对和 BWA比对 （ Burrows- Wheeler Aligner ) 进行。 在本发明的一个实施方案 中， 所釆用的比对软件是 Tmap。 将测序序列与参考基因组进行比对具 体可以是： 将测序序列与参考基因组的参考序列进行比对。 所述参考序 列为已知序列， 优选的， 釆用参考基因组的参考序列是美国国家生物技 术信息中心 ( NCBI, national center for biotechnology information )数据 库中的人类基因组参考序列。 在本发明的一个实施方案中， 所述人类基 因组参考序列是 NCBI数据库中版本 37.3 ( hgl9; NCBI Build 37.3 ) 的 人类基因组参考序列。 在将对测试样本测序得到的测序序列比对到参考 基因组的参考序列时， 根据比对软件， 可釆用容错或不容错比对， 釆用 容错比对时，一般平均 lOObp允许有 1 ~ 3个容错。本发明的一个实施例 在釆用 Life Technologies公司的 Ion Proton平台测序时， 一般釆用容错 比对。
102、 计算测试样本的染色体的测序深度。
简明起见， 以 d (i, j)表示第 j个测试样本第 i号染色体的测序深 度， i为正整数且 24>i> l, d (i, j) =r(i,j)/g(i), 其中 g(i)为第 i号染 色体的大小， r(i,j)为第 j个样本的比对到参考基因组第 i号染色体的测序 序列数目。 的比对过程， 本实施例步骤不再赘述。 ' 、、乡 ' 本发明实施例中， 由于经 Ion Proton测序平台测序得到的测序序列 长短不一， 长度范围在 8-300bp, 主峰值在 200bp, 导致部分区域的测序 序列数目分布不均匀。 而测序序列的覆盖深度更加均一， 因此使用测序 深度来作统计， 可以降低覆盖深度不均一， 有效消除全基因组各区域的 深度过度不均等的问题，使测试结果更加准确，减少假阳性信号的出现。 值得指出的是， 当得到的测序序列长短均等时，本实施例方法同样适用。
103、 计算测试样本的染色体的相对测序深度。
本实施例中， 以 D (i, j)表示相对测序深度。 同样， i表示染色体 的编号， j表示测试样本的编号。
D ( i, j ) = d(i,j) I d(j), 其中 d(j)为第 j个测试样本的总平均测序深 度。
可以釆用以下计算方式得到： d(j)=r(j)/G, G表示基因组的大小。
104、 计算测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量。 以 Z ( i, j )表示偏差统计量： Z ( i, j ) = ( D ( i, j ) -mean ( i))
/sd (i)。
其中， mean (i) 和 sd (i) 利用对照样本的测序数据来确定。 由于 正常个体是预先选择确定的， 因此关于对照样本的任何检测或计算数据 均可预先产生并保存下来， 本实施方式中釆用这种预置对照样本的相关 数据的方式， 在需要时读取使用。 在其他实施方式中， 也可以釆用对照 样本同步检测和计算的方式。
mean(i)为 N个对照样本第 i号染色体上的相对测序深度的平均值。 在本发明的一个实施例中， 以 N个正常个体的对照样本作为全部测试样 本， 计算 N个对照样本的 mean ( i ), mean(i) = [D(i,l) + ... +D(i,j)]/N, D(i,j)表示第 j个对照样本第 i号染色体的相对测序深度， N表示对照样 本的数目。 在本发明的一个实施例中， 为了使检测结果更加准确可靠， 优选地， N不小于 30。 sd (i) 为 N个对照样本第 i 号染色体的相对测序深度的标准差:
Figure imgf000006_0001
偏差统计量 Z(i,j)代表了第 j个样本的第 i条染色体是否出现了缺失 或重复的统计含义， 在上述计算公式表现形式下， Z(i,j)>0倾向于重复， Z(i,j)<0倾向于缺失， 每条染色体的 Z(i,j)具有相对独立的统计意义。
105、将每个测试样本的每条染色体的相对测序深度的偏差统计量与 预设的偏差统计量阈值进行比较，判断测试样本的每条染色体是否异常。
将 Z(i,j)与预设的偏差统计量阈比较，可以判断出测试样本的每条染 色体是否缺失或重复。 步骤 104中计算了每个测试样本的第 i条染色体 的相对测序深度的偏差统计量， 该偏差统计量是相对于 N个正常样本第 i 条染色体的相对测序深度的平均值及标准差计算得到的。 基于此偏差 统计量， 只要设置相应的置信度， 即可得到偏差统计量阈值。
本实施例步骤偏差统计量阈值的设置可根据对照样本的数目以及所 需要的检测精度等选择检验规则并设置相应的置信度。 在本发明的一个 实施例中， 釆用的是基于正态分布的 U检验， 将置信度设置为 99.9%。 本实施方式中， 依据上述设置方式得到的偏差统计量阈值为 [-3,+3]。 在 其他实施方式中， 根据对照样本数目、 经验等， 也可选择 T检验等其他 检验规则， 同时地或可选地， 置信度可选择为 90% ~ 99.9%, 例如 99%、 99.5%等， 得到不同的统计检验临界值， 即为所说的偏差统计量阈值。
若测试样本的 Z (i,j)超过偏差统计量阈值上限，则可认为第 j个测试 样本的第 i号染色体出现重复（例如 3体；)， 若测试样本的 Z (i,j)低于偏 差统计量阈值下限， 则可认为测试样本 j 的第 i号染色体出现缺失 （例 如单体）， 由此可以给出测试样本的数字化核型分析结果， 例如 "第 21 号染色体 3体"、 "X染色体缺失"、 "Y染色体缺失" 等。 实施例二：
请参阅图 2, 图 2为本发明实施例二的方法流程图。 如图 2所示， 本发明实施例二的染色体非整倍性检测方法过程与实施例一相同， 与实 施例一的区别在于， 本发明实施例二在将测试样本测序后得到的测序序 列与参考基因组进行比对之前， 增加了获取测试样本的测序序列的具体 过程， 步骤可以如下：
201、 对测试样本进行核酸提取， 获得测试样本脱氧核糖核酸 (DNA,Deoxyribonucleic acid))。
在本发明中， 所述 DNA 的获取可以釆用盐析法、 过柱法、 十二烷 基苯磺酸钠 （SDS ) 法等常规 DNA提取方法从生物样本提取全基因组， 本发明实施例优选釆用柱层析法。 简言之， 柱层析法的原理在于： 细胞 或组织经过细胞裂解液和蛋白酶 K的作用后露出棵露的 DNA分子， 其 经过能与带负电的 DNA分子结合的硅胶膜柱时， 体系中的基因组 DNA 被可逆吸附， 经漂洗液清洗除去蛋白质、 脂质等杂质后， 用纯化液洗脱 获得细胞或组织中的基因组 DNA。
本实施例对提取核酸的方法和设备不作限定。本发明实施例的 DNA 含量为不小于 50ng。 提取的 DNA是用于后续的测试样本文库的构建， 本发明实施例构建测试样本文库所要求的 DNA起始量比现有技术中的 要求低， 特别适用于目标核酸含量低或是不易获取的样本。
202、 对测试样本 DNA进行测序文库构建， 获得测试样本文库。 请一并参阅图 3 , 图 3为本发明实施例二步骤 202的方法流程图。 如图 3所示， 步骤 202可以包括如下步骤：
2020、 在本发明的一个可选的实施例中， 打断 DNA, 得到预设大小 范围的 DNA片段。 为了对所获得的全基因组 DNA进行测序， 可以对其 进行随机打断处理。
根据本发明的实施例， 随机打断处理可以通过釆用酶切、 雾化、 超 声、 或者 Covaris法的至少之一。 优选地， 釆用 Covaris法利用动超声波 聚焦原理对 DNA片段进行打断，将 DNA分子打断为比较集中的一定大 小的片段。根据本发明的实施例，经过随机打断的主带分布在 100-400bp 范围内， 优选的， 预设大小范围的 DNA片段的大小范围为 200〜300bp。
2021、 末端修复 DNA片段， 得到末端修复的 DNA片段。
2022 A , 连接接头于末端修复的 DNA 片段的两端， 得到带接头的 DNA片段。
2023A、 对所述带接头的 DNA片段进行扩增， 得到所述测试样本文 库。 其中， 所述接头 5 '端磷酸化。
在另一种实施方式中，请参阅图 4, 图 4为本发明实施例二步骤 202 的另一方法流程图。 如图 4所示， 步骤 202可以包括如下步骤：
2020、 在本发明的一个可选的实施例中， 打断 DNA, 得到预设大小 范围的 DNA片段。
2021、 末端修复 DNA片段， 得到末端修复的 DNA片段。
2022B、连接接头于所述末端修复后的 DNA片段的两端，缺口平移， 得到带接头的没有缺口的 DNA片段。
2023B、 对所述带接头的没有缺口的 DNA片段进行扩增， 得到所述 测试样本文库。
其中， 所述接头 5，端非磷酸化， 比如为直接合成的接头两末端带羟 基， 或是使接头 3，末端为双脱氧核苷酸等， 使所述末端修复后的 DNA 片段与所述接头的至少一个连接处带有缺口。
一个可选的实施例， 在连接接头于末端修复的 DNA 片段的两端之 前， 可以加碱基腺嘌呤 "A" 于步骤 2021 中末端修复的 DNA片段的两 端。
本发明实施例中， 每个测试样本的测序数据量仅需达到 4M, 即可 检测出染色体的非整倍性变异， 减少了数据产生的成本。 并且本发明方 法适用于全部染色体的检验， 检测方法更稳定， 能更全面进行人类染色 体的检验。
一个可选的实施例步骤， 对测试样本核酸 DNA进行测序文库的构 建，获得测试样本文库进一步可以包括： 为每个测试样本添加标签序列， 所述标签序列用于对测试样本进行区分。
一个优选的实施例， 当需要同时检测多个测试样本时， 每个测试样 本可以被加上不同的标签序列 （barcode ), 以用于在测序过程中进行测 试样品的区分 (Micah Hamady, Jeffrey J Walker, J Kirk Harris et al. Error-correcting barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature Methods, 2008, March, Vol.5 No.3) , 从而实现同时 对多个测试样品进行测序。 值得指出的是， 标签序列为了区分不同测试 样本， 但不影响添加标签序列的测试样本的其他功能。 标签序列长度可 以是 4-12bp。
标签序列可以通过所述接头连接步骤或者所述扩增步骤引入。
具体的， 通过接头连接步骤引入， 是通过连接带标签序列的接头实 现的， 当连接接头于末端修复的 DNA 片段的两端时， 标签序列就被接 到 DNA片段上。
另一种实施方式中， 通过 PCR引入标签序列， 是通过预先设置带标 签的引物实现的。
203、 对所述测试样本文库进行测序， 获得测试样本的测序序列。 实施例三：
依据本发明的一种实施方式， 提供一种染色体非整倍性检测装置， 参考图 5 , 该装置可以包括：
数据输入单元 40, 用于输入数据；
数据输出单元 41 , 用于输出数据；
存储单元 42 , 用于存储数据， 其中包括可执行的程序；
处理器 43 , 与所述数据输入单元、 数据输出单元及存储单元数据连 接， 用于执行所述可执行的程序， 所述程序的执行包括完成上述实施方 式中各种方法的全部或部分步骤。 行详细的描述。 下述检测过程所使用的具体参数设置为：
1. 参考序列： NCBI数据库中版本 37.3 ( hgl9; NCBIBuild37.3 ) 的 人类基因组参考序列，
2. 目标样本： 20例孕妇外周血血浆样本。 检测过程为：
1. DNA提取与建库： 对提取的 DNA片段进行筛选，选取 200-300bp 大小范围的 DNA 片段， 进行末端修复。 在末端修复体系中， 其成分包 括 10X PNK Buffer ( Enzymatics ) , dNTP和修复末端的酶. 末端修复后 , 用 Ampure beads进行纯 4匕， 纯 4匕后的 DNA进行接头连接。再用 Ampure beads 进行纯化。 然后由琼脂糖凝胶电泳将磁珠纯化后的片段进行集中 片段选择， 回收 240-260bp 的片段。 回收的胶块进行 QIAquick Gel Extraction Kit 纯化， 纯化后的片段利用 PFX ( PLATINUM PFX DNA POLYMERASE品牌 ) 酶进行扩增， cycles数为 8-12个 cycles。 在 PCR 扩增前先进行缺口平移。 平移后立即进行聚合酶链式反应 PCR扩增， 再 次进行磁珠纯化， 最后用 TE buffer进行溶解。 构建好的文库（主带约为 230bp )其两端被加上测序所用接头， 每个样本通过带有 Barcode的接头 进行区分。 2100 Bioanalyzer (Agilent)质检合格的文库 （插入片段为约 130bp ) 将被 emulsion PCR成油包水状态， 形成包裹单分子颗粒。
上述建库实施中涉及的试剂、仪器等都可通过市面购得，如购自 life technologies。
2. 测序：对于获自上述 20例血浆的 DNA样本按照 Life Technologies 官方公布的 Ion Proton说明书进行操作， 进行上机测序， 每个样本根据 标签序列进行区分。 利用比对软件 Tmap (获自 Life Technologies公司主 页），将测序结果与参考序列进行不容错比对，得到测序结果在参考序列 上的定位。
3. 数据分析： 计算每个测试样本的 Z (i,j), 并将 Z (i,j)与偏差统计 量阈值进行比较， 获得检测结果。
4. 结果检验： 以下将本发明染色体非整倍性分析结果与 CGH/FISH 结果比较， 比较结果如下表 1 所示。 标准 CGH分析步骤如下： 验使用 Human Genome CGH Micro array Kit, ( Agilent Technologies Inc. ), :¾全 按照厂商的使用说明进行操作。 对 CGH 芯片结果再利用荧光原位杂交 技术设计相应的探针 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) , 本实险 使用北京金普嘉生产的 FISHHER2试剂盒。 判断结果 样^编 测序结果 CGH结果 F I SH结果
A350 2号三体 2号重复 2号三体 一致
A221 3号三体 3号重复 3号三体 一致
A230 4号三体 4号重复 4号三体 一致
A443 5号三体 5号重复 5号三体 一致
A1554 6号三体 6号重复 6号三体 一致
A520 7号三体 7号重复 7号三体 一致
A594 8号三体 8号重复 8号三体 一致
A1925 9号三体 9号重复 9号三体 一致
A385 10号三体 10号重复 10号三体 一致
A570 11号三体 11号重复 11号三体 一致
A382 12号三体 12号重复 12号三体 一致
A352 1 3号三体 13号重复 1 3号三体 一致
A2064 14号三体 14号重复 14号三体 一致
A707 14号三体 14号重复 14号三体 一致
A236 14号三体 14号重复 14号三体 一致
A233 16号三体 16号重复 16号三体 一致
A240 17号三体 17号重复 17号三体 一致
A1838 18号三体 18号重复 18号三体 一致
A1682 20号三体 20号重复 20号三体 一致
A225 21号三体 21号重复 21号三体 一致
A254 22号三体 22号重复 22号三体 一致
表 1.
以上所述仅为本发明的较佳实施例， 应当理解， 这些实施例仅用以 解释本发明， 并不用于限定本发明。 对于本领域的一般技术人员， 依据 本发明的思想， 可以对上述具体实施方式进行变化。

Claims

权 利 要 求
1、 一种染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 包括：
将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行比对， 所述测 试样本包含 M个目标样本和 N个对照样本， 获得每个测试样本落在参 考基因组上的测序序列的数目 r(j), 其中 M、 N和 j均为正整数， j表示 测试样本的编号；
计算每个测试样本第 i号染色体的测序深度 d ( i, j ) = r(i,j) / g(i), 其中 i为正整数且 24 > i > 1 , r(i,j)为比对到参考基因组第 i号染色体的测 序序列数目， g(i)为第 i号染色体的大小；
计算每个测试样本第 i号染色体的相对测序深度 D ( i, j ) = d(i,j) I d(j), 其中 d(j)= r(j) / G, G表示基因组的大小;
计算每个测试样本第 i号染色体的相对测序深度的偏差统计量 Z( i, j ) = ( D ( i, j ) -mean ( i ) ) /sd ( i ); 其中 mean ( i ) 为戶斤述 N个对照样 本的第 i号染色体的相对测序深度的平均值， sd ( i ) 为所述 N个对照样 本第 i号染色体的相对测序深度的标准差；
将所述偏差统计量 Z ( i, j )与预设的偏差统计量阈值进行比较， 判 断所述测试样本的第 i号染色体是否出现非整倍性。
2、 如权利要求 1所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所 述测试样本选自以下至少一种： 孕妇外周血、 孕妇尿液、 孕妇宫颈胎儿 脱落滋养细胞、 孕妇宫颈粘液和胎儿有核红细胞以及孕妇的流产胚胎组 织。
3、 如权利要求 2所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所 述测试样本优选来自孕妇流产胚胎组织。
4、 如权利要求 1-3中任意一项所述的染色体非整倍性检测方法， 其 特征在于， 所述参考基因组为人类参考基因组 hgl9。
5、 如权利要求 1-3中任意一项所述的染色体非整倍性检测方法， 其 特征在于， 所述 N个对照样本的个数不少于 30。
6、 如权利要求 1-3中任意一项所述的染色体非整倍性检测方法， 其 特征在于， 所述将测试样本测序后得到的测序序列与参考基因组进行比 对之前包括：
对测试样本进行核酸提取， 获得测试样本脱氧核糖核酸 DNA;
对所述测试样本 DNA进行测序文库构建， 获得测试样本文库； 对所述测试样本文库进行测序， 获得测试样本的测序序列。
7、 如权利要求 6所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所述测试样本 DNA含量为不小于 50ng。
8、 如权利要求 6所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所 述对测试样本 DNA进行测序文库构建包括： 末端修复所述 DNA片段， 得到末端修复的 DNA片段； 连接接头于所述末端修复的 DNA片段的两端，得到带接头 DNA片 段；
对所述带接头的 DNA片段进行扩增， 得到所述测试样本文库； 其中， 所述接头 5，末端磷酸化。
9、 如权利要求 6所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所 述对测试样本 DNA进行测序文库构建包括：
末端修复所述 DNA片段， 得到末端修复后的 DNA片段；
连接接头于所述末端修复后的 DNA 片段的两端， 缺口平移， 得到 带接头的没有缺口的 DNA片段；
对所述带接头的没有缺口的 DNA 片段进行扩增， 得到所述测试样 本文库；
其中， 所述接头末端非磷酸化。
10、 如权利要求 8或 9所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在 于， 所述末端修复所述 DNA片段之前包括：
打断所述 DNA, 得到预设大小范围的 DNA片段。
11、 如权利要求 8或 9所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在 于， 所述连接接头于所述末端修复的 DNA 片段的两端之前包括： 加碱 基腺嘌呤 "A" 于所述末端修复的 DNA片段的两端。
12、 如权利要求 10所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所述预设大小范围的 DNA 片段的大小范围为 100-400bp , 优选为 200-300bp。
13、 如权利要求 6所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所述对测试样本核酸 DNA进行测序文库的构建， 获得测试样本文库进 一步包括：
为每个测试样本添加标签序列， 所述标签序列用于对测试样本进行 区分；
所述标签序列通过所述接头连接步骤或者所述扩增步骤引入。
14、 如权利要求 1-3 中任意一项所述的染色体非整倍性检测方法， 其特征在于， 所述偏差统计量阈值的设置包括：
按照预置的 U检验规则， 将置信度设置为 99.9%计算所述偏差统计 量阈值的边界值为 [-3, +3]。
15、 一种染色体非整倍性检测装置， 其特征在于， 包括：
数据输入单元， 用于输入数据；
数据输出单元， 用于输出数据；
存储单元， 用于存储数据， 其中包括可执行的程序；
处理器， 与所述数据输入单元、数据输出单元及存储单元数据连接， 用于执行所述可执行的程序， 所述程序的执行包括完成如权利要求 1-14 任意一项所述的方法。
16. 一种计算机可读存储介质， 其特征在于， 用于存储供计算机执 行的程序，所述程序的执行包括完成如权利要求 1-14任意一项所述的方 法。
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