CN113663078B - Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途 - Google Patents

Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113663078B
CN113663078B CN202110721314.0A CN202110721314A CN113663078B CN 113663078 B CN113663078 B CN 113663078B CN 202110721314 A CN202110721314 A CN 202110721314A CN 113663078 B CN113663078 B CN 113663078B
Authority
CN
China
Prior art keywords
egfr
fbxl2
grp94
cells
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110721314.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113663078A (zh
Inventor
肖智雄
牛孟孟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202110721314.0A priority Critical patent/CN113663078B/zh
Publication of CN113663078A publication Critical patent/CN113663078A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113663078B publication Critical patent/CN113663078B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。本发明首次发现了FBXL2可以作用于EGFR，并能有效抑制EGFR进而达到干预EGFR驱动的癌症的目的，还发现Grp94是EGFR介导的相关肿瘤的治疗靶点，抑制Grp94可显著增强FBXL2介导的EGFR降解，并进一步抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长，为临床治疗EGFR驱动的癌症，特别是耐性性的癌症提供新的选择。

Description

Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。
背景技术
肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞肺癌占肺癌的85％左右。非小细胞肺癌具有发病隐匿、恶性程度较高、难以早期发现、易复发转移等特点，导致非小细胞肺癌预后非常不好，患者生存率低，生存期短。
非小细胞肺癌的病理病机非常复杂，根据发病位置的不同可以分为肺腺癌、肺鳞癌、大细胞癌，根据发病机制不同可以分为很多不同的类型，比如常见的信号通路包括：人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、FMS样的酪氨酸激酶3(FLT3)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等等。根据发病机理的不同，给予的治疗药物不同。
表皮生长因子受体(EGFR)是肺癌最重要的驱动基因之一，EGFR可通过信号转导通路调节肿瘤细胞的周期，促进肿瘤细胞增殖，诱导血管生成，促进肿瘤的扩散及转移，同时可降低细胞毒性药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤的不断生长以及转移。具体地，EGFR的活化包括EGFR受体与配体结合，激活受体后EGFR受体发生二聚化，胞内区酪氨酸激酶相互磷酸化后，磷酸化的酪氨酸部位与胞内的信号传导蛋白结合，形成信号传导蛋白复合物，同时信号传导蛋白被激活，持续活化的EGFR通路将向肿瘤细胞内传递生长、增殖和抗凋亡信号。因此，以EGFR为靶点可以治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌。
EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，是靶向于EGFR的药物。其通过选择性结合细胞内酪氨酸激酶区，竞争性抑制了EGFR与ATP的结合，抑制EGFR激酶活性，从而抑制信号转导通路的最终生物学效应，达到治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的目的。EGFR-TKIs包括第一代、第二代和第三代EGFR-TKIs。第一代酪氨酸激酶抑制剂有吉非替尼(Gefitinib)，厄洛替尼(Erlotinib)和拉帕替尼(Lapatinib)等；为了克服第一代EGFR-TKIs的耐药性，制药公司开发了第二代EGFR-TKIs包括阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)，凡德他尼(Vandetanib)，来那替尼(Neratinib)等；第三代EGFR-TKIs包括奥希替尼(Osimertinib)，Rociletinib，Olmutinib等。
EGFR-TKIs显著地改善了晚期患者的总生存期(overall survival，OS)和生存质量，但几乎所有患者在接受治疗的同时均出现了耐药。其中，第一代EGFR-TKI药物包括吉非替尼、厄洛替尼，患者接受治疗后平均10个月左右会出现耐药，这与EGFR基因第20号外显子的密码子790位苏氨酸突变为甲硫氨酸(T790M)密切相关，T790M突变主要是通过增加ATP对EGFR活性位点的亲和力而引起了耐药性，使其在临床应用上受限；第二代不可逆抑制剂阿法替尼(Afatinib)和达可替尼(Dacotinib)通过亲电麦克加成受体与靠近EGFR-ATP结合位点的半胱氨酸残基(Cys797)发生共价反应，克服了因T790M突变产生的耐药性。但是第二代EGFR-TKI抑制剂缺乏对野生型EGFR的选择性，具有较严重的皮疹和胃肠道不良反应，导致其治疗窗狭窄而限制临床应用；而第三代EGFR-TKIs(以奥希替尼为代表)为高度选择性T790M突变小分子抑制剂，但是最新发现使用奥希替尼会出现C797S突变。
因此，需要进一步研发新的药物，解决目前EGFR-TKIs耐药的问题，治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌。
发明内容
本发明的目的是提供治疗EGFR驱动的癌症的药物以及降低肺癌耐药的药物。
本发明首先提供了Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。
进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的肺癌、食管癌、头颈癌、神经胶质瘤或结直肠癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗耐药性非小细胞肺癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗存在EGFR T790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌的药物。
其中，所述Grp94抑制剂是降低机体Grp94含量的物质，可以是沉默Grp94基因的shRNA，比如，shGrp94-1：CCGGTCGCCTCAGTTTGAACATTGATTCAGAGATCAATGTTCAAACTGAGGCGATTTTTG；shGrp94-2：CCGGAAGTTGATGTGGATGGTACATTCAAGAGATGTACCATCCACATCAACTTTTTTTG)。
其中，所述Grp94抑制剂是抑制Grp94活性的物质。
本发明还提供了一种治疗肺癌的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的Grp94抑制剂和FBXL2激活剂，以及药学上可接受的载体。
优选地，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的Grp94抑制剂、FBXL2激活剂和EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂，以及药学上可接受的载体。
其中，所述Grp94抑制剂是降低机体Grp94含量的物质，可以是沉默Grp94基因的shRNA，比如，shGrp94-1：CCGGTCGCCTCAGTTTGAACATTGATTCAGAGATCAATGTTCAAACTGAGGCGATTTTTG；shGrp94-2：CCGGAAGTTGATGTGGATGGTACATTCAAGAGATGTACCATCCACATCAACTTTTTTTG)。
其中，所述Grp94抑制剂是抑制Grp94活性的物质。
其中，所述Grp94抑制剂是Ganetespib。
其中，所述FBXL2激活剂是提高机体FBXL2含量的物质比如，可以表达FBXL2的重组质粒；或者是激活FBXL2活性的物质，比如Nebivolol。
其中，所述EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂是Erlotinib，Gefitinib和/或Osimertinib。
本发明还提供了前述联合用药物在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。
进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的肺癌、食管癌、头颈癌、神经胶质瘤或结直肠癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗耐药性非小细胞肺癌的药物。
进一步地，所述药物是治疗存在EGFR T790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌的药物。
本发明还提供了检测肺组织Grp94表达水平的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。其中，所述试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂、Western Blot检测方法用试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
术语解释：
EGFR驱动的癌症：是指EGFR信号通路异常激活的癌症。EGFR驱动的癌症包括很多，例如非小细胞肺癌，食管癌，头颈癌等。
存在EGFR T790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌：是指非小细胞肺癌细胞中的EGFR存在T790M突变、L858R突变和C797S突变中的任意一种或者任意多种；其中，T790M突变是指EGFR蛋白第790位氨基酸从苏氨酸(T)突变为蛋氨酸(M)；L858R突变是指EGFR蛋白第858个氨基酸从亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)；C797S突变是指EGFR蛋白第797个氨基酸从半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)。
降低EGFR驱动的癌症的耐药性：是指提高癌症对药物的敏感型。
增敏剂：能提高癌症对药物敏感型的药物。
FBXL2(F-box and leucine rich repeat protein 2)，NM_012157，F-框亮氨酸丰富重复蛋白。
FBXL2激活剂：是指能提高机体中FBXL2 E3泛素化酶活性的任何物质，包括直接提高FBXL2含量的物质，如提升FBXL2表达水平的物质，还包括激活FBXL2 E3泛素化酶活性的物质。
Nebivolol：中文名奈必洛尔，CAS号:118457-14-0，分子式:C22H25F2NO4分子量:405.43，结构式为
Figure BDA0003136640840000031
Grp94，即葡萄糖调节蛋白94，又叫做内质网蛋白99。
Grp94抑制剂：是指能降低机体中Grp94的ATPase活性的任何物质，包括直接降低Grp94含量的物质，如降低Grp94表达水平的物质，还包括抑制Grp94活性的物质。
Ganetespib：是一种热休克蛋白90(HSP90)抑制剂，CAS号：888216-25-9。分子式：C20H20N4O3。结构式如下：
Figure BDA0003136640840000032
Erlotinib：厄洛替尼，第一代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂
Gefitinib：吉非替尼，第一代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂。
Osimertinib：奥希替尼，第三代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂。
本发明首次发现了FBXL2可以作用于EGFR，并能有效抑制EGFR进而达到干预EGFR驱动的癌症的目的，为临床治疗EGFR驱动的癌症(尤其是非小细胞肺癌)提供了一种新的选择。本发明还发现Grp94可以作用于EGFR，Grp94抑制剂能够治疗EGFR驱动的癌症，特别式可以用于耐药性癌症，还可以与FBXL2激动剂、EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂联合使用，以治疗耐药性非小细胞肺癌。
本发明提供的前述Grp94抑制剂、联合用药物等为临床治疗EGFR驱动的癌症(尤其是非小细胞肺癌)提供了一种新的选择，特别是对已经产生了耐药的非小细胞肺癌患者提供一种有效的治疗药物，克服现有EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的问题，为耐药的非小细胞肺癌患者带来福音，具有非常优良的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1FBXL2以EGF非依赖性方式靶向EGFR进行多泛素和蛋白酶体介导的降解
(A)在H1299(野生型EGFR)、PC-9(EGFR19del)或H1975(EGFRL858R/T790M)细胞中稳定表达针对FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP的shRNAs，然后进行Western blot分析；
(B)稳定表达HA-FBXL2的PC-9细胞，在无血清培养基中培养12小时，然后用或者不用100ng/mL EGF处理10分钟，然后收集细胞进行Western blot分析；
(C-D)稳定表达空载或HA-FBXL2的H1975细胞，在有血清(10％)或无血清的情况下生长12小时，然后用50μg/mL的放线菌酮(CHX)在指定的时间间隔内处理。收集细胞裂解液进行Western blot分析，并对EGFR蛋白水平进行了定量分析，绘制蛋白半衰期的曲线图；
(E)稳定表达HA-FBXL2的H292或H1975细胞，利用20μM的MG132(中文名称:蛋白酶体抑制剂；CAS号:133407-82-6；分子式:C26H41N3O5)处理6小时，然后进行Western blot分析；
(F)将FBXL2与空载对照质粒、野生型HA-EGFR、HA-EGFRL858R或HA-EGFRT790M表达质粒共转染HEK293T细胞，然后细胞培养过夜，利用20μMMG132处理细胞4小时，进行IP(免疫沉淀)-Western分析；
(G)稳定表达Flag-EGFR的H1299细胞，利用20μM的MG132处理4小时，进行IP-Western分析；
(H)用MG132处理H1975细胞4小时，对内源性FBXL2蛋白用FBXL2抗体或者正常兔IgG特异性抗体进行免疫沉淀，然后用Western blot检测FBXL2和EGFR；
(I)在稳定表达HA-FBXL2的H1299细胞中，利用MG132处理4小时，然后收集细胞进行IP-Western分析；
(J)将Flag-EGFR、FBXL2或野生型HA-ubiquitin、lys48或lys63突变表达质粒共转染HEK293T细胞。细胞培养过夜，用MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；
(K)在体外泛素化试验中，共转染Flag-EGFR表达质粒与HA-FBXL2或HA-FBXL2△F表达质粒到HEK293T细胞中。细胞培养过夜，用MG132处理4小时，免疫沉淀的HA-FBXL2或HA-FBXL2△F蛋白，添加到由重组E1和E2s、ATP组成的反应混合液中，添加或不添加泛素(Ub)和醛泛素，反应混合物用于免疫印迹分析。
图2FBXL2与EGFR的激酶结构域相互作用，进而导致EGFR蛋白降解
(A)本研究构建的EGFR缺失突变体的示意图；
(B)FBXL2表达质粒和Flag-EGFR表达质粒共转染HEK293T细胞，细胞培养过夜后，用20μM MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；
(C)用BLI法测定重组FBXL2/SKP1蛋白与EGFR激酶的亲和力，用KD值表示；
(D)本研究中使用的FBXL2缺失突变体的示意图；
(E)将Flag-EGFR与HA-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞。细胞培养过夜后，利用20μM MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；
(F)对稳定表达Vector空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2C420S的H292细胞、H1975细胞或PC-9细胞进行Western blot分析；
(G)稳定表达HA-FBXL2、HA-FBXL2C420S或载体对照的H1299细胞或H1975细胞，利用MG132处理4小时，用于IP-Western分析；
(H)对稳定表达Vector空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2C420S的H1299或H1975细胞进行细胞质(CYTO)和质膜(PM)分离，然后进行Western blot分析；
(I)稳定表达Flag-FBXL2或Flag-FBXL2C420S的H1299细胞用MG132处理6小时，Flag(红色)和内源性EGFR(绿色)免疫染色，用DAPI复染，比例尺＝25μm。
图3FBXL2抑制EGFR过表达或EGFRL858R/T790M驱动的NSCLC生长，其表达与EGFR表达呈 负相关
(A)对H292稳定细胞进行免疫印迹或MTS分析，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；
(B-C)稳定表达HA-FBXL2、HA-FBXL2C420S或载体对照的H292细胞，利用(B)Westernblot分析或(C)异种移植肿瘤生长测定(n＝5/组)；在接种后第19天对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并观察其生长情况；绘制肿瘤生长曲线显示；数据以平均数±SEM表示，**p<0.01，***p<0.001；
(D-G)利用转基因小鼠Rosa26-LSL-EGFRL858R/T790M，检测FBXL2对EGFRT790M介导的TKI耐药的影响；(D)显示了代表性的Micro-CT图像(左面板)，卡其色、绿红色或紫色红色分别代表心脏、肺或肿瘤，肺被解剖、固定，并检查肿瘤个结节的表面(右面板)；(E)是肺表面可见结节的数目，数据以平均数表示±SEM，***p<0.001；(F-G)石蜡包埋肺，分别进行(F)H&E染色或(G)IHC检测EGFR和p-EGFR蛋白的表达检测；数据通过AOD统计，数据以平均数±SEM表示，***p<0.001；
(H)FBXL2在人肺腺癌(LUAD)中的表达与EGFR呈负相关；采用人LUAD连续组织微阵列切片，对IHC进行EGFR和FBXL2的皮尔逊相关分析；用AOD定量统计EGFR阳性组织；
(I)应用TCGA数据库(LUAD和LUSC)分析了EGFR突变的NSCLC和正常肺组织中FBXL2的mRNA水平，数据用平均数±SD表示；
(J)用FBXL2的mRNA表达水平对肺癌患者的总生存率(OS)进行Kaplan-Meier图的分层分析。
图4Grp94与FBXL2竞争结合EGFR，抑制Grp94可促进FBXL2介导的EGFR降解，进而抑 制EGFR-TKI耐药性肺癌的生长
(A)利用Western blot方法检测在PC-9或H1975细胞中沉默Grp94(shGrp94-1或shGrp94-2)对EGFR蛋白的影响；
(B)将Flag-EGFR、Myc-Grp94、HA-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞，然后用MG132处理细胞4小时后进行IP-Western分析；
(C)将稳定表达HA-FBXL2和/或Myc-Grp94的PC-9细胞进行Western blot分析；
(D)将Flag-EGFRT790M和HA-FBXL2质粒共转染HEK293T细胞，然后利用Ganetespib(8nM)处理细胞12小时，用MG132处理细胞4小时后进行IP-Western分析；
(E)在稳定表达HA-FBXL2或载体对照的H1975细胞中，利用Ganetespib(8nM)处理处理细胞12小时，然后进行Western blot分析；
(F-H)异种移植瘤生长测定；在稳定表达HA-FBXL2或空载的PC-9细胞中转染表达EGFR或Myc-Grp94的重组慢病毒，然后将该细胞(2.5×106)进行异种移植瘤生长试验(n＝5/组)；根据实验结果绘制生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；**p<0.01，***p<0.001；
(I-J)在BALB/C裸鼠(n＝5/组)上接种(5×105)稳定过表达FBXL2或/和沉默Grp94的H1975细胞；测量肿瘤生长曲线和肿瘤重量；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
(I-M)使用生物发光成像检测异种移植瘤生长，在BALB/C裸鼠(n＝5/组)上接种(5×105)稳定表达HA-FBXL2或空载体的H1975细胞，使用或不使用Erlotinib或Ganetespib治疗；检测生物发光成像、生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5Nebivolol是FBXL2的激活剂，可促进EGFR降解并抑制肿瘤生长
(A)H1975细胞稳定表达shFBXO3-1或shFBXO3-2，利用Western blot分析EGFR蛋白及其下游信号通路的表达；
(B)Nebivolol的化学结构，以及Nebivolol和FBXO3-ApaG分子对接模型；
(C)通过LigPlot80分析FBXO3-ApaG结构域中残基(T367、T368、E341、I333和F369)和Nebivol的相互作用示意图，氢键或静电相互作用分别以绿色或蓝色划线突出显示，疏水相互作用被认为是短辐射红线；
(D)将Flag-FBXL2和HA-FBXO3表达质粒共转染HEK293T细胞；细胞过夜培养，用20μM MG132处理4h，进行IP-Wstern分析；
(E)将HA-FBXO3和Flag-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞，并与10μMNebivolol处理36小时，不处理组为对照组，再用20μM MG132处理4小时，进行IP-Wstern分析；
(F)用不同剂量Nebivolol处理H1975细胞，然后进行Western blot检测；
(G)稳定沉默FBXL2(shFBXL2)或GFP(shGFP)的H1299细胞，利用10μMNebivolol处理48h后，进行Western-blot实验；
(H)PC-9或H1975细胞用Nebivolol或BC-1215处理72小时，然后利用MTS法测定细胞活力，并绘制曲线图和IC50；数据以平均数±SD表示；
(I-L)用转基因小鼠(ROA26-LSL-EGFRL858R/T790M)(n＝5/组)评估Nebivolol对肺癌EGFR表达和EGFR-TKIs耐药的影响；(I)显示了对照组或Nebivolol治疗组小鼠肺的代表性荧光图像(左图)和照片(右图)，红色荧光显示EGFR高表达；(J)肺表面可见结节的数目；(K-L)石蜡包埋肺切片，(K)H&E染色或(L)IHC检测FBXL2和EGFR；数据通过AOD方法进行统计,数据以平均数±SEM表示；**p<0.01，***p<0.001；
(M)将H1975细胞(5×105)皮下注射于BALB/C裸鼠右侧(n＝5/组)；从第5天开始，小鼠通过腹腔注射Ganetespib(50mg/kg)，每周一次，和/或Nebivolol(10mg/kg)，每周六次。药物治疗19天后，对小鼠实施例安乐死，解剖肿瘤。绘制生长曲线和测定肿瘤重量；数据以平均数±SEM表示，*p<0.05。
图6FBXL2的激活可克服NSCLC对Osimertinib的耐药性
(A)将HA-FBXL2和Flag-EGFRC797S或Flag-EGFRT790M/C797S表达质粒共转染HEK293T细胞，36小时后，进行Western blot实验；
(B-C)HEK293T细胞在HA-FBXL2或载体对照的存在下，与Flag-EGFRT790M/C797S共转染36小时，然后用50μg/mL的环己酰亚胺(CHX)处理，细胞裂解物进行Western blot分析；对EGFR蛋白水平进行了定量分析，并绘制代表蛋白质半衰期的曲线图；
(D-G)在稳定表达空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2C420S的PC-9-Flag-EGFRT790M/C797S细胞中分别进行(D)Western blot实验或(E-G)异种移植肿瘤生长实验(n＝6/组)；对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并拍照；绘制生长曲线和肿瘤重量；肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
(H)用HA-FBXL2的慢病毒感染稳定表达EGFRCT790M/C797S(PC-9/AZDR)的PC-9细胞，利用Osimertinib处理细胞72小时进行MTS实验，重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；
(I)PC-9/AZDR细胞用Osimertinib处理，或同时用50μM的Nebivolol处理48h处理，进行MTS分析；重复三次，数据用平均数±SD表示，*p<0.05，***p<0.001；
(J-K)PC-9/AZDR细胞(2×105)用于异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；单独使用Nebivolol或者与Osimertinib联合使用，检测其对肿瘤生长的影响；绘制生长曲线和测定肿瘤重量，数据以平均数±SEM表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
(L)工作模型，E3泛素连接酶FBXL2靶向EGFR和EGFR突变体，使蛋白酶体降解，从而抑制肿瘤生长和NSCLC的TKI抵抗；Grp94结合并保护EGFR免受FBXL2介导的降解；FDA批准的药物Nebivolol可以破坏FBXO3-FBXL2相互作用以稳定FBXL2，并降解EGFR，从而抑制NSCLC生长和TKI耐药性。
图7FBXL2以EGF非依赖性方式靶向EGFR进行蛋白酶体降解
(A)将H1299或H1975细胞在无血清DMEM中培养12h，并用20μg/ml的MG132处理6小时或45μM的Chloroquine(CLQ)处理24小时，用100ng/ml的EGF处理10min，然后进行Westernblot分析；
(B)用F-box家族E3连接酶的慢病毒shRNAs混合物感染H1299细胞，然后进行Western blot实验；
(C)对稳定表达空载质粒或HA-FBXL2的H1299、H292、PC-9或H1975细胞进行Western blot实验；
(D)FBXL2抑制EGFR蛋白的表达，与EGF刺激无关；将稳定表达Vector或HA-FBXL2的H1299或H1975细胞，在有或没有血清(10％)的培养基中培养12小时，然后无血清培养的细胞用或者不用100ng/ml EGF一起处理10分钟，然后收获细胞进行Western blot实验分析；
(E-F)利用MG132或氯喹(CLQ)处理稳定表达HA-FBXL2或空载质粒的H1299、H292、PC-9或H1975细胞，然后进行Western blot实验分析；
(G)重组纯化FBXL2/SKP1蛋白与重组纯化EGFR激酶蛋白部分(aa695-1022；EGFR-K)，纯化的重组EGFR激酶部分进行生物素化标记；
(H)EGFR和FBXL2均定位于细胞质膜和ER；上图：H1299细胞用EGFR抗体(绿色)和ER示踪剂(红色)进行免疫荧光染色，用DAPI(蓝色)复染，下图：稳定表达Flag-FBXL2的H1299用Flag抗体(绿色)和Grp78抗体(红色)进行免疫荧光染色，并用DAPI(蓝色)进行复染；(I)在稳定表达Flag-FBXL2、Flag-FBXL2C420S或载体对照的H1299细胞进行Flag(红色)和内源性EGFR(绿色)免疫荧光染色，比例尺＝25μm。
图8FBXL2以EGFR信号依赖的方式抑制肺肿瘤细胞增殖
(A-B)FBXL2不能抑制含有活化Ras的NSCLC细胞的增殖；对A549(含有K-RasG12S)或H1299(含有N-RasQ61K)稳定细胞株进行免疫印迹和MTS分析，重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。
图9FBXL2抑制EGFR-TKIs耐药性NSCLC的生长
(A)对稳定沉默FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP(-)的H1975细胞进行Western blot分析；
(B-D)稳定表达HA-FBXL2(WT)、HA-FBXL2ΔF或HA-FBXL24A的H1975细胞进行(B)Western blot分析；(C)实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)或(D)克隆形成分析，数据以平均数表示±SD，*p<0.05，**p<0.01；
(E)用于构建ROSA26-LSL-EGFRL858R/T790M转基因小鼠(C57BL/6)的质粒的示意图；用于研究HA-FBXL2在TKI耐药性肺肿瘤生长中的作用的实验流程图；AdeCre(2.5×107PFU)；Lenti-HA-FBXL2(3×106PFU)；
(F-G)将图3D所示的肺固定，石蜡包埋，切片，置于IHC中检测EGFR、p-EGFR、HA、Ki67和切割的caspase-3(CC3)，数据以AOD进行统计，并以平均数±SEM表示，***p<0.001；
(H)FBXL2在肺鳞癌中的表达与EGFR呈负相关，从LUSC获得的连续组织微阵列切片进行IHC分析，以确定EGFR和FBXL2的Pearson相关性，采用平均光密度(AOD)法对EGFR阳性组织进行定量分析；
(I)NSCLC细胞FBXL2与EGFR的相关性研究，对人支气管上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞H1299、H292、PC-9或H1975进行Western blot分析。
图10Grp94抑制剂可增强FBXL2抑制TKI耐药性肿瘤生长的功能
(A-B)利用TCGA数据库分析肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中FBXL2和Grp94的mRNA水平；数据以平均数±SD表示；
(C)图4F所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片，IHC检测EGFR、p-EGFR和HA；
(D)稳定表达Flag-EGFRT790M和HA-FBXL2或空载质粒的PC-9细胞，使用Ganetespib(8nM)处理48小时后，然后进行MTS实验；数据以平均数±SD表示，***p<0.001；(E-F)图4I所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片和IHC检测EGFR、p-EGFR、HA、Ki67和剪切的半胱氨酸蛋白酶-3(CC3)；数据通过AOD统计，并以平均数±SEM表示，***p<0.001。
图11Nebivolol通过上调FBXL2表达以抑制细胞增殖
(A)用于DrugBank数据库小分子抑制性分子的虚拟筛选的流程图；
(B)显示了计算机预测分数(Vina分数和Cyscore)和对接图三个得分最高的化学结构；
(C)PC-9细胞用Nebivolol，Flibanserin或Raltegravir处理24小时后，然后进行Western blot分析；
(D)PC-9细胞用Nebivolol处理24小时，然后进行Western blot分析；
(E)H1975细胞利用5μM或15μM的Nebivolol治疗24小时后，然后利用MG132处理6小时或氯喹处理12小时，然后进行Western blot实验；
(F)PC-9或A549细胞利用10μM Nebivolol处理后，进行Western blot分析(左图)或MTS分析(右图)。实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。
图12Nebivolol抑制Erlotinib耐药性NSCLC的生长
(A-B)将图5I所示的肺固定，石蜡包埋，切片，并进行IHC以检测EGFR、FBXL2、Ki67和切固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR、FBXL2、Ki67、剪切的caspase-3(CC3)；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示，***p<0.001；
(C)用Nebivolol(10μM)或Ganetespib(8nM)处理H1975细胞，单独或联合处理36h，然后进行Western blot分析；
(D-H)利用H1975细胞(5×105)进行异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；将肿瘤固定，石蜡包埋，切片，利用IHC检测EGFR、p-EGFR(Try1068)、FBXL2、Ki67和剪切的caspase-3(CC3)的表达，测定小鼠体重；数据通过AOD方法进行统计。数据以平均数±SEM表示，**p<0.01，**p<0.001。
图13激活FBXL2可抑制Osimertinib耐药性NSCLC的生长
(A)将HA-FBXL2与野生型Flag-EGFR或Flag-EGFR突变体表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36小时后，进行Western blot实验；
(B)将FBXL2和EGFR表达质粒共转染HEK293T细胞；细胞培养过夜，用20μMMG132处理4h后，进行IP-Western分析；
(C)稳定表达Flag-EGFRT790M/C797S(PC-9-Flag-EGFRT790M/C797S)的PC-9细胞利用用6nM Osimertinib处理36小时后，进行Western blot分析或MTS分析；
(D)对稳定表达HA-FBXL2或HA-FBXL2C420S的PC-9-Flag-EGFRT790M/C797S细胞进行MTS分析，实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；
(E)稳定表达Flag-EGFRT790M/C797S或载体对照的PC-9细胞用Osimertinib(6nM)或Nebivolol(10μM)处理36小时，或指定的时间间隔，然后进行Western blot分析或MTS分析。实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；
(F)使用Nebivolol(10μM)或Grp94抑制剂-1(iGrp94-1，15μM)单独或联合使用处理稳定表达Flag-EGFRT790M/C797S的PC-9细胞，然后进行Western blot分析或MTS分析；
(G)图6E所示的肿瘤固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计；数据以平均数±SEM，***p<0.001；
图14激活FBXL2可克服非小细胞肺癌对Erlotinib或Gefitinib的耐药性
(A)用HA-FBXL2慢病毒或载体对照感染表达EGFRT790M(PC-9/DRT790M)的PC-9细胞，然后利用Erlotinib或Gefitinib处理细胞72小时后，进行MTS分析；实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；
(B)PC-9或PC-9/DRT790M细胞用Erlotinib或Gefitinib处理72小时后，进行MTS分析；实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。比如，过表达HA-FBXL2野生型的载体、过表达FBXL2膜定位点突变C420S的载体、过表达Grp94的载体、沉默Grp94的载体，各种细胞株等，均可通过购买获得。
本申请如下实验用到的引物或者基因片段的序列如下：
Figure BDA0003136640840000091
Figure BDA0003136640840000101
实验1 FBXL2靶向EGFR进行多泛素和蛋白酶体介导的降解
1、实验方法
在H1299(野生型EGFR)、PC-9(EGFR19del)或H1975(EGFRL858R/T790M)细胞中稳定表达针对FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2，即核苷酸序列表中的HumanshFBXL2-1以及HumanshFBXL2-2)、针对GFP的shRNAs、过表达FBXL2的质粒、过表达野生型EGFR、EGFRL858R或EGFRT790M的质粒(采用核苷酸序列表中的引物扩增相应的片段)，利用Western blot、免疫共沉淀或体内外泛素化实验，检测FBXL2对EGFR野生型或其突变蛋白的多泛素化降解的作用。
利用免疫共沉淀的方法检测FBXL2和EGFR蛋白相互作用的结构域。并利用免疫荧光染色和质膜分离实验检测FBXL2的膜定位在调控EGFR表达中的作用。
2、实验结果
如图1所示，过表达FBXL2可抑制野生型EGFR，EGFRL858R/T790M或EGFR19del突变蛋白的表达。具体的分子机制是：FBXL2可与EGFR结合，进而促进EGFR蛋白的多泛素化降解，且此过程不依赖于EGF的诱导。
如图2所示，EGFR结合在FBXL2的9-13LRR结构域，而EGFR的激酶区是其与FBXL2结合所必须的。进一步研究发现，FBXL2的膜定位突变蛋白FBXL2C420S不能与EGFR结合，而且丧失抑制EGFR表达的功能。以上结果，表明FBXL2的膜定位是其调控EGFR表达所必须的。
实验结果说明，在肺癌细胞中，过表达FBXL2可以抑制野生型EGFR，EGFRL858R/T790M或EGFR19del突变蛋白的表达。
实验2 FBXL2可抑制EGFR高表达或者EGFRL858R/T790M介导的NSCLC(非小细胞肺癌)的生长，以及在NSCLC中FBXL2与EGFR表达呈负相关。
一、FBXL2对EGFR驱动的非小细胞腺癌细胞的影响
1、实验方法
在H292细胞系(NSCLC，人非小细胞肺癌细胞系，淋巴结转移，高表达EGFR)上，检测FBXL2对细胞增殖及肿瘤生长的作用，具体步骤如下：
(1)FBXL2对H292细胞增殖的影响
利用慢病毒包装和感染技术，在H292细胞中稳定过表达空载(PLVX-puro)，HA-FBXL2野生型(HA-FBXL2，NM_012157.5(CDS))或FBXL2膜定位点突变C420S。然后利用MTS检测FBXL2对细胞增殖的影响。
(2)检测FBXL2对肿瘤生长的影响(H292裸鼠异质瘤实验)
将2×106个H292稳定细胞株(过表达空载，HA-FBXL2野生型或HA-FBXL2C420S)注射到裸鼠(5～6周雌性小鼠)右颈皮下，每3天利用游标卡尺测量肿瘤体积。实验终点时，取出肿瘤，称取重量。
2、实验结果
如图3A所示，在H292细胞中过表达野生型FBXL2，可以显著抑制EGFR蛋白表达以及其下游信号通路蛋白的磷酸化，例如p-AKT或p-Erk。
如图3B-C所示，过表达野生型FBXL2可显著抑制H292细胞增殖，还可以抑制H292细胞抑制瘤的生长；但过表达E3泛素连接酶失活突变(△F或者4A突变(F-box结构域中的LPK-W突变为AAAA))的FBXL2，则无法抑制H292细胞增殖。
以上结果表明，过表达FBXL2可抑制EGFR蛋白的表达并抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)的生长，这一过程依赖于FBXL2的E3泛素连接酶的活性。
二、FBXL2抑制细胞增殖是否依赖于EGFR信号通路的抑制
由于报道K-Ras是EGFR信号通路的关键下游效应蛋白，Ras激活突变的细胞增殖可不受EGFR信号通路的调控。因此，我们接下来在H1299(N-RasQ61K)和A549(K-RasG12S)细胞中验证了FBXL2对细胞增殖的影响。
1、实验方法
利用慢病毒包装和感染技术，在H1299(N-RasQ61K)和A549(K-RasG12S)细胞中稳定过表达FBXL2。
2、实验结果
如图8A-B所示，过表达FBXL2对H1299和A549细胞增殖无显著影响。结果表明，FBXL2抑制癌细胞增殖依赖于EGFR信号通路。
三、体内验证FBXL2对EGFRL858R/T790M介导的肿瘤生长的影响
1、实验方法
构建LSL-EGFRL858R/T790M转基因小鼠(图9E)。与北京百奥赛图公司合作，在小鼠Rosa26位点稳定插入Loxp-Stop-Loxp-EGFRL858R/T790M。小鼠6周左右的时候，利用鼻腔滴入的方法将Adeno-Cre滴入小鼠肺部，特异性的诱导肺癌发生。一周后，再利用鼻腔滴入的方法将过表达HA-FBXL2的慢病毒在小鼠肺部特异性表达来验证FBXL2的功能。
检测肿瘤的大小以及数量，同时通过免疫组化检测EGFR、Ki67、LLC3的水平。
2、实验结果
实验结果表明，过表达FBXL2，可显著抑制肺部肿瘤的大小及数量(图3D-F)。免疫组化(IHC)实验表明FBXL2可显著抑制EGFR以及Ki67的表达，但对LLC3无显著调控作用(图3G和图9F-G)。
以上结果表明，FBXL2可以抑制EGFRL858R/T790M驱动的肺癌的生长，说明FBXL2可以有效抑制存在L858R突变以及T790M突变的EGFR驱动肺癌，也就是可以有效抑制耐药性的肺癌。
综上，本实施例通过体内体外实验，提高FBXL2的表达水平，可以降解EGFR，降低癌细胞中EGFR的表达水平，进而抑制EGFR驱动的肺癌(包括非小细胞肺癌)的生长，包括存在L858R突变以及T790M突变的EGFR驱动的耐药性肺癌，但是，FBXL2的E3泛素连接酶失活突变则无法降解EGFR，说明FBXL2降解EGFR依赖于其E3泛素连接酶的功能。
实验3 Grp94可与FBXL2竞争性结合EGFR，抑制Grp94可以增强FBXL2抑制TKI耐药性NSCLC生长的功能(HSP90家族内质网定位蛋白Grp94调控EGFR蛋白表达)
1、实验方法
(1)沉默Grp94、过表达Grp94对EGFR蛋白表达的影响
在在PC-9和H1975细胞中，利用慢病毒包装和感染技术，构建稳定过表达Grp94或空载(载体为PLVX-puro，插入的的片段为：NM_003299.3(CDS区))，或者稳定沉默Grp94(PLKO.1，序列为：shGrp94-1：CCGGTCGCCTCAGTTTGAACATTGATTCAGAGATCAATGTTCAAACTGAGGCGATTTTTG；shGrp94-2：CCGGAAGTTGATGTGGATGGTACATTCAAGAGATGTACCATCCACATCAACTTTTTTTG。)或对照的稳定细胞株；
(2)Grp94抑制剂Ganetespib对EGFR蛋白的影响
利用Grp94抑制剂Ganetespib(8nM)处理细胞12小时，然后利用Western blot检测EGFR蛋白的变化(H1975细胞株)。
(3)裸鼠异质瘤实验
为了研究Grp94在FBXL2介导的肿瘤(PC-9细胞介导的肺癌移植瘤中)生长抑制中的功能，进行了裸鼠异质瘤实验。
2、实验结果
(1)沉默Grp94、过表达Grp94对EGFR蛋白表达的影响
实验结果表明，在PC-9和H1975细胞中，沉默Grp94可显著抑制EGFR蛋白的表达(图4A)，而且Grp94可以与EGFR蛋白形成稳定复合体(图4B)。
进一步发现Grp94可与FBXL2竞争性结合EGFR(图4B)。过表达Grp94可抑制FBXL2介导的EGFR蛋白的降低(图4C)。
(2)Grp94抑制剂Ganetespib对EGFR蛋白的影响
利用Grp94抑制剂Ganetespib可显著促进FBXL2与EGFRT790M的结合，进而促进FBXL2对EGFR蛋白的降解作用(图4D-E)。
以上结果表明Grp94可与FBXL2竞争选性结合EGFR，而且抑制Grp94可促进FBXL2对EGFR蛋白的降解功能。
(3)裸鼠异质瘤实验
过表达Grp94或EGFR，都会显著抑制FBXL2介导的抑制肿瘤生长的功能(图4F-H和图10C)。沉默Grp94或者利用Ganetespib抑制Grp94，则可显著增强FBXL2介导的抑制细胞增殖及肿瘤生长的功能(图4I-L和图10D)。Ganetespib可显著增强FBXL2介导的Ki67+细胞的减少，还可以增加凋亡的细胞个数(CC3+)(图4M和图10E-F)。
本实施例的实验证明：Grp94是EGFR介导的相关肿瘤的治疗靶点，抑制Grp94可显著增强FBXL2介导的EGFR降解，并进一步抑制EGFR驱动的肺癌。
实验4 FBXL2激活剂(Nebivolol)促进EGFR蛋白的降解以及抑制NSCLC的生长的实验
由于FBXL2可促进EGFRL858R/T790M耐药蛋白的降解，因此，我们推测靶向FBXL2可能是治疗TKIs耐药性NSCLC的新策略。因此，我们旨在寻找FBXL2的激活剂。根据文献报道FBXO3可结合并促进FBXL2蛋白的降解，而且FBXO3-ApaG结构域是其与FBXL2结合所必需的。
因此，我们计划通过虚拟筛选小分子化合物文库，寻找到小分子化合物可以与FBXO3-ApaG结合，进而干扰FBXO3-FBXL2的结合，使得FBXL2蛋白增加，从而促进EGFR蛋白的降解。
一、沉默FBXO3导致EGFR蛋白降低的实验
1、实验方法
利用慢病毒包装和感染技术，在H1975细胞中稳定表达FBXO3的shRNA(shFBXO3-1AGGAAGATACATTGACCATTA；shFBXO3-2：CCTGGGTTCTATGTGACACTA)或对照(shCtrl)，然后利用Western blot检测FBXO3对EGFR蛋白的影响。
2、实验结果
实验结果表明在H1975细胞中，沉默FBXO3可显著促进FBXL2蛋白的表达，进而导致EGFRL858R/T790M降低(图5A)。
二、抑制FBXL2药物的筛选
1、实验方法
通过虚拟筛选DrugBank数据库(2373个FDA批准的药物)，寻找可与FBXO3-ApaG结合的小分子化合物(图11A)。
通过进一步的生物验证实验(利用Western blot实验检测这些小分子对EGFR的调控作用)以及分子对接实验(通过计算机虚拟筛选的方法将FBXO3-ApaG结构与小分子对接)进一步验证筛选得到的化合物的性质。
2、实验结果
筛选出3个化合物，分别是Nebivolol，flibanserin和reltegravir(图11B和图5B)。
进一步的生物验证表明，Nebivolol可显著抑制EGFR蛋白的表达(图11C)。进一步利用分子对接实验表明，FBXO3-ApaG的5个氨基酸，E341，T367，T368和F369是与Nebivolol结合所必需的(图5B-C)且我们利用Co-IP实验结果表明这五个氨基酸的突变可显著抑制FBXL2与FBXO3的结合(图5D)。
以上实验结果表明Nebivolol是抑制FBXO3-FBXL2结合的潜在小分子化合物。
三、Nebivolol的效果验证
1、实验方法
1)Nebivolol干扰FBXO3-FBXL2结合中的作用的实验方法
利用Nebivolol处理HEK293T细胞，然后利用免疫共沉淀的方法检测FBXO3和FBXL2蛋白结合情况。
2)细胞实验(PC-9和H1975)
在PC-9和H1975细胞中，利用Nebivolol处理不同时间或利用不同浓度的Nebivolol处理细胞。Western blot实验结果显示Nebivolol可以呈时间梯度或浓度梯度抑制EGFR蛋白的表达。并利用IC50实验检测Nebivolol对细胞增殖的影响。
3)裸鼠异质瘤实验
将H1975细胞(5X105个/100μL/只)接种在裸鼠右颈部，然后利用腹腔注射单独或联合给予Nebivolol或Genetespib。
2、实验结果
1)利用Co-IP实验表明Nebivolol可以抑制FBXO3-FBXL2的结合(图5E)，而且Nebivolol可呈时间梯度和浓度梯度显著促进FBXL2蛋白的表达以及抑制EGFR蛋白的表达(图5F和图11D)，与FBXL2相似，Nebivolol可促进EGFR的蛋白酶体途径的降解(图11E)；另一方面，沉默FBXL2后，Nebivolol无法抑制EGFR蛋白的表达(图5G)。
以上结果表明，Nebivolol可以干扰FBXO3-FBXL2蛋白的结合，进而促使FBXL2蛋白的上调，降解EGFR蛋白。
2)利用IC50实验发现Nebivolol对NSCLC细胞生存具有抑制功能(图5H)，比如，Nebivolol可以显著抑制PC-9细胞的增殖，但是均是抑制EGFR驱动的肺癌，对A549细胞的增殖无调控作用(图11F)。
以上结果说明Nebivolol抑制肺癌细胞增殖依赖于EGFR信号通路，只对EGFR驱动的肺癌有效。
3)进一步探究了Nebivolol在抑制EGFRL858R/T790M介导的肺癌生长中的作用。在LSL-EGFRL858R/T790M小鼠中，Nebivolol可以抑制EGFRL858R/T790M介导的肺癌生长及数目(图5I-K)。进一步的IHC实验结果表明Nebivolol可显著上调FBXL2蛋白的表达，并抑制EGFR蛋白的表达(图5L和图12A)。与过表达FBXL2一致的是，Nebivolol处理可显著减少Ki67阳性的细胞，而对CC3+的细胞无影响(图12B)。
4)接下来我们在H1975裸鼠移植瘤实验中验证Grp94抑制剂与Nebivolol联合使用的情况。实验结果表明Grp94抑制剂Ganetespib可显著增强Nebivolol介导的EGFRL858R/T790M下调，以及抑制肿瘤生长的功效(图12C-H和图5M)。
以上结果表明，Nebivolol作为FBXL2的激活剂，可以有效抑制EGFR，进而显著抑制TKIs耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长，进一步地，其与Grp94抑制剂联合使用的效果良好。
实验5激活FBXL2的表达克服Osimertinib的耐药性(联合用药)
EGFR-TKIs耐药性一直是NSCLC治疗的瓶颈问题，而且目前对于Osimertinib耐药的NSCLC没有可用的治疗方案。因此，我们接下来探索了FBXL2在Osimertinib耐药性NSCLC中的作用。
一、FBXL2对EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白表达的影响
1、实验方法
1)通过构建EGFR的Osimertinib的耐药突变蛋白(EGFRT790M/C797S)，将EGFR耐药突变蛋白与FBXL2或Vector共同转染到HEK-293T细胞，36小时后，收集细胞，利用Western blot检测FBXL2对EGFROsimertinib耐药突变蛋白的影响。
2)利用免疫共沉淀的方法检测FBXL2与EGFROsimertinib耐药突变蛋白结合的情况。
2、实验结果
实验结果表明FBXL2可以显著抑制EGFROsimertinib耐药突变蛋白的表达，包括G796D，C797S，L718Q和L972H突变蛋白(图13A)。此外，FBXL2也可抑制EGFRE709K，L798I和L844V突变蛋白，它们都是第三代TKIsWZ4002和CO1686耐药突变蛋白(图13A)。重要的是，FBXL2可以显著抑制EGFRT790M/C797S突变蛋白的表达以及降低其蛋白稳定性(图6A-C)。EGFRT790M/C797S突变蛋白对目前临床上所有的EGFR-TKIs均耐药。而且FBXL2可与EGFRC797S和EGFRT790M/C797S蛋白形成稳定复合体(图13B)。
以上结果表明FBXL2可显著抑制EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白的表达。
二、FBXL2在Osimertinib耐药的NSCLC生长中的作用
1、实验方法
利用慢病毒感染技术，在PC-9细胞中稳定过表达EGFRT790M/C797S，构建Osimertinib耐药的细胞株(PC-9/AZDR)，然后利用MTS检测单独使用Nebivolol或联合使用Nebivolol和Ganetespib对PC-9/AZDR生长的影响。
2、实验结果
PC-9细胞中稳定过表达EGFRT790M/C797S，构建Osimertinib耐药的细胞株(PC-9/AZDR)(图13C)。Nebivolol处理或过表达FBXL2均可显著抑制EGFRT790M/C797S的表达以及其下游信号通路的激活，并同时抑制细胞增殖(图6D和图13D-E)。
在PC-9/AZDR细胞中，Ganetespib可增强Nebivolol介导的抑制细胞增殖的功能(图13F)。
我们接下来在小鼠体内检测了FBXL2对Osimertinib耐药的NSCLC肿瘤生长中的作用。
三、裸鼠移植瘤实验
1、实验方法
利用慢病毒感染技术将HA-FBXL2，HA-FBXL2C420S或Vector在PC-9/AZDR细胞中稳定表达。然后将2×106个上述稳定细胞株接种到小鼠右颈皮下，每隔3天测量小鼠体积。
2、实验结果
在PC-9/AZDR介导的裸鼠移植瘤实验中，过表达野生型FBXL2，而不是FBXL2C420S，可显著抑制肿瘤生长，以及减少Ki67+的细胞(图6G和图13G)。以上实验结果表明，激活FBXL2可以有效抑制Osimertinib耐药的NSCLC生长。在PC-9/AZDR裸鼠移植瘤中，联合使用Nebivolol和Osimertinib可显著抑制Osimertinib耐药性NSCLC的生长(图6J-K)。
四、激活FBXL2在EGFR-TKIs耐药中的作用。
1、实验方法
①在PC-9/AZDR细胞中，利用IC50实验检测Nebivolol在Osimertinib耐药中的作用。
②利用慢病毒感染技术将HA-FBXL2或空载体在PC-9/AZDR细胞中稳定表达。然后利用IC50实验检测FBXL2在Osimertinib耐药中的作用。
2、实验结果
IC50实验结果表明，过表达FBXL2或Nebivolol处理，可显著抑制NSCLC细胞株对Erlotinib，Gefitinib(利用IC50实验检测)和Osimertinib的耐药性(图6H-I和14A-B)。
本实施例实验结果说明，FBXL2可显著抑制EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白的表达；过表达FBXL2或Nebivolol处理可显著抑制对Erlotinib，Gefitinib和Osimertinib的耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌，将Nebivolol与Osimertinib联合使用可以有效治疗耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌。
实验6 FBXL2和EGFR蛋白在肺癌中的相关性检测
1、实验方法
用肺癌组织芯片分析肺腺癌和肺鳞癌组织(组织来源是肺癌病人的组织样本)中FBXL2和EGFR蛋白在肺癌中的相关性。进一步利用TCGA数据分FBXL2mRNA与NSCLC的关系。
2、实验结果
结果表明，FBXL2和EGFR的表达在肺鳞癌和肺腺癌中呈负相关(图3H和图9H)。与正常肺细胞相比，在NSCLC细胞中FBXL2低表达，而EGFR高表达(图9I)。
进一步利用TCGA数据分析发现，FBXL2mRNA在NSCLC中低表达(图3I)。而且FBXL2的低表达与肺癌患者总生存期短密切相关(图3J)。
TCGA数据库分析表明在肺腺癌和肺鳞癌中FBXL2低表达，而Grp94高表达(图10A-B)。
以上结果表明，FBXL2的低表达、Grp94高表达与EGFR的高表达相关，FBXL2表达低、Grp94表达高，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的FBXL2的表达水平和/或Grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。
综上，EGFR驱动的癌症，包括肺癌都与EGFR息息相关，本申请实验证实了FBXL2可以EGF非依赖性方式靶向EGFR，与EGFR激酶结构域结合，通过E3泛素连接酶降解EGFR；发明人还发现Grp94是EGFR介导的相关肿瘤的治疗靶点，抑制Grp94可显著增强FBXL2介导的EGFR降解，并进一步抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长；Grp94抑制剂与FBXL2激动剂联合使用治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的效果优良；
发明人还发现Grp94高表达与EGFR的高表达相关，Grp94表达高，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的Grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途
<130> GYKH1848-2021P0112680CC
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcacagattt ccaaggcttt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcctttcggg ttgcagcaat t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcacagaact gccgaaaca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aggaagatac attgaccatt a 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgggttctat gtgacacta 19
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gctctagaat ggttttctca aacaatgatg aaggc 35
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttgcggccgc tcagagaatg acaca 25
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cggaattcgc caccatgcga ccctccggga cggccggggc agcgctcctg 50
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ttgcggccgc ctacttgtca tcgtcatcct tgtaatcacc tgctccaata aattc 55
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tctactagag gatctatttc cggtggccac catgagggcc ctgtgggtgc t 51
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
aagtggaccc ggggcctaca gatcctcttc tgagatgagt ttttgttcca attcatcttt 60
ttcagctgta g 71
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gatcttttta actttcaaac ag 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ttcatcattg tttgagaaaa c 21
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gcagccgcag aacttctgtt aagaatattt tccttc 36
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ctttttgtta ataaggcctt catcattgtt tgaga 35
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gcgaacatct tagccctgga tggaagcaac 30
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
agccttggaa atctgtgcac atcggcacaa ag 32
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
tctgtcattc tctgagcggc cgccccgggt 30
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
gcacctgcac agtcgctgtc cacttcct 28
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
tagaggatct atttccggtg gccaccatgc gaaggcgcca catcgttcgg a 51
<210> 21
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cggccaaagt ggacccgggg cctacttgtc atcgtcatcc ttgtaatcac caatgacaag 60
gtagcgc 67
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
tagaggatct atttccggtg gccaccatgc gaaggcgcca catcgttcgg a 51
<210> 23
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
cggccaaagt ggacccgggg cctacttgtc atcgtcatcc ttgtaatcac cgaattcagt 60
ttccttca 68
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
tagaggatct atttccggtg gccaccatga aaaagatcaa agtgctgggc t 51
<210> 25
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
cggccaaagt ggacccgggg cctacttgtc atcgtcatcc ttgtaatcac caatgacaag 60
gtagcgc 67
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
tagaggatct atttccggtg gccaccatgc agggggatga aagaatgc 48
<210> 27
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
cggccaaagt ggacccgggg cctacttgtc atcgtcatcc ttgtaatcac ctgctccaat 60
aaattca 67

Claims (7)

1.一种治疗肺癌的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的Grp94抑制剂和FBXL2激活剂，以及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的Grp94抑制剂、FBXL2激活剂和EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂，以及药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1或2所述的联合用药物，其特征在于：所述Grp94抑制剂是降低机体Grp94含量的物或抑制Grp94活性的物质。
4.根据权利要求3所述的联合用药物，其特征在于：所述Grp94抑制剂是Ganetespib。
5.根据权利要求1或2所述的联合用药物，其特征在于：所述FBXL2激活剂是提高机体FBXL2含量的物质或激活FBXL2活性的物质。
6.根据权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述FBXL2激活剂是Nebivolol。
7.根据权利要求2所述的联合用药物，其特征在于：所述EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂是Erlotinib，Gefitinib和/或Osimertinib。
CN202110721314.0A 2021-06-28 2021-06-28 Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途 Active CN113663078B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110721314.0A CN113663078B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110721314.0A CN113663078B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113663078A CN113663078A (zh) 2021-11-19
CN113663078B true CN113663078B (zh) 2023-05-16

Family

ID=78538417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110721314.0A Active CN113663078B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113663078B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186039A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Jang Sung-Key Novel use of grp 94 in virus infection
US9403889B2 (en) * 2010-11-29 2016-08-02 Integrated Diagnostics, Inc. Diagnostic lung cancer panel and methods for its use
WO2012075324A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods for treating a tumor using an antibody that specifically binds hmw-maa
US20140045908A1 (en) * 2011-02-25 2014-02-13 Synta Pharmaceuticals Corp. Hsp90 inhibitory compounds in treating jak/stat signaling-mediated cancers
JP6539275B2 (ja) * 2013-08-16 2019-07-03 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 選択的ｇｒｐ９４阻害剤およびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113663078A (zh) 2021-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Angiogenin/ribonuclease 5 is an EGFR ligand and a serum biomarker for erlotinib sensitivity in pancreatic cancer
Do et al. Phase I study of single-agent AZD1775 (MK-1775), a Wee1 kinase inhibitor, in patients with refractory solid tumors
Cummings et al. Small molecule inhibition of MERTK is efficacious in non–small cell lung cancer models independent of driver oncogene status
Li et al. Small-molecule MMRi62 induces ferroptosis and inhibits metastasis in pancreatic cancer via degradation of ferritin heavy chain and mutant p53
EP2994155B1 (en) Targeting the egfr-sglt1 interaction for cancer therapy
Xie et al. Mer receptor tyrosine kinase is frequently overexpressed in human non-small cell lung cancer, confirming resistance to erlotinib
Guo et al. Therapeutic targeting of the mevalonate–geranylgeranyl diphosphate pathway with statins overcomes chemotherapy resistance in small cell lung cancer
US10792284B2 (en) Synergistic cancer treatment
CN114736966A (zh) 逆转乳腺癌耐药性的组合制剂及标志物应用
US9937178B2 (en) Methods of identifying and using MDM2 inhibitors
Wang et al. The exon 19-deleted EGFR undergoes ubiquitylation-mediated endocytic degradation via dynamin activity-dependent and-independent mechanisms
Zhao et al. Systematic identification of CDC34 that functions to stabilize EGFR and promote lung carcinogenesis
Srivastava et al. Activation of EPHA2-ROBO1 heterodimer by SLIT2 attenuates non-canonical signaling and proliferation in squamous cell carcinomas
CN113663078B (zh) Grp94抑制剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途
CN113663070B (zh) Fbxl2激活剂在降低egfr驱动的癌症的耐药性的药物中的用途
CN113663071B (zh) Fbxl2激活剂在制备治疗egfr驱动的肺癌的药物中的用途
JP6701593B2 (ja) 癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法
Li et al. TCAF2 is associated with the immune microenvironment, promotes pathogenesis, and impairs prognosis in glioma
Zhao et al. Genome-wide identification of CDC34 that stabilizes EGFR and promotes lung carcinogenesis
Peng et al. ACK1 upregulated the proliferation of head and neck squamous cell carcinoma cells by promoting p27 phosphorylation and degradation
Zheng et al. FBXO43 promotes cell cycle progression in cancer cells through stabilizing SKP2
Han et al. Antitumor activity of afatinib in EGFR T790M-negative human oral cancer therapeutically targets mTOR/Mcl-1 signaling axis
Fang The Translational Applications of Using Oxadiazole-Derived Small-Molecule Agents to Induce Protein Degradation Pathways
Furnish Evaluating Immune Modulatory Therapeutic Strategies for Diffuse Intrinsic Pontine Glioma
Pan et al. DNMT3A promotes the proliferation and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma via upregulating HDAC9

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant