CN113663071B

CN113663071B - Fbxl2激活剂在制备治疗egfr驱动的肺癌的药物中的用途

Info

Publication number: CN113663071B
Application number: CN202110721278.8A
Authority: CN
Inventors: 肖智雄; 牛孟孟
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113663071A

Abstract

本发明提供了FBXL2激活剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。本发明首次发现了FBXL2可以作用于EGFR，能有效抑制EGFR，进而治疗EGFR驱动的癌症，为临床治疗EGFR驱动的癌症提供了一种新的选择，特别是可以用于治疗耐药性非小细胞肺癌，临床应用前景良好。

Description

FBXL2激活剂在制备治疗EGFR驱动的肺癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及FBXL2激活剂在制备EGFR驱动的癌症中的用途。

背景技术

肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞肺癌占肺癌的85％左右。非小细胞肺癌具有发病隐匿、恶性程度较高、难以早期发现、易复发转移等特点，导致非小细胞肺癌预后非常不好，患者生存率低，生存期短。

非小细胞肺癌的病理病机非常复杂，根据发病位置的不同可以分为肺腺癌、肺鳞癌、大细胞癌，根据发病机制不同可以分为很多不同的类型，比如常见的信号通路包括：人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、FMS样的酪氨酸激酶3(FLT3)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等等。根据发病机理的不同，给予的治疗药物不同。

表皮生长因子受体(EGFR)是肺癌最重要的驱动基因之一，EGFR可通过信号转导通路调节肿瘤细胞的周期，促进肿瘤细胞增殖，诱导血管生成，促进肿瘤的扩散及转移，同时可降低细胞毒性药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而导致肿瘤的不断生长以及转移。具体地，EGFR的活化包括EGFR受体与配体结合，激活受体后EGFR受体发生二聚化，胞内区酪氨酸激酶相互磷酸化后，磷酸化的酪氨酸部位与胞内的信号传导蛋白结合，形成信号传导蛋白复合物，同时信号传导蛋白被激活，持续活化的EGFR通路将向肿瘤细胞内传递生长、增殖和抗凋亡信号。因此，以EGFR为靶点可以治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌。

EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，是靶向于EGFR的药物。其通过选择性结合细胞内酪氨酸激酶区，竞争性抑制了EGFR与ATP的结合，抑制EGFR激酶活性，从而抑制信号转导通路的最终生物学效应，达到治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的目的。EGFR-TKIs包括第一代、第二代和第三代EGFR-TKIs。第一代酪氨酸激酶抑制剂有吉非替尼(Gefitinib)，厄洛替尼(Erlotinib)和拉帕替尼(Lapatinib)等；为了克服第一代EGFR-TKIs的耐药性，制药公司开发了第二代EGFR-TKIs包括阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)，凡德他尼(Vandetanib)，来那替尼(Neratinib)等；第三代EGFR-TKIs包括奥希替尼(Osimertinib)，Rociletinib，Olmutinib等。

EGFR-TKIs显著地改善了晚期患者的总生存期(overallsurvival，OS)和生存质量，但几乎所有患者在接受治疗的同时均出现了耐药。其中，第一代EGFR-TKI药物包括吉非替尼、厄洛替尼，患者接受治疗后平均10个月左右会出现耐药，这与EGFR基因第20号外显子的密码子790位苏氨酸突变为甲硫氨酸(T790M)密切相关，T790M突变主要是通过增加ATP对EGFR活性位点的亲和力而引起了耐药性，使其在临床应用上受限；第二代不可逆抑制剂阿法替尼(Afatinib)和达可替尼(Dacotinib)通过亲电麦克加成受体与靠近EGFR-ATP结合位点的半胱氨酸残基(Cys797)发生共价反应，克服了因T790M突变产生的耐药性，但是第二代EGFR-TKI抑制剂缺乏对野生型EGFR的选择性，具有较严重的皮疹和胃肠道不良反应，导致其治疗窗狭窄而限制临床应用；而第三代EGFR-TKIs(以奥希替尼为代表)为高度选择性T790M突变小分子抑制剂，但是最新发现使用奥希替尼会出现C797S突变。

因此，需要进一步研发新的药物，解决目前EGFR-TKIs耐药的问题，治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌。

发明内容

本发明的目的是提供治疗EGFR驱动的癌症的药物以及降低肺癌耐药的药物。

本发明首先提供了FBXL2激活剂在制备EGFR抑制剂类药物中的用途。

本发明还提供了FBXL2激活剂在制备治疗EGFR驱动的癌症的药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的肺癌、食管癌、头颈癌、神经胶质瘤或结直肠癌的药物。

进一步地，所述药物是治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的药物。

进一步地，所述药物是治疗耐药性非小细胞肺癌的药物。

进一步地，所述药物是治疗存在EGFRT790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌的药物。

优选地，所述FBXL2激活剂是提高机体FBXL2含量的物质，比如，可以表达FBXL2的重组质粒；或者是激活FBXL2活性的物质，比如Nebivolol。

本发明还提供了一种治疗EGFR驱动的癌症的药物，所述药物是以FBXL2激活剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明还提供了检测肺组织FBXL2表达水平的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。

其中，所述试剂为酶联免疫吸附试验用试剂、酶联免疫分析试剂、Western blot检测方法用试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。

术语解释：

EGFR抑制剂类药物：是指能够抑制EGFR活性或表达水平的药物，可以用于治疗EGFR信号通路异常激活的所有疾病，比如，癌症。

EGFR驱动的癌症：是指EGFR信号通路异常激活的癌症。EGFR驱动的癌症包括多种癌症，例如EGFR驱动的非小细胞肺癌，EGFR驱动的食管癌，EGFR驱动的头颈癌等。

存在EGFRT790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌：是指非小细胞肺癌细胞中的EGFR存在T790M突变、L858R突变和C797S突变中的任意一种或者任意多种；其中，T790M突变是指EGFR蛋白第790位氨基酸从苏氨酸(T)突变为蛋氨酸(M)；L858R突变是指EGFR蛋白第858个氨基酸从亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)；C797S突变是指EGFR蛋白第797个氨基酸从半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)。

降低EGFR驱动的癌症的耐药性：是指提高癌症对药物的敏感型。

增敏剂：能提高癌症对药物敏感型的药物。

FBXL2(F-boxandleucinerichrepeatprotein2)，NM_012157，F-框亮氨酸丰富重复蛋白。

FBXL2激活剂：是指能提高机体中FBXL2E3泛素化酶活性的任何物质，包括直接提高FBXL2含量的物质，如提升FBXL2表达水平的物质，还包括激活FBXL2E3泛素化酶活性的物质。

Nebivolol：中文名奈必洛尔，CAS号:118457-14-0，分子式:C₂₂H₂₅F₂NO₄分子量:405.43，结构式为

Grp94，即葡萄糖调节蛋白94，又叫做内质网蛋白99。

Grp94抑制剂：是指能降低机体中Grp94的ATPase活性的任何物质，包括直接降低Grp94含量的物质，如降低Grp94表达水平的物质，还包括抑制Grp94活性的物质。

Ganetespib：是一种热休克蛋白90(HSP90)抑制剂，CAS号：888216-25-9。分子式：C₂₀H₂₀N₄O₃。结构式如下：

Erlotinib：厄洛替尼，第一代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂

Gefitinib：吉非替尼，第一代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂。

Osimertinib：奥希替尼，第三代EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂。

本发明首次发现了FBXL2可以作用于EGFR，并能有效抑制EGFR进而达到干预EGFR驱动的癌症的目的，为临床治疗EGFR驱动的癌症(尤其是非小细胞肺癌)提供了一种新的选择；FBXL2激动剂还可以有效抑制EGFR驱动的癌症的耐药，对于目前临床出现的T790M突变和/或C797S突变型耐药性非小细胞肺癌均有良好的疗效，其可以与现有的EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂联合使用以治疗耐药性非小细胞肺癌。

本发明还发现FBXL2的低表达与EGFR的高表达相关，FBXL2表达低，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的FBXL2的表达水平和/或Grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1FBXL2以EGF非依赖性方式靶向EGFR进行多泛素和蛋白酶体介导的降解

(A)在H1299(野生型EGFR)、PC-9(EGFR^19del)或H1975(EGFR^L858R/T790M)细胞中稳定表达针对FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP的shRNAs，然后进行Western blot分析；

(B)稳定表达HA-FBXL2的PC-9细胞，在无血清培养基中培养12小时，然后用或者不用100ng/mL EGF处理10分钟，然后收集细胞进行Western blot分析；

(C-D)稳定表达空载或HA-FBXL2的H1975细胞，在有血清(10％)或无血清的情况下生长12小时，然后用50μg/mL的放线菌酮(CHX)在指定的时间间隔内处理。收集细胞裂解液进行Western blot分析，并对EGFR蛋白水平进行了定量分析，绘制蛋白半衰期的曲线图；

(E)稳定表达HA-FBXL2的H292或H1975细胞，利用20μM的MG132(中文名称:蛋白酶体抑制剂；CAS号:133407-82-6；分子式:C₂₆H₄₁N₃O₅)处理6小时，然后进行Western blot分析；

(F)将FBXL2与空载对照质粒、野生型HA-EGFR、HA-EGFR^L858R或HA-EGFR^T790M表达质粒共转染HEK293T细胞，然后细胞培养过夜，利用20μMMG132处理细胞4小时，进行IP(免疫沉淀)-Western分析；

(G)稳定表达Flag-EGFR的H1299细胞，利用20μM的MG132处理4小时，进行IP-Western分析；

(H)用MG132处理H1975细胞4小时，对内源性FBXL2蛋白用FBXL2抗体或者正常兔IgG特异性抗体进行免疫沉淀，然后用Western blot检测FBXL2和EGFR；

(I)在稳定表达HA-FBXL2的H1299细胞中，利用MG132处理4小时，然后收集细胞进行IP-Western分析；

(J)将Flag-EGFR、FBXL2或野生型HA-ubiquitin、lys48或lys63突变表达质粒共转染HEK293T细胞。细胞培养过夜，用MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；

(K)在体外泛素化试验中，共转染Flag-EGFR表达质粒与HA-FBXL2或HA-FBXL2^△F表达质粒到HEK293T细胞中。细胞培养过夜，用MG132处理4小时，免疫沉淀的HA-FBXL2或HA-FBXL2^△F蛋白，添加到由重组E1和E2s、ATP组成的反应混合液中，添加或不添加泛素(Ub)和醛泛素，反应混合物用于免疫印迹分析。

图2FBXL2与EGFR的激酶结构域相互作用，进而导致EGFR蛋白降解

(A)本研究构建的EGFR缺失突变体的示意图；

(B)FBXL2表达质粒和Flag-EGFR表达质粒共转染HEK293T细胞，细胞培养过夜后，用20μM MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；

(C)用BLI法测定重组FBXL2/SKP1蛋白与EGFR激酶的亲和力，用K_D值表示；

(D)本研究中使用的FBXL2缺失突变体的示意图；

(E)将Flag-EGFR与HA-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞。细胞培养过夜后，利用20μM MG132处理4小时，然后进行IP-Western分析；

(F)对稳定表达Vector空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2^C420S的H292细胞、H1975细胞或PC-9细胞进行Western blot分析；

(G)稳定表达HA-FBXL2、HA-FBXL2^C420S或载体对照的H1299细胞或H1975细胞，利用MG132处理4小时，用于IP-Western分析；

(H)对稳定表达Vector空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2^C420S的H1299或H1975细胞进行细胞质(CYTO)和质膜(PM)分离，然后进行Western blot分析；

(I)稳定表达Flag-FBXL2或Flag-FBXL2^C420S的H1299细胞用MG132处理6小时，Flag(红色)和内源性EGFR(绿色)免疫染色，用DAPI复染，比例尺＝25μm。

图3FBXL2抑制EGFR过表达或EGFR^L858R/T790M驱动的NSCLC生长，其表达与EGFR表达呈负相关

(A)对H292稳定细胞进行免疫印迹或MTS分析，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；

(B-C)稳定表达HA-FBXL2、HA-FBXL2^C420S或载体对照的H292细胞，利用(B)Westernblot分析或(C)异种移植肿瘤生长测定(n＝5/组)；在接种后第19天对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并观察其生长情况；绘制肿瘤生长曲线显示；数据以平均数±SEM表示，**p<0.01，***p<0.001；

(D-G)利用转基因小鼠Rosa26-LSL-EGFR^L858R/T790M，检测FBXL2对EGFR^T790M介导的TKI耐药的影响；(D)显示了代表性的Micro-CT图像(左面板)，卡其色、绿红色或紫色红色分别代表心脏、肺或肿瘤，肺被解剖、固定，并检查肿瘤个结节的表面(右面板)；(E)是肺表面可见结节的数目，数据以平均数表示±SEM，***p<0.001；(F-G)石蜡包埋肺，分别进行(F)H&E染色或(G)IHC检测EGFR和p-EGFR蛋白的表达检测；数据通过AOD统计，数据以平均数±SEM表示，***p<0.001；

(H)FBXL2在人肺腺癌(LUAD)中的表达与EGFR呈负相关；采用人LUAD连续组织微阵列切片，对IHC进行EGFR和FBXL2的皮尔逊相关分析；用AOD定量统计EGFR阳性组织；

(I)应用TCGA数据库(LUAD和LUSC)分析了EGFR突变的NSCLC和正常肺组织中FBXL2的mRNA水平，数据用平均数±SD表示；

(J)用FBXL2的mRNA表达水平对肺癌患者的总生存率(OS)进行Kaplan-Meier图的分层分析。

图4Grp94与FBXL2竞争结合EGFR，抑制Grp94可促进FBXL2介导的EGFR降解，进而抑制EGFR-TKI耐药性肺癌的生长

(A)利用Western blot方法检测在PC-9或H1975细胞中沉默Grp94(shGrp94-1或shGrp94-2)对EGFR蛋白的影响；

(B)将Flag-EGFR、Myc-Grp94、HA-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞，然后用MG132处理细胞4小时后进行IP-Western分析；

(C)将稳定表达HA-FBXL2和/或Myc-Grp94的PC-9细胞进行Western blot分析；

(D)将Flag-EGFR^T790M和HA-FBXL2质粒共转染HEK293T细胞，然后利用Ganetespib(8nM)处理细胞12小时，用MG132处理细胞4小时后进行IP-Western分析；

(E)在稳定表达HA-FBXL2或载体对照的H1975细胞中，利用Ganetespib(8nM)处理处理细胞12小时，然后进行Western blot分析；

(F-H)异种移植瘤生长测定；在稳定表达HA-FBXL2或空载的PC-9细胞中转染表达EGFR或Myc-Grp94的重组慢病毒，然后将该细胞(2.5×10⁶)进行异种移植瘤生长试验(n＝5/组)；根据实验结果绘制生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；**p<0.01，***p<0.001；

(I-J)在BALB/C裸鼠(n＝5/组)上接种(5×10⁵)稳定过表达FBXL2或/和沉默Grp94的H1975细胞；测量肿瘤生长曲线和肿瘤重量；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

(I-M)使用生物发光成像检测异种移植瘤生长，在BALB/C裸鼠(n＝5/组)上接种(5×10⁵)稳定表达HA-FBXL2或空载体的H1975细胞，使用或不使用Erlotinib或Ganetespib治疗；检测生物发光成像、生长曲线和肿瘤重量，肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5Nebivolol是FBXL2的激活剂，可促进EGFR降解并抑制肿瘤生长

(A)H1975细胞稳定表达shFBXO3-1或shFBXO3-2，利用Western blot分析EGFR蛋白及其下游信号通路的表达；

(B)Nebivolol的化学结构，以及Nebivolol和FBXO3-ApaG分子对接模型；

(C)通过LigPlot⁸⁰分析FBXO3-ApaG结构域中残基(T367、T368、E341、I333和F369)和Nebivol的相互作用示意图，氢键或静电相互作用分别以绿色或蓝色划线突出显示，疏水相互作用被认为是短辐射红线；

(D)将Flag-FBXL2和HA-FBXO3表达质粒共转染HEK293T细胞；细胞过夜培养，用20μM MG132处理4h，进行IP-Wstern分析；

(E)将HA-FBXO3和Flag-FBXL2表达质粒共转染HEK293T细胞，并与10μM Nebivolol处理36小时，不处理组为对照组，再用20μM MG132处理4小时，进行IP-Wstern分析；

(F)用不同剂量Nebivolol处理H1975细胞，然后进行Western blot检测；

(G)稳定沉默FBXL2(shFBXL2)或GFP(shGFP)的H1299细胞，利用10μM Nebivolol处理48h后，进行Western-blot实验；

(H)PC-9或H1975细胞用Nebivolol或BC-1215处理72小时，然后利用MTS法测定细胞活力，并绘制曲线图和IC50；数据以平均数±SD表示；

(I-L)用转基因小鼠(ROA26-LSL-EGFR^L858R/T790M)(n＝5/组)评估Nebivolol对肺癌EGFR表达和EGFR-TKIs耐药的影响；(I)显示了对照组或Nebivolol治疗组小鼠肺的代表性荧光图像(左图)和照片(右图)，红色荧光显示EGFR高表达；(J)肺表面可见结节的数目；(K-L)石蜡包埋肺切片，(K)H&E染色或(L)IHC检测FBXL2和EGFR；数据通过AOD方法进行统计,数据以平均数±SEM表示；**p<0.01，***p<0.001；

(M)将H1975细胞(5×10⁵)皮下注射于BALB/C裸鼠右侧(n＝5/组)；从第5天开始，小鼠通过腹腔注射Ganetespib(50mg/kg)，每周一次，和/或Nebivolol(10mg/kg)，每周六次。药物治疗19天后，对小鼠实施例安乐死，解剖肿瘤。绘制生长曲线和测定肿瘤重量；数据以平均数±SEM表示，*p<0.05。

图6FBXL2的激活可克服NSCLC对Osimertinib的耐药性

(A)将HA-FBXL2和Flag-EGFR^C797S或Flag-EGFRT^790M/C797S表达质粒共转染HEK293T细胞，36小时后，进行Western blot实验；

(B-C)HEK293T细胞在HA-FBXL2或载体对照的存在下，与Flag-EGFR^T790M/C797S共转染36小时，然后用50μg/mL的环己酰亚胺(CHX)处理，细胞裂解物进行Western blot分析；对EGFR蛋白水平进行了定量分析，并绘制代表蛋白质半衰期的曲线图；

(D-G)在稳定表达空载、HA-FBXL2或HA-FBXL2^C420S的PC-9-Flag-EGFR^T790M/C797S细胞中分别进行(D)Western blot实验或(E-G)异种移植肿瘤生长实验(n＝6/组)；对小鼠实施安乐死，解剖肿瘤并拍照；绘制生长曲线和肿瘤重量；肿瘤被固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

(H)用HA-FBXL2的慢病毒感染稳定表达EGFRCT^790M/C797S(PC-9/AZDR)的PC-9细胞，利用Osimertinib处理细胞72小时进行MTS实验，重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；

(I)PC-9/AZDR细胞用Osimertinib处理，或同时用50μM的Nebivolol处理48h处理，进行MTS分析；重复三次，数据用平均数±SD表示，*p<0.05，***p<0.001；

(J-K)PC-9/AZDR细胞(2×10⁵)用于异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；单独使用Nebivolol或者与Osimertinib联合使用，检测其对肿瘤生长的影响；绘制生长曲线和测定肿瘤重量，数据以平均数±SEM表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

(L)工作模型，E3泛素连接酶FBXL2靶向EGFR和EGFR突变体，使蛋白酶体降解，从而抑制肿瘤生长和NSCLC的TKI抵抗；Grp94结合并保护EGFR免受FBXL2介导的降解；FDA批准的药物Nebivolol可以破坏FBXO3-FBXL2相互作用以稳定FBXL2，并降解EGFR，从而抑制NSCLC生长和TKI耐药性。

图7FBXL2以EGF非依赖性方式靶向EGFR进行蛋白酶体降解

(A)将H1299或H1975细胞在无血清DMEM中培养12h，并用20μg/ml的MG132处理6小时或45μM的Chloroquine(CLQ)处理24小时，用100ng/ml的EGF处理10min，然后进行Westernblot分析；

(B)用F-box家族E3连接酶的慢病毒shRNAs混合物感染H1299细胞，然后进行Western blot实验；

(C)对稳定表达空载质粒或HA-FBXL2的H1299、H292、PC-9或H1975细胞进行Western blot实验；

(D)FBXL2抑制EGFR蛋白的表达，与EGF刺激无关；将稳定表达Vector或HA-FBXL2的H1299或H1975细胞，在有或没有血清(10％)的培养基中培养12小时，然后无血清培养的细胞用或者不用100ng/ml EGF一起处理10分钟，然后收获细胞进行Western blot实验分析；

(E-F)利用MG132或氯喹(CLQ)处理稳定表达HA-FBXL2或空载质粒的H1299、H292、PC-9或H1975细胞，然后进行Western blot实验分析；

(G)重组纯化FBXL2/SKP1蛋白与重组纯化EGFR激酶蛋白部分(aa695-1022；EGFR-K)，纯化的重组EGFR激酶部分进行生物素化标记；

(H)EGFR和FBXL2均定位于细胞质膜和ER；上图：H1299细胞用EGFR抗体(绿色)和ER示踪剂(红色)进行免疫荧光染色，用DAPI(蓝色)复染，下图：稳定表达Flag-FBXL2的H1299用Flag抗体(绿色)和Grp78抗体(红色)进行免疫荧光染色，并用DAPI(蓝色)进行复染；(I)在稳定表达Flag-FBXL2、Flag-FBXL2^C420S或载体对照的H1299细胞进行Flag(红色)和内源性EGFR(绿色)免疫荧光染色，比例尺＝25μm。

图8FBXL2以EGFR信号依赖的方式抑制肺肿瘤细胞增殖

(A-B)FBXL2不能抑制含有活化Ras的NSCLC细胞的增殖；对A549(含有K-Ras^G12S)或H1299(含有N-Ras^Q61K)稳定细胞株进行免疫印迹和MTS分析，重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。

图9FBXL2抑制EGFR-TKIs耐药性NSCLC的生长

(A)对稳定沉默FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP(-)的H1975细胞进行Western blot分析；

(B-D)稳定表达HA-FBXL2(WT)、HA-FBXL2^ΔF或HA-FBXL2^4A的H1975细胞进行(B)Western blot分析；(C)实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)或(D)克隆形成分析，数据以平均数表示±SD，*p<0.05，**p<0.01；

(E)用于构建ROSA26-LSL-EGFRL^858R/T790M转基因小鼠(C57BL/6)的质粒的示意图；用于研究HA-FBXL2在TKI耐药性肺肿瘤生长中的作用的实验流程图；AdeCre(2.5×10⁷PFU)；Lenti-HA-FBXL2(3×10⁶PFU)；

(F-G)将图3D所示的肺固定，石蜡包埋，切片，置于IHC中检测EGFR、p-EGFR、HA、Ki67和切割的caspase-3(CC3)，数据以AOD进行统计，并以平均数±SEM表示，***p<0.001；

(H)FBXL2在肺鳞癌中的表达与EGFR呈负相关，从LUSC获得的连续组织微阵列切片进行IHC分析，以确定EGFR和FBXL2的Pearson相关性，采用平均光密度(AOD)法对EGFR阳性组织进行定量分析；

(I)NSCLC细胞FBXL2与EGFR的相关性研究，对人支气管上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞H1299、H292、PC-9或H1975进行Western blot分析。

图10Grp94抑制剂可增强FBXL2抑制TKI耐药性肿瘤生长的功能

(A-B)利用TCGA数据库分析肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中FBXL2和Grp94的mRNA水平；数据以平均数±SD表示；

(C)图4F所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片，IHC检测EGFR、p-EGFR和HA；

(D)稳定表达Flag-EGFR^T790M和HA-FBXL2或空载质粒的PC-9细胞，使用Ganetespib(8nM)处理48小时后，然后进行MTS实验；数据以平均数±SD表示，***p<0.001；(E-F)图4I所示肿瘤固定，石蜡包埋，切片和IHC检测EGFR、p-EGFR、HA、Ki67和剪切的半胱氨酸蛋白酶-3(CC3)；数据通过AOD统计，并以平均数±SEM表示，***p<0.001。

图11Nebivolol通过上调FBXL2表达以抑制细胞增殖

(A)用于DrugBank数据库小分子抑制性分子的虚拟筛选的流程图；

(B)显示了计算机预测分数(Vina分数和Cyscore)和对接图三个得分最高的化学结构；

(C)PC-9细胞用Nebivolol，Flibanserin或Raltegravir处理24小时后，然后进行Western blot分析；

(D)PC-9细胞用Nebivolol处理24小时，然后进行Western blot分析；

(E)H1975细胞利用5μM或15μM的Nebivolol治疗24小时后，然后利用MG132处理6小时或氯喹处理12小时，然后进行Western blot实验；

(F)PC-9或A549细胞利用10μM Nebivolol处理后，进行Western blot分析(左图)或MTS分析(右图)。实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。

图12Nebivolol抑制Erlotinib耐药性NSCLC的生长

(A-B)将图5I所示的肺固定，石蜡包埋，切片，并进行IHC以检测EGFR、FBXL2、Ki67和切固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR、FBXL2、Ki67、剪切的caspase-3(CC3)；数据通过AOD方法进行统计，数据以平均数±SEM表示，***p<0.001；

(C)用Nebivolol(10μM)或Ganetespib(8nM)处理H1975细胞，单独或联合处理36h，然后进行Western blot分析；

(D-H)利用H1975细胞(5×10⁵)进行异种移植肿瘤生长实验(n＝5/组)；将肿瘤固定，石蜡包埋，切片，利用IHC检测EGFR、p-EGFR(Try1068)、FBXL2、Ki67和剪切的caspase-3(CC3)的表达，测定小鼠体重；数据通过AOD方法进行统计。数据以平均数±SEM表示，**p<0.01，**p<0.001。

图13激活FBXL2可抑制Osimertinib耐药性NSCLC的生长

(A)将HA-FBXL2与野生型Flag-EGFR或Flag-EGFR突变体表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36小时后，进行Western blot实验；

(B)将FBXL2和EGFR表达质粒共转染HEK293T细胞；细胞培养过夜，用20μM MG132处理4h后，进行IP-Western分析；

(C)稳定表达Flag-EGFR^T790M/C797S(PC-9-Flag-EGFR^T790M/C797S)的PC-9细胞利用用6nM Osimertinib处理36小时后，进行Western blot分析或MTS分析；

(D)对稳定表达HA-FBXL2或HA-FBXL2^C420S的PC-9-Flag-EGFR^T790M/C797S细胞进行MTS分析，实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；

(E)稳定表达Flag-EGFR^T790M/C797S或载体对照的PC-9细胞用Osimertinib(6nM)或Nebivolol(10μM)处理36小时，或指定的时间间隔，然后进行Western blot分析或MTS分析。实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；

(F)使用Nebivolol(10μM)或Grp94抑制剂-1(iGrp94-1，15μM)单独或联合使用处理稳定表达Flag-EGFR^T790M/C797S的PC-9细胞，然后进行Western blot分析或MTS分析；

(G)图6E所示的肿瘤固定，石蜡包埋，切片，进行IHC检测EGFR和p-EGFR；数据通过AOD方法进行统计；数据以平均数±SEM，***p<0.001；

图14激活FBXL2可克服非小细胞肺癌对Erlotinib或Gefitinib的耐药性

(A)用HA-FBXL2慢病毒或载体对照感染表达EGFR^T790M(PC-9/DR^T790M)的PC-9细胞，然后利用Erlotinib或Gefitinib处理细胞72小时后，进行MTS分析；实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001；

(B)PC-9或PC-9/DR^T790M细胞用Erlotinib或Gefitinib处理72小时后，进行MTS分析；实验重复三次，数据用平均数±SD表示，***p<0.001。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。比如，过表达HA-FBXL2野生型的载体、过表达FBXL2膜定位点突变C420S的载体、过表达Grp94的载体、沉默Grp94的载体，各种细胞株等，均可通过购买获得。

本申请如下实验用到的引物或者基因片段的序列如下：

实验1FBXL2靶向EGFR进行多泛素和蛋白酶体介导的降解

1、实验方法

在H1299(野生型EGFR)、PC-9(EGFR^19del)或H1975(EGFR^L858R/T790M)细胞中稳定表达针对FBXL2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2，即核苷酸序列表中的HumanshFBXL2-1以及HumanshFBXL2-2)、针对GFP的shRNAs、过表达FBXL2的质粒、过表达野生型EGFR、EGFR^L858R或EGFR^T790M的质粒(采用核苷酸序列表中的引物扩增相应的片段)，利用Western blot、免疫共沉淀或体内外泛素化实验，检测FBXL2对EGFR野生型或其突变蛋白的多泛素化降解的作用。

利用免疫共沉淀的方法检测FBXL2和EGFR蛋白相互作用的结构域。并利用免疫荧光染色和质膜分离实验检测FBXL2的膜定位在调控EGFR表达中的作用。

2、实验结果

如图1所示，过表达FBXL2可抑制野生型EGFR，EGFR^L858R/T790M或EGFR^19del突变蛋白的表达。具体的分子机制是：FBXL2可与EGFR结合，进而促进EGFR蛋白的多泛素化降解，且此过程不依赖于EGF的诱导。

如图2所示，EGFR结合在FBXL2的9-13LRR结构域，而EGFR的激酶区是其与FBXL2结合所必须的。进一步研究发现，FBXL2的膜定位突变蛋白FBXL2^C420S不能与EGFR结合，而且丧失抑制EGFR表达的功能。以上结果，表明FBXL2的膜定位是其调控EGFR表达所必须的。

实验结果说明，在肺癌细胞中，过表达FBXL2可以抑制野生型EGFR，EGFR^L858R/T790M或EGFR^19del突变蛋白的表达。

实验2FBXL2可抑制EGFR高表达或者EGFR^L858R/T790M介导的NSCLC(非小细胞肺癌)的生长，以及在NSCLC中FBXL2与EGFR表达呈负相关。

一、FBXL2对EGFR驱动的非小细胞腺癌细胞的影响

1、实验方法

在H292细胞系(NSCLC，人非小细胞肺癌细胞系，淋巴结转移，高表达EGFR)上，检测FBXL2对细胞增殖及肿瘤生长的作用，具体步骤如下：

(1)FBXL2对H292细胞增殖的影响

利用慢病毒包装和感染技术，在H292细胞中稳定过表达空载(PLVX-puro)，HA-FBXL2野生型(HA-FBXL2，NM_012157.5(CDS))或FBXL2膜定位点突变C420S。然后利用MTS检测FBXL2对细胞增殖的影响。

(2)检测FBXL2对肿瘤生长的影响(H292裸鼠异质瘤实验)

将2×10⁶个H292稳定细胞株(过表达空载，HA-FBXL2野生型或HA-FBXL2^C420S)注射到裸鼠(5～6周雌性小鼠)右颈皮下，每3天利用游标卡尺测量肿瘤体积。实验终点时，取出肿瘤，称取重量。

2、实验结果

如图3A所示，在H292细胞中过表达野生型FBXL2，可以显著抑制EGFR蛋白表达以及其下游信号通路蛋白的磷酸化，例如p-AKT或p-Erk。

如图3B-C所示，过表达野生型FBXL2可显著抑制H292细胞增殖，还可以抑制H292细胞抑制瘤的生长；但过表达E3泛素连接酶失活突变(△F或者4A突变(F-box结构域中的LPK-W突变为AAAA))的FBXL2，则无法抑制H292细胞增殖。

以上结果表明，过表达FBXL2可抑制EGFR蛋白的表达并抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)的生长，这一过程依赖于FBXL2的E3泛素连接酶的活性。

二、FBXL2抑制细胞增殖是否依赖于EGFR信号通路的抑制

由于报道K-Ras是EGFR信号通路的关键下游效应蛋白，Ras激活突变的细胞增殖可不受EGFR信号通路的调控。因此，我们接下来在H1299(N-Ras^Q61K)和A549(K-Ras^G12S)细胞中验证了FBXL2对细胞增殖的影响。

1、实验方法

利用慢病毒包装和感染技术，在H1299(N-Ras^Q61K)和A549(K-Ras^G12S)细胞中稳定过表达FBXL2。

2、实验结果

如图8A-B所示，过表达FBXL2对H1299和A549细胞增殖无显著影响。结果表明，FBXL2抑制癌细胞增殖依赖于EGFR信号通路。

三、体内验证FBXL2对EGFR^L858R/T790M介导的肿瘤生长的影响

1、实验方法

构建LSL-EGFR^L858R/T790M转基因小鼠(图9E)。与北京百奥赛图公司合作，在小鼠Rosa26位点稳定插入Loxp-Stop-Loxp-EGFR^L858R/T790M。小鼠6周左右的时候，利用鼻腔滴入的方法将Adeno-Cre滴入小鼠肺部，特异性的诱导肺癌发生。一周后，再利用鼻腔滴入的方法将过表达HA-FBXL2的慢病毒在小鼠肺部特异性表达来验证FBXL2的功能。

检测肿瘤的大小以及数量，同时通过免疫组化检测EGFR、Ki67、LLC3的水平。

2、实验结果

实验结果表明，过表达FBXL2，可显著抑制肺部肿瘤的大小及数量(图3D-F)。免疫组化(IHC)实验表明FBXL2可显著抑制EGFR以及Ki67的表达，但对LLC3无显著调控作用(图3G和图9F-G)。

以上结果表明，FBXL2可以抑制EGFR^L858R/T790M驱动的肺癌的生长，说明FBXL2可以有效抑制存在L858R突变以及T790M突变的EGFR驱动肺癌，也就是可以有效抑制耐药性的肺癌。

综上，本实施例通过体内体外实验，提高FBXL2的表达水平，可以降解EGFR，降低癌细胞中EGFR的表达水平，进而抑制EGFR驱动的肺癌(包括非小细胞肺癌)的生长，包括存在L858R突变以及T790M突变的EGFR驱动的耐药性肺癌，但是，FBXL2的E3泛素连接酶失活突变则无法降解EGFR，说明FBXL2降解EGFR依赖于其E3泛素连接酶的功能。

实验3Grp94可与FBXL2竞争性结合EGFR，抑制Grp94可以增强FBXL2抑制TKI耐药性NSCLC生长的功能(HSP90家族内质网定位蛋白Grp94调控EGFR蛋白表达)

1、实验方法

(1)沉默Grp94、过表达Grp94对EGFR蛋白表达的影响

在在PC-9和H1975细胞中，利用慢病毒包装和感染技术，构建稳定过表达Grp94或空载(载体为PLVX-puro，插入的的片段为：NM_003299.3(CDS区))，或者稳定沉默Grp94(PLKO.1，序列为：shGrp94-1：

CCGGTCGCCTCAGTTTGAACATTGATTCAGAGATCAATGTTCAAACTGAGGCGATTTTTG；shGrp94-2：

CCGGAAGTTGATGTGGATGGTACATTCAAGAGATGTACCATCCACATCAACTTTTTTTG。)或对照的稳定细胞株；

(2)Grp94抑制剂Ganetespib对EGFR蛋白的影响

利用Grp94抑制剂Ganetespib(8nM)处理细胞12小时，然后利用Western blot检测EGFR蛋白的变化(H1975细胞株)。

(3)裸鼠异质瘤实验

为了研究Grp94在FBXL2介导的肿瘤(PC-9细胞介导的肺癌移植瘤中)生长抑制中的功能，进行了裸鼠异质瘤实验。

2、实验结果

(1)沉默Grp94、过表达Grp94对EGFR蛋白表达的影响

实验结果表明，在PC-9和H1975细胞中，沉默Grp94可显著抑制EGFR蛋白的表达(图4A)，而且Grp94可以与EGFR蛋白形成稳定复合体(图4B)。

进一步发现Grp94可与FBXL2竞争性结合EGFR(图4B)。过表达Grp94可抑制FBXL2介导的EGFR蛋白的降低(图4C)。

(2)Grp94抑制剂Ganetespib对EGFR蛋白的影响

利用Grp94抑制剂Ganetespib可显著促进FBXL2与EGFR^T790M的结合，进而促进FBXL2对EGFR蛋白的降解作用(图4D-E)。

以上结果表明Grp94可与FBXL2竞争选性结合EGFR，而且抑制Grp94可促进FBXL2对EGFR蛋白的降解功能。

(3)裸鼠异质瘤实验

过表达Grp94或EGFR，都会显著抑制FBXL2介导的抑制肿瘤生长的功能(图4F-H和图10C)。沉默Grp94或者利用Ganetespib抑制Grp94，则可显著增强FBXL2介导的抑制细胞增殖及肿瘤生长的功能(图4I-L和图10D)。Ganetespib可显著增强FBXL2介导的Ki67+细胞的减少，还可以增加凋亡的细胞个数(CC3+)(图4M和图10E-F)。

本实施例的实验证明：Grp94是EGFR介导的相关肿瘤的治疗靶点，抑制Grp94可显著增强FBXL2介导的EGFR降解，并进一步抑制EGFR驱动的肺癌。

实验4FBXL2激活剂(Nebivolol)促进EGFR蛋白的降解以及抑制NSCLC的生长的实验

由于FBXL2可促进EGFR^L858R/T790M耐药蛋白的降解，因此，我们推测靶向FBXL2可能是治疗TKIs耐药性NSCLC的新策略。因此，我们旨在寻找FBXL2的激活剂。根据文献报道FBXO3可结合并促进FBXL2蛋白的降解，而且FBXO3-ApaG结构域是其与FBXL2结合所必需的。

因此，我们计划通过虚拟筛选小分子化合物文库，寻找到小分子化合物可以与FBXO3-ApaG结合，进而干扰FBXO3-FBXL2的结合，使得FBXL2蛋白增加，从而促进EGFR蛋白的降解。

一、沉默FBXO3导致EGFR蛋白降低的实验

1、实验方法

利用慢病毒包装和感染技术，在H1975细胞中稳定表达FBXO3的shRNA(shFBXO3-1AGGAAGATACATTGACCATTA；shFBXO3-2：

CCTGGGTTCTATGTGACACTA)或对照(shCtrl)，然后利用Western blot检测FBXO3对EGFR蛋白的影响。

2、实验结果

实验结果表明在H1975细胞中，沉默FBXO3可显著促进FBXL2蛋白的表达，进而导致EGFR^L858R/T790M降低(图5A)。

二、抑制FBXL2药物的筛选

1、实验方法

通过虚拟筛选DrugBank数据库(2373个FDA批准的药物)，寻找可与FBXO3-ApaG结合的小分子化合物(图11A)。

通过进一步的生物验证实验(利用Western blot实验检测这些小分子对EGFR的调控作用)以及分子对接实验(通过计算机虚拟筛选的方法将FBXO3-ApaG结构与小分子对接)进一步验证筛选得到的化合物的性质。

2、实验结果

筛选出3个化合物，分别是Nebivolol，flibanserin和reltegravir(图11B和图5B)。

进一步的生物验证表明，Nebivolol可显著抑制EGFR蛋白的表达(图11C)。进一步利用分子对接实验表明，FBXO3-ApaG的5个氨基酸，E341，T367，T368和F369是与Nebivolol结合所必需的(图5B-C)且我们利用Co-IP实验结果表明这五个氨基酸的突变可显著抑制FBXL2与FBXO3的结合(图5D)。

以上实验结果表明Nebivolol是抑制FBXO3-FBXL2结合的潜在小分子化合物。

三、Nebivolol的效果验证

1、实验方法

1)Nebivolol干扰FBXO3-FBXL2结合中的作用的实验方法

利用Nebivolol处理HEK293T细胞，然后利用免疫共沉淀的方法检测FBXO3和FBXL2蛋白结合情况。

2)细胞实验(PC-9和H1975)

在PC-9和H1975细胞中，利用Nebivolol处理不同时间或利用不同浓度的Nebivolol处理细胞。Western blot实验结果显示Nebivolol可以呈时间梯度或浓度梯度抑制EGFR蛋白的表达。并利用IC50实验检测Nebivolol对细胞增殖的影响。

3)裸鼠异质瘤实验

将H1975细胞(5X10⁵个/100μL/只)接种在裸鼠右颈部，然后利用腹腔注射单独或联合给予Nebivolol或Genetespib。

2、实验结果

1)利用Co-IP实验表明Nebivolol可以抑制FBXO3-FBXL2的结合(图5E)，而且Nebivolol可呈时间梯度和浓度梯度显著促进FBXL2蛋白的表达以及抑制EGFR蛋白的表达(图5F和图11D)，与FBXL2相似，Nebivolol可促进EGFR的蛋白酶体途径的降解(图11E)；另一方面，沉默FBXL2后，Nebivolol无法抑制EGFR蛋白的表达(图5G)。

以上结果表明，Nebivolol可以干扰FBXO3-FBXL2蛋白的结合，进而促使FBXL2蛋白的上调，降解EGFR蛋白。

2)利用IC50实验发现Nebivolol对NSCLC细胞生存具有抑制功能(图5H)，比如，Nebivolol可以显著抑制PC-9细胞的增殖，但是均是抑制EGFR驱动的肺癌，对A549细胞的增殖无调控作用(图11F)。

以上结果说明Nebivolol抑制肺癌细胞增殖依赖于EGFR信号通路，只对EGFR驱动的肺癌有效。

3)进一步探究了Nebivolol在抑制EGFR^L858R/T790M介导的肺癌生长中的作用。在LSL-EGFR^L858R/T790M小鼠中，Nebivolol可以抑制EGFR^L858R/T790M介导的肺癌生长及数目(图5I-K)。进一步的IHC实验结果表明Nebivolol可显著上调FBXL2蛋白的表达，并抑制EGFR蛋白的表达(图5L和图12A)。与过表达FBXL2一致的是，Nebivolol处理可显著减少Ki67阳性的细胞，而对CC3+的细胞无影响(图12B)。

4)接下来我们在H1975裸鼠移植瘤实验中验证Grp94抑制剂与Nebivolol联合使用的情况。实验结果表明Grp94抑制剂Ganetespib可显著增强Nebivolol介导的EGFR^L858R/T790M下调，以及抑制肿瘤生长的功效(图12C-H和图5M)。

以上结果表明，Nebivolol作为FBXL2的激活剂，可以有效抑制EGFR，进而显著抑制TKIs耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长，进一步地，其与Grp94抑制剂联合使用的效果良好。

实验5激活FBXL2的表达克服Osimertinib的耐药性(联合用药)

EGFR-TKIs耐药性一直是NSCLC治疗的瓶颈问题，而且目前对于Osimertinib耐药的NSCLC没有可用的治疗方案。因此，我们接下来探索了FBXL2在Osimertinib耐药性NSCLC中的作用。

一、FBXL2对EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白表达的影响

1、实验方法

1)通过构建EGFR的Osimertinib的耐药突变蛋白(EGFR^T790M/C797S)，将EGFR耐药突变蛋白与FBXL2或Vector共同转染到HEK-293T细胞，36小时后，收集细胞，利用Western blot检测FBXL2对EGFROsimertinib耐药突变蛋白的影响。

2)利用免疫共沉淀的方法检测FBXL2与EGFROsimertinib耐药突变蛋白结合的情况。

2、实验结果

实验结果表明FBXL2可以显著抑制EGFROsimertinib耐药突变蛋白的表达，包括G796D，C797S，L718Q和L972H突变蛋白(图13A)。此外，FBXL2也可抑制EGFRE709K，L798I和L844V突变蛋白，它们都是第三代TKIsWZ4002和CO1686耐药突变蛋白(图13A)。重要的是，FBXL2可以显著抑制EGFR^T790M/C797S突变蛋白的表达以及降低其蛋白稳定性(图6A-C)。EGFR^T790M/C797S突变蛋白对目前临床上所有的EGFR-TKIs均耐药。而且FBXL2可与EGFR^C797S和EGFR^T790M/C797S蛋白形成稳定复合体(图13B)。

以上结果表明FBXL2可显著抑制EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白的表达。

二、FBXL2在Osimertinib耐药的NSCLC生长中的作用

1、实验方法

利用慢病毒感染技术，在PC-9细胞中稳定过表达EGFR^T790M/C797S，构建Osimertinib耐药的细胞株(PC-9/AZDR)，然后利用MTS检测单独使用Nebivolol或联合使用Nebivolol和Ganetespib对PC-9/AZDR生长的影响。

2、实验结果

PC-9细胞中稳定过表达EGFR^T790M/C797S，构建Osimertinib耐药的细胞株(PC-9/AZDR)(图13C)。Nebivolol处理或过表达FBXL2均可显著抑制EGFR^T790M/C797S的表达以及其下游信号通路的激活，并同时抑制细胞增殖(图6D和图13D-E)。

在PC-9/AZDR细胞中，Ganetespib可增强Nebivolol介导的抑制细胞增殖的功能(图13F)。

我们接下来在小鼠体内检测了FBXL2对Osimertinib耐药的NSCLC肿瘤生长中的作用。

三、裸鼠移植瘤实验

1、实验方法

利用慢病毒感染技术将HA-FBXL2，HA-FBXL2^C420S或Vector在PC-9/AZDR细胞中稳定表达。然后将2×10⁶个上述稳定细胞株接种到小鼠右颈皮下，每隔3天测量小鼠体积。

2、实验结果

在PC-9/AZDR介导的裸鼠移植瘤实验中，过表达野生型FBXL2，而不是FBXL2^C420S，可显著抑制肿瘤生长，以及减少Ki67+的细胞(图6G和图13G)。以上实验结果表明，激活FBXL2可以有效抑制Osimertinib耐药的NSCLC生长。在PC-9/AZDR裸鼠移植瘤中，联合使用Nebivolol和Osimertinib可显著抑制Osimertinib耐药性NSCLC的生长(图6J-K)。

四、激活FBXL2在EGFR-TKIs耐药中的作用。

1、实验方法

①在PC-9/AZDR细胞中，利用IC50实验检测Nebivolol在Osimertinib耐药中的作用。

②利用慢病毒感染技术将HA-FBXL2或空载体在PC-9/AZDR细胞中稳定表达。然后利用IC50实验检测FBXL2在Osimertinib耐药中的作用。

2、实验结果

IC50实验结果表明，过表达FBXL2或Nebivolol处理，可显著抑制NSCLC细胞株对Erlotinib，Gefitinib(利用IC50实验检测)和Osimertinib的耐药性(图6H-I和14A-B)。

本实施例实验结果说明，FBXL2可显著抑制EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白的表达；过表达FBXL2或Nebivolol处理可显著抑制对Erlotinib，Gefitinib和Osimertinib的耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌，将Nebivolol与Osimertinib联合使用可以有效治疗耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌。

实验6FBXL2和EGFR蛋白在肺癌中的相关性检测

1、实验方法

用肺癌组织芯片分析肺腺癌和肺鳞癌组织(组织来源是肺癌病人的组织样本)中FBXL2和EGFR蛋白在肺癌中的相关性。进一步利用TCGA数据分FBXL2mRNA与NSCLC的关系。

2、实验结果

结果表明，FBXL2和EGFR的表达在肺鳞癌和肺腺癌中呈负相关(图3H和图9H)。与正常肺细胞相比，在NSCLC细胞中FBXL2低表达，而EGFR高表达(图9I)。

进一步利用TCGA数据分析发现，FBXL2mRNA在NSCLC中低表达(图3I)。而且FBXL2的低表达与肺癌患者总生存期短密切相关(图3J)。

TCGA数据库分析表明在肺腺癌和肺鳞癌中FBXL2低表达，而Grp94高表达(图10A-B)。

以上结果表明，FBXL2的低表达、Grp94高表达与EGFR的高表达相关，FBXL2表达低、Grp94表达高，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的FBXL2的表达水平和/或Grp94的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。

综上，EGFR驱动的癌症，包括EGFR驱动的肺癌与EGFR息息相关，本申请实验证实了FBXL2可以EGF非依赖性方式靶向EGFR，与EGFR激酶结构域结合，通过E3泛素连接酶降解EGFR；进一步通过体内体外实验证明了，过表达FBXL2的确能降低癌细胞中EGFR的表达水平，进而抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长，包括存在L858R突变以及T790M突变的EGFR驱动的耐药性非小细胞肺癌；

发明人还设计了找到了FBXL2的抑制剂Nebivolol，并通过实验证实了Nebivolol作为FBXL2激动剂，可以有效抑制EGFR驱动的耐药性非小细胞肺癌，尤其是可以显著抑制TKIs耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长；

进一步的机制实验发现，FBXL2可显著抑制EGFR的Osimertinib耐药突变蛋白的表达；过表达FBXL2或Nebivolol处理均可显著抑制对Erlotinib，Gefitinib和Osimertinib的耐药(即存在EGFRT790M突变或C797S突变)的EGFR驱动的非小细胞肺癌，将Nebivolol与Osimertinib联合使用可以有效治疗耐药的EGFR驱动的非小细胞肺癌。

最后，发明人还发现FBXL2的低表达与EGFR的高表达相关，FBXL2表达低，则患非小细胞肺癌的风险更大，同时患者预后也更差，因此可以通过检测待检样本肺组织中的FBXL2的表达水平，预测其患癌风险以及预后好坏。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> FBXL2激活剂在制备治疗EGFR驱动的肺癌的药物中的用途

<130> GYKH1848-2021P0112679CC

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

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<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

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<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

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<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 67

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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Claims

1.FBXL2激活剂在制备EGFR抑制剂类药物中的用途；所述EGFR抑制剂类药物是治疗EGFR驱动的癌症的药物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗EGFR驱动的肺癌、食管癌、头颈癌、神经胶质瘤或结直肠癌的药物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗EGFR驱动的非小细胞肺癌的药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗耐药性非小细胞肺癌的药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗存在EGFRT790M突变、L858R突变和/或C797S突变的耐药性非小细胞肺癌的药物。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述FBXL2激活剂是提高机体FBXL2含量的物质或激活FBXL2活性的物质。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述FBXL2激活剂是Nebivolol。