CN110218791A - Spz1的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法 - Google Patents

Spz1的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种SPZ1作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途及其抑制剂在制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途和一种预防和/或治疗肠癌的药物组合物以及预防和/或治疗肠癌的药物的筛选方法。转录因子SPZ1与肠癌细胞凋亡密切相关，能间接下调介导肠癌细胞凋亡的Bim蛋白在肠癌细胞中的表达水平。实验结果表明，SPZ1抑制剂对体内外的肠癌细胞的凋亡有明显促进作用，能够抑制肿瘤生长。因此，本发明为抗肠癌新药的设计提供了新靶点，为促肠癌凋亡药物的开发和制备提供了新的思路。

Description

SPZ1的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法
技术领域
本发明涉及抗癌技术领域，特别涉及一种SPZ1的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法。
背景技术
肠道肿瘤是最常见的肿瘤类型之一，包括结肠癌和直肠癌等。最新调查数据显示，所有恶性肿瘤中，结直肠癌死亡率为全球第二，发病率为全球第三。肠道肿瘤的发生与高脂肪低纤维素饮食、肠道慢性炎症、遗传因素和其他因素(如环境因素、吸烟等)有关。肿瘤细胞具有无限增殖的能力，而逃避细胞凋亡是肿瘤细胞的主要特征之一。因此，研究肿瘤细胞逃避细胞凋亡的机制，寻求有效的促肿瘤凋亡措施进而抑制肿瘤生长进程已成为国内外的研究热点。线粒体凋亡途径主要受B-细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族调控。根据结构和功能的差异，Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡Bcl-2蛋白(Bcl-2和Bcl-XL等)，促凋亡Bcl-2蛋白(Bak和Bax)和BH3-only蛋白(Bim，Bad和Puma等)三类。正常情况下，促凋亡BH3-only蛋白激活后竞争性结合抗凋亡Bcl-2蛋白，活化促凋亡Bcl-2蛋白，进而促使线粒体释放凋亡因子如细胞色素c进入胞浆，募集并激活启动型caspase-9，最终导致效应型caspases-3等激活，引起细胞死亡。对于肿瘤细胞而言，其线粒体凋亡途径被显著抑制，进而实现了无限增殖。根据肿瘤细胞中抑制线粒体凋亡的产生机制，选择特有的靶点设计合成直接作用于肿瘤的新药进行靶向治疗，将对肿瘤的治疗非常有益。近年研究者发现了多种促进肠道肿瘤凋亡相关的药物靶点，但是依据这些药物靶点筛选或研发出的促肠癌细胞凋亡制剂在后期的临床应用上仍显不足。因此有必要探索新的促肠癌细胞凋亡的药物相关靶点。
SPZ1(spermatogenic leucine zipper1)生精亮氨酸拉链蛋白1属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix-leucine zipper，bHLH-Zip)结构的一类转录因子，最初发现于小鼠的精子文库之中，功能上与精子生成密切相关，并主要在胚胎发育阶段表达。在转基因鼠和裸鼠模型中，发现活化的SPZ1作为转录因子促进下游基因表达，其中就包括增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)。然而SPZ1与抑制肠道肿瘤细胞凋亡以及肠癌的相关性还有待进一步的研究。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于如何提供一种SPZ1作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法。
本发明所采取的技术方案是：
SPZ1作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途。
优选的，肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
SPZ1的抑制剂在制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途。
优选的，抑制剂为siRNA、shRNA中的任一种。
优选的，肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
一种预防和/或治疗肠癌的药物组合物，包括SPZ1的抑制剂。
优选的，抑制剂为siRNA、shRNA中的任一种。
优选的，肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
一种预防和/或治疗肠癌的药物的筛选方法，使用包括SPZ1的检测靶点进行筛选，其非限制性实例可以是，在筛选过程中进行SPZ1的表达测试。
本发明的有益效果是：
转录因子SPZ1与肠癌细胞凋亡密切相关，能间接下调介导肠癌细胞凋亡的Bim蛋白在肠癌细胞中的表达水平。实验结果表明，SPZ1抑制剂对体内外的肠癌细胞的凋亡有明显促进作用，能够抑制肿瘤生长。因此，本发明为抗肠癌新药的设计提供了新靶点，为促肠癌凋亡药物的开发和制备提供了新的思路。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的Western blot检测结果图。左侧表示SW480细胞转染后的检测结果，右侧表示SW620细胞转染后的检测结果。
图2是本发明的一个实施例的流式细胞仪检测分析结果。2A和2B分别是SW480细胞和SW620细胞的结果，2C是肠癌细胞的凋亡率结果。2C中的SW480细胞和SW620细胞结果中从左到右分别代表siCTL组、siSPZ1#1组和siSPZ1#2组。
图3是本发明的一个实施例的肿瘤大小结果图。3A是转染Lenti-control(shCTL)和Lenti-SPZ1 shRNA(shSPZ1)慢病毒质粒后的每组各6个重复在第24天取下时的肿瘤照片；3B是不同时间内肿瘤的大小变化曲线图，其中，上侧曲线是shCTL控制组，下侧曲线是shSPZ1实验组。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。
1.实验材料
细胞系：人肠癌细胞SW480和SW620，购自美国模式培养物寄存库(ATCC)。
SPZ1抑制剂：SPZ1的siRNASPZ1#1(其靶向序列为SEQ ID No：1，5′-CCATTGCCTTATTCGAAAT-3′)和siRNASPZ1#2(其靶向序列为SEQ ID No：2，5′-CCATCAAGTTACAGAACAA-3′)购自广州市锐博生物科技有限公司，SPZ1的抑制性质粒Lenti-SPZ1 shRNA(其靶向序列为SEQ ID No：3，5′-GCTGTCTGAGATGCCACCTTC-3′)购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
试剂及试剂盒：CellTiter-Blue Cell Viability Aassay购自美国Promega公司，DharmaFECT 1 Transfection Reagent购自美国GE公司，Annexin V-FITC/PI apoptosisdetection kit购自美国GE公司，Anti-SPZ1购自美国GeneTex公司，Anti-Bim、Anti-cleaved caspase-9和Anti-cleaved caspase-3购自美国CST公司，Anti-ACTB购自美国Santa Cruz公司。
实验动物：荷瘤小鼠，其制备方法如下：取体外常规培养的SW480细胞，分为两组，一组转染Lenti-SPZ1 shRNA，另一组转染Lenti-control。按照每只小鼠2×106个细胞的接种量接种雄性裸鼠背部。
实验仪器：酶标仪购自美国Molecular Devices公司，5％CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司，蛋白电泳仪系统购自美国Bio-Rad公司，蛋白转印仪系统购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪购自美国BD公司。
2.实验方法
2.1转染实验
分别对SW480和SW620细胞转染siRNA contrl(siCTL)、siRNASPZ1#1和siRNASPZ1#2，转染72小时后收集细胞，通过Western blot检测SPZ1与Bim、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达量的关系。
2.2体外肠癌细胞促凋亡实验
分别对SW480和SW620细胞转染siRNAcontrl(siCTL)、siRNA SPZ1#1和siRNASPZ1#2，转染72小时后收集细胞。应用Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit，在流式细胞仪中分析细胞凋亡情况。
2.3体内肠癌细胞生长抑制实验
分别对SW480细胞转染转染Lenti-SPZ1 shRNA和Lenti-control慢病毒质粒。按照每只小鼠2×106个细胞的接种量接种雄性裸鼠背部，24天后取下肿瘤，拍照并测量肿瘤的大小。
3.实验结果
3.1转染实验结果
图1是本发明的一个实施例的Westernblot检测结果图。左侧表示SW480细胞转染后的检测结果，右侧表示SW620细胞转染后的检测结果。如图1所示，在SW480细胞和SW620细胞中，与对照组siCTL相比，SPZ1的两条siRNA均可以显著敲低SPZ1的表达，增加Bim、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达。该实验结果表明转录因子SPZ1间接抑制促凋亡蛋白Bim的表达，进而抑制肠癌细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达。
3.2体外肠癌细胞促凋亡实验结果
图2是本发明的一个实施例的流式细胞仪检测分析结果。2A和2B分别是SW480细胞和SW620细胞的结果，2C是肠癌细胞的凋亡率结果。2C中的SW480细胞和SW620细胞结果中从左到右分别代表siCTL对照组、siSPZ1#1组和siSPZ1#2组。如图2所示，在SW480细胞和SW620细胞中，与siCTL对照组相比，SPZ1抑制剂组(siSPZ1#1组和siSPZ1#2组)的两条siRNA抑制剂均可以显著增加细胞凋亡的比例。该实验结果表明转录因子SPZ1抑制肠癌细胞凋亡的发生。
3.3体内肠癌细胞生长抑制实验结果
图3是本发明的一个实施例的肿瘤大小结果图。3A是转染Lenti-control(shCTL)和Lenti-SPZ1 shRNA(shSPZ1)慢病毒质粒后的每组各6个重复在第24天取下时的肿瘤照片；3B是不同时间内肿瘤的大小变化曲线图，其中，上侧曲线是shCTL控制组，下侧曲线是shSPZ1实验组。如图3所示，与对照组相比，shSPZ1实验组的肿瘤大小明显更小，生长更慢，SPZ1抑制剂Lenti-SPZ1 shRNA能明显抑制肿瘤生长。该实验结果表明，SPZ1抑制剂对体内肠癌具有明显的抑制作用，且对实验动物无毒副作用，进一步提示SPZ1抑制剂可为促肠癌凋亡药物的开发和制备提供新的思路。
综合上述实验结果可知，SPZ1的抑制剂对体内和体外的肠癌细胞的凋亡都有明显的促进作用，能够抑制肿瘤生长。因此，本发明为抗肠癌新药的设计提供了新靶点，为促肠癌凋亡药物的开发和制备提供了新的思路。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 张鹏 深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院
<120> SPZ1的用途及其抑制剂的用途、药物组合物和药物筛选方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccattgcctt attcgaaat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccatcaagtt acagaacaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgtctgag atgccacctt c 21

Claims (9)

1.SPZ1作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的筛选或制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途，其特征在于，所述肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
3.SPZ1的抑制剂在制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途，其特征在于，所述抑制剂为siRNA、shRNA中的任一种。
5.根据权利要求3所述的制备用于预防和/或治疗肠癌的药物中的用途，其特征在于，所述肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
6.一种预防和/或治疗肠癌的药物组合物，其特征在于，包括SPZ1的抑制剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂为siRNA、shRNA中的任一种。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述肠癌为结肠癌、直肠癌中的至少一种。
9.一种预防和/或治疗肠癌的药物的筛选方法，其特征在于，使用包括SPZ1的检测靶点进行筛选。
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张灵敏等: "Spz1和Rap1b在食管鳞癌中的表达及临床意义", 《山西医科大学学报》, vol. 48, no. 5, 23 May 2017 (2017-05-23), pages 471 - 474 *

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