CN114836428A - 一种tigit基因干扰的嵌合抗原受体nk细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞及其用途。本发明提出利用RNA干扰技术敲低TIGIT在NKG2D‑CAR‑NK细胞中的表达，普遍增强CAR‑NK细胞功能的通用型方法，提升NKG2D‑CAR‑NK细胞免疫疗法的效果。本发明还公开了一种TIGIT基因RNAi靶序列以及基于该靶序列的干扰序列、及其构建方法和应用。本发明可应用于恶性肿瘤病免疫治疗中，为利用CAR‑NK治疗肿瘤提供新的改良思路，具有广泛应用前景。

Description

一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞及其应用
技术领域
本发明属于生命科学技术研究领域，具体涉及一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK 细胞及其用途。
背景技术
全球范围内癌症发病情况不断加重，成为人类的主要死因之一[1]。根据GLOBACAN最新发布的全球癌症数据，2021年全球新增癌症病例约2000万例，死亡病例约1000万例，各类型癌症分布呈现地区和性别差异[2]。目前临床上针对癌症的治疗策略主要是以放化疗、靶向治疗、介入治疗、免疫治疗为主的多学科综合治疗法(multi-disciplinaryTreatment，MDT)，旨在缓解患者临床症状，延长患者生存期[3]。
肿瘤免疫治疗包括免疫检查点阻断、癌症疫苗、细胞过继免疫治疗(adoptive Tcell transfer，ACT)、基于髓细胞的免疫治疗等[4]。在细胞过继免疫治疗方面，嵌合抗原受体 T细胞(chimeric antigen receptor T-Cell，CAR-T)在恶性肿瘤尤其是血液恶性肿瘤的免疫治疗中取得了良好的成效，CAR-T疗法成为肿瘤免疫治疗的研究热点。然而，CAR-T在杀伤肿瘤的同时存在极大的副作用，例如CAR-T细胞回输可能会引发大量细胞因子释放(细胞因子风暴)，使机体出现发热、发烧、呼吸衰竭等症状；对T细胞进行基因修饰可能会引起细胞突变；CAR-T的靶向性非常强，对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞都具有攻击性，可能产生脱靶效应；CAR-T在实体肿瘤中杀伤能力不强，还可能导致神经系统受损、自身免疫疾病、肿瘤溶解等问题[5,6]。针对这些无法避免的弊端，人们开始将目光转移到先天免疫系统的自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)上。NK细胞具有不同于 T细胞的非特异性识靶和杀伤机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞[7]。与CAR-T相比，CAR-NK临床使用更安全，不会诱发致死性的致死性的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome， CRS)和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)，不会产生严重的神经毒性，且在体外细胞模型和体内动物模型中均显示出良好的肿瘤杀伤作用[8]。
为了降低CAR-NK的脱靶效应，研究人员寻找更为有效的靶点。NKG2D受体表达于大多数天然免疫淋巴效应细胞上，其配体MICA/B在正常细胞上表达水平低甚至不表达，但在外源性或内源性刺激下(细胞分裂、病毒感染、癌变等)表达量显著上调，在大多数肿瘤细胞上都会持续稳定表达。因此，NKG2D可以作为制备CAR-NK的理想靶向分子[9]。
带有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(T cell immunoglobulin andITIM domain，TIGIT)是近年新发现的一种在淋巴细胞上表达、具有免疫抑制作用的免疫检查点分子，可以介导NK细胞的功能调控，影响肿瘤的免疫周期[10]。TIGIT的高亲和力配体CD155在大多数正常组织中几乎不表达或弱表达，但在一系列人类恶性肿瘤中表达上调，与TIGIT结合后，可以通过β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)抑制核因子κB(Nuclear Factorkappa-B，NF-κB)信号通路限制NK细胞介导的细胞毒作用[11]。
肿瘤免疫治疗中，CAR-NK是过继免疫细胞治疗的新兴研究热点，具有极大的优势和广阔的发展前景，未来几年有望构造出具有较强靶向性和功能性的CAR-NK细胞，并在临床治疗上得到推广，取得良好的治疗效果，延长癌症患者的寿命。NKG2D是C型凝集素超家族中的一员，除了表达于所有的NK细胞之外,还表达于CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的T细胞表面。NKG2D在NK细胞活化过程中起重要作用[12,13]。NKG2D的配体 MICA/B在大多数正常的细胞和组织中不表达，但却可以由病毒感染、细菌感染和应激刺激诱导表达,并在许多上皮肿瘤如黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等中均有表达，相关研究认为MICA/B与恶性转化相关。因此，以NKG2D配体为靶向的CAR-NK细胞治疗多用于多种肿瘤的免疫治疗手段。TIGIT/CD155是最近几年新发现的免疫检查点信号通路，NK细胞上的TIGIT可与恶性肿瘤表面高表达的配体CD155结合从而抑制NK细胞杀伤功能。
发明内容
本发明首次提出了在NKG2D-CAR的结构中加入TIGIT的干扰序列用于增强 NKG2D-CAR-NK功能的发明构思。本发明提出利用RNA干扰技术敲低TIGIT在 NKG2D-CAR-NK细胞中的表达，普遍增强CAR-NK细胞功能的通用型方法，提升 NKG2D-CAR-NK细胞免疫疗法的效果。
本发明提出了一种TIGIT基因RNAi靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，还包括如SEQ ID NO.5、6所示的序列。
本发明还提出了一种基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列，其序列如SEQID NO. 2、3所示。进一步地，其还包括如SEQ ID NO.7、8、9、10所示的干扰序列。
本发明还提出了上述干扰序列的构建方法，所述方法为，5端以G开头，设定G+C含量为30％～50％；根据pLL3.7载体的要求，包括如下步骤：
(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的T；
(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”；
(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”；
(4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定；
(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。
本发明还提出了一种载体，其包含所述基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列，其序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、10所示之一。
本发明还提出一种表达载体质粒，其为pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒，其中TIGIT干扰序列shRNA位于U6启动子下游，NKG2D-CAR位于CMV启动子下游。
进一步地，所述pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒包括 pLL3.7-TIGIT-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-TIGIT-shRNA-B-NKG2D-CAR、 pLL3.7-TIGIT-shRNA-C-NKG2D-CAR。
本发明还提出了一种表达载体质粒的构建方法，其包括如下步骤：
(1)将NKG2D蛋白的胞外段基因序列加入CD8a信号肽的序列，经过RT-PCR方式扩增得到如SEQ ID NO.4所示的Sig-NKG2D胞外段序列；
(2)将所述sig-NKG2DEX序列通过重叠PCR方式连接到二代CAR(4-1BB-CD3ζ)，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体；
(3)将所述基于TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列连接到所述pLL3.7-NKG2D-CAR载体上，得到所述pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒。
进一步地，所述pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒包括pLL3.7-TIGIT-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-TIGIT-shRNA-B-NKG2D-CAR、 pLL3.7-TIGIT-shRNA-C-NKG2D-CAR。
本发明还提出了一种细胞，其包括所述TIGIT基因RNAi靶序列、所述基于所述TIGIT 基因RNAi靶序列的干扰序列、或所述表达载体质粒。具体地，即TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞。
本发明还提出了一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞，通过RNA干扰(RNAi)手段对TIGIT基因进行干扰，敲低TIGIT表达量；所述干扰序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、 10之任一项所示，对嵌合抗原受体NK细胞进行改造。
优选地，所述干扰序列是针对TIGIT基因进行改造的，但不限于如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、 10之任一项所示的序列。
优选地，所述操作是对TIGIT基因进行改造致使其表达量降低，技术手段为RNA干扰但不限于此，可扩展为任何使得TIGIT表达量降低的手段。
本发明还提出了一种试剂盒、药物组合物或制剂，其包括所述TIGIT基因RNAi靶序列、所述基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、所述表达载体质粒、或所述细胞，优选地，为TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞。
本发明还提出了所述TIGIT基因RNAi靶序列、所述基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、所述表达载体质粒、所述细胞、或所述试剂盒或药物组合物或制剂的应用，包括但不限于其在制备治疗CAR-NK的药物中的应用；
在制备治疗实体瘤疾病的药物中的应用；
在制备恶性肿瘤疾病免疫治疗药物中的应用；
在制备靶向治疗胰腺癌的药物中的应用；
在制备提高NKG2D-CAR-NK细胞的活化水平的药物中的应用；
在制备增强NKG2D-CAR-NK细胞肿瘤细胞杀伤能力的药物中的应用。
具体实施方案中，包括在体外、在体内的应用。
本发明还提出一种非诊断和/或治疗目的的增强NKG2D-CAR-NK细胞肿瘤细胞杀伤能力的方法，其通过敲低TIGIT以提高NKG2D-CAR-NK细胞的活化水平，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力。
本发明还提出一种用于非治疗目的的抑制细胞内目标基因的表达的方法，其包括将所述的干扰序列导入所述细胞内的步骤，或使所述的干扰序列在所述细胞内表达的步骤。
本发明创新提出将CAR结构与TIGIT的shRNA序列构建在同一个质粒上，可以实现在 T细胞中表达NKG2D-CAR的同时，将T细胞中负调控的TIGIT基因敲低，实现增强 NKG2D-CAR-T细胞的功能。
本发明提出，通过RNA干扰技术敲低NKG2D-CAR-NK细胞中TIGIT基因的表达，获得的CAR-NK细胞具有更强的杀伤肿瘤的能力。无论在体内还是体外，敲低TIGIT可以显著提高NKG2D-CAR-NK细胞的活化水平，显著增强其对肿瘤细胞的杀伤能力。本发明研究为利用CAR-NK治疗肿瘤提供一种新的改良思路，具有一定的推广应用价值，可应用于恶性肿瘤病的免疫治疗中。
本发明创新及有益效果还包括：本发明是首次靶向胰腺癌细胞的NKG2D-CAR-NK的细胞治疗，首次将shRNA-TIGIT应用于CAR-NK治疗中，构建了一种全新的载体质粒：pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒。本发明通过体外实验不仅证明了 NKG2D-CAR-NK能够有效地靶向治疗胰腺癌，同时证明了干扰TIGIT后能够有效地增加 NKG2D-CAR-NK细胞的抗肿瘤功能，为CAR-NK应用于实体瘤治疗提供了新思路。
附图说明
图1表示本发明中的NKG2D-CAR、NKG2D-sh-CAR结构示意图。
图2表示本发明中的pLL3.7-NKG2D-shRNA-A/B/C-CAR重组质粒单酶切鉴定结果示意图。
图3表示本发明中的Q-PCR检测TIGIT-shRNA干扰效果示意图。
图4表示本发明中的流式检测NK细胞、NKG2D-CAR-NK细胞、 NKG2D-shRNA-A-CAR-NK细胞杀伤靶细胞的凋亡率。其中，图4中的A表示NKG2D-CAR-T 细胞杀伤靶细胞的流式图。B表示NKG2D-CAR-T细胞对靶细胞杀伤率的折线图。
图5表示本发明中的NKG2D-shRNA-A-CAR-NK体内杀伤肿瘤结果示意图。其中，图 5中的A表示NKG2D-CAR-NK细胞治疗移植瘤小鼠后肿瘤大小的统计结果。B表示 NKG2D-CAR-NK细胞治疗移植瘤小鼠后肿瘤重量的统计结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1 pLL3.7-shRNA-TIGIT干扰载体的构建方法及结果
1 RNAi靶序列设计
在NCBI网站中查找到Homo sapiens TIGIT的基因序号：173799.4。根据基因编号在网站 (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)设计TIGIT基因RNAi靶序列，结果表1所示。
表1.GPR97基因RNAi靶序列
靶序列名称 起始位置 RNAi靶序列的核苷酸序列 GC％ SEQ ID NO.
靶序列A 388 GGAGTACTTCTGCATCTATCA 42.86 SEQ ID NO.1
2根据靶序列设计干扰序列：
基于筛选出的靶序列，按照如下原则设计和确定干扰序列：5端以G开头，设定G+C含量为30％～50％。根据pLL3.7载体的要求，(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的 T。(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”。(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”。 (4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定。(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。
设计得到的干扰序列如下表2所示
表2.针对靶序列设计的寡核苷酸序列
Figure BDA0003683310630000051
3构建靶向质粒pLL3.7-shRNA-(A)-NKG2D
通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/和https://www.uniprot.org/网站查到NKG2D蛋白的胞外段基因序列然后加入CD8a信号肽的序列。经过RT-PCR的方式扩增得到 Sig-NKG2D胞外段序列如下SEQ ID NO.4：
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATAT GTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGT ATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAA GTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCAT TCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCT TTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG
将得到的sigNKG2DEX序列通过重叠PCR的方式连接到二代CAR CD8-CD3ζ-4-1BB)。通过测序鉴定后确定构建成功，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体。将合成好的干扰片段连接到pLL3.7-NKG2D-CAR载体上，如图1所示。重组质粒经EcoR I单酶切鉴定结果，如图2所示。
实施例2病毒包装
pLL3.7-NKG2D-CAR和pLL3.7-TIGIT-shRNA-A-NKG2D-CAR质粒的扩增与病毒包装1质粒转染
1)分别将慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2及pLL3.7-NKG2D-CAR或pLL3.7- TIGIT-shRNA-A-NKG2D-CAR与Opti-MEM混合、PEI与Opti-MEM培养基混合并在室温孵育5min；
2)将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入分别含慢病毒包装质粒的Opti-MEM中，室温静置 20min，得到DNA/PEI混合物；
3)将DNA/PEI混合物缓慢均匀地加入到铺有293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。
2病毒收集和浓缩
1)收集转染48h和72h后的细胞上清(具体指转染了慢病毒包装质粒的细胞培养上清)；
2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；
4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的PBS 进行浓缩，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；
5)将病毒浓缩液进行分装，然后置于-80℃中保存。
3病毒滴度测定
1)将293T细胞按照密度为2×105/ml接种到24孔培养板；
2)向24孔板中分别加入0.1,0.5,1ul上述步骤2中5)保存的病毒浓缩液；
3)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；
4)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；
5)计算滴度，滴度＝2×105×感染效率×稀释倍数。
实施例3 pLL3.7-NKG2D-shRNA-A-CAR载体干扰验证试验
将NK92细胞从液氮中取出置于37℃水浴锅中快速融化，800rpm/min离心3分钟后用α-MEM完全培养基(12.5％胎牛血清、12.5％马血清、2％青霉素链霉素混合液和73％的αMEM 基础培养基组成，还需额外补充100-200U/ml重组IL-2、0.2mM肌醇、0.1mM巯基乙醇以及0.02mM叶酸)重悬并接种于24孔板中培养。待细胞状态稳定后将其分为3组：无病毒感染阴性对照组、LV-NKG2D-CAR组和LV-NKG2D-shRNA-A-CAR慢病毒干扰组，每组各2 孔。两个实验组分别按照MOI＝10:1加入相应体积的病毒(LV-NKG2D-CAR和 LV-NKG2D-shRNA-A-CAR)，并加入10μg/ml polybrene促进感染。24h后将细胞进行收集， 1000g离心10min，弃去培养基，加入新鲜培养基。
慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测NKG2D表达效率，即病毒感染阳性率。结果LV-NKG2D-CAR、LV-NKG2D-shRNA-A-CAR两种病毒在NK细胞上的感染效率接近80％。
将上述中的三种细胞用Trizol裂解细胞，抽提总RNA，进行逆转录。Q-PCR分析重组质粒的干扰效果。结果如图3所示，pLL3.7-NKG2D-shRNA-A-CAR慢病毒感染细胞后能显著抑制TIGIT mRNA的转录。
实施例4靶细胞的选择及CAR-NK杀伤功能研究实验
为了选择合适的靶细胞，本发明人利用流式细胞仪对本发明课题组实验室保存的PANC1， Capan2，PANC28和SW1990四株胰腺癌细胞株进行了分析，分别检测了这四株胰腺癌细胞株上MICA/B分子及TIGIT的配体CD155的表达水平，结果显示PANC1，Capan2，PANC28 细胞株上MICA/B分子的表达量较高，SW1990上表达量较低量较高，而PANC1，SW1990 细胞株上CD155分子的相对表达量高于PANC28，Capan2上的相对表达量，所以本发明选择了MICA/B及CD155均高表达的PANC1细胞作为靶细胞进行NKG2D-CAR-NK细胞杀伤功能的检测。
靶细胞与效应细胞共孵育
将PANC1细胞株按照4×104/孔的数量接种至超低吸附细胞培养96孔板中；将NKG2D-CAR-NK、NKG2D-shRNA-A-CAR-NK细胞和感染对照病毒的NK细胞分别按照效靶比1:1、2.5:1、5:1接种至靶细胞中，每组设两个重复，每孔补液至200μl；
将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养5h；5h后经流式检测其杀伤效率。
杀伤效率分析
如图4所示，与对照组相比，NKG2D-CAR-NK和NKG2D-shRNA-A-CAR-NK均具有很强的杀伤胰腺癌的效果，并且与NKG2D-CAR-NK相比，NKG2D-shRNA-A-CAR-NK具有更强的杀伤效率，此实验表明，NKG2D可以很好的靶向胰腺癌细胞株发挥功能，并且干扰TIGIT 能增强NKG2D-CAR-NK的杀伤效率。
动物实验结果
实验过程期间观察并记录三组小鼠的生存状态，绘制每组小鼠的胰腺癌肿瘤生长曲线。仁慈终点时终止动物实验，剥离肿瘤称重。如图5所示，相对于NK92组以及NKG2D组，NKG2D-shRNA-A-CAR-NK治疗能够明显抑制肿瘤的生长。
实施例5～6
在本发明实施例1筛选本发明的shRNA-A干扰序列的过程中，还同时针对多个不同靶序列设计了不同的干扰序列，并进行了相关实验。实验方法与上述实施例1相同。
筛选得到的其他RNAi靶序列如表3所示，各靶序列对应的干扰序列的上下游片段如表4 所示，其中shRNA-A为本发明实施例1中的序列。
表3.GPR97基因RNAi靶序列
实施例 靶序列名称 起始位置 RNAi靶序列的核苷酸序列 GC％ SEQ ID NO.
实施例1 靶序列A 388 GGAGTACTTCTGCATCTATCA 42.86 SEQ ID NO.1
实施例5 靶序列B 137 GGAATGATGACAGGCACAATA 42.86 SEQ ID NO.5
实施例6 靶序列C 268 GCTTCTGGCCATTTGTAATGC 47.62 SEQ ID NO.6
表4.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列
Figure BDA0003683310630000081
Figure BDA0003683310630000091
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
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SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagtacttc tgcatctatc a 21
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggagtactt ctgcatctat cattcaagag atgatagatg cagaagtact ccttttttga 60
attcc 65
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgaggaatt caaaaaagga gaggttcaag tcagaagatc tcttgaatct tctgacttga 60
acctctcca 69
<210> 4
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120
cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180
tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240
aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300
attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360
acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420
atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt g 471
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaatgatga caggcacaat a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttctggcc atttgtaatg c 21
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggaatgatg acaggcacaa tattcaagag atattgtgcc tgtcatcatt ccttttttga 60
attcc 65
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgaggaatt caaaaaagga atgatgacag gcacaatatc tcttgaatat tgtgcctgtc 60
atcattcca 69
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcttctggc catttgtaat gcttcaagag agcattacaa atggccagaa gcttttttga 60
attcc 65
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcgaggaatt caaaaaagct tctggccatt tgtaatgctc tcttgaagca ttacaaatgg 60
ccagaagca 69

Claims (13)

1.一种TIGIT基因RNAi靶序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、5、6所示。
2.一种基于如权利要求1所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、10所示。
3.如权利要求2所述的干扰序列的构建方法，其特征在于，所述方法为，5端以G开头，设定G+C含量为30％～50％；根据pLL3.7载体的要求，包括如下步骤：
(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的T；
(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”；
(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”；
(4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定；
(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。
4.一种载体，其特征在于，其包含如权利要求2所述的干扰序列。
5.一种表达载体质粒，其特征在于，其为pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒。
6.一种表达载体质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将NKG2D蛋白的胞外段基因序列加入CD8a信号肽的序列，经过RT-PCR方式扩增得到如SEQ ID NO.4所示的Sig-NKG2D胞外段序列；
(2)将所述sig-NKG2D胞外段序列通过重叠PCR方式连接到二代CAR(4-1B-CD3ζ)，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体；
(3)将如权利要求2所述的干扰序列连接到所述pLL3.7-NKG2D-CAR载体上，得到所述pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表达载体质粒。
7.一种细胞，其特征在于，其包括如权利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如权利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、或如权利要求5所述的表达载体质粒。
8.一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，通过RNA干扰(RNAi)手段对TIGIT基因进行干扰，敲低TIGIT表达量；所述干扰序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、10所示，对嵌合抗原受体NK细胞进行改造。
9.一种试剂盒、药物组合物或制剂，其特征在于，其包括如权利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如权利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、或如权利要求5所述的表达载体质粒、如权利要求7所述的细胞。
10.如权利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如权利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、如权利要求5所述的表达载体质粒、如权利要求7所述的细胞、如权利要求9所述的试剂盒或药物组合物或制剂在制备治疗CAR-NK的药物中的应用、在制备治疗实体瘤疾病的药物中的应用、在制备恶性肿瘤疾病免疫治疗药物中的应用、在制备靶向治疗胰腺癌的药物中的应用、在制备提高NKG2D-CAR-NK细胞的活化水平的药物中的应用、在制备增强NKG2D-CAR-NK细胞肿瘤细胞杀伤能力的药物中的应用。
11.如权利要求10的应用，其特征在于，所述应用包括在体外、在体内。
12.一种非诊断和/或治疗目的的增强NKG2D-CAR-NK细胞肿瘤细胞杀伤能力的方法，其特征在于，其通过敲低TIGIT以提高NKG2D-CAR-NK细胞的活化水平，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力。
13.一种用于非治疗目的的抑制细胞内目标基因的表达的方法，其特征在于，其包括将如权利要求2所述的干扰序列导入所述细胞内的步骤，或使如权利要求2所述的干扰序列在所述细胞内表达的步骤。
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